CN114752626A - 一种可逆性永生化ⅱ型肺泡上皮细胞及其构建与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞工程技术领域，具体公开了一种可逆性永生化Ⅱ型肺泡上皮细胞及其构建与应用。本发明通过SSR#41永生化工具质粒和逆转录病毒系统构建了可逆性永生化肺泡细胞株imPACs，并进一步分选出了可逆性永生化小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞，为了解Ⅱ型肺泡细胞的功能和作用机制，以及肺相关疾病诊断及治疗的研究提供了更好的细胞模型。进一步地，本发明通过体内外腺病毒Ad‑TGF‑β1干预imPAC2细胞株，以及构建稳定低表达β‑Catenin的imPAC2细胞系(imPAC2‑Si‑β‑Catenin)，还构建了pSEBI‑Kras和pSEBI‑p53R273H稳定过表达Kras及R273H位点突变p53的imPAC2细胞系(imPAC2‑KrasmP53)，为肺纤维化、肿瘤等相关研究提供了良好的细胞工具。

Description

一种可逆性永生化Ⅱ型肺泡上皮细胞及其构建与应用
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，特别是涉及一种可逆性永生化Ⅱ型肺泡上皮细胞及其构建与应用。
背景技术
肺泡为肺气体交换功能的关键部位，主要由Ⅰ型肺泡上皮细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞构成，其中祖细胞主要来源于Ⅱ型肺泡上皮细胞其功能异常与呼吸窘迫综合征，特发性肺纤维化等密切相关。在肺炎症反应或损伤时，除免疫细胞如T细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞等发挥抗炎症的作用外，肺泡上皮细胞也被认为是能够分泌各种细胞因子而直接作用于炎症或受损部位，从而发挥着巨大的体内自身保护机制。随着再生医学的研究进展，人们发现，在不同的肺损伤区域，存在一些干细胞祖细胞，可通过增殖或诱导定向分化，修复受损器官。因此寻找及鉴定肺的干细胞祖细胞对于研究肺损伤相关疾病治疗和预防等方面显示了极大的研究价值。
认知肺泡内干细胞的基本生物学功能对于了解许多肺部疾病及肺损伤等非常重要。研究发现，Ⅱ型肺泡上皮细胞能增殖分化，在肺损伤和修复中扮演肺泡干细胞的作用，能诱导产生Ⅱ型肺泡上皮细胞和Ⅰ型肺泡上皮细胞。近十几年的研究证实，在小鼠肺损伤和功能重建中，Ⅱ型肺泡上皮细胞可以增殖或分化为Ⅰ型肺泡上皮细胞。研究证实，不同部位的Ⅱ型肺泡细胞增殖和再生能力有显著差异，但对其进一步的研究却非常少，究竟是何种亚群，以及有些什么特征性标志物或功能也尚不清楚。同时Ⅱ型肺泡细胞如何联系间质细胞，内皮细胞以及一些免疫细胞发挥其自我更新、分化和修复功能也尚不清楚。因此，本研究拟从新生小鼠入手，分离纯化Ⅱ型肺泡上皮细胞，拟寻找鉴定出肺泡干细胞的标志物及诱导其分化的相关信号通路，其研究结果不仅能运用于研究肺发育中重要的生理机制，同时也能用于肺再生医学相关应用研究，具有重要的基础研究与临床应用价值。
原代肺泡细胞体外增殖慢，细胞量获取有限。同时体外长期培养细胞易发生自行分化，反复冻存复苏后也会影响其增殖活性。细胞永生化技术目前已经十分成熟，应用于各个细胞，为成功构建细胞系的有效方法。永生化后细胞增殖活性大大提高，使扩增变得相对较容易，而且永生化后的细胞具有相对稳定的生物学特性，对于该细胞后续研究提供高效而稳定的重要手段。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种可逆性永生化Ⅱ型肺泡上皮细胞及其构建与应用，为研究肺发育中重要的生理机制，以及肺再生医学相关应用研究提供新的细胞模型及技术手段。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种可逆性永生化肺泡细胞系imPACs的构建方法，包括如下步骤：提取小鼠原代肺泡细胞mPACs，采用携带潮霉素B抗性基因和SV40T基因的SSR#41永生化工具质粒，结合FLP/FRT系统制备表达SV40T基因的逆转录病毒，然后运用所述逆转录病毒感染原代肺泡细胞mPACs，使细胞增值，经潮霉素B进行阳性克隆筛选，获得可逆性永生化肺泡细胞系imPACs。
进一步，所述逆转录病毒通过293PA细胞、pCL-Ampho质粒和SSR41质粒包装而得。
进一步，所述pCL-Ampho质粒和SSR41质粒来源于芝加哥大学医学中心分子肿瘤实验室。
进一步，在抗性筛选过程中，潮霉素B的用量为≥0.5mg/ml，优选为0.5mg/ml。
本发明第二方面提供一种根据第一方面所述的方法构建得到的可逆性永生化肺泡细胞系imPACs。
本发明第三方面提供一种可逆性永生化小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的构建方法，采用流式细胞仪检测第二方面所述的可逆性永生化肺泡细胞系imPACs中ProsurfactantProtein C(pro-SPC)的表达，确定细胞中Ⅱ型肺泡上皮细胞比例，采用磁珠法分选EpCAM+细胞，即得Ⅱ型肺泡上皮细胞imPAC2。
本发明第四方面提供根据第三方面所述的方法构建得到的可逆性永生化小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞imPAC2。
本发明第五方面提供根据第二方面所述的可逆性永生化肺泡细胞系imPACs及根据第四方面所述的可逆性永生化小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞在作为肺相关疾病诊断及治疗用细胞模型中的应用。
本发明第六方面提供一种稳定低表达β-catenin的imPAC2细胞株(imPAC2-Si-β-catenin)，通过质粒pSEB-BSG-simCtnnb1ABC，包装逆转录病毒感染如第四方面所述的Ⅱ型肺泡上皮细胞imPAC2而得。
本发明第七方面提供根据第四方面所述的可逆性永生化小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞在作为肺纤维化研究用细胞模型中的应用，采用过表达TGF-β1的腺病毒AdR-TGF-β1诱导如第四方面所述的Ⅱ型肺泡上皮细胞。
本发明第八方面提供一种imPAC2细胞株(imPAC2-KrasmP53)，其构建方法为：采用pSEBI-Kras质粒和pSEBI-p53R273H质粒制备稳定过表达Kras片段和p53R273H突变片段的逆转录病毒，感染如第四方面所述的Ⅱ型肺泡上皮细胞imPAC2，经BSD药物筛选抗BSD的稳定细胞株，获得所述imPAC2细胞株(imPAC2-KrasmP53)。
本发明第九方面提供根据第八方面所述的imPAC2-KrasmP53细胞株在作为Kras和P53突变体所致肺癌研究用细胞模型中的应用。
如上所述，本发明的可逆性永生化Ⅱ型肺泡上皮细胞及其构建与应用，具有以下有益效果：
1.本发明通过SSR#41永生化工具质粒和逆转录病毒系统成功构建了可逆性永生化肺泡细胞株imPACs。imPACs相比原代肺泡细胞mPACs，表现出较强的增殖活性和生长能力，且不具有成瘤风险。同时，本发明构建的永生化肺泡细胞imPACs基本保持了肺泡细胞的特性。
2.本发明通过可逆性永生化肺泡细胞株imPACs分选出了可逆性永生化小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞，并成功建立了类器官培养体系，说明分选出的Ⅱ型肺泡细胞imPAC2更好的代表了肺泡干细胞，更具有研究潜力，能更高效的了解Ⅱ型肺泡细胞的功能和作用机制。
3.本发明通过体内外腺病毒Ad-TGF-β1干预，表明imPAC2细胞在TGF-β1诱导下具有向纤维化分化的潜能。同时，还构建了pSEBI-Kras和pSEBI-p53R273H稳定过表达Kras及R273H位点突变p53的imPAC2细胞系(imPAC2-KrasmP53)，过表达Kras和p53R273H构建的imPAC2-KrasmP53细胞株具有成瘤潜能，说明所建imPAC2细胞系为肺纤维化、肿瘤等相关研究提供了良好的细胞工具。
附图说明
图1-1为实施例1中小鼠肺泡原代细胞形态。
图1-2为实施例1中永生化质粒SSR#41。
图1-3为实施例1中mPACs和imPACs细胞形态。
图1-4为实施例1中结晶紫染色检测mPACs和imPACs增殖活力。
图1-5为实施例1中Ⅰ型肺泡上皮细胞标志物Aqp5、Pdpn及Ager在mPACs和imPACs中mRNA的表达。
图1-6为实施例1中Ⅱ型肺泡上皮细胞标志物SftpC、Mucl、Ctsh及Nkx2.1在mPACs和imPACs中mRNA的表达。
图1-7为实施例1中Ⅱ型肺泡上皮细胞标志物SftpB、SftpD、Abca3、Lamp1及Lamp2在mPACs和imPACs中mRNA的表达。
图1-8为实施例1中重组酶FLP诱导imPACs细胞形态变化。
图1-9为实施例1中Ad-FLP成功敲除SV40T基因片段。
图1-10为实施例1中imPACs裸鼠皮下不具成瘤风险。
图2-1为实施例2中流式检测分选的Ⅱ型肺泡上皮细胞imPAC2。
图2-2为实施例2中Ⅱ型肺泡上皮细胞特异性标志物SftpA，SftpB，SftpC，SftpD，Abca3和Nkx2.1在imPACs及imPAC2细胞中的mRNA表达。
图2-3为实施例2中标志物SftpA1、SftpB、SftpC、SftpD和PCNA在imPAC2细胞中的蛋白水平表达。
图2-4为实施例2中7天、14天、21天imPACs和imPAC2细胞类器官培养形态。
图2-5为实施例2中21天imPAC2细胞“类器官”冰冻切片SftpC蛋白高表达。
图3-1为实施例3中体外TGF-β1诱导imPAC2细胞纤维化损伤及功能紊乱。
图3-2为实施例3中体内TGF-β1诱导imPAC2细胞纤维化损伤及功能紊乱。
图3-3为实施例3中Ad TGF-β1干预imPAC2细胞体内30天包块H&E观察。
