CN111117968B - 一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，属于医疗领域用动物模型领域，包括以下步骤：S1、稳转细胞培养：采用改良DMEM/F12完全培养基进行细胞培养，大量扩增稳定表达荧光素酶的原代细胞；S2、细胞悬液准备：用改良DMEM/F12完全培养基反复清洗后，收集细胞悬液备用，细胞悬液浓度为6×109个细胞/mL，悬液制备后在40min内使用；S3、裸鼠胶质瘤模型建立：原位注射悬液于小鼠颅内，得到稳定表达荧光素酶的小鼠模型。本发明方法制备的人脑胶质瘤荧光裸鼠模型肿瘤生长和病理特性与人脑胶质瘤相似且可实时观察肿瘤生长，为人脑胶质瘤原位移植示踪研究胶质瘤及肿瘤微环境研究提供理想的研究模型。

Description

一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法
技术领域
本发明属于医疗领域用动物模型领域，更具体的，涉及一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法。
背景技术
脑胶质瘤是来源于胶质细胞及其前身的原发肿瘤，是中枢神经系统最常见而又最难治疗的恶性肿瘤，约占颅内肿瘤的50％。由于大部分胶质瘤呈侵袭性生长，与周围正常脑组织界限不清，手术难以彻底切除肿瘤。基于胶质瘤细胞的生物多样性及发病机制尚未明确的情况，其至今仍是所有恶性肿瘤中接受综合治理预后最差的一类中枢神经系统肿瘤，胶质母细胞瘤患者的平均生存周期仅为14.6个月。如何提高脑胶质瘤的治疗效果已经成为神经外科最富挑战性的难题之一。
国内外科研工作者都在广泛开展脑胶质瘤的基础研究，其中动物模型作为研究领域的重要工具也最受广大研究者的青睐。转基因技术及细胞培养技术的发展大力推进了各种基于人类基因异常的大/小鼠胶质瘤模型及基于细胞建立的人脑胶质瘤模型，尤其是原位肿瘤模型的建立。虽然目前此类动物模型较为成熟，但存在一定的不足：
1)由于细胞系的易于培养，经济且高效，目前以细胞系如U251和9L建立的肿瘤模型较为常见，如中国专利号CN200610000881.2公开了一种稳定表达萤火虫荧光素酶的9LLUC细胞株的构建与应用，但由于细胞系在体外持续传代，连续传代的细胞系适应了外界培养皿的环境，逐渐丧失了肿瘤的异质性且相关的信号通路等也发生改变，无法准确代表细胞在机体内部的生理变化。
2)基于近交系免疫缺陷小鼠建立的可稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的肿瘤模型虽然可以直观的分辨肿瘤于宿主之间的复杂关系，如中国专利号CN201710452157.1公开了一种建立绿色荧光BALB/c裸小鼠模型的方法及模型应用，但GFP有较强的背景干扰，其敏感性和精确度都大大降低，且培育合适小鼠的周期太长，花费较大、操作复杂。
发明内容
基于上述问题，本发明提供了一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠模型的方法。虽然原代细胞相较于细胞系，在体外极难获得与培养，但与胶质瘤细胞系不同，原代细胞分离自新鲜的临床组织，其很好的反应了肿瘤的异质性问题；通过体外质粒转染操作，将荧光素酶质粒转入到原代胶质瘤细胞，通过筛选获得稳定表达荧光素酶的稳转细胞后，再将含有质粒的原代细胞通过微量注射器精准注射到裸鼠脑部的安全部位，接种后7d通过动物活体成像仪观察肿瘤增长情况，操作上方便易行，便于观察肿瘤与宿主动物之间的关系，缩短实验周期，减少花费。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，包括以下步骤：
S1、稳转细胞培养：采用改良DMEM/F12完全培养基进行细胞培养，大量扩增稳定表达荧光素酶的原代细胞；
S2、细胞悬液准备：用改良DMEM/F12完全培养基反复清洗后，收集细胞悬液备用，细胞悬液浓度为6×109个细胞/mL，悬液制备后在40min内使用；
S3、裸鼠胶质瘤模型建立：取步骤S2的悬液5-8μL缓慢注入小鼠颅内，定期监测裸鼠的后期反应，得到稳定表达荧光素酶的小鼠模型；
所述改良DMEM/F12完全培养基为DMEM/F12培养基添加1×NeuroCult SM1Neuronal Supplement。
进一步的，步骤S1中，所述细胞培养具体包括以下步骤：
