JP2016515403A - ニューロン細胞培養のための培地組成物 - Google Patents

Abstract

本明細書ではとりわけ、神経細胞を培養するのに有用な培地組成物が提供される。特に、本明細書で提供される組成物は、生きている脳における重要な生理学的条件を模倣し、神経活性を持続させる。本明細書で提供される培地組成物は、ヒトニューロン成熟の効率を改善し、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養において長期間にわたりシナプス機能を促進する。本出願は、培地中で培養した脳細胞の成長および／または維持および／または機能活性を促進する細胞培地を提供する。

Description

関連出願への相互参照
本願は、２０１３年４月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８１３，０３４号への優先権および利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。

発明の背景
ヒト疾患を模擬し、緊急的に必要とされる治療を見出すための幹細胞および体細胞の再プログラミングに対して相当量の希望と努力が注がれている。ヒト体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングする革命的方法を公表した僅か５年後に山中博士に最近のノーベル生理学医学賞が授与されたことによって、いかに多くの期待が人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）技術に注がれているかが裏付けられる（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年）。その直後に、患者の皮膚細胞に由来するＩＰＳＣはｉｎ ｖｉｔｒｏでニューロンに変えることができることが示された（Ｄｉｍｏｓら、２００８年）。神経科学者は神経障害および精神障害を有する患者からｉｎ ｖｉｔｒｏで生きたニューロンの培養物を得るというこの前例のない機会へと一斉に向かい、特定の障害と関連する主要な表現型をディッシュで再現することができることを実証した（Ｍａｒｃｈｅｔｔｏら、２０１０年；Ｂｒｅｎｎａｎｄら、２０１１年；Ｍａｒｃｈｅｔｔｏら、２０１１年；Ｎｇｕｙｅｎら、２０１１年；Ｓｅｉｂｌｅｒら、２０１１年；Ｂｅｌｌｉｎら、２０１２年；Ｅｇａｗａら、２０１２年；Ｉｓｒａｅｌら、２０１２年；Ｓｈｉら、２０１２年）。

それにも関わらず、ニューロンをｉｎ ｖｉｔｒｏで成長させる基礎的培養条件は完全な神経生理学的アプローチでは決して確立されてこなかった。現在、殆ど全てのヒトニューロン培養物は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＣａｔｔａｎｅｏおよびＭｃＫａｙ、１９９０年；Ｏｋａｂｅら、１９９６年；Ｓｏｌｄｎｅｒら、２００９年；Ｖｉｅｒｂｕｃｈｅｎら、２０１０年；Ｂｒｅｎｎａｎｄら、２０１１年；Ｃａｉａｚｚｏら、２０１１年；Ｅｉｒａｋｕら、２０１１年；Ｍａｒｃｈｅｔｔｏら、２０１１年；Ｎｇｕｙｅｎら、２０１１年；Ｐａｎｇら、２０１１年；Ｐｆｉｓｔｅｒｅｒら、２０１１年；Ｑｉａｎｇら、２０１１年；Ｓｏｌｄｎｅｒら、２０１１年；Ｓｏｎら、２０１１年；Ｂｏｙｅｒら、２０１２年；Ｂｒａｚら、２０１２年；Ｇｉｏｒｇｅｔｔｉら、２０１２年；Ｉｓｒａｅｌら、２０１２年；Ｓｈａｏら、２０１２年；Ｖｉｌｃｈｅｚら、２０１２年）中で、および場合によりＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｈｅｒｍａｎｎら、２００４年；Ｌｉら、２００５年；Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００７年）またはＤＭＥＭおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌの両方の混合物（Ｋｏｃｈら、２００９年；Ｂｏｕｌｔｉｎｇら、２０１１年；Ｋｒｉｋｓら、２０１１年；Ｅｇａｗａら、２０１２年；Ｓｈｉら、２０１２年）中で成長させる。次いで、種々の成長因子および補充物を基礎培地に加え、ニューロンの分化および生存を促進させる。出願人等は、パッチクランプ法およびカルシウムイメージング技術を使用したところ、これらの汎用の基礎培地は、神経生理学的機能について適合性が極めて低いことを見出した。これらは活動電位発射、ならびに興奮性および抑制性シナプス機能を強く損ない、したがって自発性神経活性を劇的に低減させる。これはさらにｉｎ ｖｉｔｒｏでのニューロンの機能的発達および作動に対して有害な結果を有する。このように、例えば、成熟神経細胞、神経前駆細胞または初代神経細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化、増殖または維持の間に、損なうことのない条件をもたらすｉｎ ｖｉｖｏの生理学的条件を密接に反映する培地組成物が当技術分野で必要とされている。

本明細書ではとりわけ、神経細胞を培養するのに有用な培地組成物が提供される。特に、本明細書で提供される組成物は、生きている脳における重要な生理学的条件を模倣し、神経活性を持続させる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される培地組成物は、ヒトニューロン分化の効率性を改善し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養において長期間にわたりシナプス機能を促進する。

Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ， Ｔａｎａｂｅ Ｋ， Ｏｈｎｕｋｉ Ｍ， Ｎａｒｉｔａ Ｍ， Ｉｃｈｉｓａｋａ Ｔ， Ｔｏｍｏｄａ Ｋ， Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ （２００７） Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆａｃｔｏｒｓ． Ｃｅｌｌ １３１：８６１〜８７２

発明の要旨
本出願は、培地中で培養した脳細胞の成長および／または維持および／または機能活性を促進する細胞培地を提供する。ある特定の実施形態において、細胞培地は、１種もしくは複数の神経活性無機塩、および／または１種もしくは複数の神経活性アミノ酸、および／または１種もしくは複数のビタミン、および／または１種もしくは複数のアミノ酸、および／または１種もしくは複数のエネルギー基質、および／または１種もしくは複数のｐＨ調節剤を含む。

ある特定の実施形態において、培地は、約７０〜約１５０ｍＭの濃度で塩化ナトリウム、約０．０００００１〜約１０ｍＭの濃度で神経活性無機塩、約０．０００１〜約０．０５ｍＭの濃度でグリシン、約００００１〜約０．０５ｍＭの濃度でＬ−アラニン、および約０．００１〜約０．０３ｍＭの濃度でＬ−セリンを含む。

ある特定の実施形態において、培地は、約０．０５ｍＭ未満の濃度でＬ−アラニン、約０．２５ｍＭ未満の濃度でグリシン、約０．２５ｍＭ未満の濃度でＬ−セリン、約０．１５ｍＭ未満の濃度でＬ−プロリン、約０．６０ｍＭ未満の濃度でＬ−アルギニン塩酸塩、約２．５ｍＭ未満の濃度でＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、約０．４１ｍＭ超の濃度で硫酸マグネシウム、約１．０５ｍＭ超の濃度で塩化カルシウム、約４．１６ｍＭ超の濃度で塩化カリウム、約１２０．７ｍＭ超の濃度で塩化ナトリウム、約１７．５ｍＭ未満の濃度でＤ−グルコース、または約５ｍＭの濃度でＨＥＰＥＳを含む。

ある特定の実施形態において、本出願は、１種または複数の神経活性無機塩および１種または複数の神経活性アミノ酸を含む培地を提供する。ある特定の実施形態において、培地は、１種もしくは複数のｐＨ調節剤、１種もしくは複数のエネルギー基質、１種もしくは複数のアミノ酸、および／または１種もしくは複数のビタミン、およびこれらの組合せをさらに含む。ある特定の実施形態において、培地の成分は、培地中で培養した神経細胞の成長、維持および神経機能性を促進する量で存在する。

ある特定の実施形態において、培地は、血清を含まない。

ある特定の実施形態において、培地は、１種または複数のエネルギー感受性成分を含み、その成分と、エネルギーの源、例えば、光または電気とを接触させることは、培地中で培養した神経細胞の活性を増加させる。ある特定の実施形態において、エネルギー源へのその成分の連続曝露は、培地中で培養した神経細胞の興奮毒性をもたらす。

別の態様において、ニューロン細胞を培養する方法を提供する。この方法は、ニューロン細胞と、その実施形態を含め本明細書で示されるような培地とを接触させ、ニューロン細胞が成長することを可能とし、それによってニューロン細胞を培養することを含む。

別の態様において、その実施形態を含め本明細書で提供されるような培地中で培養した哺乳動物細胞を提供する。

図１Ａ〜Ｃは、ＤＭＥＭまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌをベースとする培地は、ニューロンおよびシナプスの活性を損なうことを示す図である。ｉＰＳまたはＥＳ細胞に由来するヒトニューロンを、ガラス製カバースリップ上に直接蒔いた。単一の成熟ニューロンの基本的なニューロン機能を試験し、２種の古典的な細胞外基礎培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ）中で比較した。細胞外培地の灌流は、ＡＣＳＦからＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａに、および回復のために再びＡＣＳＦに切り換えた。Ａ．ＡＣＳＦ中、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中および再びＡＣＳＦにおいて記録した同じ視野の１０分の動画における自発的活性細胞の数を示すカルシウムイメージング分析。ＡＣＳＦの無機塩濃度および容量オスモル濃度は、ＤＭＥＭに整合させた。灰色のラインは、個々の視野を表す。統計をウィルコクソン検定で行った。^＊＊Ｐ＝０．００９；^＊Ｐ＝０．０２２。Ｂ．上のトレース：電流クランプ記録は、ＡＣＳＦ中で観察された自発性活動電位が、静止膜電位の大きな増加と一緒に、ＤＭＥＭ中で急速に消滅することを明らかにする。中央のトレース：電圧クランプ記録（−７０ｍＶ、Ｃｌ−逆転電位）は、ＤＭＥＭをベースとする培地が、大きなＮａ＋内向き電流を誘導し、自発性ＡＭＰＡシナプス活性を完全に遮断することを明らかにする。下のトレース：電圧クランプ記録（０ｍＶ、Ｎａ＋逆転電位）は、ＤＭＥＭをベースとする培地が、大きなＣｌ−電流を誘導し、自発性ＧＡＢＡシナプス活性を完全に遮断したことを明らかにする。Ｃ．上のトレース（シナプス活性）：電圧クランプ記録は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａをベースとする培地が、自発性ＡＭＰＡシナプス活性を強く低減させることを明らかにする。さらに、これはまた、大きな持続性Ｃｌ−電流を誘導し、自発性ＧＡＢＡシナプス活性を完全に遮断する。下のトレース（活動電位）：ＮＢ−Ａは静止膜電位に影響を与えないが、誘発活動電位（５００ｍｓステップの電流）、電圧依存性Ｎａｖ／Ｋｖ電流（ＩＶトレース、クランプ−７０ｍＶ、電圧ステップ５ｍＶ）および自発性活動電位を強く損なう。 図１Ａ〜Ｃは、ＤＭＥＭまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌをベースとする培地は、ニューロンおよびシナプスの活性を損なうことを示す図である。ｉＰＳまたはＥＳ細胞に由来するヒトニューロンを、ガラス製カバースリップ上に直接蒔いた。単一の成熟ニューロンの基本的なニューロン機能を試験し、２種の古典的な細胞外基礎培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ）中で比較した。細胞外培地の灌流は、ＡＣＳＦからＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａに、および回復のために再びＡＣＳＦに切り換えた。Ａ．ＡＣＳＦ中、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中および再びＡＣＳＦにおいて記録した同じ視野の１０分の動画における自発的活性細胞の数を示すカルシウムイメージング分析。ＡＣＳＦの無機塩濃度および容量オスモル濃度は、ＤＭＥＭに整合させた。灰色のラインは、個々の視野を表す。統計をウィルコクソン検定で行った。^＊＊Ｐ＝０．００９；^＊Ｐ＝０．０２２。Ｂ．上のトレース：電流クランプ記録は、ＡＣＳＦ中で観察された自発性活動電位が、静止膜電位の大きな増加と一緒に、ＤＭＥＭ中で急速に消滅することを明らかにする。中央のトレース：電圧クランプ記録（−７０ｍＶ、Ｃｌ−逆転電位）は、ＤＭＥＭをベースとする培地が、大きなＮａ＋内向き電流を誘導し、自発性ＡＭＰＡシナプス活性を完全に遮断することを明らかにする。下のトレース：電圧クランプ記録（０ｍＶ、Ｎａ＋逆転電位）は、ＤＭＥＭをベースとする培地が、大きなＣｌ−電流を誘導し、自発性ＧＡＢＡシナプス活性を完全に遮断したことを明らかにする。Ｃ．上のトレース（シナプス活性）：電圧クランプ記録は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａをベースとする培地が、自発性ＡＭＰＡシナプス活性を強く低減させることを明らかにする。さらに、これはまた、大きな持続性Ｃｌ−電流を誘導し、自発性ＧＡＢＡシナプス活性を完全に遮断する。下のトレース（活動電位）：ＮＢ−Ａは静止膜電位に影響を与えないが、誘発活動電位（５００ｍｓステップの電流）、電圧依存性Ｎａｖ／Ｋｖ電流（ＩＶトレース、クランプ−７０ｍＶ、電圧ステップ５ｍＶ）および自発性活動電位を強く損なう。