图3-4为实施例3中β-Catenin干扰质粒pSEB-BSG-simCtnnb1ABC。
图3-5为实施例3中BSD筛选后imPAC2-Si-β-Catenin细胞形态观察。
图3-6为实施例3中β-catenin基因在imPAC2-Si-β-Catenin细胞表达水平。
图3-7为实施例3中Ⅱ型肺泡上皮细胞特异性标志物SftpA1、B、C、D、Nkx2.1和Abca3在imPAC2和imPAC2-Si-β-Catenin细胞中mRNA表达。
图3-8为实施例3中裸鼠皮下imPAC2细胞包块30天检测SftpC、SftpD、Nkx2.1mRNA表达水平。
图3-9为实施例3中DiI细胞荧光探针体内追踪观察imPAC2和imPAC2-Si-β-Catenin细胞。
图3-10为实施例3中体内体外Ki67mRNA表达水平检测反应imPAC2和imPAC2-Si-β-Catenin细胞增殖能力。
图3-11为实施例3中Ki67检测imPAC2和imPAC2-Si-β-Catenin细胞体内增殖能力。
图3-12为实施例3中BSD筛选imPAC2-KrasmP53细胞株前后细胞形态。
图3-13为实施例1中Kras基因和P53基因在imPAC2和imPAC2-KrasmP53中mRNA表达水平。
图3-14为实施例1中imPAC2和imPAC2-KrasmP53细胞裸鼠皮下包块30天H&E染色。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
本实验通过小鼠肺泡原代细胞提取培养，观察其形态，并检测其增殖活性及肺泡相关标志物的表达，然后用SSR#41永生化工具质粒和FLP/FRT系统构建可逆性永生化小鼠肺泡细胞，对其功能特性进行鉴定，并与原代肺泡细胞进行比较。
1材料
1.1主要试剂
DMEM高糖培养基、胎牛血清购买于美国Gibco公司，青-链霉素、PEI、分子水(ddH2O)、NucleoZOL购买于美国Invitrogen公司，潮霉素B、DMSO、细胞培养瓶购买于美国Thermo Fisher Scientific公司，SSR41质粒、pCL-Ampho质粒购买于芝加哥大学医学中心分子肿瘤实验室，PC-8(酚抽提试剂、PBS、无水乙醇、甲醛、Blasticidin(BSD)购买于美国Thermo Fisher Scientific公司，引物于美国IDT公司合成，琼脂糖购买于美国Sigma公司，D-Lueiferin购买于美国GBT Gold Biotechnology公司，细胞培养皿购买于美国Corning公司，SYBR Taq购买于美国Bio-Bad公司，MMLV逆转录酶购买于美国New England Biolabs公司。
1.2主要试剂配制
(1)完全DMEM培养基过滤配制：称取相应比例的DMEM粉末，溶与无菌双蒸水中，放入磁珠搅拌直到澄清。使用时500ml培养基加入10％或者2％胎牛小牛混合血清，再加入100ug/ml青霉素和链霉素。
(2)PBS试剂配制：称取相应比例的盐粉溶解于相应量的双蒸水中，放入磁珠搅拌直到澄清，高压灭菌后4℃保存待用。
(3)质粒提取碱裂解法试剂配制：BDI：葡萄糖50mM，Tris-HCL(PH＝8)25mM，EDTA(PH＝8)10mM；BDⅡ：ddH2O 88ml，10％SDS 10ml，NaOH 2ml；BDⅢ：ddH2O28.5ml，5M乙酸钾60ml，冰醋酸11.5ml。
1.4细胞株准备
293PA细胞株用于逆转录病毒包装，HEK293细胞株用于腺病毒的包装与扩增，肺癌细胞株PC9用于对照，三种细胞株均来自于芝加哥大学医学中心分子肿瘤实验室。
2、实验方法
2.1、肺泡细胞原代提取
(1)脱颈处死5-10只CD1新生小鼠。(2)迅速取出新生小鼠的肺组织，为保护肺部结构，沿着气管将整个肺拉出，放置冰上的培养皿中(培养皿中加入混有青霉素/链霉素的PBS液体)。(3)在显微镜下尽量剔除气管，支气管，剪下肺叶，用手术剪将肺叶剪成小块。(4)将小块肺组织分别放入数个35mm培养皿中，加入适量胰酶淹没组织，37℃培养箱放置20分钟。(5)取出胰酶消化后的培养皿，收集组织胰酶混合液体，离心收集肺叶组织，PBS冲洗一次。(6)PBS冲洗后，转移至盛有2ml 10％DMEM完全培养基的100mm培养皿中，放入37℃培养箱中。(7)30分钟后，待肺叶组织稍微贴底后，补加完全培养基至6ml，放回培养箱中。(8)根据爬出细胞多少置换培养基，待细胞爬出70-80％时，收集细胞，继续10％DMEM，37℃培养箱培养。
2.2细胞培养
肺泡原代细胞mPACs、病毒包装细胞293PA、扩增病毒细胞HEK293均用10％DMEM培养(含有500X的青霉素和链霉素)，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养。根据细胞生长速度置换培养基和细胞传代。
2.3质粒提取
(1)取2-2ml菌液加入灭菌后的2ml EP管中，高速离心机离心后弃上清，加入200ulBDⅠ，振动数分钟重悬底部细菌沉淀。(如果提取4ml需重复离心步骤后再加入BDⅠ)(2)加入200ulBDⅡ，轻微摇晃，上下颠倒EP管数次(无需振动)裂解细胞。(3)加入200ul碱性蛋白酶BDⅢ，上下颠倒混匀数次，可见白色黏稠絮状物产生，高速离心(12000rpm)2-3分钟。(4)移液器将上清移至灭菌后的1.5EP管中，加入等体积的异丙醇，振动混匀后放入高速离心机中14000rpm离心5-10分钟。(5)可见白色沉淀于EP管底部，倒掉上清，加入500-1ml70％乙醇，14000rpm离心2分钟。(6)重复第五步。(7)倒掉上清，放置晾干2分钟，根据白色沉淀大小加入5-30ul ddH2O溶解沉淀。
2.4制备逆转录病毒液
(1)准备5-10盘病毒包装细胞293PA，100mm培养皿，每个培养皿培养50％-60％密度细胞。(2)转染混合液准备：预先准备好的已经纯化后的pCL-Ampho质粒15ul和SSR41质粒(均为1ug/ul)15ul，PEI(3ug/ul)40ul，混入450ul无血清培养基DMEM中。(3)轻轻吹打几次，放置室温20分钟。(4)细胞贴壁6-8小时候，准备好转染试剂后，将5-10盘293PA细胞换成无血清培养基，每盘培养皿加入5ml无血清培养基。20分钟到后，小心倾斜培养皿缓慢加入转染混合液。(5)放回37℃培养箱，2两时候观察细胞转染后的变化，4-6小时更换为10％完全培养基。(6)分别在36小时，48小时，60小时，72小时收取5-10盘细胞的培养基，即为逆转录病毒液。(7)0.45um过滤器过滤收集好的病毒上清液，放置与4℃冰箱备用。
2.5构建可逆转的永生化肺泡细胞株
(1)预先准备好的原代肺泡细胞，接种于T25培养器中。(2)细胞贴壁后，向T25中加入3ml已经过滤准备好的病毒上清液，4-6小时更换一次病毒液，一共更换四次病毒液。(3)最后一次更换病毒液后，感染4-6小时后更换为10％完全培养基，放入37℃培养箱中。(4)四次感染原代肺泡细胞完成后，维持细胞生长，根据细胞密度状态2-3天1：1或者1：2传代，大概维持一周时间。(5)待病毒感染基因整合，细胞状态改善后，加入0.5mg/ml潮霉素B(原代细胞致死最低量)对细胞进行筛选，加药后维持2-3天，存活的即为第一批阳性细胞。(6)再次加入0.5mg/ml潮霉素B对肺泡细胞进行再次筛选，此次存活的细胞即为永生化的肺泡细胞株。
2.6细胞结晶紫染色
(1)将10cm培养皿40％-50％密度的细胞铺到5个35mm大小的培养皿中，尽量保持每个35mm培养皿中的细胞密度一致。(2)细胞贴壁以后，更换为2％FBS的DMEM培养基。(3)分别在更换培养基后的第一天到第五天每天进行染色，每次一个培养皿。(4)PBS冲洗培养皿一次，加入1-2ml预先过滤好的结晶紫，染色15-20分钟后倒掉结晶紫，并轻轻冲洗走多余的结晶紫(避免冲走细胞，可以将培养皿泡在自来水中即可)。(5)清洗完毕后，晾干培养皿，待5个培养皿均染色后，扫描保存数据。
2.7提取总RNA和逆转录
(1)用60mmdish培养待提取总RNA的细胞，贴壁过夜后，用PBS洗两次，加入500ulNucleoZOL,静置在冰上15分钟。(2)吹打数次，更好的裂解细胞后转移至无菌干净的1.7mlEP管中，加入200ul RNA分子水，振荡混合均匀，14000rpm离心12-15分钟。(3)吸出500ul上清至干净的新EP管中，加入等体积的异丙醇，振荡混匀，12000rpm离心12-15分钟。(4)弃掉上清，可见白色沉淀，加入800ul 85％乙醇，振动混匀清洗两次，12000rpm离心3分钟。(5)倒掉乙醇后，加入适量的分子水使RNA溶于水中。(6)取2ul RNA用于逆转录，首先预混Hexamer和RNA：RNA(2ul用水补齐10ul反应)10ul，Hexamer 2ul，总体积12ul。(7)逆转录Mix制备(总反应)：RNA+Hexamer 12ul，10xbuffer 3ul，dNTP 3ul，ddH2O 12ul，MMLV(逆转录酶)0.4ul，总体积30ul。(8)Mix制备好后，放入普通PCR仪器中，编好程序为：37℃：60分钟；92℃：1分钟；12℃：∞。cDNA放置于-80℃冰箱保存。
2.8荧光定量PCR检测
(1)引物序列列表
表1-1qPCR引物列表
Gene Forward Reverse
SV40T AGAATGGATGGCTGGAGTTGCT AGCTCAAAGTTCAGCCTGTCCA
Aqp5 GACCTGTGAGTGGTGGCC TGGCGCCAACCAGTACAG
Ager GGTCACAGAAACCGGCGA GGGGCCTTCCTCTCCTCA
Pdpn AAATGCCGACTGTGCCGA GGGAAGAGCTCGGGAGGA
SftpA1 TGCGACCATGACCCACAC GTGGGCAGAGCACAGGAG
SftpB GACAAGCCTCAGCCTGCA GGGGGAGCCAGAAACCAC
SftpC GCTGTGAGCACCCTGTGT TTTCTGGGCAGGAGCAGC
