CN113621573B - 一种异质性3d肿瘤复合多细胞球侵袭模型的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型的制备方法,主要解决现有技术存在模型制备成本高、技术操作难度大的问题。本发明包括:1)获取单细胞悬液;2)形成肿瘤初始多细胞;3)建立稳定表达GFP荧光蛋白的肿瘤细胞株;4)形成肿瘤复合多细胞;5)构建异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型。本发明成功开发了一种简单、高效且可重复的方法来建立异质性的3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型,不仅更好地具备了大规模推广的条件,而且为研究肿瘤异质性、肿瘤微环境、肿瘤免疫和肿瘤药物筛选等领域提供了重要的研究模型,充分满足了科研和临床应用的需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物细胞培养技术领域,具体地说,是涉及一种异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型的制备方法。
背景技术
根据国际癌症研究机构的癌症统计报告,恶性肿瘤的发病人数在迅速增长。尽管近几十年来,手术治疗、放疗、化疗及靶向治疗在恶性肿瘤治疗取得了较大的进展,但是部分癌症患者对治疗耐受、反应差,每年死于癌症的人数仍高达九百万余人。肿瘤病灶存在异质性的肿瘤细胞亚群,其分子生物学和基因不同,肿瘤细胞的生长和侵袭能力存在差异性。更重要的是,不同肿瘤细胞亚群对化疗药物的敏感程度不同,容易产生对治疗耐受亚群,是癌症治疗失败的重要原因。因此,探讨恶性肿瘤异质性的分子机制有利于提高肿瘤治疗的疗效。
传统的2D细胞培养技术是将肿瘤细胞以单层的方式培养于培养皿中,缺乏细胞与微环境和其他细胞之间的相互作用,与体内状态具有较大的差异性,在应用于肿瘤异质性研究中存在很大的缺陷。3D细胞培养技术相比2D细胞培养技术来说,能够更好地模拟肿瘤细胞间相互作用和三维立体结构,因此已经成为研究肿瘤异质性的重要模型。
然而,目前应用于肿瘤异质性研究的3D细胞模型普遍存在制备成本高、技术操作难度大和无法高通量使用等难题,推广难度较大。如果能开发一种简易、低成本和适合大规模实验的3D肿瘤细胞的异质性培养模型,将具有重要的价值,尤其是在肿瘤侵袭作用的研究方面。
发明内容
本发明的目的在于提供一种异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型的制备方法,主要解决现有技术存在模型制备成本高、技术操作难度大的问题。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型的制备方法,包括以下步骤:
步骤1、获取单细胞悬液;
步骤2、形成肿瘤初始多细胞:将单细胞悬液接种于U型底球形板中培养,直至U型底球形板中形成单一、规则的3D肿瘤多细胞球,即形成初始多细胞球;
步骤3、建立稳定表达GFP荧光蛋白的肿瘤细胞株;
步骤4、形成肿瘤复合多细胞:挑选部分规则、形态致密的初始多细胞球,转移至新的U型底球形板,弃培养基后离心;然后获取表达GFP荧光蛋白的肿瘤细胞悬液,稀释后接种于含有初始多细胞球的U型底球形板中培养,直至原U型底球形板中形成体积较初始多细胞球更大的3D肿瘤多细胞球,即形成由两种细胞构成的异质性复合多细胞球;
步骤5、构建异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型:采用Ⅰ型胶原蛋白溶液,结合完全培养基对异质性复合多细胞球进行培养,直至被胶原包裹的3D肿瘤多细胞球向周围基质侵袭,形成肿瘤侵袭枝,即构建了异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型。
优选地,所述U型底球形板为96孔U型底球形板或384孔U型底球形板。
进一步地,所述步骤1中,将肿瘤细胞用胰蛋白酶消化获得细胞悬液,离心后重悬,获得单细胞悬液。