図２Ａ〜Ｇは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、効率的な活動電位活性を支持することを示す図である。Ａ．電圧開口型電流のピークは単一のニューロンの間で可変であり得るが、これらはＢｒａｉｎＰｈｙｓおよびＡＣＳＦにおいて同様である。各ニューロンを、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの両方中で試験した（黒色対青色のドット）。ノンパラメトリック一対ウィルコクソン検定のＰ値をイタリック体で示す。ヒストグラムは平均値±標準誤差を表す。Ｂ．静止膜電位、自発性活動電位および誘発活動電位は、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で同じであった。Ｃ．光遺伝子（ｏｐｔｏｇｅｎｅ）（シナプシン：Ｃｈｅｔａ−ＹＦＰ）を発現し、ローダミンで充填した典型的なパッチした成熟ニューロン。ニューロン活性の光遺伝学的対照は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で確実に達成することができる。Ｄ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ中で同じパラメーターで試験した単一の成熟ニューロンは、光遺伝学的対照がＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で劇的に改善したことを例示する。Ｅ．単一のニューロンの電圧開口型ＮａｖおよびＫｖ電流（ＩＶ曲線から測定、クランプ−７０ｍＶ、ステップ５ｍＶ）の最大振幅は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（青色のドット）またはＡＣＳＦ（黒色のドット）と比較して、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（赤色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ、オレンジ色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）中で有意に低減した。Ｆ．興奮性（ＡＭＰＡ）および抑制性（ＧＡＢＡ）シナプス活性の両方は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で明らかに明白であった。単一のニューロンの自発性シナプス活性を記録する一方で、異なる培地の灌流は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓが、他の培地、例えば、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａと比較してシナプス機能をより良好に支持することを明らかにした。１２のスイープを灰色で上書きし、これらの１つを明確にするために黒色で強調表示する。Ｇ．ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの存在下でカルシウムイメージングによってネットワークレベルで測定した自発活性。 図２Ａ〜Ｇは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、効率的な活動電位活性を支持することを示す図である。Ａ．電圧開口型電流のピークは単一のニューロンの間で可変であり得るが、これらはＢｒａｉｎＰｈｙｓおよびＡＣＳＦにおいて同様である。各ニューロンを、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの両方中で試験した（黒色対青色のドット）。ノンパラメトリック一対ウィルコクソン検定のＰ値をイタリック体で示す。ヒストグラムは平均値±標準誤差を表す。Ｂ．静止膜電位、自発性活動電位および誘発活動電位は、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で同じであった。Ｃ．光遺伝子（ｏｐｔｏｇｅｎｅ）（シナプシン：Ｃｈｅｔａ−ＹＦＰ）を発現し、ローダミンで充填した典型的なパッチした成熟ニューロン。ニューロン活性の光遺伝学的対照は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で確実に達成することができる。Ｄ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ中で同じパラメーターで試験した単一の成熟ニューロンは、光遺伝学的対照がＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で劇的に改善したことを例示する。Ｅ．単一のニューロンの電圧開口型ＮａｖおよびＫｖ電流（ＩＶ曲線から測定、クランプ−７０ｍＶ、ステップ５ｍＶ）の最大振幅は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（青色のドット）またはＡＣＳＦ（黒色のドット）と比較して、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（赤色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ、オレンジ色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）中で有意に低減した。Ｆ．興奮性（ＡＭＰＡ）および抑制性（ＧＡＢＡ）シナプス活性の両方は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で明らかに明白であった。単一のニューロンの自発性シナプス活性を記録する一方で、異なる培地の灌流は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓが、他の培地、例えば、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａと比較してシナプス機能をより良好に支持することを明らかにした。１２のスイープを灰色で上書きし、これらの１つを明確にするために黒色で強調表示する。Ｇ．ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの存在下でカルシウムイメージングによってネットワークレベルで測定した自発活性。 図２Ａ〜Ｇは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、効率的な活動電位活性を支持することを示す図である。Ａ．電圧開口型電流のピークは単一のニューロンの間で可変であり得るが、これらはＢｒａｉｎＰｈｙｓおよびＡＣＳＦにおいて同様である。各ニューロンを、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの両方中で試験した（黒色対青色のドット）。ノンパラメトリック一対ウィルコクソン検定のＰ値をイタリック体で示す。ヒストグラムは平均値±標準誤差を表す。Ｂ．静止膜電位、自発性活動電位および誘発活動電位は、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で同じであった。Ｃ．光遺伝子（ｏｐｔｏｇｅｎｅ）（シナプシン：Ｃｈｅｔａ−ＹＦＰ）を発現し、ローダミンで充填した典型的なパッチした成熟ニューロン。ニューロン活性の光遺伝学的対照は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で確実に達成することができる。Ｄ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ中で同じパラメーターで試験した単一の成熟ニューロンは、光遺伝学的対照がＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で劇的に改善したことを例示する。Ｅ．単一のニューロンの電圧開口型ＮａｖおよびＫｖ電流（ＩＶ曲線から測定、クランプ−７０ｍＶ、ステップ５ｍＶ）の最大振幅は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（青色のドット）またはＡＣＳＦ（黒色のドット）と比較して、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（赤色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ、オレンジ色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）中で有意に低減した。Ｆ．興奮性（ＡＭＰＡ）および抑制性（ＧＡＢＡ）シナプス活性の両方は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で明らかに明白であった。単一のニューロンの自発性シナプス活性を記録する一方で、異なる培地の灌流は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓが、他の培地、例えば、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａと比較してシナプス機能をより良好に支持することを明らかにした。１２のスイープを灰色で上書きし、これらの１つを明確にするために黒色で強調表示する。Ｇ．ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの存在下でカルシウムイメージングによってネットワークレベルで測定した自発活性。 図２Ａ〜Ｇは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、効率的な活動電位活性を支持することを示す図である。Ａ．電圧開口型電流のピークは単一のニューロンの間で可変であり得るが、これらはＢｒａｉｎＰｈｙｓおよびＡＣＳＦにおいて同様である。各ニューロンを、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの両方中で試験した（黒色対青色のドット）。ノンパラメトリック一対ウィルコクソン検定のＰ値をイタリック体で示す。ヒストグラムは平均値±標準誤差を表す。Ｂ．静止膜電位、自発性活動電位および誘発活動電位は、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で同じであった。Ｃ．光遺伝子（ｏｐｔｏｇｅｎｅ）（シナプシン：Ｃｈｅｔａ−ＹＦＰ）を発現し、ローダミンで充填した典型的なパッチした成熟ニューロン。ニューロン活性の光遺伝学的対照は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で確実に達成することができる。Ｄ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ中で同じパラメーターで試験した単一の成熟ニューロンは、光遺伝学的対照がＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で劇的に改善したことを例示する。Ｅ．単一のニューロンの電圧開口型ＮａｖおよびＫｖ電流（ＩＶ曲線から測定、クランプ−７０ｍＶ、ステップ５ｍＶ）の最大振幅は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（青色のドット）またはＡＣＳＦ（黒色のドット）と比較して、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（赤色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ、オレンジ色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）中で有意に低減した。Ｆ．興奮性（ＡＭＰＡ）および抑制性（ＧＡＢＡ）シナプス活性の両方は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で明らかに明白であった。単一のニューロンの自発性シナプス活性を記録する一方で、異なる培地の灌流は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓが、他の培地、例えば、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａと比較してシナプス機能をより良好に支持することを明らかにした。１２のスイープを灰色で上書きし、これらの１つを明確にするために黒色で強調表示する。Ｇ．ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの存在下でカルシウムイメージングによってネットワークレベルで測定した自発活性。 図２Ａ〜Ｇは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、効率的な活動電位活性を支持することを示す図である。Ａ．電圧開口型電流のピークは単一のニューロンの間で可変であり得るが、これらはＢｒａｉｎＰｈｙｓおよびＡＣＳＦにおいて同様である。各ニューロンを、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの両方中で試験した（黒色対青色のドット）。ノンパラメトリック一対ウィルコクソン検定のＰ値をイタリック体で示す。ヒストグラムは平均値±標準誤差を表す。Ｂ．静止膜電位、自発性活動電位および誘発活動電位は、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で同じであった。Ｃ．光遺伝子（ｏｐｔｏｇｅｎｅ）（シナプシン：Ｃｈｅｔａ−ＹＦＰ）を発現し、ローダミンで充填した典型的なパッチした成熟ニューロン。ニューロン活性の光遺伝学的対照は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で確実に達成することができる。Ｄ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ中で同じパラメーターで試験した単一の成熟ニューロンは、光遺伝学的対照がＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で劇的に改善したことを例示する。Ｅ．単一のニューロンの電圧開口型ＮａｖおよびＫｖ電流（ＩＶ曲線から測定、クランプ−７０ｍＶ、ステップ５ｍＶ）の最大振幅は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（青色のドット）またはＡＣＳＦ（黒色のドット）と比較して、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（赤色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ、オレンジ色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）中で有意に低減した。Ｆ．興奮性（ＡＭＰＡ）および抑制性（ＧＡＢＡ）シナプス活性の両方は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で明らかに明白であった。単一のニューロンの自発性シナプス活性を記録する一方で、異なる培地の灌流は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓが、他の培地、例えば、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａと比較してシナプス機能をより良好に支持することを明らかにした。１２のスイープを灰色で上書きし、これらの１つを明確にするために黒色で強調表示する。Ｇ．ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの存在下でカルシウムイメージングによってネットワークレベルで測定した自発活性。 図２Ａ〜Ｇは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、効率的な活動電位活性を支持することを示す図である。Ａ．電圧開口型電流のピークは単一のニューロンの間で可変であり得るが、これらはＢｒａｉｎＰｈｙｓおよびＡＣＳＦにおいて同様である。各ニューロンを、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの両方中で試験した（黒色対青色のドット）。ノンパラメトリック一対ウィルコクソン検定のＰ値をイタリック体で示す。ヒストグラムは平均値±標準誤差を表す。Ｂ．静止膜電位、自発性活動電位および誘発活動電位は、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で同じであった。Ｃ．光遺伝子（ｏｐｔｏｇｅｎｅ）（シナプシン：Ｃｈｅｔａ−ＹＦＰ）を発現し、ローダミンで充填した典型的なパッチした成熟ニューロン。ニューロン活性の光遺伝学的対照は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で確実に達成することができる。Ｄ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ中で同じパラメーターで試験した単一の成熟ニューロンは、光遺伝学的対照がＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で劇的に改善したことを例示する。Ｅ．単一のニューロンの電圧開口型ＮａｖおよびＫｖ電流（ＩＶ曲線から測定、クランプ−７０ｍＶ、ステップ５ｍＶ）の最大振幅は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（青色のドット）またはＡＣＳＦ（黒色のドット）と比較して、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（赤色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ、オレンジ色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）中で有意に低減した。Ｆ．興奮性（ＡＭＰＡ）および抑制性（ＧＡＢＡ）シナプス活性の両方は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で明らかに明白であった。単一のニューロンの自発性シナプス活性を記録する一方で、異なる培地の灌流は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓが、他の培地、例えば、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａと比較してシナプス機能をより良好に支持することを明らかにした。１２のスイープを灰色で上書きし、これらの１つを明確にするために黒色で強調表示する。Ｇ．ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの存在下でカルシウムイメージングによってネットワークレベルで測定した自発活性。 図２Ａ〜Ｇは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、効率的な活動電位活性を支持することを示す図である。Ａ．電圧開口型電流のピークは単一のニューロンの間で可変であり得るが、これらはＢｒａｉｎＰｈｙｓおよびＡＣＳＦにおいて同様である。各ニューロンを、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの両方中で試験した（黒色対青色のドット）。ノンパラメトリック一対ウィルコクソン検定のＰ値をイタリック体で示す。ヒストグラムは平均値±標準誤差を表す。Ｂ．静止膜電位、自発性活動電位および誘発活動電位は、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で同じであった。Ｃ．光遺伝子（ｏｐｔｏｇｅｎｅ）（シナプシン：Ｃｈｅｔａ−ＹＦＰ）を発現し、ローダミンで充填した典型的なパッチした成熟ニューロン。ニューロン活性の光遺伝学的対照は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で確実に達成することができる。Ｄ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ中で同じパラメーターで試験した単一の成熟ニューロンは、光遺伝学的対照がＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で劇的に改善したことを例示する。Ｅ．単一のニューロンの電圧開口型ＮａｖおよびＫｖ電流（ＩＶ曲線から測定、クランプ−７０ｍＶ、ステップ５ｍＶ）の最大振幅は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（青色のドット）またはＡＣＳＦ（黒色のドット）と比較して、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（赤色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ、オレンジ色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）中で有意に低減した。Ｆ．興奮性（ＡＭＰＡ）および抑制性（ＧＡＢＡ）シナプス活性の両方は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で明らかに明白であった。単一のニューロンの自発性シナプス活性を記録する一方で、異なる培地の灌流は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓが、他の培地、例えば、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａと比較してシナプス機能をより良好に支持することを明らかにした。１２のスイープを灰色で上書きし、これらの１つを明確にするために黒色で強調表示する。Ｇ．ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの存在下でカルシウムイメージングによってネットワークレベルで測定した自発活性。 図２Ａ〜Ｇは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、効率的な活動電位活性を支持することを示す図である。Ａ．電圧開口型電流のピークは単一のニューロンの間で可変であり得るが、これらはＢｒａｉｎＰｈｙｓおよびＡＣＳＦにおいて同様である。各ニューロンを、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの両方中で試験した（黒色対青色のドット）。ノンパラメトリック一対ウィルコクソン検定のＰ値をイタリック体で示す。ヒストグラムは平均値±標準誤差を表す。Ｂ．静止膜電位、自発性活動電位および誘発活動電位は、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で同じであった。Ｃ．光遺伝子（ｏｐｔｏｇｅｎｅ）（シナプシン：Ｃｈｅｔａ−ＹＦＰ）を発現し、ローダミンで充填した典型的なパッチした成熟ニューロン。ニューロン活性の光遺伝学的対照は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で確実に達成することができる。Ｄ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ中で同じパラメーターで試験した単一の成熟ニューロンは、光遺伝学的対照がＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で劇的に改善したことを例示する。Ｅ．単一のニューロンの電圧開口型ＮａｖおよびＫｖ電流（ＩＶ曲線から測定、クランプ−７０ｍＶ、ステップ５ｍＶ）の最大振幅は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（青色のドット）またはＡＣＳＦ（黒色のドット）と比較して、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（赤色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ、オレンジ色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）中で有意に低減した。Ｆ．興奮性（ＡＭＰＡ）および抑制性（ＧＡＢＡ）シナプス活性の両方は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で明らかに明白であった。単一のニューロンの自発性シナプス活性を記録する一方で、異なる培地の灌流は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓが、他の培地、例えば、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａと比較してシナプス機能をより良好に支持することを明らかにした。１２のスイープを灰色で上書きし、これらの１つを明確にするために黒色で強調表示する。Ｇ．ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの存在下でカルシウムイメージングによってネットワークレベルで測定した自発活性。 図２Ａ〜Ｇは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、効率的な活動電位活性を支持することを示す図である。Ａ．電圧開口型電流のピークは単一のニューロンの間で可変であり得るが、これらはＢｒａｉｎＰｈｙｓおよびＡＣＳＦにおいて同様である。各ニューロンを、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの両方中で試験した（黒色対青色のドット）。ノンパラメトリック一対ウィルコクソン検定のＰ値をイタリック体で示す。ヒストグラムは平均値±標準誤差を表す。Ｂ．静止膜電位、自発性活動電位および誘発活動電位は、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で同じであった。Ｃ．光遺伝子（ｏｐｔｏｇｅｎｅ）（シナプシン：Ｃｈｅｔａ−ＹＦＰ）を発現し、ローダミンで充填した典型的なパッチした成熟ニューロン。ニューロン活性の光遺伝学的対照は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で確実に達成することができる。Ｄ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ中で同じパラメーターで試験した単一の成熟ニューロンは、光遺伝学的対照がＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で劇的に改善したことを例示する。Ｅ．単一のニューロンの電圧開口型ＮａｖおよびＫｖ電流（ＩＶ曲線から測定、クランプ−７０ｍＶ、ステップ５ｍＶ）の最大振幅は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（青色のドット）またはＡＣＳＦ（黒色のドット）と比較して、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（赤色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ、オレンジ色のドット＝Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）中で有意に低減した。Ｆ．興奮性（ＡＭＰＡ）および抑制性（ＧＡＢＡ）シナプス活性の両方は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で明らかに明白であった。単一のニューロンの自発性シナプス活性を記録する一方で、異なる培地の灌流は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓが、他の培地、例えば、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａと比較してシナプス機能をより良好に支持することを明らかにした。１２のスイープを灰色で上書きし、これらの１つを明確にするために黒色で強調表示する。Ｇ．ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの存在下でカルシウムイメージングによってネットワークレベルで測定した自発活性。

図３Ａ〜Ｄは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中の好ましい成熟および活性ヒトニューロンの培養物を示す図である。Ａ．補充物を有するＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で４週間超成長させた典型的なヒトＩＰＳＣに由来するニューロン培養物の免疫染色。Ｂ〜Ｃ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓ＋補充物中で３〜６週間成熟させた典型的な機能的ニューロンの電気生理学的活性。パッチクランプ記録をまた、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で行った。Ｂ．左から右へ：小さな５００ｍｓの脱分極ステップの電流、または光の短時間のフラッシュによって誘発された一連の活動電位（ｓｙｎ：Ｃｈｅｔａ−ＹＦＰ）。典型的な電圧依存性Ｎａ＋およびカリウム電流を示すＩＶトレース（クランプ−７０ｍＶ、ステップ５ｍＶ）。電流クランプにおいて記録した自発性活動電位。Ｃ．ＡＭＰＡ受容体（ＮＢＱＸに対して感受性である、−７０ｍＶでの電圧クランプ）およびＧＡＢＡ受容体（ガバジンに対して感受性である、０ｍＶでの電圧クランプ）によって媒介される自発性シナプス事象。Ｄ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓ＋補充物中で成長し、記録した神経ネットワークの典型的な活性を示すカルシウムイメージング。時系列分析は、対象とする活性領域についてプロットする。 図３Ａ〜Ｄは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中の好ましい成熟および活性ヒトニューロンの培養物を示す図である。Ａ．補充物を有するＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で４週間超成長させた典型的なヒトＩＰＳＣに由来するニューロン培養物の免疫染色。Ｂ〜Ｃ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓ＋補充物中で３〜６週間成熟させた典型的な機能的ニューロンの電気生理学的活性。パッチクランプ記録をまた、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で行った。Ｂ．左から右へ：小さな５００ｍｓの脱分極ステップの電流、または光の短時間のフラッシュによって誘発された一連の活動電位（ｓｙｎ：Ｃｈｅｔａ−ＹＦＰ）。典型的な電圧依存性Ｎａ＋およびカリウム電流を示すＩＶトレース（クランプ−７０ｍＶ、ステップ５ｍＶ）。電流クランプにおいて記録した自発性活動電位。Ｃ．ＡＭＰＡ受容体（ＮＢＱＸに対して感受性である、−７０ｍＶでの電圧クランプ）およびＧＡＢＡ受容体（ガバジンに対して感受性である、０ｍＶでの電圧クランプ）によって媒介される自発性シナプス事象。Ｄ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓ＋補充物中で成長し、記録した神経ネットワークの典型的な活性を示すカルシウムイメージング。時系列分析は、対象とする活性領域についてプロットする。 図３Ａ〜Ｄは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中の好ましい成熟および活性ヒトニューロンの培養物を示す図である。Ａ．補充物を有するＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で４週間超成長させた典型的なヒトＩＰＳＣに由来するニューロン培養物の免疫染色。Ｂ〜Ｃ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓ＋補充物中で３〜６週間成熟させた典型的な機能的ニューロンの電気生理学的活性。パッチクランプ記録をまた、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で行った。Ｂ．左から右へ：小さな５００ｍｓの脱分極ステップの電流、または光の短時間のフラッシュによって誘発された一連の活動電位（ｓｙｎ：Ｃｈｅｔａ−ＹＦＰ）。典型的な電圧依存性Ｎａ＋およびカリウム電流を示すＩＶトレース（クランプ−７０ｍＶ、ステップ５ｍＶ）。電流クランプにおいて記録した自発性活動電位。Ｃ．ＡＭＰＡ受容体（ＮＢＱＸに対して感受性である、−７０ｍＶでの電圧クランプ）およびＧＡＢＡ受容体（ガバジンに対して感受性である、０ｍＶでの電圧クランプ）によって媒介される自発性シナプス事象。Ｄ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓ＋補充物中で成長し、記録した神経ネットワークの典型的な活性を示すカルシウムイメージング。時系列分析は、対象とする活性領域についてプロットする。 図３Ａ〜Ｄは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中の好ましい成熟および活性ヒトニューロンの培養物を示す図である。Ａ．補充物を有するＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で４週間超成長させた典型的なヒトＩＰＳＣに由来するニューロン培養物の免疫染色。Ｂ〜Ｃ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓ＋補充物中で３〜６週間成熟させた典型的な機能的ニューロンの電気生理学的活性。パッチクランプ記録をまた、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で行った。Ｂ．左から右へ：小さな５００ｍｓの脱分極ステップの電流、または光の短時間のフラッシュによって誘発された一連の活動電位（ｓｙｎ：Ｃｈｅｔａ−ＹＦＰ）。典型的な電圧依存性Ｎａ＋およびカリウム電流を示すＩＶトレース（クランプ−７０ｍＶ、ステップ５ｍＶ）。電流クランプにおいて記録した自発性活動電位。Ｃ．ＡＭＰＡ受容体（ＮＢＱＸに対して感受性である、−７０ｍＶでの電圧クランプ）およびＧＡＢＡ受容体（ガバジンに対して感受性である、０ｍＶでの電圧クランプ）によって媒介される自発性シナプス事象。Ｄ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓ＋補充物中で成長し、記録した神経ネットワークの典型的な活性を示すカルシウムイメージング。時系列分析は、対象とする活性領域についてプロットする。