SftpD CCCCTGGTGTGCAAGGAG GGAAGCCCGCTTTCACCT
Abca3 GTGCTGCCAAACCACTGC CACAAACTTGCCCACGCC
Ctsh GCCCCTACCCTTCCTCCA GGGCACAATCCACCAGCT
Lamp-1 GGAGTCACGCCGGCTATC GTGCCTCCCTTCCACACC
Lamp-2 CTGGCTACCATGGGGCTG TGAGGTTGACAGCTGCCG
Muc1 GCCACCAGTCCAGACCAC GCACCGAGGAGCCATTGT
Nkx2.1 CATGGGCAAGGGTCAGGG GCCCTCCATGCCCACTTT
(2)荧光定量PCR
a)引物准备：将上下游引物(1ug/ul)各取5ul加入到490ul ddH2O中，准备为工作浓度10ng/ul。b)cDNA准备：将逆转录后所得的cDNA取5ul，加入195ul ddH2O，稀释40倍待用。c)反应体系：SYBR Green Mix，2.5ul，cDNA，2.5ul，上下游引物，2.5ul，总体积为7.5ul。d)PCR反应程序：95℃10min，95℃15s，65℃10s，4个循环，每个循环降低3℃；95℃20s，55℃10s，70℃1s，共40个循环。
2.9免疫荧光染色
(1)将细胞接种于48孔板中，密度40％-50％，贴壁24小时。(2)吸引器吸掉培养基，PBS轻轻洗两遍，每次3分钟，注意不要吹起细胞。然后，每孔加入200ul甲醇(或者4％多聚甲醛)固定10分钟。(3)吸掉甲醇后，用PBS清洗三遍，每次5分钟。(4)室温下，羊血清封闭细胞(1：20PBS稀释)1小时。(5)吸掉封闭液，加入稀释好的(根据说明1：100，1：200稀释)相对应小鼠一抗(SP-C、PCNA、SP-B、SP-D等)，阴性对照孔加入不含抗体的PBS，摇床上慢摇30分钟后，放置4℃孵育过夜。(6)吸掉一抗后，PBS清洗5次，每次3-5分钟。(7)在较暗的环境下，吸走PBS，加入1：500稀释好的抗鼠IgG二抗，放置摇床上慢慢摇动孵育1小时。(8)吸掉二抗，PBS清洗3次，每次3-5分钟。(9)加入1：1000稀释的DAPI染细胞核，室温下孵育3-5分钟。(10)PBS清洗2次后，荧光显微镜观察细胞染色，拍照记录。
2.10裸鼠皮下细胞注射Xenogen成像
(1)表达荧光素酶基因细胞株构建：运用腺病毒Ad-Fluc感染永生化肺泡细胞株，得到表达荧光素酶基因的细胞株。(2)细胞准备：准备10盘imPACs细胞和10盘肺癌PC9细胞，感染Ad-Fluc后，36小时收集细胞，离心，PBS重悬放在冰上备用(每个点用50-100ulPBS重悬)。(3)裸鼠皮下注射准备：取出裸鼠，气雾麻醉后，酒精消毒皮肤，然后用0.5ml注射器吸出50-100ul细胞，打入裸鼠皮下，看到皮丘形成，标记。(4)Xenogen成像：注射后第三天第十天成像，取出裸鼠，观察皮丘后，放入成像麻醉容器中麻醉裸鼠，待麻醉后，给裸鼠腹腔注射成像底物D-Luciferin 100ul，等待药物反应5-10分钟后，放入成像仪中成像，运用LivingImage分析结果。
2.11统计学分析
所有实验计量数据采用均值±标准差(x-±S)表示，运用SPSS19.0进行统计分析，组间两两比较采用t检验，p＜0.05认为差异具有统计学意义。
3、实验结果
3.1、原代提取小鼠肺泡细胞及建立永生化细胞系imPACs
3.1.1小鼠肺泡细胞原代提取
选用5-10只新生CD1小鼠，手术分离出整个肺组织，显微镜下尽量清除气管和支气管，手术剪处理组织后，胰酶消化离心后培养箱培养。如图1-1，可见组织培养24h，少量细胞从组织爬出，爬出细胞大部分存活，培养48h后，大量细胞爬出，可见细胞形状饱满，呈立方形，上皮样细胞居多，72h后，当细胞爬满培养皿时，胰酶消化离心收集原代mPACs细胞重新接种细胞于培养皿中，传代后的第一代P1细胞形态稍有变化，但仍然以上皮样细胞为主，少量细胞死亡。P2、P3代，细胞死亡数目增加，增殖能力明显下降，细胞形状改变，核变大，处于凋亡前状态，第四代时原代肺泡细胞mPACs几乎丧失增殖活性，无法存活。
3.1.2可逆转永生化细胞系imPACs构建
本课题选用逆转录病毒载体，表达SV40T基因来永生化肺泡原代细胞mPACs，运用表达SV40T基因的逆转录病毒去感染肺组织原代细胞，影响改变细胞分化特性，从而使细胞在37℃培养环境下大量增殖，以获得永生化的肺泡细胞。本实验运用自主构建的永生化工具质粒SSR#41(图1-2)，该质粒同时携带了潮霉素B抗性基因和SV40T基因，携带潮霉素B抗性基因主要方便于对永生化后阳性克隆的筛选。运用表达SV40T基因的逆转录病毒系统，收集4个时间点的病毒液去感染肺泡原代细胞，然后用潮霉素B进行阳性克隆筛选，筛选出的阳性克隆即为成功建立的可逆转永生化肺泡细胞株imPACs。如图1-3，永生化的肺泡细胞imPACs中呈立方形或多边形细胞居多，也能看见一些形状扁平的细胞，岛状生长，在37℃培养环境下，细胞生长增殖旺盛，能够维持自我更新能力及分裂复制能力。然而肺组织原代细胞mPACs形态与永生化的肺泡细胞imPACs不同，3代后便不具备增殖和自我更新能力，无法存活。
3.2imPACs细胞增殖能力检测以及特异性标志物的表达细胞增殖能力检测以及特异性标志物的表达
3.2.1结晶紫染色读数检测肺泡细胞增殖能力
将mPACs和imPACs按相同的细胞密度接种到35mm的培养皿中，分别在第1-5天进行结晶紫染色检测细胞的增殖能力。结晶紫染色结果显示出(图1-4)，在同等起始细胞密度的情况下，imPACs显示出了较强的细胞增殖能力。
3.2.2肺泡细胞特异性标志物mRNA水平表达
提取imPACs和mPACs细胞的总RNA，RT-PCR检测结果显示(图1-5)，Ⅰ型肺泡细胞特异性标志物Ager，Pdpn，Aqp5在mPACs和imPACs中均有表达，与mPACs细胞相比，Ager基因的表达在imPACs中极显著增加，Pdpn基因的表达显著增加，差异有统计学意义(**P＜0.01，*P＜0.05)。
同等密度接种imPACs和mPACs细胞，待细胞贴壁培养过夜后，提取细胞的总RNA，检测标志物mRNA水平的表达，如图所示(图1-6)，肺泡Ⅱ型细胞分化早期相关标志物在均有表达，Ctsh和Nkx2.1在imPACs和mPACs细胞中的表达量无明显差异，但在imPACs细胞中SftpC的表达明显增高，Mucl的表达极显著增高，差异具有统计学意义(**P＜0.01，*P＜0.05)。SftpB(Surfactant protein B，SP-B)和SftpD(Surfactant protein D，SP-D)也为肺表面活性蛋白，为肺泡Ⅱ型细胞成熟晚期的标志物之一，成熟晚期的标志物还包括Abca3(ATP-binding cassette,sub-family A(ABC1),member 3)、Lamp-1(Lysosomal-associatedmembrane protein 1)和Lamp-2(Lysosomal-associated membrane protein 2)等。同等密度接种imPACs和mPACs细胞，待细胞贴壁培养过夜后，提取细胞的总RNA，检测标志物mRNA水平的表达，如图1-7Q-PCR结果所示，Ⅱ型肺泡细胞分化成熟晚期相关特异性标志物SftpB、SftpD、Abca3、Lamp1、Lamp2在imPACs和mPACs细胞中均有表达，无明显差异。
3.3imPACs细胞去永生化建立及鉴定
FLP/FRT系统是由一个重组酶和一段特殊的DNA序列组成。在SV40T基因片段的两端插入了FRT位点，可使永生化肺泡细胞imPACs逆转，降低其增殖能力并且逐渐丧失，促进细胞分化。检测SV40T的表达水平来检测敲除效率及逆转效率。运用腺病毒Ad-GFP和Ad-FLP分别感染imPACs细胞，感染24小时后观察感染效率，如图所示(图1-8)，24小时后，GFP和FLP的感染效率均为40％左右，FLP感染后的imPACs细胞与GFP感染后的imPACs细胞相比，FLP组细胞生长速度明显减低。通过RT-PCR检测SV40T表达证明了在腺病毒FLP感染下，成功敲除了SV40T基因片段(图1-9)，SV40T基因在Ad-FLP组的表达明显低于Ad-GFP组，差异具有统计学意义(**P＜0.01)。
3.4imPACs细胞裸鼠皮下成瘤能力鉴定
imPACs永生化细胞株是通过SV40T系统构建的，SV40T基因虽然能增加细胞的增殖能力，但同时也提高了细胞在体内成瘤的风险。本实验通过活体成像来检测imPACs是否具有成瘤风险。运用荧光素酶腺病毒(AdFluc)感染细胞，并用肺癌细胞株PC9作为对照细胞株，表达萤火虫荧光素酶基因去检测细胞成瘤性。培养等量细胞，腺病毒感染细胞，感染36小时后注射于裸鼠皮下，注射后第三天和第十天用Xenogen仪器对小鼠进行成像。实验结果显示(图1-10)，注射相等细胞量的情况下，第三天imPACs细胞和PC9细胞Fluc信号强度已经表现出明显差别，PC9的信号强度明显高于imPAC。在第十天时，imPAC细胞Fluc信号已经消失，包块逐渐消失，无成瘤趋势，但PC9细胞仍检测出较强的信号，包块变大，形成明显的肿瘤。
4讨论
肺是一个十分复杂并且功能强大的器官，肺其最主要的气体交换功能发生在肺泡，肺泡主要由两种上皮细胞构成，Ⅰ型肺泡上皮细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞。Ⅰ型肺泡上皮细胞主要功能为气体交换，然而Ⅱ型肺泡上皮细胞则主要分泌肺表面活性物质，防止肺泡塌陷。Ⅱ型肺泡上皮细胞被认为是祖细胞中的一种，其功能的缺失或功能紊乱都可能导致严重的肺部疾病，比如呼吸窘迫综合征，特发性肺纤维化等。因此，了解鉴定肺泡区域祖细胞种系及特性功能是十分重要的，为未来肺癌、肺纤维化以及其他肺损伤相关疾病的早期诊断及预防治疗提供更可靠的依据。肺泡细胞体外增殖能力较差，难以长时间维持培养一直是一个难以攻克的难题。因此，本实验通过SSR#41永生化工具质粒和逆转录病毒系统成功构建可逆转永生化肺泡细胞株imPACs，imPACs相比原代肺泡细胞mPACs，表现出较强的增殖活性和生长能力。Ⅰ型肺泡细胞和Ⅱ型肺泡细胞特异性标志物mRNA水平检测提示，在原代肺泡细胞mPACs和永生化肺泡细胞imPACs中均有不同程度的表达，imPACs细胞中，Ager和Mucl表达极显著增高，SftpC和Pdpn表达也显著增高。这说明永生化肺泡细胞imPACs基本保持了肺泡原代细胞的特性。实验构建的永生化细胞株通过腺病毒Ad-FLP感染细胞株以敲除SV40T基因片段来实现去永生化过程，结果显示永生化肺泡细胞是可逆转的。于此同时本实验还检测了该系统永生化细胞所存在的成瘤风险，结果证实了imPACs细胞并不具有成瘤风险，可进行后续研究。