P1、将稳定表达荧光素酶的原代细胞接种于改良DMEM/F12完全培养基重悬，于37℃、5％CO2条件下进行培养；
P2、培养至细胞丰度达到80％时，用PBS缓冲液漂洗细胞2次，加入1mL消化液消化单层细胞2-3min，所述PBS缓冲液的pH值为pH7.2-7.4；
P3、加入2mL改良DMEM/F12完全培养基终止消化，低速离心去上清，收集细胞沉淀，再用1mL改良DMEM/F12完全培养基重悬后补足培养基，按照1传2的比例进行培养，连续传代20代后，备用；
所述改良DMEM/F12完全培养基为DMEM/F12培养基添加1×NeuroCult SM1Neuronal Supplement。
进一步的，所述改良DMEM/F12完全培养基配方为：DMEM/F12培养基添加1×NeuroCult SM1 Neuronal Supplement、10ng/mL人表皮生长因子、10μg/mL人重组胰岛素、100μg/mL肝素、10ng/mL霍乱毒素、1×谷氨酰胺及100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素；所述改良DMEM/F12完全培养基需经过0.22um孔径滤膜过滤后使用。
进一步的，步骤P2中，所述消化液为含有1×I型胶原酶和0.25％胰酶-0.2％EDTA的消化液。
进一步的，步骤P3中，所述低速离心条件为：1000rpm离心4min。
进一步的，步骤S1中，所述稳定表达荧光素酶的原代细胞的构建方法为：步骤S1中，所述稳定表达荧光素酶的原代细胞的构建方法为：体外分离获取人脑胶质瘤原代细胞，传代培养3～5代，将荧光素酶慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒混合后，共转染293T细胞，以产生含有萤火虫荧光素酶的慢病毒上清，确定慢病毒的滴度，应用上述慢病毒感染传代培养的原代细胞，经筛选得到稳定表达萤火虫荧光素酶的胶质瘤细胞。
其中，稳定表达荧光素酶的原代细胞的筛选方法为常规筛选方法，所述筛选方法较佳的包括以下步骤：向慢病毒感染胶质瘤原代细胞的培养基中加入嘌呤霉素进行稳转细胞的筛选，嘌呤霉素加入量为8μg/mL，每2-3d更换1次含嘌呤霉素的培养基，持续筛选30d，获得稳定表达荧光素酶的原代细胞。
进一步的，所述荧光素酶慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒分别为：pcDNA3.0-Luc和pLent-U6-GFP-Puro；本发明的质粒带有GFP标签，可在荧光显微镜下有效观察转染效率，且带有嘌呤霉素的抗性基因，可用于选项稳转株，且本申请的质粒具有双向接听，便于用于后续研究，包括目的基因的敲低或过表达。
由上述方法制备的人脑胶质瘤荧光裸鼠模型，应用于人脑胶质瘤原位移植示踪研究胶质瘤及模拟肿瘤微环境研究。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提供一种基于人胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，经过改良的细胞培养组合物能够成功地对分离自临床患者的胶质瘤原代细胞和稳定表达荧光素酶的稳转原代细胞进行体外培养，特别是进行原代培养，大大地提高了原代培养的周期和成活率，可以连续培养20代而不丢失异质性，细胞生物特性保持不变、具备正常胶质瘤原代细胞的迁移和侵袭能力，从而得到稳定、不变异的传代原代细胞，克服了现有技术中胶质瘤细胞难以进行原代培养或培养成功率极低的缺陷，以及现有脑胶质瘤细胞最多仅能原代培养10代，导致细胞浓度低难以成功建立肿瘤模型的缺陷，因此对胶质瘤研究具有非常重要的现实意义和实用价值。
2、本发明采用原位成瘤，脑原位微环境为肿瘤细胞提供了合适的生长环境，有利于原代胶质瘤细胞的原位成瘤，其成瘤率及周期均优于异位成瘤，且载瘤裸鼠生存期稳定，重复性好，有利于进行长期观测，是一种理想的胶质瘤原位移植瘤模型。
3、本发明所用的脑胶质瘤原代细胞，由于分离自新鲜的临床组织，从遗传背景及生理功能上均能更好的体现细胞在机体内的情况，其很好的反应了肿瘤的异质性问题，成瘤的优越性要高于普通的U251细胞系和9L细胞系；本发明的荧光裸鼠肿瘤模型的肿瘤生长和遗传、形态学、病理学特性与人脑胶质瘤相似，与临床上保持了较好的一致性，且可实时观察肿瘤生长，为人脑胶质瘤原位移植示踪研究胶质瘤及肿瘤微环境研究提供一种强大的可视化监测工具。