図４Ａ〜Ｊは、ＤＭＥＭ／ｆ１２またはＮｅｕｒｏｂａｓａｌをベースとする培地と比較した、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で培養したヒトニューロンの特性決定を示す図である。Ａ〜Ｇ．並列させて成長させた３種の培養物において観察される代表的な免疫染色。核を、ＤＡＰＩ（青色）で染色した。いくらかの可変性にも関わらず、ヒトニューロンの生存、ニューロンサブタイプ（例えば、ドパミン作動性、ＧＡＢＡ作動性）の割合、および近位シナプスの点の数の間で明らかな差異は見出されなかった。Ｈ．ニューロンの機能タイプを、５００ｍｓの脱分極ステップの電流に反応するこれらの発射パターンに基づいて定義した。Ｉ．機能的成熟に対するＢｒａｉｎＰｈｙｓの影響を特性決定するために、ニューロンを同じプレートにおいてＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２をベースとする培地中のいずれかで培養した。パッチクランプ法を、ＡＣＳＦ中で盲検的に行った。より高い割合の成熟タイプ５ニューロンが、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物において見出された。ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物はまた、機能的ＡＭＰＡシナプス入力（ＮＢＱＸ感受性）またはＧＡＢＡシナプス入力（ガバジン感受性）を受ける、より高い割合のニューロン（タイプ３、４および５）を示した。これは、電圧クランプ（それぞれ、−７０ｍＶまたは０ｍＶ）において４分の記録にわたり特有のキネティクスを伴う少なくとも５つの自発性シナプス事象を有することによって決定された。Ｊ．様々なｉＰＳ細胞系から得て、ＡＣＳＦ中でパッチしたニューロンのより大きな試料のさらなる分析によって、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中でニューロンを培養することは、シナプス性活性ニューロンを得る機会を著しく増加させることが確認された。 図４Ａ〜Ｊは、ＤＭＥＭ／ｆ１２またはＮｅｕｒｏｂａｓａｌをベースとする培地と比較した、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で培養したヒトニューロンの特性決定を示す図である。Ａ〜Ｇ．並列させて成長させた３種の培養物において観察される代表的な免疫染色。核を、ＤＡＰＩ（青色）で染色した。いくらかの可変性にも関わらず、ヒトニューロンの生存、ニューロンサブタイプ（例えば、ドパミン作動性、ＧＡＢＡ作動性）の割合、および近位シナプスの点の数の間で明らかな差異は見出されなかった。Ｈ．ニューロンの機能タイプを、５００ｍｓの脱分極ステップの電流に反応するこれらの発射パターンに基づいて定義した。Ｉ．機能的成熟に対するＢｒａｉｎＰｈｙｓの影響を特性決定するために、ニューロンを同じプレートにおいてＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２をベースとする培地中のいずれかで培養した。パッチクランプ法を、ＡＣＳＦ中で盲検的に行った。より高い割合の成熟タイプ５ニューロンが、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物において見出された。ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物はまた、機能的ＡＭＰＡシナプス入力（ＮＢＱＸ感受性）またはＧＡＢＡシナプス入力（ガバジン感受性）を受ける、より高い割合のニューロン（タイプ３、４および５）を示した。これは、電圧クランプ（それぞれ、−７０ｍＶまたは０ｍＶ）において４分の記録にわたり特有のキネティクスを伴う少なくとも５つの自発性シナプス事象を有することによって決定された。Ｊ．様々なｉＰＳ細胞系から得て、ＡＣＳＦ中でパッチしたニューロンのより大きな試料のさらなる分析によって、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中でニューロンを培養することは、シナプス性活性ニューロンを得る機会を著しく増加させることが確認された。 図４Ａ〜Ｊは、ＤＭＥＭ／ｆ１２またはＮｅｕｒｏｂａｓａｌをベースとする培地と比較した、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で培養したヒトニューロンの特性決定を示す図である。Ａ〜Ｇ．並列させて成長させた３種の培養物において観察される代表的な免疫染色。核を、ＤＡＰＩ（青色）で染色した。いくらかの可変性にも関わらず、ヒトニューロンの生存、ニューロンサブタイプ（例えば、ドパミン作動性、ＧＡＢＡ作動性）の割合、および近位シナプスの点の数の間で明らかな差異は見出されなかった。Ｈ．ニューロンの機能タイプを、５００ｍｓの脱分極ステップの電流に反応するこれらの発射パターンに基づいて定義した。Ｉ．機能的成熟に対するＢｒａｉｎＰｈｙｓの影響を特性決定するために、ニューロンを同じプレートにおいてＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２をベースとする培地中のいずれかで培養した。パッチクランプ法を、ＡＣＳＦ中で盲検的に行った。より高い割合の成熟タイプ５ニューロンが、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物において見出された。ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物はまた、機能的ＡＭＰＡシナプス入力（ＮＢＱＸ感受性）またはＧＡＢＡシナプス入力（ガバジン感受性）を受ける、より高い割合のニューロン（タイプ３、４および５）を示した。これは、電圧クランプ（それぞれ、−７０ｍＶまたは０ｍＶ）において４分の記録にわたり特有のキネティクスを伴う少なくとも５つの自発性シナプス事象を有することによって決定された。Ｊ．様々なｉＰＳ細胞系から得て、ＡＣＳＦ中でパッチしたニューロンのより大きな試料のさらなる分析によって、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中でニューロンを培養することは、シナプス性活性ニューロンを得る機会を著しく増加させることが確認された。 図４Ａ〜Ｊは、ＤＭＥＭ／ｆ１２またはＮｅｕｒｏｂａｓａｌをベースとする培地と比較した、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で培養したヒトニューロンの特性決定を示す図である。Ａ〜Ｇ．並列させて成長させた３種の培養物において観察される代表的な免疫染色。核を、ＤＡＰＩ（青色）で染色した。いくらかの可変性にも関わらず、ヒトニューロンの生存、ニューロンサブタイプ（例えば、ドパミン作動性、ＧＡＢＡ作動性）の割合、および近位シナプスの点の数の間で明らかな差異は見出されなかった。Ｈ．ニューロンの機能タイプを、５００ｍｓの脱分極ステップの電流に反応するこれらの発射パターンに基づいて定義した。Ｉ．機能的成熟に対するＢｒａｉｎＰｈｙｓの影響を特性決定するために、ニューロンを同じプレートにおいてＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２をベースとする培地中のいずれかで培養した。パッチクランプ法を、ＡＣＳＦ中で盲検的に行った。より高い割合の成熟タイプ５ニューロンが、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物において見出された。ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物はまた、機能的ＡＭＰＡシナプス入力（ＮＢＱＸ感受性）またはＧＡＢＡシナプス入力（ガバジン感受性）を受ける、より高い割合のニューロン（タイプ３、４および５）を示した。これは、電圧クランプ（それぞれ、−７０ｍＶまたは０ｍＶ）において４分の記録にわたり特有のキネティクスを伴う少なくとも５つの自発性シナプス事象を有することによって決定された。Ｊ．様々なｉＰＳ細胞系から得て、ＡＣＳＦ中でパッチしたニューロンのより大きな試料のさらなる分析によって、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中でニューロンを培養することは、シナプス性活性ニューロンを得る機会を著しく増加させることが確認された。 図４Ａ〜Ｊは、ＤＭＥＭ／ｆ１２またはＮｅｕｒｏｂａｓａｌをベースとする培地と比較した、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で培養したヒトニューロンの特性決定を示す図である。Ａ〜Ｇ．並列させて成長させた３種の培養物において観察される代表的な免疫染色。核を、ＤＡＰＩ（青色）で染色した。いくらかの可変性にも関わらず、ヒトニューロンの生存、ニューロンサブタイプ（例えば、ドパミン作動性、ＧＡＢＡ作動性）の割合、および近位シナプスの点の数の間で明らかな差異は見出されなかった。Ｈ．ニューロンの機能タイプを、５００ｍｓの脱分極ステップの電流に反応するこれらの発射パターンに基づいて定義した。Ｉ．機能的成熟に対するＢｒａｉｎＰｈｙｓの影響を特性決定するために、ニューロンを同じプレートにおいてＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２をベースとする培地中のいずれかで培養した。パッチクランプ法を、ＡＣＳＦ中で盲検的に行った。より高い割合の成熟タイプ５ニューロンが、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物において見出された。ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物はまた、機能的ＡＭＰＡシナプス入力（ＮＢＱＸ感受性）またはＧＡＢＡシナプス入力（ガバジン感受性）を受ける、より高い割合のニューロン（タイプ３、４および５）を示した。これは、電圧クランプ（それぞれ、−７０ｍＶまたは０ｍＶ）において４分の記録にわたり特有のキネティクスを伴う少なくとも５つの自発性シナプス事象を有することによって決定された。Ｊ．様々なｉＰＳ細胞系から得て、ＡＣＳＦ中でパッチしたニューロンのより大きな試料のさらなる分析によって、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中でニューロンを培養することは、シナプス性活性ニューロンを得る機会を著しく増加させることが確認された。 図４Ａ〜Ｊは、ＤＭＥＭ／ｆ１２またはＮｅｕｒｏｂａｓａｌをベースとする培地と比較した、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で培養したヒトニューロンの特性決定を示す図である。Ａ〜Ｇ．並列させて成長させた３種の培養物において観察される代表的な免疫染色。核を、ＤＡＰＩ（青色）で染色した。いくらかの可変性にも関わらず、ヒトニューロンの生存、ニューロンサブタイプ（例えば、ドパミン作動性、ＧＡＢＡ作動性）の割合、および近位シナプスの点の数の間で明らかな差異は見出されなかった。Ｈ．ニューロンの機能タイプを、５００ｍｓの脱分極ステップの電流に反応するこれらの発射パターンに基づいて定義した。Ｉ．機能的成熟に対するＢｒａｉｎＰｈｙｓの影響を特性決定するために、ニューロンを同じプレートにおいてＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２をベースとする培地中のいずれかで培養した。パッチクランプ法を、ＡＣＳＦ中で盲検的に行った。より高い割合の成熟タイプ５ニューロンが、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物において見出された。ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物はまた、機能的ＡＭＰＡシナプス入力（ＮＢＱＸ感受性）またはＧＡＢＡシナプス入力（ガバジン感受性）を受ける、より高い割合のニューロン（タイプ３、４および５）を示した。これは、電圧クランプ（それぞれ、−７０ｍＶまたは０ｍＶ）において４分の記録にわたり特有のキネティクスを伴う少なくとも５つの自発性シナプス事象を有することによって決定された。Ｊ．様々なｉＰＳ細胞系から得て、ＡＣＳＦ中でパッチしたニューロンのより大きな試料のさらなる分析によって、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中でニューロンを培養することは、シナプス性活性ニューロンを得る機会を著しく増加させることが確認された。 図４Ａ〜Ｊは、ＤＭＥＭ／ｆ１２またはＮｅｕｒｏｂａｓａｌをベースとする培地と比較した、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で培養したヒトニューロンの特性決定を示す図である。Ａ〜Ｇ．並列させて成長させた３種の培養物において観察される代表的な免疫染色。核を、ＤＡＰＩ（青色）で染色した。いくらかの可変性にも関わらず、ヒトニューロンの生存、ニューロンサブタイプ（例えば、ドパミン作動性、ＧＡＢＡ作動性）の割合、および近位シナプスの点の数の間で明らかな差異は見出されなかった。Ｈ．ニューロンの機能タイプを、５００ｍｓの脱分極ステップの電流に反応するこれらの発射パターンに基づいて定義した。Ｉ．機能的成熟に対するＢｒａｉｎＰｈｙｓの影響を特性決定するために、ニューロンを同じプレートにおいてＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２をベースとする培地中のいずれかで培養した。パッチクランプ法を、ＡＣＳＦ中で盲検的に行った。より高い割合の成熟タイプ５ニューロンが、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物において見出された。ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物はまた、機能的ＡＭＰＡシナプス入力（ＮＢＱＸ感受性）またはＧＡＢＡシナプス入力（ガバジン感受性）を受ける、より高い割合のニューロン（タイプ３、４および５）を示した。これは、電圧クランプ（それぞれ、−７０ｍＶまたは０ｍＶ）において４分の記録にわたり特有のキネティクスを伴う少なくとも５つの自発性シナプス事象を有することによって決定された。Ｊ．様々なｉＰＳ細胞系から得て、ＡＣＳＦ中でパッチしたニューロンのより大きな試料のさらなる分析によって、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中でニューロンを培養することは、シナプス性活性ニューロンを得る機会を著しく増加させることが確認された。 図４Ａ〜Ｊは、ＤＭＥＭ／ｆ１２またはＮｅｕｒｏｂａｓａｌをベースとする培地と比較した、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で培養したヒトニューロンの特性決定を示す図である。Ａ〜Ｇ．並列させて成長させた３種の培養物において観察される代表的な免疫染色。核を、ＤＡＰＩ（青色）で染色した。いくらかの可変性にも関わらず、ヒトニューロンの生存、ニューロンサブタイプ（例えば、ドパミン作動性、ＧＡＢＡ作動性）の割合、および近位シナプスの点の数の間で明らかな差異は見出されなかった。Ｈ．ニューロンの機能タイプを、５００ｍｓの脱分極ステップの電流に反応するこれらの発射パターンに基づいて定義した。Ｉ．機能的成熟に対するＢｒａｉｎＰｈｙｓの影響を特性決定するために、ニューロンを同じプレートにおいてＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２をベースとする培地中のいずれかで培養した。パッチクランプ法を、ＡＣＳＦ中で盲検的に行った。より高い割合の成熟タイプ５ニューロンが、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物において見出された。ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物はまた、機能的ＡＭＰＡシナプス入力（ＮＢＱＸ感受性）またはＧＡＢＡシナプス入力（ガバジン感受性）を受ける、より高い割合のニューロン（タイプ３、４および５）を示した。これは、電圧クランプ（それぞれ、−７０ｍＶまたは０ｍＶ）において４分の記録にわたり特有のキネティクスを伴う少なくとも５つの自発性シナプス事象を有することによって決定された。Ｊ．様々なｉＰＳ細胞系から得て、ＡＣＳＦ中でパッチしたニューロンのより大きな試料のさらなる分析によって、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中でニューロンを培養することは、シナプス性活性ニューロンを得る機会を著しく増加させることが確認された。 図４Ａ〜Ｊは、ＤＭＥＭ／ｆ１２またはＮｅｕｒｏｂａｓａｌをベースとする培地と比較した、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で培養したヒトニューロンの特性決定を示す図である。Ａ〜Ｇ．並列させて成長させた３種の培養物において観察される代表的な免疫染色。核を、ＤＡＰＩ（青色）で染色した。いくらかの可変性にも関わらず、ヒトニューロンの生存、ニューロンサブタイプ（例えば、ドパミン作動性、ＧＡＢＡ作動性）の割合、および近位シナプスの点の数の間で明らかな差異は見出されなかった。Ｈ．ニューロンの機能タイプを、５００ｍｓの脱分極ステップの電流に反応するこれらの発射パターンに基づいて定義した。Ｉ．機能的成熟に対するＢｒａｉｎＰｈｙｓの影響を特性決定するために、ニューロンを同じプレートにおいてＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２をベースとする培地中のいずれかで培養した。パッチクランプ法を、ＡＣＳＦ中で盲検的に行った。より高い割合の成熟タイプ５ニューロンが、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物において見出された。ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物はまた、機能的ＡＭＰＡシナプス入力（ＮＢＱＸ感受性）またはＧＡＢＡシナプス入力（ガバジン感受性）を受ける、より高い割合のニューロン（タイプ３、４および５）を示した。これは、電圧クランプ（それぞれ、−７０ｍＶまたは０ｍＶ）において４分の記録にわたり特有のキネティクスを伴う少なくとも５つの自発性シナプス事象を有することによって決定された。Ｊ．様々なｉＰＳ細胞系から得て、ＡＣＳＦ中でパッチしたニューロンのより大きな試料のさらなる分析によって、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中でニューロンを培養することは、シナプス性活性ニューロンを得る機会を著しく増加させることが確認された。 図４Ａ〜Ｊは、ＤＭＥＭ／ｆ１２またはＮｅｕｒｏｂａｓａｌをベースとする培地と比較した、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地中で培養したヒトニューロンの特性決定を示す図である。Ａ〜Ｇ．並列させて成長させた３種の培養物において観察される代表的な免疫染色。核を、ＤＡＰＩ（青色）で染色した。いくらかの可変性にも関わらず、ヒトニューロンの生存、ニューロンサブタイプ（例えば、ドパミン作動性、ＧＡＢＡ作動性）の割合、および近位シナプスの点の数の間で明らかな差異は見出されなかった。Ｈ．ニューロンの機能タイプを、５００ｍｓの脱分極ステップの電流に反応するこれらの発射パターンに基づいて定義した。Ｉ．機能的成熟に対するＢｒａｉｎＰｈｙｓの影響を特性決定するために、ニューロンを同じプレートにおいてＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２をベースとする培地中のいずれかで培養した。パッチクランプ法を、ＡＣＳＦ中で盲検的に行った。より高い割合の成熟タイプ５ニューロンが、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物において見出された。ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物はまた、機能的ＡＭＰＡシナプス入力（ＮＢＱＸ感受性）またはＧＡＢＡシナプス入力（ガバジン感受性）を受ける、より高い割合のニューロン（タイプ３、４および５）を示した。これは、電圧クランプ（それぞれ、−７０ｍＶまたは０ｍＶ）において４分の記録にわたり特有のキネティクスを伴う少なくとも５つの自発性シナプス事象を有することによって決定された。Ｊ．様々なｉＰＳ細胞系から得て、ＡＣＳＦ中でパッチしたニューロンのより大きな試料のさらなる分析によって、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中でニューロンを培養することは、シナプス性活性ニューロンを得る機会を著しく増加させることが確認された。

図５Ａ〜Ｃは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとするニューロン培地は、効率的な直接のニューロン変換（ｉＮ）、およびヒトｉＮ細胞の機能的成熟を可能とし、ＡＲＣタンパク質発現を増加させることを示す図である。Ａ．実験計画：ｉＮ−コンピテントＨＤＦを、ＮＣ培地中で３週間変換した。成熟のために、ｉＮ細胞をアストロサイト上に再配置し、ＮＭ培地中でさらに培養した。Ｂ．３週間の変換に続くベータ−ＩＩＩ−チューブリン、ｈＴａｕ、ＭＡＰ２ａｂおよびＮｅｕＮについての免疫蛍光染色。スケール：５０μｍ。Ｃ．アストロサイト上の成熟に続く６週齢のｉＮ細胞におけるｈＴａｕおよびＡＲＣについての免疫蛍光染色の代表的な画像、および分析。ＩｍａｇｅＪにおけるＲＯＩ選択および測定を使用した定量化。スケール：１００μｍ。３人のドナーに由来するｉＮ培養物中のニューロンのＡＲＣレベルの定量化。灰色のポイントは、個々の細胞を表す（群毎に平均ｎ＝３８、群毎に最小ｎ＝１９）。バーは、各群の平均値±ＳＥＭを示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図５Ａ〜Ｃは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとするニューロン培地は、効率的な直接のニューロン変換（ｉＮ）、およびヒトｉＮ細胞の機能的成熟を可能とし、ＡＲＣタンパク質発現を増加させることを示す図である。Ａ．実験計画：ｉＮ−コンピテントＨＤＦを、ＮＣ培地中で３週間変換した。成熟のために、ｉＮ細胞をアストロサイト上に再配置し、ＮＭ培地中でさらに培養した。Ｂ．３週間の変換に続くベータ−ＩＩＩ−チューブリン、ｈＴａｕ、ＭＡＰ２ａｂおよびＮｅｕＮについての免疫蛍光染色。スケール：５０μｍ。Ｃ．アストロサイト上の成熟に続く６週齢のｉＮ細胞におけるｈＴａｕおよびＡＲＣについての免疫蛍光染色の代表的な画像、および分析。ＩｍａｇｅＪにおけるＲＯＩ選択および測定を使用した定量化。スケール：１００μｍ。３人のドナーに由来するｉＮ培養物中のニューロンのＡＲＣレベルの定量化。灰色のポイントは、個々の細胞を表す（群毎に平均ｎ＝３８、群毎に最小ｎ＝１９）。バーは、各群の平均値±ＳＥＭを示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図５Ａ〜Ｃは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとするニューロン培地は、効率的な直接のニューロン変換（ｉＮ）、およびヒトｉＮ細胞の機能的成熟を可能とし、ＡＲＣタンパク質発現を増加させることを示す図である。Ａ．実験計画：ｉＮ−コンピテントＨＤＦを、ＮＣ培地中で３週間変換した。成熟のために、ｉＮ細胞をアストロサイト上に再配置し、ＮＭ培地中でさらに培養した。Ｂ．３週間の変換に続くベータ−ＩＩＩ−チューブリン、ｈＴａｕ、ＭＡＰ２ａｂおよびＮｅｕＮについての免疫蛍光染色。スケール：５０μｍ。Ｃ．アストロサイト上の成熟に続く６週齢のｉＮ細胞におけるｈＴａｕおよびＡＲＣについての免疫蛍光染色の代表的な画像、および分析。ＩｍａｇｅＪにおけるＲＯＩ選択および測定を使用した定量化。スケール：１００μｍ。３人のドナーに由来するｉＮ培養物中のニューロンのＡＲＣレベルの定量化。灰色のポイントは、個々の細胞を表す（群毎に平均ｎ＝３８、群毎に最小ｎ＝１９）。バーは、各群の平均値±ＳＥＭを示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

図６Ａ〜Ｃは、多電極配列（ＭＥＡ）を使用し、現在使用されている条件と比較した数週間にわたるＢｒａｉｎＰｈｙｓ中のヒトニューロンの電気的活性の試験を示す図である。ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、長期間のニューロン活性を改善させる。Ａ．血清（例えば、ノックアウト血清、ウシ胎仔血清ＦＢＳ）を成熟培地に加えることは、ニューロン機能を強く損なう。Ｂ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、試験したＮＢ／ＤＭＥＭＦ１２混合物またはＤＭＥＭ／Ｆ１２と比較して、供給サイクルによる可変性を低減させ、長期間のニューロン機能を改善および維持する。Ｃ．補充されてはいるが、血清を含まないＢｒａｉｎＰｈｙｓは、同一の無血清補充物を有するｉＣｅｌｌニューロン培地またはＮｅｕｒｏｂａｓａｌと比較して、ニューロン活性を改善し、数週間持続させる。 図６Ａ〜Ｃは、多電極配列（ＭＥＡ）を使用し、現在使用されている条件と比較した数週間にわたるＢｒａｉｎＰｈｙｓ中のヒトニューロンの電気的活性の試験を示す図である。ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、長期間のニューロン活性を改善させる。Ａ．血清（例えば、ノックアウト血清、ウシ胎仔血清ＦＢＳ）を成熟培地に加えることは、ニューロン機能を強く損なう。Ｂ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、試験したＮＢ／ＤＭＥＭＦ１２混合物またはＤＭＥＭ／Ｆ１２と比較して、供給サイクルによる可変性を低減させ、長期間のニューロン機能を改善および維持する。Ｃ．補充されてはいるが、血清を含まないＢｒａｉｎＰｈｙｓは、同一の無血清補充物を有するｉＣｅｌｌニューロン培地またはＮｅｕｒｏｂａｓａｌと比較して、ニューロン活性を改善し、数週間持続させる。