实施例2
小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞imPAC2分选及鉴定
Ⅱ型肺泡上皮细胞在肺发育特别是肺泡形成中发挥重要作用，是最具潜力的肺内干细胞。肺损伤修复时，Ⅱ型肺泡上皮细胞能自我更新及分化未Ⅰ型肺泡上皮细胞来修复损伤，维持肺泡结构的完整及功能正常。本发明实施例1已对永生化的肺泡细胞进行鉴定，本实施例通过磁珠法分选出Ⅱ型肺泡上皮细胞，通过流式检测细胞纯度，检测增殖活性，表面标志物表达，3D类器官培养等手段对其生物学功能进行鉴定，并与分选前相比较。
1材料
1.1主要试剂
分子水(ddH2O)、NucleoZOL、Gelatin(明胶)购买于美国Invitrogen公司，Polybrene(聚凝胺)、Matrigel、EpCAM抗体购买于美国Sigma公司，DMEM培养基、FBS(胎牛血清)购买于美国Gibco公司，潮霉素B、PC-8(酚抽提试剂)、PBS、无水乙醇、甲醇、Trypsin(胰酶)、细胞培养瓶购买于美国Thermo Fisher Scientific公司，引物为美国IDT公司合成，dNTP购买于美国NEB公司，SYBR Taq购买于美国Bio-Bad公司，MMLV逆转录酶购买于美国NewEngland Biolabs公司，D-Lueiferin美国GBT Gold Biotechnology公司，细胞培养皿美国Corning公司，Column buffer、FcR blocking reagent购买于Miltenyi公司，PPCN购买于美国西北大学生物材料实验室。
1.2主要试剂配制
伊红染料液：准备500ml 95％乙醇，称5g伊红染料加入已准备好的乙醇中，避光搅拌混匀。(2)25XTAE电泳液：0.5M EDTA(pH＝8)：200ml，冰醋酸：114.2ml，冰醋酸：114.2ml，三氨基甲烷：484g，双蒸水定容(ddH2O)：4L。
2实验方法
2.1流式检测/磁珠分选Ⅱ型肺泡上皮细胞
2.1.1流式细胞术检测Prosurfactant Protein C
(1)细胞培养12天后，胰酶消化离心3分钟，PBS洗一遍，离心3分钟。(2)加入1ml4％多聚甲醛固定1小时，PBS洗一遍，离心3分钟。(3)在室温下，加入1ml 0.1％TRITON X-100破细胞膜5分钟，PBS洗一遍，离心3分钟。(4)1:100PBS稀释后的pro-SftpC抗体，4℃孵育1-2小时，PBS洗一遍，离心3分钟。(5)加稀释后的二抗，孵育30分钟，PBS洗一遍后，离心弃掉上清，200ulPBS重悬上机。
2.1.1EpCAM+细胞分选
(1)培养细胞12天后，胰酶消化，900rpm离心3分钟。PBS重悬洗一遍，细胞计数，900rpm离心3分钟。(2)column buffer重悬细胞，90ul重悬1X 107细胞，加入FcR blockingreagent 10ul，4℃下，缓慢摇动孵育10分钟。(3)加入EpCAM抗体10ul(1X 107细胞)，4℃下，30分钟缓慢摇动孵育。加入10ml column buffer，300rpm离心15分钟。(4)倾倒掉上清液，继续重复90ul column buffer重悬，10ul链酶亲和素，4℃下，缓慢摇动孵育20分钟。加入10mlcolumn buffer，300rpm离心15分钟。(5)40um滤器放置在LS柱子上，加入5ml columnbuffer冲洗柱子和滤器。(6)2.5ml column buffer重悬细胞，过柱子后，清洗3遍，过滤器，流出的液体中收集EpCAM+细胞。取下柱子放在EP管上，加入column buffer，加压活塞推出柱子内残留的液体，即为EpCAM+细胞。
2.2细胞结晶紫染色步骤同实施例1。
2.3细胞总RNA提取步骤同实施例1。
2.4荧光定量PCR检测步骤同前。
(1)引物序列包括表1-1中的SftpA1、SftpB、SftpC、SftpD、Abca3、Nkx2.1，其余引物序列列表见表2-1。
表2-1qPCR引物列表
Gene Forward Reverse
TGF-β1 TTGCTTCAGCTCCACAGAGA TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC
Col1a1 GCTCCTCTTAGGGGCCACT CCACGTCTCACCATTGGGG
CTGF AAGGACCGCACAGCAGTT AACAGGCGCTCCACTCTG
E-Cadherin ACGAGGGCAGTGGTTCTG CATGTCCGCCAGCTTCTT
Vimentin CAGATGCGTGAGATGGAAGA TCCAGCAGCTTCCTGTAGGT
ZO-1 CCCGAGACCTGGACTCCA GTTCGAGGCAGCTGCTCA
α-SMA CTGACAGAGGCACCACTGAA CATCTCCAGAGTCCAGCACA
2.5裸鼠皮下细胞注射Xenogen成像步骤同实施例1。
2.6“类器官”培养
(1)首先接种imPACs和imPAC2细胞于低黏附培养皿中，筛选干性较强的细胞团，收集细胞团后再次进行2次筛选。(2)将3次筛选后具有较强干性的细胞团，胰酶消化后，离心3分钟，PBS冲洗一次，再次接种于正常的培养皿中，培养3-5天，稳定并观察细胞状态。(3)用Ad-GFP感染筛选出的细胞，以便于观察类器官形态及大小。(4)24小时候后，离心收集Ad-GFP感染的细胞，通过培养皿的大小大概估算细胞个数后，稀释细胞，放在冰上备用，用20-50ul Matrigel重悬细胞(大概1000-5000个细胞)后滴加在12孔板中，迅速从冰上放入37℃培养箱中(或者在加热板上滴加，加快Matrigel的凝固)。(5)半小时后，可见Matrigel凝结成透明小点状，加入新鲜10％DMEM进行培养，应缓慢贴壁加入，避免将Matrigel吹起。(6)培养期间观察Matrigel中细胞状态，3-5天可置换新鲜培养基。在类器官培养2-3天后，为避免污染也可2天换液一次。
2.7收集“类器官”冰冻切片
(1)冰冻切片及提前开启制冷1-2小时，设置-22℃。(2)将培养类器官的12孔板取出，吸掉培养基，轻轻靠壁滴加75％乙醇固定1小时。(3)取出冰冻切片机切片底座，包埋剂将底座包埋薄薄一层。(4)固定完成后，吸掉固定液，轻轻转移“类器官”于已覆盖包埋机的冰冻切片底座上。(5)继续加入OCT包埋剂包埋类器官，注意包埋机应全部覆盖类器官，放置1小时至完全凝固。(6)调节4-6um厚度，进行类器官切片。(7)切片后，标记切片，-80℃保存，或立即进行下一步实验。
2.8统计学分析
所有实验计量数据采用均值±标准差(x-±S)表示，运用SPSS19.0进行统计分析，组间两两比较采用t检验，p＜0.05认为差异具有统计学意义。
3实验结果
3.1流式检测/磁珠分选Ⅱ型小鼠肺泡上皮细胞imPAC2
Ⅱ型肺泡上皮细胞在肺上皮细胞中占据着重要地位，具有干细胞功能的Ⅱ型上皮细胞在肺损伤时能够自我更新以及微分化为Ⅰ型肺泡上皮细胞。本实验通过流式检测磁珠分选出小鼠永生化的型肺泡上皮细胞，进行培养并进行进一步研究。如图可见(图2-1)，用磁珠分选法分选出imPAC2。随后用流式检测pro-SPC阳性率＞95％。
3.2Ⅱ型肺泡上皮细胞特异性标志物mRNA水平检测
肺表面活性物质是一种混合物，由90％脂类和10％蛋白类构成，能够降低表面张力，以防止肺泡塌陷。表面活性物质蛋白包括表面活性蛋白A(SftpA)包含两个功能基因A1和A2，表面活性蛋白B(SftpB)、表面活性蛋白C(SftpC)和表面活性蛋白D(SftpD)，其中，SftpA含量最多，占50％-75％。SftpB和SftpC为疏水性小分子，主要功能为调节表面张力，SftpA和SftpD为亲水性大分子，主要功能是参与宿主防御功能。SftpA，SftpB，SftpC，SftpD，Abca3和Nkx2.1均为Ⅱ型肺泡上皮细胞成熟早期，中期，晚期特异性标志物。前面实验已经证实其在mPACs和imPACs细胞中的表达，其次，如图所示(图2-2)，筛选后的imPAC2细胞中，表面活性蛋白A、B、C、Nkx2.1的表达极明显增加，而表面活性蛋白D和Abca3的表达也明显增高，相比起筛选前的imPACs细胞，差异具有统计学意义(**P＜0.01,*P＜0.05)。
3.3Ⅱ型肺泡上皮细胞特异性标志物蛋白水平检测
实验选取肺表面活性物质A、B、C、D进行检测。如图所示(图2-3)，在永生化Ⅱ型肺泡上皮细胞imPAC2中，表面活性蛋白A1、B、C、D均有较强表达，说明imPAC2能较好的呈现肺Ⅱ型细胞的特性。同时，检测增殖细胞核抗原(PCNA)，imPAC2细胞表现出明显的较强的PCNA表达，反映了imPAC2较强的增殖活性。
3.4imPAC2细胞类器官培养及分化潜能初探
3.4.1imPAC2细胞类器官培养初步观察
本实验运用Matrigel基质胶来培养“肺泡样类器官”，实验结果所示(图2-4第7天，第14天，第21天观察可见，在第7天时已经形成了数个细胞团样“类器官”结构(直径大于25um相比imPACs细胞，Ⅱ型肺泡上皮细胞imPAC2来源培养的“类器官”形成数量明显增加，差异有统计学意义(*P＜0.05)，随着培养时间的增加，类器官形成数量停止增加，基本7天后保持一致。观察第14天，“类器官”形状逐渐变大，imPAC2细胞组“类器官”直径达到120um左右，明显大于imPACs细胞所形成的直径50um左右的“类器官”，差异具有统计学意义(**P＜0.01)。21天时，“类器官”逐渐停止生长，大小变化不大，出现类似肺泡样空泡，蜂窝状结构，imPAC2细胞组形成直径200um左右的“类器官”，然而imPACs细胞组形成直径100um左右的“类器官”，两者比较具有统计学差异(**P＜0.01)。