附图说明
图1为本发明人脑胶质瘤原代细胞的细胞形态图，放大倍数：100；
图2为实施例2人脑胶质瘤原代细胞的传代培养建系的细胞生长曲线；
图3为人脑胶质瘤原代细胞的特异性标记物免疫组化图，放大倍数为：200；
图4为稳转人脑胶质瘤原代细胞生物学特性鉴定：稳转细胞侵袭能力鉴定实验结果图；
图5为稳转人脑胶质瘤原代细胞组与对照组裸鼠原位移植瘤模型活体成像图：A为对照组，B为实验组；
图6为脑胶质瘤病理检测图：A、B分别为稳转人脑胶质瘤原代细胞组与对照组裸鼠原位移植瘤模型病理切片HE染色；C、D分别为临床人脑胶质瘤病理切片与稳转人脑胶质瘤原代细胞组裸鼠原位移植瘤模型病理切片GFAP标记物组化图；
图7为模型动物的生存曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件进行，或按照制造厂商所建议的条件，室温为26℃，本发明所用的原料或试剂除特别说明外，均市售可得。
实施例1人脑胶质瘤原代细胞的分离
(1)通过医院伦理委员会，经患者或患者监护人同意且签订知情同意书后，从武汉协和医院获得新鲜的临床脑胶质瘤切除标本，经病理结果验证，为胶质母细胞瘤，WHOIV级。
(2)切除标本立即放入含预冷无菌的组织保存液(含1000U/mL青霉素、1000μg/mL硫酸链霉素、2.5μg/mL两性霉素和50μg/mL的庆大霉素)的收集管中，并立即放入4℃样本运输箱中，于4h内运输至实验室进行细胞分离。
(3)原代细胞分离：获取组织在生物安全柜中，用无水乙醇迅速冲洗1次，用1×PBS(pH7.2-7.4)迅速冲洗2次，用解剖镊子在显微镜下去除血管、脂肪及坏死组织部分，用解剖剪刀将组织剪至糜状，加入20mL含1×I型胶原酶和0.25％胰酶-0.2％EDTA的消化液消化肿瘤组织，消化时间为2小时，并用70μm滤膜过滤收集细胞沉淀，1000rpm，4分钟，离心后收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入10mL红细胞裂解液(Solarbio，R1010)，室温裂解5min后离心收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入5mL的无血清及抗生素的新鲜DMEM，1000rpm离心4分钟，收集细胞沉淀，得到原代细胞。
实施例2人脑胶质瘤原代细胞的传代培养及传代培养条件的优化
将分离得到的原代细胞分为四组，分别在不同的改良DMEM/F12完全培养基(培养基A～D)条件下进行传代培养；
(1)用改良DMEM/F12完全培养基重悬细胞沉淀，于37℃、5％CO2条件下进行培养，培养至T25培养瓶的细胞丰度达到80％时，用1×PBS(pH7.2-7.4)漂洗细胞2次，加入1mL0.05％胰酶-EDTA消化单层细胞2-3min。
(2)加入2mL改良DMEM/F12完全培养基终止消化；1000rpm离心4min，去上清，收集细胞悬液，用1mL改良DMEM/F12完全培养基重悬后补足培养基，按照1传2的比例，放入T25培养瓶中进行培养，连续传代20代后，备用。
采用的改良DMEM/F12完全培养基(培养基A～D)分别为：
培养基A：DMEM/F12培养基添加1×NeuroCult SM1 Neuronal Supplement、10ng/mL人表皮生长因子、10μg/mL人重组胰岛素、100μg/mL肝素、10ng/mL霍乱毒素、1×谷氨酰胺及100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。
培养基B：DMEM/F12培养基添加0.5×NeuroCult SM1 Neuronal Supplement、10ng/mL人表皮生长因子、10μg/mL人重组胰岛素、100μg/mL肝素、10ng/mL霍乱毒素、1×谷氨酰胺及100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。
培养基C：DMEM/F12培养基添加1×NeuroCult SM1 Neuronal Supplement、1mM丙酮酸钠、1x非必需氨基酸、10ng/ml硒酸钠、5ug/ml转铁蛋白、10ng/ml人表皮生长因子、10ng/ml人成纤维细胞生长因子、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、100ug/ml肝素、5ng/ml孕酮及100U/mL青霉素、100ug/ml链霉素、0.25ug/mL两性霉素B。