図７Ａ〜Ｃは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ＋補充物中で培養したパーキンソン患者のｉＰＳＣに由来するニューロンの活性を示す図である。Ａ．ｉＰＳＣに由来するニューロンの発生を示すダイアグラム。Ｂ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中での培養の後のＴＵＪ−１およびＧＦＡＰについて染色した、パーキンソン患者のｉＰＳＣに由来する生きたおよび活性脳細胞。Ｃ．健康な被験体およびパーキンソン患者からの神経細胞の活性。

図８Ａ〜Ｇは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中の好ましいおよび活性なラットの初代海馬ニューロンの分化を示す図である。Ａ〜Ｇ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓ＋補充物（ｓｍ１）中で２〜３週間成長させた典型的な機能的ニューロンの電気生理学的活性。Ａ．ラット海馬からの初代ニューロンをＢｒａｉｎＰｈｙｓ＋ｓｍ１中で２週間超培養し、次いで、機能的分析したことを示すダイアグラム。Ｂ．ローダミンで充填した典型的なパッチクランプしたニューロンの画像。右側の明るい白色の影は、ローダミンを充填したパッチピペットである。Ｃ．小さな５００ｍｓの脱分極ステップの電流によって誘発される一連の活動電位、ならびに典型的な電圧依存性Ｎａ＋およびＫ＋電流を示すＩＶトレース（クランプ−７０ｍＶ、ステップ５ｍＶ）。有色のトレースは、異なる電圧ステップに対応する。Ｄ．電流クランプにおいて記録された自発性活動電位。Ｅ．（０ｍＶ）での電圧クランプにおいて記録された自発性ＧＡＢＡシナプス事象。Ｆ．電圧クランプ（−７０ｍＶ）において記録された自発性ＡＭＰＡシナプス事象。Ｇ．カバースリップをパッチした後で固定し、免疫組織化学のために処理した。樹状突起をＭＡＰ２で染色し、シナプス前終末をシナプシンで染色し、核をＤＡＰＩで染色した。 図８Ａ〜Ｇは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中の好ましいおよび活性なラットの初代海馬ニューロンの分化を示す図である。Ａ〜Ｇ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓ＋補充物（ｓｍ１）中で２〜３週間成長させた典型的な機能的ニューロンの電気生理学的活性。Ａ．ラット海馬からの初代ニューロンをＢｒａｉｎＰｈｙｓ＋ｓｍ１中で２週間超培養し、次いで、機能的分析したことを示すダイアグラム。Ｂ．ローダミンで充填した典型的なパッチクランプしたニューロンの画像。右側の明るい白色の影は、ローダミンを充填したパッチピペットである。Ｃ．小さな５００ｍｓの脱分極ステップの電流によって誘発される一連の活動電位、ならびに典型的な電圧依存性Ｎａ＋およびＫ＋電流を示すＩＶトレース（クランプ−７０ｍＶ、ステップ５ｍＶ）。有色のトレースは、異なる電圧ステップに対応する。Ｄ．電流クランプにおいて記録された自発性活動電位。Ｅ．（０ｍＶ）での電圧クランプにおいて記録された自発性ＧＡＢＡシナプス事象。Ｆ．電圧クランプ（−７０ｍＶ）において記録された自発性ＡＭＰＡシナプス事象。Ｇ．カバースリップをパッチした後で固定し、免疫組織化学のために処理した。樹状突起をＭＡＰ２で染色し、シナプス前終末をシナプシンで染色し、核をＤＡＰＩで染色した。

図９Ａ〜Ｃは、ＤＭＥＭは全ての検査したニューロンの膜電位を脱分極させ、殆どの場合、これはまた自発性活動電位発射を飽和させ、停止させたことを示す図である。トレースは、ＡＣＳＦまたはＤＭＥＭ中の幹細胞に由来するヒトニューロンのホールセル電流クランプ自発性記録から得た。Ａ．ＤＭＥＭが活動電位発射を飽和させ、停止させなかったまれな例。Ｂ〜Ｃ．ＤＭＥＭにより誘導される脱分極が自発性活動電位発射を停止させた、さらに２つの典型的な例。

図１０は、ＤＭＥＭは、大きなＣｌ−電流を誘導し、自発性抑制性シナプス活性を遮断することを示す図である。ＤＭＥＭによって遮断され、回復することができるＡＣＳＦ中の自発性ＧＡＢＡシナプス活性を示す、典型的なニューロンの電圧クランプ記録（０ｍＶ）。上のトレースは、典型的なＧＡＢＡ事象を表すが、これはＡＣＳＦ中で見られるが、ＤＭＥＭ中で見られなかった。下のトレースは、灌流を次々に行った間の対応する連続記録であり、ＤＭＥＭ灌流の開始時の大きなＣｌ−流入、その後に続くプラトーを示す。

図１１Ａ〜Ｄは、培地の全てのビタミン、全てのアミノ酸または全てのその他の構成要素を除去したＤＭＥＭを示す図である。大部分のアミノ酸を除去することによって、ＤＭＥＭにおいて活動電位およびシナプス活性の機能低下をもたらしたＤＭＥＭにより誘導される脱分極は回避された。しかし、この解決は、ニューロンの発達および生存を１週間超持続させることができなかった。 図１１Ａ〜Ｄは、培地の全てのビタミン、全てのアミノ酸または全てのその他の構成要素を除去したＤＭＥＭを示す図である。大部分のアミノ酸を除去することによって、ＤＭＥＭにおいて活動電位およびシナプス活性の機能低下をもたらしたＤＭＥＭにより誘導される脱分極は回避された。しかし、この解決は、ニューロンの発達および生存を１週間超持続させることができなかった。 図１１Ａ〜Ｄは、培地の全てのビタミン、全てのアミノ酸または全てのその他の構成要素を除去したＤＭＥＭを示す図である。大部分のアミノ酸を除去することによって、ＤＭＥＭにおいて活動電位およびシナプス活性の機能低下をもたらしたＤＭＥＭにより誘導される脱分極は回避された。しかし、この解決は、ニューロンの発達および生存を１週間超持続させることができなかった。 図１１Ａ〜Ｄは、培地の全てのビタミン、全てのアミノ酸または全てのその他の構成要素を除去したＤＭＥＭを示す図である。大部分のアミノ酸を除去することによって、ＤＭＥＭにおいて活動電位およびシナプス活性の機能低下をもたらしたＤＭＥＭにより誘導される脱分極は回避された。しかし、この解決は、ニューロンの発達および生存を１週間超持続させることができなかった。

図１２は、一般に使用される補充物の完全なセット（Ｎ２、Ｂ２７、レチノイン酸、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、ｃＡＭＰ、ラミニン、およびコレステロール）をＢｒａｉｎＰｈｙｓ基礎培地に短期間に（ａｃｕｔｅｌｙ）加えることは、発射率にも興奮性／抑制性シナプス活性にも影響を与えなかったことを示す図である。

図１３Ａ〜Ｃは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中のマウス脳スライス（ｅｘ ｖｉｖｏ）のパッチクランプ記録を示す図である。Ａ〜Ｃ．ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で成体マウス海馬からパッチした典型的な機能的顆粒ニューロン。Ａ．静止膜電位からの５００ｍｓステップの電流で誘発された活動電位。Ｂ．ＮａｖおよびＫｖ電流を示す増加性の５ｍＶステップ（静止−７０ｍＶ）のＩＶトレース。Ｃ．自発性ＡＭＰＡシナプス事象（電圧クランプ−７０ｍＶ）。

図１４Ａ〜Ｂは、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌは、大きなＣｌ−電流を誘導し、自発性抑制性シナプス活性を遮断することを示す図である。

発明の詳細な説明
本開示は、培地中で培養された神経細胞の成長および維持、ならびに機能活性を促進する培地の発見に少なくとも部分的に基づいている。特に、本出願は、このような培地が、神経活性無機塩、神経活性アミノ酸、ｐＨ調節剤、エネルギー基質、アミノ酸、およびビタミンの組合せを含むことができることを開示する。ある特定の実施形態において、培地の成分は、培地中で培養した神経細胞の成長、維持および神経機能性を促進する量で存在する。

Ｉ．定義
他の規定がない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、第２版、Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９４年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年）を参照されたい。本明細書に記載されているものと同様または等しいあらゆる方法、デバイスおよび材料を本発明の実施に使用することができる。下記の定義は、本明細書において頻繁に使用され、本開示の範囲を限定することを意味しない特定の用語の理解を容易にするために提供する。

「アミノ酸」という用語は、天然に存在するおよび合成のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるもの、ならびに後で修飾されるこれらのアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般の化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を指す。「天然に存在しないアミノ酸」および「非天然アミノ酸」という用語は、天然において見出されないアミノ酸類似体、合成アミノ酸、およびアミノ酸模倣物を指す。

アミノ酸は、本明細書においてこれらの一般に公知の３文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字記号によってのいずかで言及し得る。ヌクレオチドは、同様に、これらの一般に認められた単一文字コードによって言及し得る。

「細胞培養物」は、生物の外側に存在する細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの集団である。細胞培養物は、細胞バンクもしくは動物から単離した初代細胞、またはこれらの源の１つに由来し、長期間のｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養のために不死化されている二次細胞から確立することができる。

「培養する」、「培養すること」、「成長する」、「成長すること」、「維持する」、「維持すること」、「増殖する」、「増殖すること」などという用語は、細胞培養物それ自体または培養のプロセスに言及するとき、互換的に使用して、細胞が生存に適した条件下で体の外側（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ）で維持されることを意味することができる。培養細胞は生存することが可能となり、培養することにより細胞成長、分化、または分裂をもたらすことができる。この用語は、いくつかの細胞が自然に老化し得るなどであるため、培養物中の全ての細胞が生存し、または成長し、または分裂することを意味しない。細胞は典型的には、培養の過程中に変更することができる培地中で培養される。

「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」、「培地（ｍｅｄｉａ）」および「培養液」という用語は、細胞培養環境を指す。培地は典型的には等張液であり、例えば、細胞接着または支持のためのマトリックスを提供する液体、ゼラチン質、または半固体でよい。培地は、本明細書において使用する場合、細胞を培養するのに必要な栄養的、化学的、および構造的支持のための構成要素を含むことができる。

本明細書において使用する場合、培養物などにおいて「成長を可能とする条件」は、細胞が、細胞分裂を起こし、または少なくとも生存を少なくとも２４時間、好ましくはそれ超（例えば、数日、数週間または数カ月）維持することができるような、適当な培地（塩、バッファ、血清を含む）における温度（典型的には、哺乳動物細胞について約３７℃）、湿度、ＣＯ_２（典型的には、およそ５％）の条件を指す。

「に由来する」という用語は、細胞または生体試料について言及するとき、細胞または試料を結局はある時点で記述した源から得たことを示す。例えば、個体に由来する細胞は、個体から直接得た初代細胞（すなわち、改変されていない）を表すことができ、または例えば、組換えベクターの導入によって、特定の条件下で培養することによって、もしくは不死化によって改変することができる。場合によって、所与の源に由来する細胞は細胞分裂および／または分化を起こし、それにより当初の細胞がもはや存在しないが、連続する細胞は同じ源に由来すると理解される。

「組換え」という用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用するとき、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、または天然核酸もしくはタンパク質の変化によって改変されていること、あるいは細胞がこのように改変された細胞に由来することを示す。このように、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内には見出されない遺伝子を発現し、またはそうでなければ異常に発現するか、低発現であるか、もしくは全く発現しない天然遺伝子を発現する。トランスジェニック細胞およびトランスジェニック動物は、典型的には組換え方法の結果として、異種遺伝子またはコード配列を発現する細胞および動物である。

「体細胞」は、生物の体を形成する細胞である。体細胞は、生物において器官、皮膚、血液、骨および結合組織を作る細胞を含むが、生殖系列細胞を含まない。

「幹細胞」は、有糸分裂細胞の分裂による自己再生する能力、および組織または器官に分化する潜在力によって特徴付けられる細胞である。哺乳動物の幹細胞の中で胚性幹細胞および体性幹細胞は区別することができる。胚性幹細胞は、胚盤胞中に存在し、胚組織を生じさせ、一方、体性幹細胞は、組織再生および修復の目的のために成体組織中に存在する。

「多能性の」または「多能性」という用語は、適当な条件下で、３種の胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）からの細胞系統と関連する特徴を集合的に示す細胞型への分化を受けることができる子孫を生じさせる能力を有する細胞を指す。多能性幹細胞は、出生前、出生後または成体生物の組織に寄与することができる。標準的な当技術分野において受け入れられている試験、例えば、８〜１２週齢のＳＣＩＤマウスにおいて奇形腫を形成する能力を使用して、細胞集団の多能性を確立することができる。しかし、様々な多能性幹細胞の特徴の同定をまた使用して、多能性細胞を同定することができる。

「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」は、非多能性細胞に人工的（例えば、試験施設の設定において非天然）に由来する多能性幹細胞を指す。「非多能性細胞」は、多能性幹細胞より自己再生および分化する能力が少ない細胞であり得る。より少ない能力の細胞は、これらに限定されないが、成体幹細胞、組織特異的前駆細胞、初代または二次細胞であり得る。成体幹細胞は、胚発生の後に体中に見出される未分化細胞である。成体幹細胞は細胞分裂によって増加し、瀕死の細胞を補充し、損傷された組織を再び生じさせる。成体幹細胞は、分裂し、別の同様の細胞を生じさせ、また分裂し、より分化した細胞を生じさせる能力を有する。成体幹細胞は多能性マーカー、例えば、Ｒｅｘ１、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２の発現と関連しているにも関わらず、これらは３種の胚葉全ての細胞型に分化する多能性幹細胞の能力を有さない。成体幹細胞は、自己再生し、別個の細胞型の子孫を生じさせる限定された能力を有する。限定されないが、成体幹細胞は、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、間葉系幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞または神経幹細胞であり得る。組織特異的前駆体は、特定の器官または組織に分化することに関係する自己再生の潜在力を欠失した細胞を指す。初代細胞は、卵細胞、精子細胞および幹細胞は別として、成体または胎生期生物の任意の細胞を含む。有用な初代細胞の例には、これらに限定されないが、皮膚細胞、骨細胞、血液細胞、内部器官の細胞および結合組織の細胞が含まれる。二次細胞は初代細胞に由来し、長く続くｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養のために不死化されている。

「再プログラミング」という用語は、非多能性細胞（例えば、起源細胞）を多能性幹細胞の特徴（例えば、ヒト人工多能性幹細胞）を示す細胞に脱分化するプロセスを指す。

適切な場合、増殖しているトランスフェクトされた誘導幹細胞は、選択のプロセスに供し得る。選択のプロセスは、トランスフェクションによって人工多能性幹細胞中に導入される選択マーカーを含み得る。選択マーカーは、酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であり得る。酵素活性には、これらに限定されないが、アセチルトランスフェラーゼおよびホスホトランスフェラーゼの活性が含まれる。いくつかの実施形態において、選択マーカーの酵素活性は、ホスホトランスフェラーゼの活性である。選択マーカーの酵素活性は、トランスフェクトされた人工多能性幹細胞に、毒素の存在下で増殖する能力を与え得る。このような毒素は典型的には、細胞増殖を阻害し、かつ／または細胞死をもたらす。このような毒素の例には、これらに限定されないが、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシンおよびゲンタマイシンが含まれる。いくつかの実施形態において、毒素は、ハイグロマイシンである。選択マーカーの酵素活性によって、毒素は、非毒素に変換され得ることから、これはもはや増殖を阻害せず、トランスフェクトされた人工多能性幹細胞の細胞死をもたらさない。毒素への曝露によって、選択マーカーを欠失した細胞は除去され、それによって増殖を防止し得る。

人工多能性幹細胞の同定には、これらに限定されないが、上述の多能性幹細胞の特徴の評価が含まれてもよい。このような多能性幹細胞の特徴は、さらに限定することなく、分子マーカーの特定の組合せの発現または非発現を含む。さらに、多能性幹細胞と関連する細胞形態はまた、多能性幹細胞の特徴である。

「ｈｉＰＳＣに由来する神経細胞」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｈｉＰＳＣ細胞に由来（例えば、分化）している神経前駆細胞（ＮＰＣ）または成熟ニューロンを指す。ｈｉＰＳＣは、当技術分野において公知の任意の適当な方法によって分化することができる（例えば、Ｍａｒｃｈｅｔｔｏ， Ｍ． Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、３巻、６４９〜６５７頁（２００８年）；Ｙｅｏ， Ｇ． Ｗ．ら、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ、３巻、１９５１〜１９６７頁（２００７年））。

神経前駆体は、神経細胞に分化する傾向を有し、かつ幹細胞の多能性の潜在力を有さない細胞である。神経前駆体は、神経系統に特異的な１種または複数のマーカー遺伝子を発現することによって特徴付けられる、神経系統に関係する細胞である。神経系統マーカー遺伝子の例は、早期神経マーカー（すなわち、神経前駆体）について、Ｎ−ＣＡＭ、中間径フィラメントタンパク質ネスチン、ＳＯＸ２、ビメンチン、Ａ２Ｂ５、および転写因子ＰＡＸ−６；後期神経マーカー（すなわち、分化した神経細胞）について、ＮＦ−Ｍ、ＭＡＰ−２ＡＢ、シナプシン（ｓｙｎａｐｔｏｓｉｎ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、βＩＩＩ−チューブリンおよびチロシンヒドロキシラーゼである。神経分化は、共培養したアストロサイトの非存在下で、または存在下で行い得る。「神経の」および「ニューロンの」という用語は、当技術分野におけるこれらの一般の意味に従って使用され、全体にわたって互換的に使用することができる。

「ＤＭＥＭ」という用語は、本明細書において使用する場合、限定されないが、無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび他のタンパク質構成要素を含めた様々な構成要素を含む栄養素培地であるダルベッコ改変イーグル培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）によって商業的に利用可能）を指す。

本明細書において言及するような「改変ＤＭＥＭ」培地は、ＤＭＥＭ中に存在する１種または複数（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種）の構成要素を含む栄養素培地である。いくつかの実施形態において、構成要素は、ＤＭＥＭ中と同じ濃度で存在する。他の実施形態において、構成要素は、ＤＭＥＭと比較して異なる濃度で存在する。いくつかの実施形態において、構成要素は、ＤＭＥＭに対してより高い濃度で存在する。他の実施形態において、構成要素は、ＤＭＥＭに対してより低い濃度で存在する。

「ＨＥＰＥＳ」は、本明細書で提供される場合、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸を指し、細胞培養において汎用の双性イオン性有機緩衝剤である。ＨＥＰＥＳは、通常の意味において、ＣＡＳ登録番号７３６５−４５−９を指す。