具体地,所述步骤1中,将肿瘤细胞用PBS清洗3遍后,加入1ml的0.25%胰蛋白酶,于37℃培养箱内消化2-5min,然后加入4ml完全培养基,轻轻吹打获得单个细胞悬液,1000rpm离心5min,弃上清,加入完全培养基重悬细胞,获得单细胞悬液。
具体地,所述步骤2中,先将单细胞悬液稀释至5×103个/mL,然后吸取200μl细胞悬液接种于U型底球形板中,培养24-48h。
具体地,所述步骤3中,采用慢病毒转染的方法获得表达GFP荧光蛋白的肿瘤细胞,并使用嘌呤霉素进行筛选,建立稳定表达GFP的肿瘤细胞株。
具体地,所述步骤4中,将GFP荧光蛋白的肿瘤细胞悬液稀释至5×103个/mL,吸取200μl细胞悬液接种于含有初始多细胞球的U型底球形板中,培养24-48小时。
具体地,所述步骤5中,使用预冷的10X PBS,1M的NaOH溶液和DMEM培养基,按照200μL初始胶原溶液配置1mL工作液的方式,配置Ⅰ型胶原蛋白溶液。
进一步地,所述步骤5中,用微量移液器吸弃96孔U型底球形板里培养基,加入50μL稀释的Ⅰ型胶原蛋白溶液,置于37℃培养箱中待其形成胶体后,加入完全培养基进行培养。
优选地,所述完全培养基为含有10%胎牛血清、1%青霉素链霉素双抗的DMEM培养基。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明以U型底球形板为基础,采用两步成球法的方式建立异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型,并且异质性复合多细胞球数量可根据实际需要调整U型底球形板的孔数(例如96孔或384孔),因此,与传统的3D生物打印技术、微流体技术和细胞喷涂技术相比,本发明很好地解决了操作复杂、需要特殊仪器等问题,实现了简易、低成本和可高通量的检测。
(2)本发明通过建立稳定表达GFP荧光蛋白的肿瘤细胞株,并获取表达GFP荧光蛋白的肿瘤细胞悬液,然后以初始多细胞球为核心聚集成球后,实现了两种细胞的共培养,如此,本发明不仅形成了异质性3D肿瘤复合多细胞球,而且细胞间不但存在间接相互作用,还可发挥直接相互作用,更加真实地模拟了肿瘤体内微环境。
(3)本发明制备的异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型,制备流程简单、验证效果好,不仅更好地具备了大规模推广的条件,而且为研究肿瘤异质性、肿瘤微环境、肿瘤免疫和肿瘤药物筛选等领域提供了重要的研究模型,更好地满足了科研和临床应用的需求。
附图说明
图1为本发明实施例中异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型的制备流程图。
图2为本发明实施例中初始多细胞球的镜下观察图;比例尺为500μm,其中,A为光镜下观察结果,B为荧光显微镜观察结果。
图3为本发明实施例中复合多细胞球的镜下观察图;比例尺为500μm,其中,A为光镜下观察结果,B为荧光显微镜观察结果。
图4为本发明实施例中异质性复合多细胞球3D培养后的镜下观察图;比例尺为1000μm。
图5为本发明实施例中PD-L1过表达及对照组复合多细胞球的侵袭实验结果;比例尺为100μm,其中,A为对照组观察结果,B为PD-L1过表达组观察结果。
具体实施方式
本发明公开了一种异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型的制备方法,其是将肿瘤细胞接种于超低粘附表面的U型底球形板,使其自发地形成单一且规则的多细胞球,第一次接种细胞成球形成初始多细胞球,接着第二次接种的肿瘤细胞以初始多细胞球为核心聚集成球,最终形成异质性复合多细胞球。
下面结合附图说明和实施例对本发明作进一步说明,本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
实施例1
根据本发明的一个优选实施例,以SCC47细胞构建3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型,具体如下:
细胞来源:从四川大学华西口腔国家重点实验室获得。
试剂耗材/仪器设备
模型构建过程如下,如图1所示:
步骤1:单细胞悬液的获得:将培养至铺满培养瓶底的80%-90%的SCC47肿瘤细胞,用PBS清洗3遍后,加入1ml 0.25%胰蛋白酶,于37℃培养箱消化(约2-5分钟),加入4ml完全培养基,轻轻吹打获得单个细胞悬液,1000rpm离心5min,弃上清,加入完全培养基重悬细胞。
步骤2:初始多细胞球的形成:使用计数板将上一步骤获得的单细胞悬液进行计数,将单细胞悬液稀释至5×103个/mL,移液枪吸取200μl细胞悬液(含有1×103个肿瘤细胞)接种于96孔U型底球形板,在37℃二氧化碳培养箱培养24-48小时,如图2所示,倒置显微镜观察可见96孔U型底球形板中每一小孔形成单一的形态规则、致密的3D肿瘤多细胞球,即形成初始多细胞球。
步骤3:表达GFP荧光蛋白的SCC47肿瘤细胞稳转株获取:采用慢病毒转染的方法获得表达GFP荧光蛋白的SCC47肿瘤细胞,并使用嘌呤霉素进行筛选,建立稳定表达GFP的肿瘤细胞株。
步骤4:复合多细胞球的形成:取出步骤2的96孔U型底球形板,倒置显微镜观察,挑选规则形态致密的多细胞球,于超净台内用微量移液器吸取多细胞球,转移至新的96孔U型底球形板,弃培养基。上述操作应动作应轻微,避免破坏多细胞球。
而后,将96孔U型底球形板于1000rpm离心3分钟,使得多细胞球位于U型底中央。
最后,按照步骤1中的方法获得表达GFP荧光蛋白的SCC47肿瘤细胞悬液,稀释至5×103个/mL,吸取200μl细胞悬液(含有1×103个肿瘤细胞)接种于含有初始多细胞球的96孔U型底球形板中,在37℃二氧化碳培养箱培养24-48小时。
培养后,如图3所示,倒置显微镜下观察可见96孔U型底球形板中每一小孔形成单一的形态规则且体积较初始多细胞球更大的异质性3D肿瘤多细胞球,即形成由两种细胞构成的复合多细胞球。荧光显微镜下观察可见复合多细胞球核心部分由步骤1中接种的SCC47细胞构成,边缘部分由GFP阳性SCC47细胞构成。
步骤5:异质性复合多细胞球的3D培养:使用预冷的10X PBS,1M的NaOH溶液和DMEM培养基,配置Ⅰ型胶原蛋白溶液(200μL原胶原蛋白溶液配置1mL工作液)。用微量移液器吸弃96孔U型底球形板里170μl培养基,加入50μL稀释的Ⅰ型胶原蛋白溶液,置于37℃培养箱中40分钟待其形成胶体,加入150μl完全培养基进行培养。
培养24-48小时后,如图4所示,倒置显微镜下观察可见96孔U型底球形板中被胶原包裹的3D肿瘤多细胞球向周围基质侵袭,形成肿瘤侵袭枝,至此,异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型构建成功。
实施例2
与实施例1不同的是,步骤4中的细胞采用转染PD-L1过表达质粒的SCC47肿瘤细胞,转染方法如下:
PD-L1过表达质粒转染:取对数生长期的SCC47细胞,接种于6孔板中使得第二天贴壁细胞达50-60%,微量移液器吸取2μg PD-L1过表达质粒于250μl Opti-MDM培养基,吸取8μl Lipofectamine 2000试剂于250μl Opti-MDM培养基,孵育10分钟,再将上述液体轻轻混匀,室温下孵育20分钟,加入细胞中并补足培养基,培养6小时后更换新鲜完全培养基,继续培养24小时。
实施例3
与实施例1不同的是,步骤4中的细胞为转染对照质粒的SCC47肿瘤细胞,转染方法同实施例2。
验证:过表达PD-L1肿瘤复合多细胞球侵袭能力的检测
设置实施例2及实施例3两组体系,每组3个复孔,放置于细胞培养箱中,24小时后倒置显微镜观察多细胞球,对比检测两组细胞侵袭能力。
根据图5所示,与实施例3组的转染对照质粒的SCC47肿瘤细胞相比,实施例2转染PD-L1过表达质粒的SCC47肿瘤细胞形成的多细胞球侵袭范围更广,侵袭枝的数目更多,代表细胞侵袭能力更强。因此,应用该3D肿瘤复合多细胞球共培养模型可以研究不同细胞构成的异质性多细胞球的侵袭能力。