培养基D：DMEM/F12培养基添加10ng/mL人表皮生长因子、10μg/mL人重组胰岛素、100μg/mL肝素、10ng/mL霍乱毒素、1×谷氨酰胺及100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。
对照组：DMEM/F12培养基。
上述培养基需经过0.22um孔径滤膜过滤后使用。
按照实施例1的方法分离成功的人脑胶质瘤原代细胞，显微镜下观察，细胞形态如图1所示，可以看出原代细胞呈梭形、具有不规则分支或分叉；采用不同的培养基对原代细胞进行传代培养建系，培养基A培养得到的细胞生长曲线如图2，连续传代60d，人胶质瘤原代细胞仍能保持增殖状态正常生长，且细胞的大小、形态与原代无明显差别，呈梭形、具有不规则分支或分叉、突起较小、核大小不一，增殖和生长活跃、每6～7d传代一次、每7d细胞数增加9～11倍，且特异性表达人脑胶质瘤原代细胞标志物GFAP，具有肿瘤异质性；培养基B培养得到的细胞因添加低量的NeuroCult SM1 Neuronal Supplement，胶质瘤原代细胞的增殖较慢、细胞活性降低，每8～10d传代一次，每9d细胞数增加8～9倍；培养基C培养得到的细胞增殖和生长较活跃，但经过几次传代后，细胞形态逐渐变得单一，丢失了异质性；培养基D培养得到的细胞活性低、增殖慢，经过几次传代后，细胞形态呈更规则的球形，形态发生较大变化，完全丢失异质性，因此，本发明选用培养基A为最优培养基。以下实施例中的改良DMEM/F12完全培养基皆采用此配方：所述改良DMEM/F12完全培养基配方为：DMEM/F12培养基添加1×NeuroCult SM1 Neuronal Supplement、10ng/mL人表皮生长因子、10μg/mL人重组胰岛素、100μg/mL肝素、10ng/mL霍乱毒素、1×谷氨酰胺及100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素；所述改良DMEM/F12完全培养基需经过0.22um孔径滤膜过滤后使用。
实施例3人脑胶质瘤原代细胞的特异性标记物表达鉴定
(1)在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
(2)用4％的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；
(3)0.5％TritonX-100(PBS配制)室温通透20min；
(4)PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
(5)吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
(6)第二天用PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min(荧光二抗加入后的所有操作需避光进行)；
(7)复染核：滴加DAPI对细胞进行染核，避光孵育5min,用PBST洗4次，每次5min；
(8)用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片后在荧光显微镜下观察采集图像。
染色结果见图3，由图可知体外分离所得的人脑胶质瘤原代细胞的特异性标记物GFAP表达为阳性，连续传代20代依然具有肿瘤异质性。
实施例4人脑胶质瘤原代稳转细胞构建
1)慢病毒包装
(1)293T细胞准备：开始病毒包装前24h对293T细胞进行传代。
I.弃去旧培养基，加入5mL无菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液。
II.用1mL的0.25％胰酶消化对数生长期的293T细胞，37℃消化1-3min。
III.以含10％血清的DMEM培养基终止细胞后，调整细胞浓度为5×106细胞/10mL，重新接种于10cm细胞培养皿中，放置37℃，5％CO2继续培养，转染前细胞丰度达到80％。
(2)质粒转染
I.转染前2h将细胞培养基更换为Opti-MEM培养基。