「神経活性」という用語は、本明細書において使用する場合、細胞の神経活性に短期間に影響を与える作用物質、例えば無機塩またはアミノ酸などを指す。例えば、神経活性剤を含む培地中で培養した神経細胞は、測定可能な神経活性（例えば、電気生理学的活性）を示す。ある特定の実施形態において、このような神経活性は、そのｉｎ ｖｉｖｏでの天然の環境において、細胞によって示される野性型神経活性と同様、または同じである。

「エネルギー基質」という用語は、本明細書において使用する場合、細胞にとって代謝プロセスに使われるためのエネルギー源である作用物質、例えば糖を指す。ある特定の実施形態において、エネルギー基質を含む培地中で細胞を培養するとき、細胞は、培地中で培養されている間、成長および／または維持のためにエネルギー基質を利用することができる。

ＩＩ．培地組成物
一態様において、本出願は、細胞の成長および／または維持および／または機能活性を促進する培地を提供する。ある特定の実施形態において、培地は、１種または複数の神経活性無機塩および１種または複数の神経活性アミノ酸を含む。ある特定の実施形態において、培地は、１種もしくは複数のｐＨ調節剤、１種もしくは複数のエネルギー基質、１種もしくは複数のアミノ酸、および／または１種もしくは複数のビタミン、およびこれらの組合せをさらに含む。

ある特定の実施形態において、培地の成分は、培地中で培養した神経細胞の成長、維持および神経機能性を促進する量で存在する。

ある特定の実施形態において、培地は、ヒポキサンチンＮａ、有機硫黄化合物（例えば、リポ酸）、ＤＮＡヌクレオシド（例えば、チミジン）、必須脂肪酸（例えば、リノール酸）、有機化学化合物（例えば、プトレシン２ＨＣｌ）、ビオチン（Ｂ７）、およびこれらの組合せを含まない。

ある特定の実施形態において、培地は、血清を含まない。

ある特定の実施形態において、培地は、ＨＥＰＥＳ；フェノールレッド；ピルビン酸ナトリウム；ＢＳＡ、脂肪酸を含まない画分Ｖ；カタラーゼ；ヒト組換えインスリン；ヒトトランスフェリン；コルチコステロン；Ｔ３（トリヨード（ｔｒｉｏｄｏ）−Ｉ−チロニン）；リノール酸；リノレン酸；アスコルビン酸（Ｖｉｔ Ｃ）；ビオチン（Ｂ７）；ＤＬアルファ酢酸トコフェロール；ＤＬアルファ−トコフェロール；ビタミンＡ（レチノイン酸）；セレナイト；Ｄ−ガラクトース；およびこれらの組合せからなる群から選択される１種または複数の成分を含まない。

神経活性無機塩
ある特定の実施形態において、培地は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）（例えば、無水ＣａＣｌ_２）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）（例えば、無水ＭｇＳＯ_４）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）（例えば、無水ＭｇＣｌ_２）、硝酸第二鉄（Ｆｅ（ＮＯ_３）_３−９Ｈ_２Ｏ）、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ）、硫酸第二銅（ＣｕＳＯ_４−５Ｈ_２Ｏ）、硫酸第二鉄（ＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ）、およびこれらの組合せからなる群から選択される神経活性無機塩を含む。

ある特定の実施形態において、神経活性無機塩は、約（ａｂｕｔ）０．０００００１〜約１０ｍＭ、または約０．０００００５〜約８ｍＭ、または約０．００００１〜約６ｍＭ、または約０．００００５〜約４ｍＭ、または約０．００００５〜約２ｍＭ、または約０．０００１〜約１ｍＭ、または約０．０００５〜約０．５ｍＭ、または約０．００１〜約０．０５ｍＭ、または約０．０１〜約０．０５ｍＭの濃度である。

ある特定の実施形態において、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は、約２０〜約２００ｍＭ、または約４０〜約１８０ｍＭ、または約６０〜約１６０ｍＭ、または約７０〜約１５０ｍＭ、または約９０〜約１３０ｍＭ、または約１１０〜約１２５ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は、約１２１ｍＭの濃度で存在する。

ある特定の実施形態において、塩化カリウム（ＫＣｌ）は、約０．００１〜約１０ｍＭ、または約０．００５〜約９ｍＭ、または約０．０１〜約８ｍＭ、または約０．０５〜約７ｍＭ、または約０．１〜約６ｍＭ、または約１〜約５ｍＭ、または約２〜約４．５ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、塩化カリウム（ＫＣｌ）は、約５ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、塩化カリウム（ＫＣｌ）は、約４．２ｍＭの濃度で存在する。

ある特定の実施形態において、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）（無水）は、約０．０５〜約１０ｍＭ、または約０．１〜約８ｍＭ、または約０．５〜約６ｍＭ、または約０．８〜約４ｍＭ、または約０．８〜約４ｍＭ、または約０．８〜約２ｍＭ、または約０．９〜約１．５ｍＭ、または約０．９〜約１ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）（無水）は、約１．１ｍＭの濃度で存在する。

ある特定の実施形態において、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）（無水）は、約０．００１〜約１０ｍＭ、または約０．００５〜約９ｍＭ、または約０．０１〜約８ｍＭ、または約０．０５〜約７ｍＭ、または約０．１〜約６ｍＭ、または約０．５〜約５ｍＭ、または約１〜約４ｍＭ、または約１．５〜約３の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）は、約２ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）は、約１ｍＭの濃度で存在する。

ある特定の実施形態において、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）（無水）は、約０．００１〜約１０ｍＭ、または約０．００５〜約９ｍＭ、または約０．０１〜約８ｍＭ、または約０．０５〜約７ｍＭ、または約０．１〜約６ｍＭ、または約０．５〜約５ｍＭ、または約１〜約４ｍＭ、または約１．５〜約３の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）は、約２ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）は、培地中に存在しない。

ある特定の実施形態において、硝酸第二鉄（Ｆｅ（ＮＯ_３）_３−９Ｈ_２Ｏ）は、約０．００００１〜約０．００５ｍＭ、または約０．００００５〜約０．００１ｍＭ、または約０．０００１〜約０．０００８ｍＭ、または約０．０００２〜約０．０００７ｍＭ、または約０．０００３〜約０．０００６ｍＭ、または約０．０００４〜約０．０００５ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、硝酸第二鉄（Ｆｅ（ＮＯ_３）３−９Ｈ_２Ｏ）は、約０．０００４ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、硝酸第二鉄（Ｆｅ（ＮＯ_３）３−９Ｈ_２Ｏ）は、約０．０００１２４ｍＭの濃度で存在する。

ある特定の実施形態において、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ）は、約０．００００１〜約０．０５ｍＭ、または約０．００００５〜約０．００５ｍＭ、または約０．０００１〜約０．００４ｍＭ、または約０．０００５〜約０．００３ｍＭ、または約０．００２〜約０．００３ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ）は、約０．００２ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ）は、約０．００１５ｍＭの濃度で存在する。

ある特定の実施形態において、硫酸第二銅（ＣｕＳＯ_４−５Ｈ_２Ｏ）は、約０．００００００１〜約０．０００５ｍＭ、または約０．００００００５〜約０．００００５ｍＭ、または約０．０００００１〜約０．００００４ｍＭ、または約０．０００００５〜約０．００００３ｍＭ、または約０．００００１〜約０．００００２ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、硫酸第二銅（ＣｕＳＯ_４−５Ｈ_２Ｏ）は、約０．００００１ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、硫酸第二銅（ＣｕＳＯ_４−５Ｈ_２Ｏ）は、培地中に存在しない。

ある特定の実施形態において、硫酸第二鉄（ＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ）は、約０．００００１〜約０．０５ｍＭ、または約０．００００５〜約０．００５ｍＭ、または約０．０００１〜約０．００４ｍＭ、または約０．０００５〜約０．００３ｍＭ、または約０．００１〜約０．００４ｍＭ、または約０．００２〜約０．００３ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、硫酸第二鉄（ＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ）は、約０．００１５ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、硫酸第二鉄（ＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ）は、培地中に存在しない。

神経活性アミノ酸
ある特定の実施形態において、培地は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−セリン、およびこれらの組合せからなる群から選択される神経活性アミノ酸を含む。

ある特定の実施形態において、神経活性アミノ酸は、約０．０００１〜約１ｍＭ、または約０．０００５〜約０．５ｍＭ、または約０．００１〜約０．０５ｍＭ、または約０．００５〜約０．０１ｍＭの濃度で存在する。

ある特定の実施形態において、グリシンは、約０．０００１〜約１ｍＭ、または約０．０００５〜約０．５ｍＭ、または約０．００１〜約０．１ｍＭ、または約０．００５〜約０．０５ｍＭ、または約０．０１〜約０．０５ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、グリシンは、約０．０５ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、グリシンは、約０．０００１〜約０．０５ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、グリシンは、約０．００２ｍＭの濃度で存在する。

ある特定の実施形態において、Ｌ−アラニンは、約０．０００１〜約１ｍＭ、または約０．０００５〜約０．５ｍＭ、または約０．００１〜約０．１ｍＭ、または約０．００５〜約０．０５ｍＭ、または約０．０１〜約０．０５ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、Ｌ−アラニンは、約０．０５ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、Ｌ−アラニンは、約００００１〜約０．０５ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、Ｌ−アラニンは、約０．００２ｍＭの濃度で存在する。

ある特定の実施形態において、Ｌ−アスパラギン酸は、約０．００００１〜約０．０５ｍＭ、または約０．００００５〜約０．００５ｍＭ、または約０．０００１〜約０．００４ｍＭ、または約０．０００５〜約０．００３ｍＭ、または約０．００２〜約０．００３ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、Ｌ−アスパラギン酸は、約０．００３ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、Ｌ−アスパラギン酸は、約０．００００１〜約０．００３ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、Ｌ−アスパラギン酸は、培地中に存在しない。

ある特定の実施形態において、Ｌ−グルタミン酸は、約０．０００１〜約０．５ｍＭ、または約０．０００５〜約０．１ｍＭ、または約０．００１〜約０．０５ｍＭ、または約０．００５〜約０．０４ｍＭ、または約０．００５〜約０．０２ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、Ｌ−グルタミン酸は、約０．０２ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、Ｌ−グルタミン酸は、約０．００００１〜約０．０２ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、Ｌ−グルタミン酸は、培地中に存在しない。

ある特定の実施形態において、Ｌ−セリンは、約０．０００１〜約０．５ｍＭ、または約０．０００５〜約０．１ｍＭ、または約０．００１〜約０．０５ｍＭ、または約０．００５〜約０．０４ｍＭ、または約０．０１〜約０．０３ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、Ｌ−セリンは、約０．０３ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、Ｌ−セリンは、約０．００１〜約０．０３ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、Ｌ−セリンは、約０．０２ｍＭの濃度で存在する。

ｐＨ調節剤
ある特定の実施形態において、培地は、無機塩、ｐＨ緩衝剤、ｐＨ指示薬、またはこれらの組合せからなる群から選択されるｐＨ調節剤を含む。

ｐＨ調節剤が無機塩を含むある特定の実施形態において、無機塩は、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）無水、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４−Ｈ_２Ｏ）、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

ある特定の実施形態において、各無機塩は、約０．００１〜約１０ｍＭ、または約０．００５〜約８ｍＭ、または約０．０１〜約６ｍＭ、または約０．０５〜約４ｍＭ、または約０．１〜約２ｍＭ、または約０．５〜約１ｍＭ、または約０．００１〜約１ｍＭの濃度で存在する。

ある特定の実施形態において、各無機塩は、約１〜約６０ｍＭ、または約５〜約４０ｍＭ、または約１０〜約２５ｍＭ、または約１５〜約２０ｍＭ、または約１〜約３５ｍＭの濃度で存在する。

ある特定の実施形態において、無機塩は、約３５ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、無機塩は、約１ｍＭ未満の濃度で存在する。

ある特定の実施形態において、ｐＨ調節剤は、約２９ｍＭの濃度で炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、約０．５ｍＭの濃度でリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）無水、および／または約０．５ｍＭの濃度でリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４−Ｈ_２Ｏ）を含む。

ある特定の実施形態において、細胞培地は、約０．１〜約３０ｍＭ、または約０．５〜約２５ｍＭ、または約１〜約２０ｍＭ、または約５〜約１５ｍＭの濃度でＨＥＰＥＳを含む。ある特定の実施形態において、ＨＥＰＥＳは、約１０ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、ＨＥＰＥＳは、約５ｍＭの濃度で存在する。

ある特定の実施形態において、細胞培地は、約０．０００１〜約１ｍＭ、または約０．０００５〜約０．５ｍＭ、または約０．００１〜約０．１ｍＭ、または約０．００５〜約０．０８、または約０．０１〜約０．０７ｍＭの濃度でフェノールレッドを含む。ある特定の実施形態において、フェノールレッドは、約０．０７ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、フェノールレッドは、約０．０２１５ｍＭの濃度で存在する。

ある特定の実施形態において、培地のｐＨは、約７〜約８、または約７．１〜約７．８、または約７．２〜約７．６、または約７．３〜約７．５である。ある特定の実施形態において、培地のｐＨは、約７．４である。

エネルギー基質
ある特定の実施形態において、培地は、糖（例えば、Ｄ−グルコース（デキストロース））、ピルビン酸ナトリウム、およびこれらの組合せからなる群から選択されるエネルギー基質を含む。ある特定の実施形態において、エネルギー基質は、約０．００１〜約１０ｍＭ、または約０．００５〜約９ｍＭ、または約０．０１〜約８ｍＭ、または約０．０５〜約７ｍＭ、または約０．１〜約６ｍＭ、または約１〜約５ｍＭ、または約２〜約４．５ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、エネルギー基質は、約５ｍＭ未満、または約１ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、エネルギー基質は、０．１〜約５ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、エネルギー基質は、約２．５ｍＭまたは約０．５ｍＭの濃度で存在する。

成長／維持を促進するアミノ酸
ある特定の実施形態において、培地は、１種または複数のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態において、１種または複数のアミノ酸は、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−アスパラギン−Ｈ２Ｏ、Ｌ−システイン塩酸塩−Ｈ２Ｏ、Ｌ−シスチン２ＨＣｌ、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩−Ｈ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩二水和物、Ｌ−バリン、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態において、各アミノ酸は、約０．００１〜約５ｍＭ、または約０．００５〜約３ｍＭ、または約０．０１〜約１ｍＭ、または約０．０５〜約０．８ｍＭ、または約０．１〜約０．５ｍＭ、または約０．００１〜約１ｍＭの濃度で存在する。

ある特定の実施形態において、１種または複数のアミノ酸は、約０．５ｍＭの濃度のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、約０．５ｍＭの濃度のＬ−アルギニン塩酸塩、約０．０５ｍＭの濃度のＬ−アスパラギン−Ｈ２Ｏ、約０．１５ｍＭの濃度のＬ−システイン塩酸塩−Ｈ２Ｏ、約０．２ｍＭの濃度のＬ−ヒスチジン塩酸塩−Ｈ２Ｏ、約０．８ｍＭの濃度のＬ−イソロイシン、約０．８ｍＭの濃度のＬ−ロイシン、約０．８ｍＭの濃度のＬ−リシン塩酸塩、約０．２ｍＭの濃度のＬ−メチオニン、約０．４ｍＭの濃度のＬ−フェニルアラニン、約０．１ｍＭの濃度のＬ−プロリン、約０．７ｍＭの濃度のＬ−トレオニン、約０．０７ｍＭの濃度のＬ−トリプトファン、約０．４ｍＭの濃度のＬ−チロシン二ナトリウム塩二水和物、約０．７ｍＭの濃度のＬ−バリン、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

ある特定の実施形態において、培地は、Ｌ−シスチン２ＨＣｌを含まない。

成長／維持を促進するビタミン
ある特定の実施形態において、培地は、１種または複数のビタミンを含む。ある特定の実施形態において、１種または複数のビタミンは、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム（Ｂ５）、葉酸（Ｂ９）、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド（Ｂ３）、ピリドキシン塩酸塩、チアミン塩酸塩、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、リボフラビン（Ｂ２）、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態において、各ビタミンは、約０．００００１〜約１ｍＭ、または約０．００００５〜約０．５ｍＭ、または約０．０００１〜約０．９ｍＭ、または約０．０００５〜約０．８ｍＭ、または約０．００１〜約０．７ｍＭ、または約０．００５〜約０．６ｍＭ、または約０．０１〜約０．５ｍＭ、または約０．０５〜約０．１ｍＭの濃度で存在する。

ある特定の実施形態において、１種または複数のビタミンは、約０．０７ｍＭの濃度の塩化コリン、約０．００６ｍＭの濃度のＤ−パントテン酸カルシウム（Ｂ５）、約０．００６ｍＭの濃度の葉酸（Ｂ９）、約０．０７ｍＭの濃度のｉ−イノシトール、約０．０２ｍＭの濃度のナイアシンアミド（Ｂ３）、約０．０１０ｍＭの濃度のピリドキシン塩酸塩、約０．００７ｍＭの濃度のチアミン塩酸塩、約０．０００６ｍＭの濃度のビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、約０．０００６ｍＭの濃度のリボフラビン（Ｂ２）、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

補充剤
ある特定の実施形態において、培地は、タンパク質（例えば、ラミニン；ＢＳＡ、脂肪酸を含まない画分Ｖ；カタラーゼ；インスリン；ヒト組換えインスリン；インスリン組換え完全鎖；トランスフェリン；ヒトトランスフェリン；ヒトトランスフェリン（Ｈｏｌｏ）；スーパーオキシドジスムターゼ）、神経栄養因子（例えば、ヒト脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；グリア神経栄養因子（ＧＤＮＦ））、ホルモン、ステロイド（例えば、コルチコステロン、プロゲステロン）、甲状腺ホルモン（例えば、Ｔ３（トリヨード−Ｉ−チロニン））、脂肪酸、必須脂肪酸（例えば、リノール酸、リノレン酸）、脂質（例えば、コレステロール）、ビタミン（例えば、アスコルビン酸（Ｖｉｔ Ｃ）、ビオチン（Ｂ７）、ＤＬアルファ酢酸トコフェロール、ＤＬアルファ−トコフェロール、ビタミンＡ（レチノイン酸））、硫酸塩鉱物（例えば、セレナイト）、有機化学化合物（例えば、プトレシン２ＨＣｌ）、単糖（Ｍｏｎｏｓａｃｈａｒｉｄｅ）（例えば、Ｄ−ガラクトース）、ヌクレオチド（例えば、ジブチリル（Ｄｉｂｕｔｙｒｉｌ）ｃＡＭＰナトリウム塩）、およびこれらの組合せからなる群から選択される１種（ｏｎ）または複数の補充剤をさらに含む。

ある特定の実施形態において、各補充剤は、約０．０１〜約５０μｇ／ｍＬ、または約１〜約４０μｇ／ｍＬ、または約５〜約３０μｇ／ｍＬ、または約１０〜約２０μｇ／ｍＬの濃度で培地中に存在する。

ある特定の実施形態において、各補充剤は、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｍＬ、または約１〜約４０ｍｇ／ｍＬ、または約５〜約３０ｍｇ／ｍＬ、または約１０〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で培地中に存在する。

他の実施形態において、各補充剤は、約０．０００００１〜約１ｍＭ、または約０．００００１〜約０．５ｍＭ、または約０．０００１〜約０．１ｍＭ、または約０．００１〜約０．０１ｍＭの濃度で培地中に存在する。