综上,本发明成功开发了一种简单、高效且可重复的方法来建立异质性的3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型,并能够应用于肿瘤异质性在肿瘤侵袭作用的研究。本发明相比现有技术来说,具有操作简单、成本低廉、且可高通量筛选的优势,非常适合大规模推广应用。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一,不应当用于限制本发明的保护范围,凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色,其所解决的技术问题仍然与本发明一致的,均应当包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、获取单细胞悬液;
步骤2、形成肿瘤初始多细胞:先将单细胞悬液稀释至5×103个/mL,然后吸取200μl细胞悬液接种于U型底球形板中,培养24-48h,直至U型底球形板中形成单一、规则的3D肿瘤多细胞球,即形成初始多细胞球;
步骤3、采用慢病毒转染的方法获得表达GFP荧光蛋白的肿瘤细胞,并使用嘌呤霉素进行筛选,建立表达GFP的肿瘤细胞株;
步骤4、两步成球法形成异质性肿瘤复合多细胞球:挑选部分规则、形态致密的初始多细胞球,转移至新的U型底球形板,弃培养基后于1000rpm离心3分钟,使得多细胞球位于U型底中央;然后获取表达GFP荧光蛋白的肿瘤细胞悬液,将表达GFP荧光蛋白的肿瘤细胞悬液稀释至5×103个/mL,吸取200μl细胞悬液接种于含有初始多细胞球的U型底球形板中,培养24-48小时,直至原U型底球形板中形成体积较初始多细胞球更大的3D肿瘤多细胞球,即形成由两种细胞构成的异质性复合多细胞球;所述异质性复合多细胞球包括以初始多细胞球构成的核心区,以及聚集在核心区外面且能表达GFP荧光蛋白的肿瘤细胞构成的边缘区;
步骤5、构建异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型:采用Ⅰ型胶原蛋白溶液,结合完全培养基对异质性复合多细胞球进行培养,直至被胶原包裹的3D肿瘤多细胞球向周围基质侵袭,形成肿瘤侵袭枝,即构建了异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型。
2.根据权利要求1所述的一种异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型的制备方法,其特征在于,所述U型底球形板为96孔U型底球形板或384孔U型底球形板。
3.根据权利要求1所述的一种异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型的制备方法,其特征在于,所述步骤1中,将肿瘤细胞用胰蛋白酶消化获得细胞悬液,离心后重悬,获得单细胞悬液。
4.根据权利要求3所述的一种异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型的制备方法,其特征在于,所述步骤1中,将肿瘤细胞用PBS清洗3遍后,加入1ml的0.25%胰蛋白酶,于37℃培养箱内消化2-5min,然后加入4ml完全培养基,轻轻吹打获得单个细胞悬液,1000rpm离心5min,弃上清,加入完全培养基重悬细胞,获得单细胞悬液。
5.根据权利要求1所述的一种异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型的制备方法,其特征在于,所述步骤5中,使用预冷的10 X PBS,1M的 NaOH溶液和DMEM培养基,按照200μL初始胶原溶液配置1mL工作液的方式,配置Ⅰ型胶原蛋白溶液。
6.根据权利要求5所述的一种异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型的制备方法,其特征在于,所述步骤5中,用微量移液器吸弃96孔U型底球形板里培养基,加入50μL稀释的Ⅰ型胶原蛋白溶液,置于37℃培养箱中待其形成胶体后,加入完全培养基进行培养。
7.根据权利要求6所述的一种异质性3D肿瘤复合多细胞球侵袭模型的制备方法,其特征在于,所述完全培养基为含有10%胎牛血清、1%青霉素链霉素双抗的DMEM培养基。
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