3.4.2imPAC2细胞类器官培养分化潜能初步探讨
21天时，取出imPAC2中直径最大的“类器官球”，75％乙醇固定后，冰冻切片染色观察其功能特性，实验结果提示(图2-5)，可见大量细胞聚集形成圆球形结构，细胞与细胞之间可能为残留的Matrigel，选用Ⅱ型肺泡细胞经典特异性标志物SftpC蛋白检测可见均有较强信号表达。
4讨论
Ⅱ型肺泡上皮细胞在肺发育特别是肺泡形成中发挥重要作用。Ⅱ型肺泡可以促进肺泡和血气屏障形成，维持肺泡的正常发育。本实验成功分选出小鼠永生化的Ⅱ型肺泡上皮细胞imPAC2。imPAC2细胞中立方形上皮细胞居多，聚集性生长。IF检测细胞增殖核抗原PCNA蛋白较强表达也证明了imPAC2细胞具有较强的增殖和更新能力。实验选取部分Ⅱ型肺泡上皮细胞特异性标志物检测可见，相比imPACs细胞株，SftpA，SftpB，SftpC，SftpD，Abca3和Nkx2.1的mRNA表达在imPAC2中明显增高，表面活性蛋白A1、B、C、D蛋白水平表达检测结果也提示在imPAC2中有较强的荧光表达，说明分选出的imPAC2能更好的表达Ⅱ型肺泡上皮细胞的特性，可作为研究Ⅱ型肺泡上皮细胞更好的细胞模型。为进一步证明其功能，在此还进行了“类器官”培养，运用Matrigel提供3D环境对imPACs和imPAC2细胞体外“类器官”培养，观察到，imPACs和imPAC2细胞均能形成大小不一的“类器官小球”(直径＞25um)，在培养7天后，类器官形成数目停止增加。同时，观察到第七天时，imPAC2细胞形成的类器官数量明显高于imPAC细胞，继而观察14天和21天发现，imPAC2细胞形成最大直径达200um的类器官，明显大于imPACs细胞形成的100um类器官。本实验切片IF染色可见SftpC在类器官中表达，本部分实验成功建立了小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞类器官培养体系，但并未加入任何诱导因子，因此未检测Ⅰ型肺泡上皮细胞标志物的表达，该培养体系中是否存在Ⅰ型肺泡上皮细胞的分化，仍需进一步实验验证。因此，本部分的实验结果证实，分选出的Ⅱ型肺泡细胞imPAC2更好的代表了肺泡干细胞，相比混合imPACs细胞株，更具有研究潜力，能更有针对性的了解Ⅱ型肺泡细胞的功能及作用机制，为后续肺相关疾病诊断及治疗的研究提供更可靠有效的细胞模型。
实施例3
体内外实验研究小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞imPAC2诱导分化潜能
1材料
1.1主要试剂
FBS(胎牛血清)、DMEM培养基购买于美国Gibco公司，分子水(ddH2O)、Gelatin(明胶)、NucleoZOL、青/链霉素购买于美国Invitrogen公司，7.5M醋酸铵、PC-8、无水乙醇、Trypsin(胰酶)、甲醇、苏木素、伊红、封片树脂、Glycogen购买于美国Thermo FisherScientific公司，5xPCR Buffer、10xPCR Buffer、dNTP购买于美国NEB公司，SYBR Taq购买于美国Bio-Bad公司，MMLV逆转录酶购买于美国New England Biolabs公司，D-Lueiferin购买于美国GBT Gold Biotechnology公司，PPCN购买于美国西北大学生物材料实验室，抗体购买于美国Santa Cruz公司。
1.2主要试剂配制
(1)裂解缓冲液：10N NAOH：5ul，0.5M EDTA(PH＝8)：0.5ul，ddH2O：244.5ul，总体积：250ul。
(2)伊红染料液：准备500ml 95％乙醇，称5g伊红染料加入已准备好的乙醇中，避光搅拌混匀。
2实验方法
2.1imPAC2-Si-β-Catenin构建筛选过程
(1)提取β-catenin干扰质粒pSEB BSG simCtnnb1ABC并纯化，具体详细质粒提取和纯化步骤请见实施例1实验方法。(2)制备稳定干扰的逆转录病毒，具体详细的制备方法及步骤请见实施例1实验方法。(3)准备10cm培养皿培养的imPAC2细胞，贴壁过夜后，加入病毒液感染4次，4-6小时更换一次病毒液。(4)感染完毕后的细胞，传代培养24小时后加入BSD(0.5mg/ml)，筛选稳定细胞株，筛选时间大概5-7天。(5)筛选出的细胞即为成功构建的稳定干扰细胞株，命名为imPAC2-Si-β-Catenin。
2.2imPAC2-KrasmP53构建筛选过程
(1)分别提取构建好的pSEBI Kras和pSEBI p53R 273H质粒并纯化备用(该质粒由芝加哥大学医学中心分子肿瘤实验室自主构建)，具体详细质粒提取和纯化步骤请见实施例1实验方法。(2)分别制备稳定过表达Kras片段和p53R 273H突变片段的逆转录病毒，具体详细的制备方法及步骤请见实施例1实验方法。(3)接种imPAC2于T25培养瓶中，贴壁过夜后，交替加入收集好的kras病毒液和p53R273H病毒液，总共感染8次，4h-6h更换一次病毒液。(4)8次感染完后，更换新鲜培养基，传代培养48小时，稳定细胞状态后即可加入BSD药物筛选抗BSD(0.5mg/ml)的稳定细胞株，筛选时间大概5-7天。(5)筛选出的细胞即为成功构建的稳定细胞株，命名为imPAC2-KrasmP53。
2.3提取总RNA和逆转录步骤同实施例1。
2.4荧光定量PCR检测步骤同实施例1。
(1)引物序列包括表1-1中的SftpA1、SftpB、SftpC、SftpD、Abca3、Nkx2.1，其余引物序列列表见表3-1。
表3-1qPCR引物列表
Gene Forward Reverse
β-catenin GAGCCTGCCATCTGTGCT TGGTGGGTGCAGGAGTTT
Ki67 TGTCAGCAAGAGGCCACG GGTCGCCTTGGTGAGCTT
Kras TGTGGTAGTTGGAGCTGGTG TGACCTGCTGTGTCGAGAAT
P53 GCAGGGTGTCACGCTTCT CATCCTGGGGCAGCAACA
2.5冰冻切片
(1)冰冻切片及提前开启制冷1-2小时，设置-22℃。(2)-80℃取出固定好的组织块，放在冰冻切片机切片底座中间，OCT包埋剂包埋组织，注意包埋机应全部覆盖组织，放置1小时至完全凝固。(3)将底座插入且头上，首先调节20-50um厚度，直至看到组织。(4)再次调节切片厚度4-6um(组织易碎时可适当调节为8-10um)。(5)快速切片后，标记切片，-80℃保存，或立即进行下一步实验。
2.6H&E染色
(1)处死裸鼠，取出皮下包块，泡入放有PBS的培养皿中，PBS冲洗两遍，放入4％多聚甲醛中侵泡固定过夜(24小时)。(2)取出固定好后的组织快，放入冰冻切片底座上，同组织冰冻切片OCT包埋剂进行包埋，30分钟至1小时后可切片，切片可放于-80℃保存。(3)取出切片，水化切片，向切片上滴上少量PBS。(4)倾倒掉多余的ddH2O，滴加苏木素于组织上，染色3分钟，放入干净自来水中缓慢冲洗，注意防止组织脱片。(5)取出切片，滴加氨水反蓝，10s后立马泡入盛有干净自来水的容器中。(6)10分钟后取出，滴加伊红，染色1分钟，缓慢冲洗切片。(7)盖玻片封片后放在通风处待切片充分干燥后，可显微镜下观察拍照记录。
2.7组织免疫荧光染色
(1)将冰冻切片机切好的切片放在暗盒上，PBS水化1分钟。(2)吸引器吸掉多余的PBS，室温下，羊血清封闭组织(1：20PBS稀释)1小时。(3)吸掉封闭液，加入稀释好的(根据说明1：50，1：100稀释)相对应小鼠一抗，阴性对照组织滴加PBS，防止组织干燥，轻轻放置于4℃孵育过夜(暗盒中加入适当自来水，放置切片变干)。(4)轻轻吸掉一抗后，轻轻用PBS润洗5次，每次5分钟。(5)在较暗的环境下，吸走PBS，加入1：500稀释好的抗鼠IgG二抗，盖上暗盒盖子，孵育40分钟。(6)吸掉二抗后，PBS清洗3次，每次5分钟。(7)滴加1：1000稀释的DAPI染细胞核，室温下孵育10分钟。(8)PBS清洗3次后，树脂封片后，荧光显微镜观察并记录。
2.8统计学分析
所有实验计量数据采用均值±标准差(x-±S)表示，运用SPSS19.0进行统计分析，组间两两比较采用t检验，p＜0.05认为差异具有统计学意义。
3实验结果
3.1TGF-β1诱导imPAC2细胞的纤维化分化潜能
3.1.1体外TGF-β1诱导imPAC2细胞的纤维化损伤及功能紊乱
本实验运用腺病毒AdR-TGF-β1感染Ⅱ型肺泡上皮细胞imPAC2，72小时后，提取细胞RNA，RT-PCR检测相关细胞因子mRNA水平表达。结果如图所示(图3-1)，TGF-β1干预后，与对照组相比较，imPAC2细胞的TGF-β1表达量增高极明显(**P＜0.01)。AdR-TGF-β1诱导下，上皮型钙黏附蛋白(E-cadherin)和紧密连接蛋白(ZO-1)的表达明显低于RFP对照组(*P＜0.05)。然后，实验检测到上皮细胞间充质转化相关标志物vimentin和α-SMA的表达水平在TGF-β1干预下明显增加(**P＜0.01，*P＜0.05)。AdR-TGF-β1感染组，Col1a1的表达量也明显增加，CTGF表达极明显上调，差异有统计学意义(**P＜0.01，*P＜0.05)。
3.1.2体内TGF-β1诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞的纤维化损伤及功能紊乱
体外实验提示TGF-β1诱导imPAC2细胞纤维化相关标志物上调，可能引起纤维化损伤及功能紊乱，本实验通过PPCNg有机材料进行体内长时间观察再次验证，同样用腺病毒Ad-TGF-β1感染imPAC2。如图3-2，相比正常对照组imPAC2，TGF-β1干预组组，TGF-β1、CTGF以及α-SMA的表达量增高极明显，然而上皮型钙黏附蛋白E-cadherin下调极明显(**P＜0.01)。TGF-β1干预组Col1a1、vimentin的表达明显增高，ZO-1则明显降低，差异有统计学意义(*P＜0.05)。