さらなる培地配合物
ある特定の実施形態において、培地は、約０．０５ｍＭ未満の濃度でＬ−アラニン、約０．２５ｍＭ未満の濃度でグリシン、約０．２５ｍＭ未満の濃度でＬ−セリン、約０．１５ｍＭ未満の濃度でＬ−プロリン、約０．６０ｍＭ未満の濃度でＬ−アルギニン塩酸塩、約２．５ｍＭ未満の濃度でＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、約０．４１ｍＭ超の濃度で硫酸マグネシウム、約１．０５ｍＭ超の濃度で塩化カルシウム、約４．１６ｍＭ超の濃度で塩化カリウム、約１２０．７ｍＭ超の濃度で塩化ナトリウム、約１７．５ｍＭ未満の濃度でＤ−グルコース、または約５ｍＭの濃度でＨＥＰＥＳを含む。いくつかの実施形態において、培地は、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−シスチン２ＨＣｌ、ＣｕＳＯ_４−５Ｈ_２Ｏ、ＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、無水塩化マグネシウム、リノール酸、プトレシン２ＨＣｌ、リポ酸、チミジン、ヒポキサンチンＮａ、またはビオチンを含まない。

いくつかの実施形態において、Ｌ−アラニンは、約０．００１ｍＭ〜約０．０５ｍＭで存在する。他の実施形態において、Ｌ−アラニンは、約０．００２ｍＭで存在する。いくつかの実施形態において、グリシンは、約０．００１ｍＭ〜約０．００５ｍＭで存在する。他の実施形態において、グリシンは、約０．００２ｍＭで存在する。いくつかの実施形態において、Ｌ−セリンは、約０．００１ｍＭ〜約０．００５ｍＭで存在する。いくつかの実施形態において、Ｌ−セリンは、約０．００２ｍＭで存在する。他の実施形態において、Ｌ−プロリンは、約０．０１ｍＭ〜約０．１ｍＭで存在する。いくつかの実施形態において、Ｌ−プロリンは、約０．０６ｍＭで存在する。他の実施形態において、Ｌ−アルギニン塩酸塩は、約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭで存在する。いくつかの実施形態において、Ｌ−アルギニン塩酸塩は、約０．３ｍＭで存在する。いくつかの実施形態において、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンは、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭで存在する。他の実施形態において、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンは、約０．５ｍＭで存在する。

いくつかの実施形態において、硫酸マグネシウムは、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭで存在する。他の実施形態において、硫酸マグネシウムは、約１ｍＭで存在する。いくつかの実施形態において、塩化カルシウムは、約１．１ｍＭ〜約２ｍＭで存在する。いくつかの実施形態において、塩化カルシウムは、約１．１ｍＭで存在する。他の実施形態において、塩化カリウムは、約４．１８ｍＭ〜約４．５ｍＭで存在する。いくつかの実施形態において、塩化カリウムは、約４．２ｍＭで存在する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムは、約１２１ｍＭ〜約１２５ｍＭで存在する。他の実施形態において、塩化ナトリウムは、約１２１ｍＭで存在する。いくつかの実施形態において、Ｄ−グルコースは、約１ｍＭ〜約１０ｍＭで存在する。他の実施形態において、Ｄ−グルコースは、約２．５ｍＭで存在する。

いくつかの実施形態において、培地は、約０．００２ｍＭの濃度でＬ−アラニン、約０．００２ｍＭの濃度でグリシン、約０．００２ｍＭの濃度でＬ−セリン、約０．０６ｍＭの濃度でＬ−プロリン、約０．３ｍＭの濃度でＬ−アルギニン塩酸塩、および約０．５ｍＭの濃度でＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む。

いくつかの実施形態において、培地は、約１ｍＭの濃度で硫酸マグネシウム、約１．１ｍＭの濃度で塩化カルシウム、約４．２ｍＭの濃度で塩化カリウム、および約１２１ｍＭの濃度で塩化ナトリウムを含む。

いくつかの実施形態において、培地は、約０．０５ｍＭ未満の濃度でＬ−アラニン、約０．２５ｍＭ未満の濃度でグリシン、約０．２５ｍＭ未満の濃度でＬ−セリン、約０．１５ｍＭ未満の濃度でＬ−プロリン、約０．６０ｍＭ未満の濃度でＬ−アルギニン塩酸塩、約２．５ｍＭ未満の濃度でＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、約０．４１ｍＭ超の濃度で硫酸マグネシウム、約１．０５ｍＭ超の濃度で塩化カルシウム、約４．１６ｍＭ超の濃度で塩化カリウム、約１２０．７ｍＭ超の濃度で塩化ナトリウム、約１７．５ｍＭ未満の濃度でＤ−グルコース、および約５ｍＭの濃度でＨＥＰＥＳを含む。

容量オスモル濃度
いくつかの実施形態において、培地は、約３１５ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ未満の容量オスモル濃度を有する。他の実施形態において、容量オスモル濃度は、約２００〜約４００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、または約２２０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、または約２４０〜約３６０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、または約２６０〜約３４０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、または約２８０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、または約３００〜約３２０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌである。ある特定の実施形態において、容量オスモル濃度は、約３００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜約３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌである。いくつかの実施形態において、容量オスモル濃度は、約３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌである。

ＩＩＩ．培養の方法および細胞組成物
別の態様において、ニューロン細胞を培養する方法を提供する。この方法は、ニューロン細胞と、その実施形態を含め本明細書で示されるような培地とを接触させ、ニューロン細胞が成長することを可能とし、それによってニューロン細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、ニューロン細胞は、初代ニューロン細胞である。他の実施形態において、ニューロン細胞は、ｉＰＳＣに由来するニューロン細胞である。

別の態様において、その実施形態を含め本明細書で示されるような培地中で培養した哺乳動物細胞を提供する。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ニューロン細胞である。

ある特定の実施形態において、培地は、エネルギー源、例えば、光および／または電気などに対して感受性である１種または複数の成分を含む。ある特定の実施形態において、成分と、エネルギー、例えば、光または電気とを接触させることは、培地中で培養した細胞、例えば、神経細胞の活性の増加をもたらす。ある特定の実施形態において、培地へエネルギーを連続して加えることは、培地中で培養した細胞において興奮毒性効果を生じさせ得る。ある特定の実施形態において、エネルギーに対して感受性である成分は、リボフラビン（Ｂ２）、ＨＥＰＥＳ、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態において、上記作用物質（ａｇｅｎｔ）は、約０．００００００１〜約１ｍＭ、または約０．００００００５〜約０．５ｍＭ、または約０．０００００１〜約０．０５ｍＭ、または約０．０００００５〜約０．０１ｍＭ、または約０．００００１〜約０．００５ｍＭ、または約０．００００５〜約０．００１ｍＭ、または約０．０００１〜約０．０００６ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、上記作用物質は、約０．００００６ｍＭ未満の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、上記作用物質は、約０．０１〜約５０ｍＭ、または約０．０５〜約２５ｍＭ、または約０．１〜約２０ｍＭ、または約０．５〜約１５ｍＭ、または約１〜約１０ｍＭ、または約２〜約８ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、上記作用物質は、約１０ｍＭ未満の濃度で存在する。

ＩＶ．実施例
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト脳細胞のシナプス活性および機能を支持する神経生理学的培地
要約
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）技術は、患者に由来する生きたヒトニューロンへのアクセス、ならびに神経障害および精神障害をｉｎ ｖｉｔｒｏで模擬する新規な代替物を提供する。ニューロン回路の有効なモデルは、ニューロン機能を持続させる生理学的条件を必要とする。したがって、出願人は、ニューロンを培養するために現在使用されている異なる培地中でニューロン活性を特に検査した。げっ歯類およびヒトからのニューロンは、種々の補充物を有する基礎培地中でｉｎ ｖｉｔｒｏにて常習的に成長する。標準的基礎培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）および血清は、活動電位発射およびシナプスのコミュニケーションを含めた基本的なニューロン機能を強く損なうことが見出された。これらの制限を克服し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト脳の生理学的条件をより良好に再現するために、新規な基礎培地（ＢｒａｉｎＰｈｙｓ）を設計し、これを化学的に定義された補充物と合わせ、種々のヒトニューロン培養物でこれを完全に試験した。この新規な培地は、典型的にはｉｎ ｖｉｖｏで観察される電気生理学的活性のタイプを最適に支持するが、加えて、これはまたｉｎ ｖｉｔｒｏでの長期間の生存を持続させる。ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、患者または健康な被験体から得た機能的および成熟ヒトニューロンを培養するように本質的に設計されたが、またげっ歯類ニューロンに対して使用することができる。全体的に、これはヒト神経系疾患を模擬するより現実的および機能的なｉｎ ｖｉｔｒｏの条件を提供する。

本実施例により下記のことが示される。
・古典的な基礎培地（ＤＭＥＭおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ）および血清は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトニューロンの基本的機能（活動電位および興奮性／抑制性シナプス活性）を強く損なう。
・血清を含まないＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのニューロンの成熟および脳細胞の生存をまた持続させる一方で、最適なニューロン機能（活動電位／シナプスのコミュニケーション）を支持する。
・ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地は、活性および機能的シナプスの結合性を有する成熟ニューロンの割合を増加させる。
・無血清補充物を有するＢｒａｉｎＰｈｙｓは、安定的および好ましいニューロン活性を数週間にわたり持続させ、ＤＭＥＭをベースとする培地において観察される供給サイクルとリンクする変動を低減させることができる。
・ＢｒａｉｎＰｈｙｓ組成物は、ＣＳＦ神経生理学的条件をより良好に模倣し、より現実的な条件をヒト神経系疾患および精神疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏのモデルに提供し、トランスレーショナルの成功の機会を増加させる。

結果
培養物中のニューロンの神経ネットワーク活性を評価するために、ｉＰＳＣまたは胚性幹細胞（ＥＳＣ）に由来したヒト神経前駆細胞（ＮＰＣ）を使用した。ヒトＮＰＣは、Ｎ２、Ｂ２７、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、ｃＡＭＰおよびラミニンを補充した様々な基礎培地を有するガラス製カバースリップ上で２〜８週間にわたってニューロンに分化した。カバースリップを灌流チャンバーにおいてニューロンと共に移し、様々な細胞外溶液中の細胞の自発性カルシウム活性または電気生理学的特性を短期間に検査した。

ＤＭＥＭ／Ｆ１２をベースとする培地は、ヒトニューロンにおいてカルシウム活性、自発性活動電位発射、およびシナプス活性を損なう
ヒトニューロンのカルシウム活性を、ＤＭＥＭをベースとする培地中で最初に画像化し、該培地中で該ヒトニューロンを数週間培養した。ごく少数の活性ヒトニューロンが見出されたが、同じ視野をＡＣＳＦ中で画像化したとき、より多くの細胞が自発的活性となった。ＡＣＳＦ溶液の組成は、試験施設間で僅かに異なっている可能性がある。例えばカルシウム濃度は、シナプス放出を人工的に増加させるために生理学的レベルより高いことが多く、これは、潜在的にネットワーク活性を増加させ得る。この問題を明らかにするために、本発明者らのＡＣＳＦの無機塩濃度、ｐＨ、および容量オスモル濃度をＤＭＥＭ中のそれらと整合させて、これらのカルシウムイメージング実験を繰り返した。これらの注意に関わらず、活性細胞の数は、ＡＣＳＦ中よりＤＭＥＭ中で有意に少なかったことが確認された（図１ａ）。

次いで、パッチクランプ法を使用して、ＤＭＥＭがどのようにｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトニューロンの全体的な自発活性を低減させたかを決定した。ＤＭＥＭが、ニューロンの静止電位を一貫して脱分極させたことが見出された（ｎ＝２２／２２個の細胞、２３±３ｍＶによる）。次いで、ＡＣＳＦ中の自発的活性ニューロンを検査し、まれに、ＤＭＥＭによって誘導される脱分極は、飽和を伴わずに発射周波数を増加させた（ｎ＝２／１４、図９ａ）が、殆どの場合、細胞発射を飽和させ、停止させたことが見出された（ｎ＝１２／１４、図１ｂ、図９ｂ）。

シナプス機能に対するＤＭＥＭの影響を調査するために、Ｃｌ⁻（−７０ｍＶ）またはＮａ＋（０ｍＶ）の逆転電位で電圧クランプ実験を行い、ＡＣＳＦにおいて記録することができた自発性ＡＭＰＡおよびＧＡＢＡシナプス事象の両方が、ＤＭＥＭ中で完全に消滅したことが見出された（図１ｂ）。この効果は可逆性であり、全ての試験したニューロンにおいて起こった（ｎ＝６／６個の細胞）。

同時に、ＤＭＥＭの灌流は、細胞への大きな脱分極性Ｎａ＋およびＣｌ−流入を一貫して誘導したことがまた観察された（例えば、図１０）。したがって、ＤＭＥＭ中に存在するが、ＡＣＳＦ中には存在しない構成要素は、ニューロン上のＮａ＋およびＣｌ−チャネルを活性化し得ることが疑われた。したがってＤＭＥＭの全てのビタミン、全てのアミノ酸または全てのその他の構成要素を除去し、大部分のアミノ酸ルクを除去することによって、ＤＭＥＭにおいて活動電位およびシナプス活性の機能低下をもたらしたＤＭＥＭにより誘導される脱分極を回避することができたことが見出された。しかし、この解決は、ニューロンの発達および生存を１週間超持続させることができなかった（図１１）。これらの実験から、ＤＭＥＭ中の神経活性アミノ酸は、活動電位の伝播およびシナプスのコミュニケーションを含めた基本的なニューロン機能を損なったことが明らかであった。

Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌをベースとする培地は、シナプスのコミュニケーションおよび活動電位発射を低減させる
ＤＭＥＭを事前に改変して、培養中のラット初代ニューロンの生存を最適化した（Ｂｒｅｗｅｒら、１９９３年）。Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地と称されるこの改変バージョンにおいて、開発者は、いくつかの興奮性アミノ酸および硫酸第一鉄を本質的に除去し、容量オスモル濃度を低減させた。開発者は、ＤＭＥＭと比較して、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌがｉｎ ｖｉｔｒｏでのラットニューロンの生存を改善したことを見出した（Ｂｒｅｗｅｒら、１９９３年）。細胞生存は細胞培養の決定的なパラメーターであるが、基本的電気生理学的特性はＮｅｕｒｏｂａｓａｌで試験されなかった。したがって、ヒトｉＰＳＣおよびＥＳＣに由来するニューロン（神経成熟培地中で２〜８週間）を使用して、ニューロン機能に対するＮｅｕｒｏｂａｓａｌの効果を検査した。ＤＭＥＭとは異なり、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌは静止膜電位を脱分極させず、場合により少なくともいくつかの興奮性シナプス事象を観察することができた。それにも関わらず、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌは、ＡＣＳＦ中で観察される自発性興奮性シナプス活性を強く低減または消失させた（ｎ＝５／５成熟ニューロン、ＡＣＳＦ対照：２１．３±１２．５Ｈｚ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ：０．４４±０．１７Ｈｚ、ＡＣＳＦ回復：１５．１±１０．５Ｈｚ；図１ｃ）。Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌの無機塩の濃度および容量オスモル濃度は、ニューロンが脳内で天然に曝露しているものと非常に異なる（ＤａｖｓｏｎおよびＳｅｇａｌ、１９９６年）。可能性がある結果として、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌが、電圧依存性ナトリウム電流および急速に不活性化するカリウム電流を有意に低減させ、誘発活動電位および自発性活動電位の振幅および周波数を損なったことが見出された（ｎ＝８／８個の細胞；図１ｃ）。Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ中のＮａＣｌの濃度を増加させる試みを最初に試みたが、電圧依存性ナトリウム電流の振幅における僅かな改善にも関わらず、この改変はヒトニューロンの電気的活性およびシナプス活性を最適化するのに十分ではなかった。したがって、ＤＭＥＭ中と同様に、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ中のいくつかの神経活性構成要素は、神経生理学的活性を防止したことが疑われた。ＤＭＥＭもＮｅｕｒｏｂａｓａｌも、不可欠な電気生理学的なニューロンの特性、例えば、活動電位発射およびシナプス機能を持続させることができなかったため、ニューロン機能により良好に適合される新規な基礎培地を設計した。

新規なＢｒａｉｎＰｈｙｓ基礎培地は、機能的活動電位発射を支持する
ニューロン機能は、活動電位の発生および伝播に基本的に基づいている。電圧依存性ナトリウム（Ｎａｖ）およびカリウム（Ｋｖ）チャネルは、高い発射率の活動電位を達成するのに決定的である。活動電位は、イオン勾配に負うところが大きいナトリウム電流の大きな流出およびカリウム電流の流入をトリガーする逐次活性化ＮａｖおよびＫｖチャネルを反映する。したがって、ＢｒａｉｎＰｈｙｓの最初の改善は、無機塩の濃度を神経生理学的レベルに近く調整することであった（例えば、Ｎａ＋、Ｃｌ−、Ｋ＋、Ｃａ２＋）。電圧クランプにおける試験は、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓ中のＮａｖおよびＫｖ電流の振幅が異ならなかったことを示した（図２ａ）。結果的に、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で試験した単一のニューロンにおける自発性活動電位および誘発活動電位はまた、ＡＣＳＦ中で測定した同様のレベルまでかなり改善した（ｎ＝３個の細胞；図２ｂ）。同様に、ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓ中のカルシウムイメージングによるネットワークレベルで測定した自発活性は匹敵するものであった。

さらに、光遺伝子、例えば、チャネルロドプシン（Ｃｈａｎｅｌ Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）（ＣｈＲ２）またはＣｈｅｔａは、ヒトニューロンにおいて効率的に発現することができ、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で光の短時間のフラッシュによって本発明者らがニューロンの発射活性を離れて制御できることが示された（図２ｃ）。際立って対照的に、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で首尾よく反応を誘発したニューロンのＬＥＤ刺激は、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌまたはＤＭＥＭ中のいずれにおいても明らかな活動電位を誘発することができなかった（図２ｄ）。発射活性における全体的な改善と一致して、Ｎａｖおよび急速に不活性化するＫｖ電流の振幅は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌと比較してＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＡＣＳＦにおいて記録したとき系統的により大きかった（図２ｅ）。

新規なＢｒａｉｎＰｈｙｓは、機能的興奮性および抑制性シナプス活性を支持する
統合神経ネットワーク活性および最終的に脳機能は、ニューロン間のシナプスのコミュニケーションによって達成される。したがって、本発明者らは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓが興奮性および抑制性シナプス機能の両方を持続させるようにデザインした。興奮性および抑制性シナプス神経伝達物質の合計は、ニューロンが活動電位を発射する可能性を決定する。このように、単純に最適な活動電位発射を支持することによって、ＢｒａｉｎＰｈｙｓは間接的に作用して、シナプス活性を促進させる。さらに、特定のイオン、例えば、カルシウムは、シナプスにおいて速い小胞の放出をトリガーする決定的な役割を果たす。できるだけ現実的なｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件を設定することを目的として、本発明者らは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中のカルシウムレベルをｉｎ ｖｉｖｏでのヒト脳脊髄液中で報告されるものに近くなるよう（Ｃａ２＋約１．１ｍＭ）に調整した。しかし、ＤＭＥＭまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌの灌流によって強いＮａ＋および／またはＣｌ−電流を示す電圧クランプ実験に基づいて、シナプス機能はまた、神経活性構成要素の存在によって損なわれたと本発明者らは強く疑った。