II.取质粒pcDNA3.0-Luc和pLent-U6-GFP-Puro各10μg和25μL Lenti-EasyPackaging MiX，与1455μL的Opti-MEM混合均匀，总体积为1.5mL，室温下温育5分钟；本发明的质粒带有GFP标签，可在荧光显微镜下有效观察转染效率，且带有嘌呤霉素的抗性基因，可用于选项稳转株，且本申请的质粒具有双向接听，便于用于后续研究，包括目的基因的敲低或过表达；
III.将Lipofectamine 2000(Lipo 20000)轻柔摇匀，取60μL Lipo 2000与1440μL的Opti-MEM混合均匀，总体积为1.5mL，在室温下温育5min；
IV.把稀释后的包装体系与稀释后的Lipo 2000混合，总体积为3mL，轻轻地颠倒混匀，室温下温育20min，形成DNA与Lipo 2000稀释液的转染复合物；
V.将转染复合物转染至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
VI.培养8h后倒去含有转染复合物的培养基，每盘细胞加入10mL的PBS轻轻洗涤残余的转染混合物，然后倒去PBS；
VII.每盘细胞中加入含10％血清的DMEM细胞培养基12mL，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养48h。
(3)病毒上清收集
I.转然后48-72h，收集细胞上清液，并根据细胞生长状态适当补充新鲜含10％血清/DMEM培养基；
II.将收集的细胞上清液1500rpm离心5min，并用0.22um的过滤膜过滤；
III.过滤后的细胞上清液及时分装并保存于-80℃冰箱储存。
(4)病毒滴度测定
采用p24蛋白ELSIA试剂盒测定慢病毒滴度；检测原理：采用固相酶联免疫吸附分析法(Enzyme-linked Immunosorbent linked Immunosorbent linked Assay，ELISA)检测样品中的HIV-1p24抗原。样品中HIV-1p24抗原与固相抗p24单克隆抗体和生物素标记的p24多克隆抗体通过免疫反应，形成固相p24单克隆抗体—p24抗原—抗p24多克隆抗体—生物素复合；然后加入HRP(Horseradish Pero×idase，辣根过氧化物酶)标记的链亲和素，形成固相抗p24单克隆抗体—p24抗原—抗p24多克隆抗体—生物素—链亲和素—HRP复合物；加入TMB-H2O2底物溶液，HRP催化H2O2氧化TMB生成蓝色的产物(最大吸收峰655nm)，加入终止液酶催化反应，生成黄色产物(最大吸收峰450nm)。其吸光度与校准品和样品中的HIV-1p24抗原浓度成正相关。通过建立标准样品曲线可得出样品中HIV-1p24抗原浓度。
其主要步骤为样品准备和稀释、标准曲线样品制备、样品检测和检测数据分析，具体操作流程参见市售人类HIV-1p24抗原酶联免疫试剂盒说明书。
2)细胞转染及稳转筛选
I.原代细胞准备：获取原代细胞后，取传达培养3～5d代的人胶质瘤原代细胞(此时处于对数生长期、活性较高)接种于10cm细胞培养皿中，使细胞丰度达60％，贴壁培养24h；
II.慢病毒转染原代细胞：第2d，用提前制备的慢病毒感染上述原代细胞，病毒感染复数为3MOI；37℃、5％CO2培养箱中孵育24h，洗去病毒液，加入新鲜的改良DMEM/F12完全培养基继续培养；
III.转染效率观察：病毒感染后3-4天，向细胞培养基中加入荧光素酶底物荧光素钠观察细胞的转染效率，荧光素钠加入量为1mL，浓度15mg/mL。
IV.稳转细胞筛选：向上述培养皿中加入嘌呤霉素进行稳转细胞的筛选，嘌呤霉素加入量为8μg/mL，每2-3d更换1次含嘌呤霉素的培养基，持续筛选30d，获得稳定表达荧光素酶的原代细胞。
3)稳转细胞生物学特性鉴定
收集上述稳转细胞，经嘌呤霉素筛选且鉴定为稳定表达荧光素酶的原代细胞后批量扩增，用24孔Transwell细胞侵袭实验鉴定人胶质瘤原代细胞转染前后的生物学特性，侵袭实验操作方法如下：
I.基质胶准备：将冻存于-80℃的BD Mateigel 4度过夜(16-24h)，使基质胶融化成液态。
II.Transwell小室预处理：将80μL Matrigel胶和640μL DMEM培养基(按1：8的比例)混匀后取100μL铺于Transwell小室上层，37℃孵育过夜。
III.细胞准备：分别取对数生长期的原代稳转细胞及转染前原代细胞，消化细胞，用无血清DMEM培养基洗3次，用改良DMEM/F12完全培养基制备细胞悬液，细胞悬液浓度为1×105个/mL。