3.1.3TGF-β1诱导imPAC2细胞纤维化体内包块组织学观察
准备同等量密度的10盘100cm大小的imPAC2细胞，取5盘细胞加入腺病毒Ad-TGF-β1病毒，感染效率为50％左右，36小时后，分开收集细胞，PPCNg重悬细胞，裸鼠皮下注射(50-80ul一个点)，30天后收取包块，4％多聚甲醛固定后包埋切片，H&E染色可见(3-3)，相比正常对照组imPAC2，TGF-β1病毒干预组，细胞间空隙减少，基质增加，细胞排列紧密，增殖更旺盛。
3.2Wnt信号通路诱导imPAC2细胞分化及机制探讨
3.2.1β-Catenin稳定干扰细胞株imPAC2-Si-β-Catenin质粒构建及细胞筛选
本实验首先通过构建pMOK质粒与pSEBBSG质粒作为骨架，插入三个干扰片段，分别为A/B/C，最终得到包含三个干扰片段的质粒pSEBBSGsimCtnnb1ABC(如图3-4)。然后进行逆转录病毒包装以达到稳定干扰βcatenin的效果。因为质粒上同时加入了BSDBlasticidin)抗性基因，有利于稳定干扰细胞株的筛选。通过两轮筛选后，存活率达到80％左右，筛选出的细胞命名为imPAC2SiβCatenin，图3-5可见筛选出的细胞从形态学上改变不大，细胞呈长立方形居多。
3.2.2imPAC2-Si-β-Catenin细胞β-CateninmRNA水平检测
同等细胞量的前提下，收集细胞mRNA,RTPCR检测βcatenin在mRNA水平的表达情况，如图3-6可见，干扰后的细胞株imPAC2siβcatenin与imPAC2相比较，βcatenin表达量明显降低，差异有统计学意义(**P＜0.01)。
3.2.3Ⅱ型肺泡上皮细胞特异性标志物在imPAC2和imPAC2-Si-β-Catenin细胞中mRNA水平检测
接种同等细胞量，贴壁后2％培养基37℃培养箱过夜，RNA提取，cDNA逆转，运用RTPCR方法对选取的型肺泡上皮细胞特异性标志物SftpA1、SftpB、SftpC、SftpD、Nkx2.1及Abca3进行检测，结果如图所示(图3-7)，干扰βcatenin表达下调后，与imPAC2对照组相比较，SftpA1、SftpB、SftpC、Nkx2.1及Abca3基因的表达量在imPAC2siβcatenin细胞中降低极明显，SftpD基因表达也明显降低，差异有统计学意义(**P＜0.01，*P＜0.05)。
3.2.4DiI细胞荧光探针体内追踪imPAC2和imPAC2-Si-β-Catenin细胞情况
DiI全称为(dioctadecyl3,3,3',3'tetramethylindocarbocyaninePerchlorate)Perchlorate)，是亲脂性膜染料是最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现为橙红色荧光。DiI在进入细胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。被DiI标记的细胞在体外培养的条件下可以存活长达4周，在体内可以长达一年。周，在体内可以长达一年。用DiI标记同等量imPAC2和imPAC2si-β-catenin细胞后，PPCNg重悬细胞，裸鼠皮下注射，追踪观察，30天后收集细胞包块，组织切片后观察到，如图3-9，与imPAC2组相比较，β-catenin干扰组imPAC2-Si-β-Catenin细胞红色荧光消失，仅略略可见数个，大部分细胞死亡，增殖活性明显下降。而且，在imPAC2细胞组细胞红色荧光明显可见，并且细胞圆排列，类似大小不等的肺泡样。
3.2.5体内体外imPAC2和imPAC2-Si-β-Catenin细胞存活增殖情况
DiI细胞荧光探针体内追踪发现下调β-catenin细胞株细胞增殖活力明显下降，本实验对体外体内增殖相关抗原ki67进行检测，首先，PPCNg混合细胞裸鼠皮下注射追踪30天收集细胞包块，然后提取等量细胞总RNA和30天包块的组织总RNA，RT-PCR结果显示(图3-10)，相比imPAC2，mRNA水平增殖相关抗原Ki67的表达在imPAC2-Si-β-Catenin细胞组中明显降低，而且，在组织mRNA中降低更加明显，差异具有统计学意义(*P＜0.05，**P＜0.01)。组织荧光免疫结果显示(图3-11)，结果与mRNA水平一致，imPAC2-si-β-catenin组Ki67表达强度明显低于imPAC2细胞。
3.3Kras基因及P53突变体诱导imPAC2成瘤潜能及机制探讨
3.3.1imPAC2-KrasmP53细胞株构建筛选
运用过表达质粒pSEBI-Kras和pSEBI-p53R273H，逆转录病毒系统，进行Kras和点突变P53R273H片段的稳定过表达，分别包装kras逆转录病毒和点突变P53R273H逆转录病毒，收集两份病毒液后，4℃保存备用。将imPAC2细胞接种于T25培养瓶中培养，感染8次后更换新鲜培养基，培养过夜后(如图3-12左)，加入BSD(0.3mg/ml)筛选3-5天后，可见70％细胞存活(如图3-12右)。因为质粒是带BSD抗性基因，所以存活耐BSD的细胞则为imPAC2-KrasmP53。
3.3.2imPAC2-KrasmP53细胞Kras基因P53基因mRNA水平检测
用60mm直径大小培养皿培养大致相等密度的imPAC2和imPAC2-KrasmP53细胞，贴壁过夜后，收集细胞，提取总RNA，逆转cDNA后进行Q-PCR检测。实验结果如图可见(图3-13)，相比imPAC2细胞，Kras基因和P53表达在imPAC2-KrasmP53细胞中增加极显著(**P＜0.01)。说明imPAC2-KrasmP53细胞株成功过表达kras基因片段和P53R273H基因片段。
3.3.3imPAC2-KrasmP53细胞体内瘤样包块形态学观察
分别准备5盘100cm大小培养皿70％80％密度的imPAC2和imPAC2细胞培养过夜后，收集细胞，PBS润洗2次后，再分别用PPCNg和PBS重悬，50ul-100ul一个点裸鼠皮下注射。前期实验结果显示imPAC2不具有成瘤风险，皮下包块10天左右消失，所以用PPCNg作为有机支架。实验结果显示(图3-14)，观察第30天，imPAC2-KrasmP53细胞皮下包块仍未消失，黄豆大小，收集包块，切片H&E染色观察到，相比imPAC2对照组，imPAC2-KrasmP53细胞排列紊乱，细胞核核大小不一。
4讨论
肺纤维化是一类病死率较高且目前尚无根治方法的慢性进行性呼吸系统疾病，在儿童中的病死率高达15％。据报道，TGF-β1可诱导肺泡上皮细胞间质转化并导致纤维化的发生。本实验通过通过腺病毒Ad-TGF-β1体内、体外诱导imPAC2细胞，分析其诱导纤维化分化潜能。体外实验结果显示，Ad-TGF-β1干预后，与对照组相比较，E-cadherin和ZO-1的表达明显降低，提示了imPAC2在接受TGF-β1干预后可能出现了功能紊乱。进而检测上皮细胞间充质转化过程中起重要作用的相关标志物vimentin和α-SMA的表达水平，我们发现在TGF-β1干预组vimentin和α-SMA的表达水平明显增加；Col1a1和CTGF的表达量在TGF-β1干预后明显增加，提示了imPAC2在接受TGF-β1干预后细胞发生了上皮-间充质转化。体内实验印证了我们在体外细胞水平的结果。提示在Ad-TGF-β1的诱导下，imPAC2具有向纤维化分化的潜力。因此，我们所建细胞系为后续研究TGF-β1信号在肺纤维化中相关研究提供了更好的种子来源，扩大了所建细胞系的后期应用范围。
Ⅱ型肺泡上皮细胞在肺发育中肺泡的形成中发挥重要作用，维持着肺泡的正常形成过程。肺泡受损时Ⅱ型肺泡上皮细胞扮演肺泡干细胞发挥损伤修复及自我更新的功能。早产儿支气管肺发育不良的主要特征性病理改变为肺发育过程受阻和不成熟肺组织，且不能正常修复，肺部发育欠佳，肺表面活性物质分泌不足等，通过肺泡上皮的损伤程度可以间接了解BPD的严重程度。所以Ⅱ型肺泡上皮细胞作为干细胞，与肺部的正常发育密切相关，且其分泌的肺表面活性物质，功能障碍与BPD发生发展密不可分。Wnt信号通路在多种器官的发育中占据重要地位，在维持肺正常发育以及肺泡形成中更是必不可少的。其中研究较多的为经典的Wnt/β-catenin信号通路。在本发明利用实施例1和2已成功构建imPACs和imPAC2细胞株，针对经典Wnt/β-catenin信号通路，构建了稳定低表达β-catenin细胞株imPAC2-Si-β-catenin。实验结果可见，通过QPCR检测SftpA1、SftpB、SftpC、SftpD、Nkx2.1及Abca3发现，imPAC2-Si-β-catenin与imPAC2相比较，SftpA1、SftpB、SftpC、SftpD、Nkx2.1及Abca3基因的表达量明显降低。可见下调β-catenin后，imPAC2细胞的增殖活性降低，并影响其正常功能表达。最后，本实验运用DiI细胞膜荧光探针体内长时间追踪细胞，30天后观察到imPAC2SiβCatenin细胞组红色荧光消失，细胞大量死亡，增殖活性明显下降。然而在imPAC2细胞存活较多，并且细胞排列有序，类似大小不等的肺泡样。Ki67表达水平也提示imPAC2-Si-β-Catenin细胞严重丧失增殖能力。文献报道激活维持经典的Wnt信号通路维持着AT2的增殖和自我更新，维持着正常功能作用，但阻断Wnt信号通路促进AT2向AT1分化。但本实验并未检测Ⅱ型肺泡上皮细胞标志物的表达，因此需要进一步实验验证。由此可见，Wnt信号通路可以促进imPAC2增殖及分化，说明本实验所建的imPAC2细胞系能较好代表型肺泡上皮细胞的功能特性，为进一步研究及应用前景提供了更可靠的依据和研究来源。