脳における主要な興奮性シナプス結合は、グルタメートによって媒介され、一方、大部分のシナプスの阻害は、ＧＡＢＡによって媒介される。したがって、グルタミン酸作動性およびＧＡＢＡ作動性のシナプス活性に直接的に影響することができた古典的な培地中の神経活性要素を除去または低減させた。これらの改変がシナプス機能を改善させることを確認するために、ＡＭＰＡまたはＧＡＢＡａ受容体によって媒介される自発性グルタミン酸作動性およびＧＡＢＡ作動性のシナプス活性のレベルを電圧クランプにおいて試験した（これらのそれぞれのアンタゴニストＮＢＱＸまたはＳＲ９５５３１による可逆的遮断によって示されるように）。自発活性は細胞間で可変であり得るが、一対分析は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中の自発性ＡＭＰＡシナプス活性のレベルが、ＡＣＳＦ中のそれらに対して有意差があるとはいえず（ｎ＝５個の細胞、ＡＣＳＦ：１１．０±１０Ｈｚ、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ：１２．８±１０Ｈｚ）、したがって、ＤＭＥＭまたはさらにＮｅｕｒｏｂａｓａｌと比較して大きく改善したことを明らかに示した（図２ｆ）。

ＮｅｕｒｏｂａｓａｌおよびＤＭＥＭの両方は、シナプスの抑制性の相動性活性（ｐｈａｓｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を完全に遮断したことが系統的に見出された（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ中のｎ＝４／４個の細胞；図１ｃ）。ＧＡＢＡシナプス活性の遮断がクロライド電流の大きな流入（図１４）を伴ったため、遮断は塩素イオン向性（ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｉｎｏｔｒｏｐｉｃ）チャネルを飽和する神経活性構成要素の存在によるものであったことが疑われた。

この仮説に従って、クロライドチャネルに作用する特定の神経活性構成要素の濃度を低減させることは、ＧＡＢＡ作動性シナプス活性を劇的に改善させたことが実証された。これらの改変の結果として、自発性ＧＡＢＡシナプス活性は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で機能的であり（ｎ＝７個の細胞；図２ｆ）、ＡＣＳＦ中の活性のレベルに匹敵するものであった（ｎ＝３個の細胞）ことが証明された。

要約すれば、これらの結果は、ＤＭＥＭおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ中に存在する神経活性構成要素の非生理学的濃度が興奮性および抑制性シナプス活性を強く損なったことを示す。したがってこの決定的な警告は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓの配合によって修復され、シナプスのコミュニケーションは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で活性および機能的であることが示された。総合すると、生理学的静止膜電位、活動電位発射およびシナプス機能を支持するためにＢｒａｉｎＰｈｙｓ中でなされた改善はまた、ＡＣＳＦに匹敵する好ましいカルシウムネットワーク活性の存在によっても示された。

ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、ヒト脳の生理学的環境をより良好に模倣する
主要な目的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのニューロン機能および活性をより良好に支持する培地を設計することであった。しかし、ヒト脳における基礎条件をより良好に模倣する培地を設計することもまた目的であった。これらの改善は、ニューロン活性に直接的に焦点をあてる研究のために重要なだけでなく、より現実的な実験モデルは患者のためのトランスレーショナルの成功を増加させるため、疾患モデリング研究のためにもまた潜在的に必要不可欠である。

この目標に到達するために、健康なヒト脳において通常厳密に維持される同様のエネルギーレベルを提供することは必須であると報告されてきた（Ｚｉｌｂｅｒｔｅｒら、２０１０年）。いくつかの神経障害はミトコンドリア機能障害と関連付けられてきたため、これは特に重要である（Ｋｎｏｔｔら、２００８年；Ｃｏｏｐｅｒら、２０１２年；Ｉｔｏｈら、２０１２年）。しかし驚いたことに、ＤＭＥＭおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ中のグルコースレベルは、高血糖患者の脳中のグルコースレベルより少なくとも２〜５倍高い（Ｇｒｕｅｔｔｅｒら、１９９２年）。したがって、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中のエネルギー性構成要素のバランスをとって、健常な患者の脳について報告されるものと同様な血糖レベル（約２．５ｍＭ）を実現した。

さらに、無機塩の濃度を生理学的レベルに調整し、神経活性構成要素の飽和を回避する一方、容量オスモル濃度をまた、典型的なヒト脳脊髄液の容量オスモル濃度（約３０５ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ）に近くなるように設定した。対照的に、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌの容量オスモル濃度は、神経生理学的レベルより約３０％低い（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａについて約２２０または２５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ）。

これらの改変はより良好なニューロン機能を説明し、神経生理学的条件に対してより近かったことが示されてきたが、人工のｉｎ ｖｉｔｒｏでの設定において脳細胞の生存をまた数週間または恐らく数カ月持続させることができる条件を維持する一方で、これらの改善を行うことは決定的であった。ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中でヒトニューロンを成熟させる影響をこのように試験した。

フィーダー層を伴わないＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする無血清培地中で数週間成熟させた好ましい活性神経ネットワークの特性決定
異なるタイプのニューロンを使用して、ヒトニューロンをｉｎ ｖｉｔｒｏで研究することができ（例えば、皮質性、ドパミン作動性）、これらのニューロンを得るための方法論的バリエーションは無数である。しかし、特定のタイプのニューロン前駆体が得られた後、通常、細胞は、補充物を有する基礎培地中で成熟する。典型的には、ＤＭＥＭ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌまたは両方の混合物を、基礎培地として選ぶ。基礎培地に加える補充物は、実験者の必要性または好みによって調整することができる。一般に使用される補充物の完全なセット（Ｎ２、Ｂ２７、レチノイン酸、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、ｃＡＭＰ、ラミニン、およびコレステロール）をＢｒａｉｎＰｈｙｓ基礎培地に短期間に加えることは、発射率にも興奮性／抑制性シナプス活性にも影響を与えないことについて本発明者らは最初に試験した（ｎ＝６個の細胞、図１２）。しかし、ニューロン培地に場合により加えられる血清（例えば、ウシ胎仔血清、ＦＢＳ、または化学的に定義された血清）は、ニューロン活性を強く損なったことを本発明者らは見出した（図６ａ）。したがって、全ての実験は、無血清培地中で行った。さらに、血清は、バッチ毎に可変性をもたらすことができる。同様に、抗生物質は使用せず、実験は無菌状態で行い、上清をマイコプラズマについて毎週試験した。

ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとするニューロン培地は、例えば、ヒトＥＳおよびＩＰＳ細胞に由来するニューロン、ヒト線維芽細胞から直接再プログラミングしたｉＮ、初代ニューロン、およびさらにｅｘ−ｖｉｖｏの脳スライスを含めて多種多様のニューロンと共に使用するのに有能であり得ることを試験した。補充物（Ｎ２、Ｂ２７、レチノイン酸、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、ｃＡＭＰ、ラミニン）を有するＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中で数週間成熟させた後に、細胞の生理学的特性をパッチクランプ法、カルシウムイメージングおよび共焦点ＩＨＣで試験するために、殆ど全てのニューロンを、移すことができるコーティングされたガラス製カバースリップ上で培養したが、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをまた使用して、プラスチック上に蒔いたニューロンを支持することができたが、これは細胞付着を改善し得る。グリアのフィーダー層を加えることはまた、ニューロンの長期間の付着を改善し、他の利益を実現し得るが、グリア前駆体は神経成熟培地中でニューロンに変わることが多いことが認められたため、試験の大部分においてフィーダー層を省略することを選んだ。これはいくつかの疾患モデリング研究に対する懸念であり得る。それは、げっ歯類アストロサイトが使用される場合、ニューロン試料を別の患者またはさらに別の種からの細胞で汚染し得るためである。

ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（補充物を有する）を使用して、ガラス製カバースリップ上でヒトｉＰＳＣおよびＥＳＣに由来するＮＰＣをニューロンネットワークに分化させることができることについて広範に試験した。ＢｒａｉｎＰｈｙｓに蒔いたヒトＮＰＣは、成熟およびシナプス性活性ニューロンに３〜５週間以内に効果的に分化した（図３）が、これは細胞系および再プログラミングプロトコルによって変化し得ることが見出された。ニューロンは、最良の細胞系についてガラス製カバースリップ上で数週間またはさらに数カ月生存した（４カ月まで試験した）。約４週間の成熟後、培養物は、密なニューロンネットワークを形成し、樹状突起／軸索マーカー（ＭＡＰ２およびＴＵＪ１）、シナプスマーカー（シナプシン）ならびにニューロンマーカー（ＴＨ、ＧＡＢＡ、ＶＧｌｕｔ）について好都合に染色した（図３ａ）。従前の観察と一致して、ヒトＮＰＣはニューロンに分化しただけでなく、ＧＦＡＰについて染色で陽性であるアストロサイトの集団にもまた分化した（図７）。

ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（補充物を有する）中のパッチクランプ記録は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（補充物を有する）中で数週間成熟したｉＰＳＣまたはＥＳＣに由来するニューロンが好ましい一連の活動電位を発射し（図３ｂ）、自発性ＡＭＰＡおよびＧＡＢＡシナプス活性の両方を受けたことを明らかにした（図３ｃ）。カルシウムイメージング実験はまた、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする神経培養物が、機能的活性神経ネットワークを生じさせたことを実証した（図３ｄ）。

ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、ヒトｉＰＳＣおよびＥＳＣに由来するＮＰＣの機能的成熟を改善した
ＤＭＥＭおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を特に最適化して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の生存を促進した。異なる基礎培地、ＤＭＥＭ、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓ（全て同じセットの無血清補充物を有する）中での細胞の生存率を試験するために、同様の密度で同時に蒔いたが、数週間異なる基礎培地で支持した同じ細胞系を使用して整合実験（ｍａｔｃｈｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）を行った。いずれかの培地中で１カ月後、アポトーシス細胞の割合（活性カスパーゼ３）、全体的な細胞密度（ＤＡＰＩ）、または瀕死の細胞によって上清中に放出されるＬＤＨの濃度は、３群の間で有意に変化しなかったことが見出された（図４ａ〜ｄ）。ＧＡＢＡニューロン、ドパミン作動性ニューロン（ＴＨ）またはＮｅｕＮ陽性ニューロンの割合において有意差は見出されなかった（図４ａ、ｅ）。同様に、いずれかをベースとする培地中の４週間の成熟の後に、近位樹状突起上のシナプスの点の密度における明らかな差異は観察されなかった（図４ｆ〜ｇ）。

ＢｒａｉｎＰｈｙｓは細胞の生存にも運命にも影響を与えないようであったため、次いで、活性ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中で細胞を２〜６週間成長させることは、ニューロンの機能的成熟度を改善し得るかどうかについて問うた。機能的成熟度の程度を評価するため、６５のシナプシン−ＧＦＰ−陽性ニューロンの均質な試料を、ＤＭＥＭまたはＢｒａｉｎＰｈｙｓ（補充物を有する）中で並列させて成長させた培養物中に最初にランダムにパッチした（図４）。組織培養の可変性による任意の可能性のあるバイアスを回避するために、同じＮＰＣを、同じ密度（ウェル毎に約２×１０^５個の細胞；１９０ｍｍ^２）で、同じプレートに同時に蒔き、カバースリップおよび／または細胞の大きな凝集塊からの細胞の剥離によるより低い細胞密度を伴う各群におけるいくつかのカバースリップを廃棄した。パッチクランプ法のために選択されたＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＤＭＥＭ（補充物を有する）中で成長するニューロンは、平均して同じ数の一次神経突起を有した（ＢｒａｉｎＰｈｙｓ：３．５±０．２ｕｍ、ＤＭＥＭ：３．５±１．２ｕｍ）。ＢｒａｉｎＰｈｙｓまたはＤＭＥＭ中で培養したニューロンのパッチを盲検的に次々に行った。したがって、ニューロンの年齢は、両方の群において実質的に同一であった（それぞれ、平均２８日対２９日、１７〜４５日の範囲）（表４）。パッチしたニューロンは、ＤＭＥＭまたはＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中で分化したが、これらの実験のために、ＡＣＳＦ中のこれらの機能特性を短期間に評価した。これらの条件において、分析のために選択したカバースリップ（ｎ＝２２）の間の唯一の差異は栄養補給のために使用した培地であったという妥当な確信が存在した。記録したニューロンの採取試料をホモジナイズする努力にも関わらず、より多くの成熟ニューロンがＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物中で得られた。この結果を定量化するために、５００ｍｓの脱分極ステップの電流に反応したこれらの発射パターンに基づいて異なる機能タイプのニューロンを定義した（図４ｈ、分類のための方法の詳細を参照されたい）。それぞれの培地中の２〜６週間の成熟、およびＡＣＳＦ中の電気生理学的試験の後で、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地中で分化したニューロンの半分（４７％）は、機能タイプ５ニューロンと分類されたが、これは整合させたＤＭＥＭをベースとする培養物中より２倍超多いタイプ５ニューロンであった（図４ｉ）。Ｎａｖおよび急速に不活化するＫｖ電流は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培養物からのニューロンにおいて有意により高かったが、これらの電圧活性化閾値は同様であったことが一貫してまた測定された（表４）。さらに、ＤＭＥＭで成長したニューロンにおけるより、ＢｒａｉｎＰｈｙｓで成長したニューロンの膜抵抗は、有意に低く、キャパシタンスは有意に高く、これはより成熟様の特性とまた典型的には相関する特徴であった（表４）。

ＩＨＣによって測定したシナプスの点の数の明らかな増加の欠如にも関わらず、機能的活性シナプスの数はＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で分化したニューロンにおいて大いに増加したことが見出された。実際、活性興奮性ＡＭＰＡシナプス入力を受けるニューロンの数は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物中で約３倍多かった（６７％対２３％のタイプ３〜５のニューロン、図４ｉ）。同様に、機能的抑制性ＧＡＢＡシナプス入力を受けるニューロンの数は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培養物中で約２倍多かった（４２％対２４％、図４ｉ）。これらの結果をさらに支持するために、パッチしたニューロンの大きな非整合試料において活性興奮性シナプスを受けるニューロンの割合をまた検査した。試料を浄化するために、ＡＣＳＦ中でパッチする前に異なる基礎培地中に約１カ月存在したタイプ３、４および５のニューロンのみ（ｎ＝ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で成熟させた２２３のニューロン、ＤＭＥＭ中で成熟させた６９のニューロン）を含めた。この大きな試料は、各タイプの互いの比較、および約４週間のＢｒａｉｎＰｈｙｓ中の細胞の成熟により活性興奮性シナプス入力を伴うニューロンの割合が倍以上に増えることの確認を可能とした（図４ｊ）。

次いで、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地はまた、線維芽細胞（ｈｉＮ）から直接再プログラミングされたヒトニューロンと共に使用することができることが示された（図５）。これらの実験において、同じ補充物（Ｎ２、Ｂ２７、アスコルビン酸、レチノイン酸、ラミニン、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ）を有する、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとするもの、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２の混合物（５０：５０）、およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌによるｉＮの成熟を、特に比較した。他と同様に、基礎培地に関わらず、ヒトまたはマウスの初代アストロサイトの層上で、精製ｉＮニューロンを蒔くことは、培養物の全体的な形態学的質を改善させたことが見出された。しかし、ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、ヒトＩＮにおけるＡＲＣタンパク質発現のレベルを有意に増加させたことは明らかであった（図５ｃ〜ｄ）。ＡＲＣは、ニューロンの機能活性と相関しており、記憶形成のために決定的であることが示されたきた前初期遺伝子である。

ヒトニューロン培養物に対する異なる培地の影響をさらに特性決定するために、４８ウェルプレート（Ａｘｉｏｎ）のウェル毎に１６個の電極を含む多電極配列（ＭＥＡ）システムを使用した。このアプローチは、ニューロンをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養するために研究団体によって使用されるいくつかの他の条件と比較して、数週間にわたる同じニューロンのニューロン機能に対するＢｒａｉｎＰｈｙｓの影響の検査を可能とした。

これらの実験のために、市販の純粋で完全に特性決定されたヒトｉＰＳＣニューロン（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤｙｎａｍｉｃｓからのｉＣｅｌｌニューロン）を使用した。これらのニューロンの冷凍ストックは成熟ニューロンであると既に推定されるため、細胞はＭＥＡプレート上で直接解凍し、僅か数日後に記録することができる。

使用する基礎培地（例えば、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ、ＮＢ−Ａ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２；ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＮＢ−Ａの混合物）に関わらず、血清を加えることは、ニューロン活性を劇的に損なうことが最初に留意された。これは、無血清補充物（パッチクランプ法で試験したノックアウト血清または補充物カクテル）を使用することによって改善させることができた。しかし、ＤＭＥＭ中の活性は、栄養補給サイクルと同調して高度に変動した一方で、無血清補充物およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ、またはＮＢおよびＤＭＥＭ／ｆ１２の混合物を用いて試験したとき、ニューロン活性は相対的に低く、約１週間以内に悪化したことが留意された。対照的に、血清を有さないＢｒａｉｎＰｈｙｓは、ヒトニューロンの神経生理学的活性を数日以内に有意に改善させたが、最も重要なことに、ニューロン機能は数週間にわたって安定的に維持された。最終的に、殆どの場合、古典的な培地中のニューロンの乏しいパフォーマンスは、ＢｒａｉｎＰｈｙｓをベースとする培地で置き換えるとき、数日以内に著しく救済することができた（図６）。

要約すれば、新規に設計された基礎培地は生きた脳の条件により近く、したがってニューロンがｉｎ ｖｉｔｒｏで神経生理学的に活性であることを可能とすることが示された。これらの変化はｉｎ ｖｉｔｒｏでのニューロン分化および生存のために有害ではないことが示された。それとは反対に、ＢｒａｉｎＰｈｙｓのより生理学的条件下で見られる神経およびシナプス活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトニューロンの成熟および機能を経時的に促進し、これを維持することができることが見出された。

培養物中の細胞密度
ＢｒａｉｎＰｈｙｓが、数週間後に培養物中の全体的な細胞密度を変化させ得るかを評価するために、平均して３５日間（２１〜５４日の範囲）、いずれかの培地中で並列させて成長させたニューロンを含有する３６のカバースリップを、固定および染色した。同じ密度のＤＡＰＩ核が、両方の群において見出された（ＤＭＥＭ＝１６５７±２３９／ｍｍ^２、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ＝１７４５±２５２／ｍｍ^２、マンホイットニーＰ値＝０．７５）。ＢｒａｉｎＰｈｙｓがドパミン作動性ニューロンの割合を変化させ得るかを問うために、１２のカバースリップ上で、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）について染色で陽性である細胞の数を定量化したが、有意差は見出されなかった（ＴＨ＋／ＤＡＰＩについて、ＤＭＥＭ＝８．７±２．７％、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ １２±２．５％、Ｐ＝０．２６）。

ＢｒａｉｎＰｈｙｓはまた、げっ歯類ニューロンに適用可能である
ＢｒａｉｎＰｈｙｓはヒトニューロンを培養するために開発されたが、急性マウス脳スライスおよびラット初代ニューロン培養物における電気生理学的記録のために利用することができたことがまた実証された。ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中でパッチしたマウス海馬顆粒細胞は、完全に機能的であり（図１３）、ＢｒａｉｎＰｈｙｓにおいて記録したこれらの特性は、ＡＣＳＦにおけるそれらと実質的に同一であった（ｎ＝４個の細胞）。ラット初代ニューロンはＢｒａｉｎＰｈｙｓ（ｓｍ１を補充）中で健全に成長することができ、２週間以内にｉｎ ｖｉｔｒｏで活性および機能的神経ネットワークを形成したことがまた示された（図８）。