IV.细胞接种：用改良DMEM/F12完全培养基洗Mateigel 1次，分别取上述细胞悬液200μL接种于Transwell上室，下室加入含10％FBS的改良DMEM/F12完全培养基600μL，37℃、5％CO2培养48h。
V.取出Transwell，用PBS漂洗2遍，5％戊二醛固定20min。
VI.加入0.1％结晶紫染色，室温染色0.5h，PBS漂洗2遍，用棉球擦去上表面细胞。
VII.自然干燥后于显微镜下随机选取5个不同视野观察，计算穿膜细胞数。
实验结果见图4，结果显示侵袭实验中，稳转细胞实验组与对照组的细胞数无明显差异，说明细胞的生物学特性未受转染及后续筛选操作的影响。
实施例5基于人脑胶质瘤原代细胞动物肿瘤模型建立及评价
1)动物模型建立
S1、稳转细胞培养：采用实施例1的方法，大量扩增稳定表达荧光素酶的原代细胞；
S2、细胞悬液准备：用改良DMEM/F12完全培养基反复清洗后，收集细胞悬液备用，细胞悬液浓度为6×109个细胞/mL，悬液制备后在40min内使用；
S3、裸鼠胶质瘤模型建立：取步骤S2的悬液5-8μL缓慢注入小鼠颅内，实时监测裸鼠的后期反应，得到稳定表达荧光素酶的小鼠模型。
稳转细胞培养具体包括以下步骤：
P1、将稳定表达荧光素酶的原代细胞接种于改良DMEM/F12完全培养基重悬，于37℃、5％CO2条件下进行培养；
P2、培养至细胞丰度达到80％时，用1×PBS(pH7.2-7.4)漂洗细胞2次，加入1mL消化液消化单层细胞2-3min；所述消化液为含有1×I型胶原酶和0.25％胰酶-0.2％EDTA的消化液；
P3、加入2mL改良DMEM/F12完全培养基终止消化，1000rpm离心4min，去上清，收集细胞沉淀，再用1mL改良DMEM/F12完全培养基重悬后补足培养基，按照1传2的比例，放入T25培养瓶中进行培养，连续传代20代后，备用。
裸鼠胶质瘤模型建立的具体步骤如下：
I.购买8周龄大小的BALB/c裸鼠，雌性，在SPF级实验室中适应性饲养3-5天。
II.称量裸鼠的体重，用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后将裸鼠固定在立体定向仪上，消毒，切皮及用魔钻在固定安全区域钻孔。
III.用微量注射器吸取约5-8μL细胞悬液缓慢注入颅内。
IV.注射完毕后用生物胶封闭小孔及用丝线缝合皮肤，时刻注意小鼠保温，等待小鼠麻醉苏醒。
2)动物模型评价
(1)动物活体成像
颅内注射后需定期观察裸鼠的后期反应。
I.分别于移植后的第7、14、21和28天，通过腹腔注射荧光素酶底物10-15min，底物浓度为15mg/mL，10μL/g。
II.将荷瘤鼠和对照组裸鼠用1％戊巴比妥钠麻醉后，仰卧于小动物活体成像仪上进行显像，利用活体成像观察颅内肿瘤大小，利用活体成像分析软件分别记录在接种胶质瘤细胞后的荧光图像和荧光强度值。
(2)动物脑组织形态及病理检测
I.动态活体成像结束后，濒死的裸鼠经1％戊巴比妥钠麻醉后暴露胸腔。
II.经4％多聚甲醛心脏灌流至躯体发白，取出脑组织，浸泡在4％多聚甲醛中24h。
III.梯度脱水后石蜡包埋、切片、行常规HE染色，在镜下观察肿瘤情况。
图5所示为对照组(A)和造模组(B)裸鼠的活体成像图，细胞接种后7天即可检测到脑部荧光信号，且随接种时间推移，所有可检测到的荧光信号逐渐增强，在接种后的第28天，信号强度达到饱和。
图6所示为脑胶质瘤病理检测图，其中图A、B分别为稳转人脑胶质瘤原代细胞组与对照组裸鼠原位移植瘤模型病理切片HE染色；C、D分别为临床人脑胶质瘤病理切片与稳转人脑胶质瘤原代细胞组裸鼠原位移植瘤模型病理切片GFAP标记物组化图。HE切片显示肿瘤区无明显包膜，与正常脑组织界限清楚，核异型性显著，大小不均一。对比临床上人脑胶质瘤的病理切片与造模组动物脑胶质瘤病理切片，该造模组的胶质瘤细胞经过长时间的培养，能够模拟人胶质瘤病理特征，具备与人胶质瘤相似的疾病发生发展过程。
图7所示为造模动物生存曲线，分析已发表文献(双荧光标记的胶质瘤原位移植瘤模型的建立[J].中国比较医学杂志,2017(4).)中造模动物(对照)的生存时间与此次申请中造模动物的生存时间，并作统计学分析，发现本申请中造模动物的生存期明显优于已有的造模动物生存期(p＝0.027)。