Kras基因突变与肺癌的发生发展有着密切的关系，据报道30％以上的非小细胞肺癌中的腺癌病人都带有Kras基因突变。这个最具挑战性的致癌基因，仍然是分子靶向药物治疗的大难题，至今也未能发现有效的kras基因靶向药物。本实验拟通过对imPAC2细胞进行改造，过表达Kras及点突变P53R273H基因片段来诱导imPAC2细胞瘤样变并且对其发生机制进行探讨。实验结果显示，裸鼠皮下imPAC2-KrasmP53细胞注射30天观察发现，imPAC2-KrasmP53细胞包块不消失，增大为黄豆大小，H&E染色观察到，相比imPAC2，imPAC2-KrasmP53细胞排列紊乱，细胞核核大小不一。由此可见，imPAC2-KrasmP53可以用于后期针对kras突变所致肺癌研究，为研究其发生发展提供更为早期的细胞来源，为疾病药物的筛选提供新的依据。
综上所述，本发明的方法如下：原代提取CD1新生小鼠肺泡细胞(mPACs)，采用FLP/FRT系统制备SV40T逆转录病毒，经潮霉素B(Hygromycin)抗性筛选，获得可逆性永生化肺泡细胞系(imPACs)。随后采用结晶紫染色鉴定细胞的增殖能力、qPCR及免疫荧光检测细胞系中肺泡相关的特异性基因及蛋白以明确所建细胞系是否保持肺泡的相关特性。稳定过表达重组酶FLP于imPACs中，观察细胞增殖能力的改变以及qPCR检测SV40T基因的表达变化，明确所建细胞系是否具有可逆转性；稳定过表达荧光素酶报告基因Fluc于imPACs中，裸鼠皮下接种细胞，活体成像评估细胞皮下成瘤风险。采用流式细胞仪检测imPACs中Prosurfactant Protein C的表达，确定细胞中Ⅱ型肺泡上皮细胞比例，采用磁珠法分选EpCAM+细胞即Ⅱ型肺泡上皮细胞(imPAC2)。qPCR及免疫荧光检测细胞系中Ⅱ型肺泡相关的特异性基因及蛋白的表达。imPACs与imPAC2细胞采取类器官培养，制备4-6微米厚度冰冻切片，免疫荧光检测Ⅱ型肺泡上皮细胞SftpC的表达。构建稳定低表达β-Catenin的imPAC2细胞系(imPAC2-Si-β-Catenin)，构建pSEBI-Kras和pSEBI-p53R273H稳定过表达Kras及R273H位点突变p53的imPAC2细胞系(imPAC2-KrasmP53)。qPCR、免疫荧光、及裸鼠皮下细胞接种探讨TGF-β1诱导imPAC2细胞的纤维化分化潜能、Wnt信号通路诱导imPAC2细胞分化及机制、Kras基因及P53突变体诱导imPAC2成瘤潜能及机制。
本发明的结果如下：
1.成功提取成功提取mPACs并建立并建立imPACs细胞系，与mPACs比较，imPACs细胞显示出较强的增殖能力，且能进行稳定传代。Ⅰ型肺泡细胞特异性标志物Ager，Pdpn，Aqp5在mPACs和imPACs中均有表达。Ⅱ型肺泡细胞早期相关标志物在mPACs和imPACs中均有表达，与mPACs细胞相比，SftpC和Mucl的表达明显增高。Ⅱ型肺泡细胞成熟晚期相关标志物SftpB、SftpD、Abca3、Lamp1、Lamp2在imPACs和mPACs细胞中均有表达，但二者无明显差异。腺病毒FLP感染下，成功敲除SV40T基因片段，明确永生化可逆转性，并且经证实，imPACs裸鼠皮下无成瘤风险。
2.流式检测用磁珠分选出Ⅱ型肺泡上皮细胞即imPAC2。筛选后的imPAC2中，表面活性蛋白A、B、C、D、Nkx2.1和Abca3的mRNA表达明显增加，相比imPACs。说明imPAC2能较好的呈现Ⅱ型肺泡上皮细胞的特性。类器官培养中，第7天时imPAC2形成的类器官个数明显多于imPACs。随着培养时间的增加，第14天，imPAC2细胞组“类器官”直径达到120um左右，明显大于imPACs细胞所形成的直径50um左右的“类器官”。21天时，imPAC2细胞组形成直径200um左右的“类器官”，明显大于imPACs细胞组形成直径100um左右的“类器官”。Ⅱ型肺泡上皮细胞特异性标志物SftpC蛋白检测可见均有较强信号表达。
3.(1)AdR-TGF-β1干预imPAC2，相比RFP对照组，上皮型钙黏附蛋白(E-cadherin)和紧密连接蛋白(ZO-1)的表达明显降低；相反，TGF-β1、vimentin、α-SMA、Col1a1、CTGF的表达明显增加。体内检测Ad-TGF-β1干预imPAC2后相关纤维化标记物mRNA水平表达，结果与体外一致。体内30天包块组织切片结果显示，AdR-TGF-β1干预后呈现出细胞间空隙减少，基质增加，细胞排列紧密，增殖更旺盛。
(2)成功建立稳定低表达β-Catenin的细胞株imPAC2-Si-β-Catenin。qPCR检测mRNA水平，相比imPAC2，SftpA1、SftpB、SftpC、SftpD、Nkx2.1及Abca3基因的表达量在imPAC2-si-β-catenin细胞中明显降低。体内Dil示踪结果提示，与imPAC2组相比较，imPAC2-Si-β-Catenin细胞红色荧光消失，仅略略可见数个，大部分细胞死亡，增殖活性明显下降，而在imPAC2细胞组细胞红色荧光明显可见，并且细胞圆排列，类似大小不等的“肺泡样”。体内外检测Ki67mRNA和蛋白水平表达发现其表达水平在imPAC2-Si-β-Catenin细胞组中明显降低，说明增殖活性大大降低，这与DiI追踪得到的结果一致。
(3)成功构建过表达Kras和p53R273H点突变基因片段的imPAC2-KrasmP53细胞株。裸鼠皮下包块30天观察发现，imPAC2-KrasmP53细胞形成瘤样包块，黄豆大小，H&E染色显示细胞排列紊乱，细胞核核大小不一。本发明的结论如下：
1.本实验通过SSR#41永生化工具质粒和逆转录病毒系统成功构建可逆转永生化肺泡细胞株imPACs，imPACs相比原代肺泡细胞mPACs，表现出较强的增殖活性和生长能力，且不具有成瘤风险。永生化肺泡细胞imPACs基本保持了肺泡细胞的特性。
2.本实验成功分选出小鼠永生化的Ⅱ型肺泡上皮细胞。成功建立类器官培养体系，说明分选出的Ⅱ型肺泡细胞imPAC2更好的代表了肺泡干细胞，更具有研究潜力，能更高效的了解Ⅱ型肺泡细胞的功能和作用机制。
3.本实验通过体内外Ad-TGF-β1干预，提示imPAC2细胞在TGF-β1诱导下具有向纤维化分化的潜能。Wnt信号通路可促进imPAC2细胞增殖及分化。过表达Kras和p53R273H构建的imPAC2-KrasmP53细胞株具有成瘤潜能。说明所建imPAC2细胞系为肺纤维化、肿瘤等相关研究提供了良好的细胞工具。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆医科大学附属儿童医院
<120> 一种可逆性永生化小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞及其构建与应用
<130> PYZYK2216067
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
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<213> Artificial
<220>
<223> Pdpn Forward
<400> 7
aaatgccgac tgtgccga 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Pdpn Reverse
<400> 8
gggaagagct cgggagga 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SftpA1 Forward
<400> 9
tgcgaccatg acccacac 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SftpA1 Reverse
<400> 10
gtgggcagag cacaggag 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SftpB Forward
<400> 11
gacaagcctc agcctgca 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SftpB Reverse
<400> 12
gggggagcca gaaaccac 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SftpC Forward
<400> 13
gctgtgagca ccctgtgt 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SftpC Reverse
<400> 14
tttctgggca ggagcagc 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SftpD Forward
<400> 15
cccctggtgt gcaaggag 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SftpD Reverse
<400> 16
ggaagcccgc tttcacct 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Abca3 Forward
<400> 17
gtgctgccaa accactgc 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Abca3 Reverse
<400> 18
cacaaacttg cccacgcc 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Ctsh Forward
<400> 19
gcccctaccc ttcctcca 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Ctsh Reverse
<400> 20