以上数据说明，活体成像结果结果显示随时间推移，荧光信号逐渐增强，显示与肿瘤体积有良好的线性关系，证明肿瘤随接种时间推移逐渐长大。利用人源脑胶质瘤原代细胞建立的荧光裸鼠脑原位移植瘤模型，裸鼠成瘤时间适中，动物生存期稳定，重复性好，是一种理想的胶质瘤原位移植瘤模型，其肿瘤生长和病理特性与人脑胶质瘤相似且可实时观察肿瘤生长，为人脑胶质瘤原位移植示踪研究胶质瘤及肿瘤微环境研究提供一种强大的可视化监测工具。

Claims (8)

1.一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、稳转细胞培养：采用改良DMEM/F12完全培养基进行细胞培养，大量扩增稳定表达荧光素酶的原代细胞；
所述稳定表达荧光素酶的原代细胞的构建方法为：体外分离获取人脑胶质瘤原代细胞，采用改良DMEM/F12完全培养基传代培养3~5代，之后应用慢病毒感染传代培养的原代细胞，经筛选得到稳定表达荧光素酶的胶质瘤细胞；
S2、细胞悬液准备：用改良DMEM/F12完全培养基反复清洗后，收集细胞悬液备用，细胞悬液浓度为6×109个细胞/mL，悬液制备后在40min内使用；
S3、裸鼠胶质瘤模型建立：取步骤S2的悬液5-8μL缓慢注入小鼠颅内，定期监测裸鼠的后期反应，得到稳定表达荧光素酶的小鼠模型；
所述改良DMEM/F12完全培养基组成为：DMEM/F12培养基添加1×NeuroCult SM1Neuronal Supplement、10ng/mL人表皮生长因子、10μg/mL人重组胰岛素、100μg/mL肝素、10ng/mL霍乱毒素、1×谷氨酰胺及100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。
2.如权利要求1所述的基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，步骤S1中，所述细胞培养具体包括以下步骤：
P1、将稳定表达荧光素酶的原代细胞接种于改良DMEM/F12完全培养基重悬，于37℃、5%CO2条件下进行培养；
P2、培养至细胞丰度达到80%时，用PBS缓冲液漂洗细胞2次，加入1mL消化液消化单层细胞2-3min，所述PBS缓冲液的pH值为pH7.2-7.4；
P3、加入2mL改良DMEM/F12完全培养基终止消化，低速离心去上清，收集细胞沉淀，再用1mL改良DMEM/F12完全培养基重悬后补足培养基，按照1传2的比例进行培养，连续传代20代后，备用。
3.如权利要求1或2所述的基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，所述改良DMEM/F12完全培养基需经过0.22um孔径滤膜过滤后使用。
4.如权利要求2所述的基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，步骤P2中，所述消化液为含有1×I型胶原酶和0.25%胰酶-0.2%EDTA的消化液。
5.如权利要求2所述的基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，步骤P3中，所述低速离心条件为：1000rpm离心4min。
6.如权利要求1所述的基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，步骤S1中，所述稳定表达荧光素酶的原代细胞的构建方法为：体外分离获取人脑胶质瘤原代细胞，传代培养3~5代，将荧光素酶慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒混合后，共转染293T细胞，以产生含有萤火虫荧光素酶的慢病毒上清，确定慢病毒的滴度，应用上述慢病毒感染传代培养的原代细胞，经筛选得到稳定表达萤火虫荧光素酶的胶质瘤细胞。
7.如权利要求6所述的基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，所述荧光素酶慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒分别为：pcDNA3.0-Luc和pLent-U6-GFP-Puro。
8.权利要求1或2或4~7任一项所述的基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法在构建人脑胶质瘤荧光裸鼠肿瘤模型中的应用。
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