gggcacaatc caccagct 18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Lamp-1 Forward
<400> 21
ggagtcacgc cggctatc 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Lamp-1 Reverse
<400> 22
gtgcctccct tccacacc 18
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Lamp-2 Forward
<400> 23
ctggctacca tggggctg 18
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Lamp-2 Reverse
<400> 24
tgaggttgac agctgccg 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Muc1 Forward
<400> 25
gccaccagtc cagaccac 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Muc1 Reverse
<400> 26
gcaccgagga gccattgt 18
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Nkx2.1 Forward
<400> 27
catgggcaag ggtcaggg 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Nkx2.1 Reverse
<400> 28
gccctccatg cccacttt 18
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TGF-β1 Forward
<400> 29
ttgcttcagc tccacagaga 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TGF-β1 Reverse
<400> 30
tggttgtaga gggcaaggac 20
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Col1a1 Forward
<400> 31
gctcctctta ggggccact 19
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Col1a1 Reverse
<400> 32
ccacgtctca ccattgggg 19
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CTGF Forward
<400> 33
aaggaccgca cagcagtt 18
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CTGF Reverse
<400> 34
aacaggcgct ccactctg 18
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> E-Cadherin Forward
<400> 35
acgagggcag tggttctg 18
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> E-Cadherin Reverse
<400> 36
catgtccgcc agcttctt 18
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Vimentin Forward
<400> 37
cagatgcgtg agatggaaga 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Vimentin Reverse
<400> 38
tccagcagct tcctgtaggt 20
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ZO-1 Forward
<400> 39
cccgagacct ggactcca 18
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ZO-1 Reverse
<400> 40
gttcgaggca gctgctca 18
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> α-SMA Forward
<400> 41
ctgacagagg caccactgaa 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> α-SMA Reverse
<400> 42
catctccaga gtccagcaca 20
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> β-catenin Forward
<400> 43
gagcctgcca tctgtgct 18
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> β-catenin Reverse
<400> 44
tggtgggtgc aggagttt 18
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Ki67 Forward
<400> 45
tgtcagcaag aggccacg 18
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Ki67 Reverse
<400> 46
ggtcgccttg gtgagctt 18
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Kras Forward
<400> 47
tgtggtagtt ggagctggtg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Kras Reverse
<400> 48
tgacctgctg tgtcgagaat 20
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P53 Forward
<400> 49
gcagggtgtc acgcttct 18
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P53 Reverse
<400> 50
catcctgggg cagcaaca 18

Claims (10)

1.一种可逆性永生化肺泡细胞系imPACs的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：提取小鼠原代肺泡细胞mPACs，采用携带潮霉素B抗性基因和SV40T基因的SSR#41永生化工具质粒，结合FLP/FRT系统制备表达SV40T基因的逆转录病毒，然后运用所述逆转录病毒感染原代肺泡细胞mPACs，使细胞增值，经潮霉素B进行阳性克隆筛选，获得可逆性永生化肺泡细胞系imPACs。
2.根据权利要求1所述的可逆性永生化肺泡细胞系imPACs的构建方法，其特征在于：所述逆转录病毒通过293PA细胞、pCL-Ampho质粒和SSR41质粒包装而得。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法构建得到的可逆性永生化肺泡细胞系imPACs。
4.一种可逆性永生化小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的构建方法，其特征在于：采用流式细胞仪检测权利要求3所述的可逆性永生化肺泡细胞系imPACs中Prosurfactant Protein C的表达，确定细胞中Ⅱ型肺泡上皮细胞比例，采用磁珠法分选EpCAM+细胞，即得Ⅱ型肺泡上皮细胞imPAC2。
5.根据权利要求4所述的方法构建得到的可逆性永生化小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞。
6.根据权利要求3所述的可逆性永生化肺泡细胞系imPACs及根据权利要求5所述的可逆性永生化小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞在作为肺相关疾病诊断及治疗用细胞模型中的应用。
7.一种稳定低表达β-catenin的imPAC2-Si-β-Catenin细胞株，其特征在于：通过质粒pSEB-BSG-simCtnnb1ABC，包装逆转录病毒感染如权利要求5所述的Ⅱ型肺泡上皮细胞imPAC2而得。
8.根据权利要求5所述的可逆性永生化小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞在作为肺纤维化研究用细胞模型中的应用，其特征在于：采用过表达TGF-β1的腺病毒AdR-TGF-β1诱导如权利要求5所述的Ⅱ型肺泡上皮细胞。
9.一种imPAC2-KrasmP53细胞株，其特征在于，其构建方法为：采用pSEBI-Kras质粒和pSEBI-p53R273H质粒制备稳定过表达Kras片段和p53R273H突变片段的逆转录病毒，感染如权利要求5所述的Ⅱ型肺泡上皮细胞imPAC2，经BSD药物筛选抗BSD的稳定细胞株，获得所述imPAC2-KrasmP53细胞株。
10.根据权利要求9所述的imPAC2-KrasmP53细胞株在作为Kras和P53突变体所致肺癌研究用细胞模型中的应用。
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