考察
この実施例において、基礎培地を、基本的なニューロン機能に対するこれらの影響について完全に試験した。多くの重大な神経生理学的特性は、汎用のＤＭＥＭおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で有意に変化したことが見出された（表１）。したがって、新規な基礎培地を設計し、これをヒトおよびげっ歯類ニューロンで試験した。ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、ＤＭＥＭおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌにおいて同定された問題を克服した。適当な補充物を伴って、ＢｒａｉｎＰｈｙｓを使用して、ＮＰＣをニューロンに分化させることができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活発に作動する成熟ニューロンのための条件が提供される。ＢｒａｉｎＰｈｙｓはまた補充物を伴って、または伴わずに使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養物において、またはｅｘ ｖｉｖｏの脳スライスにおいて、ヒトおよびげっ歯類ニューロンの機能特性を電気生理学的に評価することができる。

ＢｒａｉｎＰｈｙｓはヒト脳の生理学的環境を模倣するように設計された
ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中の構成要素の大部分は、基本的な細胞機能のために必須である。ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、９種の無機塩、１８種のアミノ酸、９種のビタミン、ならびにデキストロース、ピルビン酸ナトリウム、Ｈｅｐｅｓ、コレステロールおよびフェノールレッドを含む５種のその他の構成要素の混合物である（表２）。ニューロンが生きた脳において機能するように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで機能することを可能とするために、ＤＭＥＭまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ中に存在する多くの構成要素の濃度を適合させた。例えば、ＤＭＥＭ中の２０種の構成要素およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ中の３９種の構成要素を、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中の１０％超だけ除去し、加え、または変更した。ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中の無機塩の濃度は、脳脊髄液において報告される濃度と似ている。Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌの容量オスモル濃度は、神経生理学的レベルより約３０％低い（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａについて約２２０または２５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ）。対照的に、ＢｒａｉｎＰｈｙｓの容量オスモル濃度を、生理学的脳脊髄液の容量オスモル濃度（約３０５ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ）に整合するように設定した。ニューロンに対して潜在的に毒性であると報告された、ＤＭＥＭまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ中に存在するいくつかのその他の構成要素を低減させ、または完全に除去した（例えば、酸化ストレスを誘導し得るリポ酸、Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼを低減させ、酸化ストレスを誘導し得るヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅ）、ＨＥＰＥＳ、光毒性であり得るリボフラビン、神経毒性であり、ＮＭＤＡ受容体と相互作用し得るＬ−システイン塩酸塩、ニューロンにおけるＤＮＡ修復を損ない、ニューロンをアミロイドに対して感受性にし得る葉酸およびホモシステインの欠損、その他のシナプスのＧＡＢＡａ受容体を遮断することができる銅、ならびに硫酸第二鉄）。いくつかのアミノ酸およびビタミンの濃度を変化させ、神経生理学的機能を改善させた。ＢｒａｉｎＰｈｙｓのｐＨを、重要な無機塩濃度を乱すことなく生理学的ｐＨ（約７．３〜７．５）に調整した。ＣＯ_２レベルに対して感受性のｐＨ緩衝剤、および低濃度のＨｅｐｅｓでｐＨを着実に維持する。

ＤＭＥＭおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ中で、グルコースレベルは、高血糖患者の脳内のグルコースレベルより少なくとも２〜５倍高い（Ｇｒｕｅｔｔｅｒら、１９９２年）。ディッシュで神経障害を現実的に模擬するために、脳における典型的な生理学的エネルギー活性を模倣することを試みることは重要であることが報告されてきた（Ｚｉｌｂｅｒｔｅｒら、２０１０年）。いくつかの神経障害がミトコンドリア機能障害と関連付けられてきたため、これは特に重要である（Ｋｎｏｔｔら、２００８年；Ｃｏｏｐｅｒら、２０１２年；Ｉｔｏｈら、２０１２年）。ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中で、エネルギー性構成要素のバランスをとって、健常な患者の脳について報告されてきたものと同様の血糖レベルを実現する。ＤＭＥＭおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌの両方における異常レベルのイオン電流（Ｃａ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、およびＣｌ−）がまた留意された。リガンド活性化（例えば、ＡＭＰＡもしくはＧＡＢＡ）または電圧依存性（例えば、Ｎａｖ、Ｋｖ、Ｃａｖ）イオン向性チャネルは通常、イオンポンプと並行して作用し、細胞内イオンの静止濃度を再確立する。イオンポンプはエネルギー（ＡＴＰ）を使用して、浸透勾配に反して働く。多数のシナプスおよびシナプス外の受動イオン向性チャネルが慢性的に開いている場合、ＤＭＥＭおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌについて本明細書で報告するように、ポンプは勾配に対して効果なくあらがい、これによって相当な量の細胞のエネルギーが消耗される可能性がある。

本実施例は、シナプス機能、活動電位の発生およびエネルギー維持を含めた様々なレベルでの神経生理学的な改善を合わせることによって、ＢｒａｉｎＰｈｙｓが機能的ニューロンへの細胞の分化を有意に改善させたことを示す。

ＢｒａｉｎＰｈｙｓのｐＨを、重要な無機塩濃度を乱すことなしに生理学的ｐＨ（約７．３〜７．４）に調整した。周囲のＣＯ_２レベルに対して感受性のｐＨ緩衝剤（炭酸水素塩）および低濃度のＨｅｐｅｓで、ｐＨを着実に維持する。

ニューロンに対して潜在的に毒性であると報告された、ＤＭＥＭまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ中に存在するいくつかのその他の構成要素を低減し、または完全に除去した（例えば、リポ酸、ヒポキサンチン、ＨＥＰＥＳ、リボフラビン（Ｒｏｂｏｆｌａｖｉｎ）、Ｌ−システイン塩酸塩、硫酸第二鉄、硫酸第二銅）。いくつかのアミノ酸およびビタミンの濃度を変化させて、神経生理学的機能を改善させた。

本実施例はまた、ＤＭＥＭおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌの両方中の異常レベルのイオン電流（Ｃａ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、およびＣｌ−）を示す。リガンド活性化（例えば、ＡＭＰＡもしくはＧＡＢＡ）または電圧依存性（例えば、Ｎａｖ、Ｋｖ、Ｃａｖ）イオン向性チャネルは通常、イオンポンプと並行して作用し、細胞内イオンの静止濃度を再確立する。イオンポンプはエネルギー（ＡＴＰ）を使用して、浸透勾配に反して働く。多数のシナプスおよびシナプス外の受動イオン向性チャネルが慢性的に開いている場合、ＤＭＥＭおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌについて本明細書で報告するように、ポンプは勾配に対して効果なくあらがい、これによって相当な量の細胞のエネルギーが消耗される可能性がある。

ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中の構成要素の大部分は、基本的な細胞機能のために必須である。ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、９種の無機塩、１８種のアミノ酸、９種のビタミン、ならびにデキストロース、ピルビン酸ナトリウム、コレステロール、Ｈｅｐｅｓ、およびフェノールレッドを含む５種のその他の構成要素の混合物である（表２）。ニューロンが生きた脳におけるようにｉｎ ｖｉｔｒｏで機能することを可能とするために、ＤＭＥＭまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ中に存在する多くの構成要素の濃度を適合させた。例えば、ＤＭＥＭ中の２０種の構成要素およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ中の３９種の構成要素を、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ中の１０％超だけ除去し、加え、または変更した。ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、シナプス機能、活動電位の発生およびエネルギー維持を含めた様々なレベルでの神経生理学的な改善を合わせることによって機能的ニューロンへの細胞の分化を有意に改善したことが示された。

ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、ヒトおよびげっ歯類ニューロンのために適切である
ＢｒａｉｎＰｈｙｓを、異なるプロトコルを使用することによって得たｉＰＳＣおよびＥＳＣに由来するニューロンを含めて異なる系のヒトニューロンで広範におよび首尾よく試験した。ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、マウス海馬スライスの電気生理学的記録のため、およびラット初代海馬ニューロンを培養するために適合されていることがまた示された。ＢｒａｉｎＰｈｙｓはまた、多様な脳領域からの、および他の種からのニューロンを支持するはずである。

ディッシュにおける神経障害のモデリング：ＢｒａｉｎＰｈｙｓを伴わない従前の研究、および将来の実験
本実施例は、ヒトニューロンを分化させるために使用される利用可能な基礎培地が、生きている脳における条件と非常に異なり、したがって、ニューロンの培養物の電気的活性のために最適以下であることを記載する。ニューロンのｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長および持続可能性の両方を最適化する１つの重要な態様は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓと同様に、成熟および機能的ニューロンを見出す可能性が、現在の条件において相対的に低いことである。さらに、大部分の神経障害は慢性および進行性であり、ニューロン活性およびシナプス機能と非常に密接に関連する。このように、ヒト神経障害および精神障害をｉｎ ｖｉｔｒｏで模擬するとき、生理学的条件および活性の欠如によって、人工産物をもたらし、または病理の現実の機序をマスクする可能性がある。現在の培地中で分化した患者に由来するニューロン培養物および対照のｉＰＳＣに由来するニューロン培養物の間で関連性のある表現型が見出された（Ｍａｒｃｈｅｔｔｏら、２０１０年；Ｂｒｅｎｎａｎｄら、２０１１年；Ｎｇｕｙｅｎら、２０１１年；Ｓｅｉｂｌｅｒら、２０１１年；Ｂｅｌｌｉｎら、２０１２年；Ｅｇａｗａら、２０１２年；Ｉｓｒａｅｌら、２０１２年；Ｓｈｉら、２０１２年）が、新規な表現型はこれらの電気生理学的活性を促進する条件においてニューロンを研究することから明らかにし得る。生きている脳を密接に模倣する神経モデルは、患者の脳において起こっている機能障害を再現する可能性が高く、ひいては、神経障害および精神障害に対するより有効な処置の発見をもたらす。ＢｒａｉｎＰｈｙｓは、生理学的神経活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで持続させることによってこのような使用のために有利である。

材料および方法
ヒトニューロン：ヒト皮膚線維芽細胞を、レトロウイルスベクターまたは非組み込み型センダイウイルスベクターのいずれかにおいて４種の山中因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃＭｙｃ）で多能性細胞へと再プログラミングした。ヒトｉＰＳＣおよびＥＳＣは、従前に記載したように神経前駆体（ＮＰＣ）に分化した（Ｂｒｅｎｎａｎｄら、２０１１年；Ｂｏｙｅｒら、２０１２年）。神経成熟のために、ＮＰＣは、ポリ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ Ｐ３６５５）およびラミニン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ２３０１７−０１５）でコーティングしたガラス製カバースリップ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ１２−５４５−８０）上に蒔き、２４ウェルプレートにおいてニューロン成熟培地（ＮＭ、下記の「培地および細胞外溶液」を参照されたい）中で培養した。培地の半分を、１週間に２〜３回穏やかに置き換えた。プレートを、インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２で保持した。

誘導されたニューロン（ｉＮ）へのヒト皮膚線維芽細胞の直接の変換：初代ヒト皮膚線維芽細胞ＨＤＦは健常なドナーからの皮膚生検から樹立し、１５％ＦＢＳおよび０．１％ＮＥＡＡ（全てＧｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ培地中で培養した。線維芽細胞系＃１は、ＡＴＣＣから得た（ＢＪ−ＣＲＬ−２５２２（商標）包皮線維芽細胞）。＃２および＃３は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得た（カタログＩＤ、ＧＭ２２１５９およびＡＧ０８４９８）。

直接の変換は、僅かな改変を伴う、Ｌａｄｅｗｉｇらによって従前に記載されたのと同様なＮｇｎ２／Ａｓｃｌ１をベースとするプロトコルで行った（Ｌａｄｅｗｉｇら、２０１２年）。ヒトＡｓｃｌ１およびＮｇｎ２についてのコード配列は、２Ａペプチド配列によってリンクされ、ｐＬＶＸ−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒｏコンストラクト（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローン化され、ｐＬＶＸＴＰ−Ｎ２Ａをもたらした。ｐＬＶＸ−ＥｔＯおよびｐＬＶＸＴＰ−Ｎ２Ａのためのレンチウイルス粒子は、ＨＥＫ−２９３ＦＴ細胞中で産生し、遠心分離によって富化した。形質導入に続いて４８時間で、トランスジェニックｉＮコンピテントな線維芽細胞を、テトラサイクリンを含有しないＦＢＳ含有培地中でＧ４１８（２００μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）およびピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下でさらに継代した。

誘導されたニューロンを生じさせるために、培地を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２／Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＤＮ；１：１ｖ／ｖ）またはＢｒａｉｎＰｈｙｓ（登録商標）（ＢＰ）のいずれかをベースとする誘導ニューロン変換（ｉＮＣ）培地に３週間変更した。ＮＣは、下記の補充物：Ｎ２補充物およびＢ２７補充物（両方とも１×；Ｇｉｂｃｏ）、ドキシサイクリン（２μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ラミニン（１μｇ／ｍｌ、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ジブチリルサイクリックＡＭＰ（５００μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヒト組換えノギン（１５０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＬＤＮ−１９３１８９（５μＭ；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）およびＡ８３−１（５μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ、ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、フォルスコリン（５μＭ、ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＳＢ−４３１５４２（１０μＭ；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）を含有する。これは２種のｉＮＣ培地であるＤＮ−ｉＮＣおよびＢＰ−ｉＮＣをもたらし、これを３日毎に変更した。

直接のｉＮ変換がＢｒａｉｎＰｈｙｓ（登録商標）をベースとする培地中で行うことができるかを試験するために、ＤＮ−ｉＮＣまたはＢＰ−ｉＮＣのいずれかで３週間変換したｉＮ培養物を、４％ＰＦＡで固定し、ニューロンマーカーベータ−ＩＩＩ−チューブリン（ウサギ、１：３０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ｈＴａｕ（ＰＨＦ１、マウス、１：５００、Ｐｅｔｅｒ Ｄａｖｉｅｓからの親切なギフト）、ＮｅｕＮ（マウス、１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＭａｐ２ａｂ（ニワトリ、１：３００、Ａｂｃａｍ）について染色した。

完全な機能的成熟のために、ｉＮ細胞を、ＴｒｙｐＬＥを使用してこれらの変換プレートから穏やかに取り出し、マウスアストロサイトの単層培養物の上に再配置し（Ｍｅｒｔｅｎｓら、ＡＪＰ、２０１３年を参照されたい）、補充物ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ（両方とも２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）、ジブチリルサイクリックＡＭＰ（５００μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ドキシサイクリン（２μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびラミニン（１μｇ／ｍｌ、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する誘導ニューロン成熟（ｉＮＭ）培地中でさらに培養した。ＮＭ含有培地は、ＤＭＥＭ：Ｆ１２／Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＤＮ；１：１ｖ／ｖ）またはＢｒａｉｎＰｈｙｓ（登録商標）（ＢＰ）のいずれかを再度ベースとしており、ＤＮ−ｉＮＭまたはＢＰ−ｉＮＭがもたらされ、これは３日毎に変更した。３週間の成熟（全部で６週間の変換）に続いて、培養物を４％ＰＦＡで固定し、ｈＴａｕおよびＡＲＣ（ウサギ、１：２００、ｘｙｚ）について染色した。

げっ歯類ニューロン：ラット海馬解離培養物を、胎生１８日目において調製した。海馬切開片をパパインで短時間処理し、次いで、穏やかに解離させ、ポリ−Ｌ−リシンでコーティングしたガラス製カバースリップ上のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ ｓｍ１ニューロン補充物（カタログ番号０７５１１、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）に蒔いた。ＢｒａｉｎＰｈｙｓを人工培養物中よりはむしろｅｘ ｖｉｖｏの脳上で直接試験するために、本発明者らは、マウス海馬（Ｃ５７Ｂｌ６）の３００μｍ厚さのスライスを調製した。

培地および細胞外溶液：神経成熟培地（ＮＭ）は、基礎培地および無血清補充物からなった。本発明者らは、下記の基礎培地：ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（ＢＰ、注文製）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０５６５−０１８）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ（ＮＢ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０８８８−０２２）、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａの混合物（ＤＭ、５０：５０）を使用した。これらの実験において使用したＤＭＥＭの大部分は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。いくつかのバッチを、組織内で注文製であった。Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌは常にＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。ＡＣＳＦおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓは、組織内で注文製であった。

ニューロンの成熟を下記の補充物を加えた基礎培地中で行った：１×Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１７５０２−０４８）、１×Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１７５０４−０４４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号４５０−０２）、グリアに由来する神経栄養因子（ＧＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号４５０−１０）、アスコルビン酸（ＡＡ、２００ｎＭ；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ０２７８）、ジブチリルサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ、１ｍＭ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ０６２７）およびラミニン（１μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２３０１７−０１５）。機能活性を測定する急性実験を、補充物を有する、または有さないＡＣＳＦまたは基礎培地中で行った。

パッチクランプ法：ホールセルパッチクランプ記録のために、個々のカバースリップを加熱した記録チャンバー中に移し、ＣＯ_２（５％）およびＯ_２（９５％）の混合物で通気した基礎培地または人工の脳脊髄液（ＡＣＳＦ）のいずれかで連続的に灌流（１ｍｌ ｍｉｎ^−１）し、２５℃にて維持した。ＡＣＳＦの組成を、短期間に比較したとき、ＤＭＥＭおよびＢｒａｉｎＰｈｙｓの無機塩濃度および容量オスモル濃度に整合するように調整した。ＡＣＳＦは、（ｍＭで）１２１のＮａＣｌ、４．２のＫＣｌ、１．１のＣａＣｌ２、１のＭｇＳＯ４（または０．４のＭｇＳＯ４および０．３のＭｇＣｌ）、２９のＮａＨＣＯ３、０．４５のＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ、０．５のＮａ２ＨＰＯ４ならびに２０のグルコース（全ての化学物質はＳｉｇｍａから）を含有した。

標的とするホールセル記録のために、本発明者らは、４０×水浸対物レンズ、微分干渉フィルター（全てオリンパス株式会社）、赤外デジタルカメラ（Ｒｏｌｅｒａ ＸＲ−Ｑｉｍａｇｉｎｇ）、ｄｉｇｉｄａｔａ１４４０Ａ／Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ７００ＢおよびＣｌａｍｐｅｘ１０．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した。パッチ電極の抵抗は、３〜５ＭＯｈｍであった。パッチ電極を、１３０ｍＭのＫ−グルコネート、６ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ、０．２ｍＭのＫ−ＥＧＴＡ；０．３ｍＭのＧＴＰ、２ｍＭのＭｇ−ＡＴＰ、０．２ｍＭのｃＡＭＰ、１０ｍＭのＤ−グルコース、０．１５％ビオシチンおよび０．０６％ローダミンを含有する内部溶液で充填した。内部溶液のｐＨおよび容量オスモル濃度は、生理学的条件（ｐＨ７．３、２９０〜３００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ）に近かった。データを液間電位（１０ｍＶ）について全て補正した。電極容量は、細胞付着モードにてオンラインで代償した（約７ｐＦ）。５０ｍｓ（２０ｋＨｚ）の間隔で、記録を２ｋＨｚにて低域フィルターにかけ、デジタル化し、サンプリングした。実験を通して記録の質および安定性を制御するために、アクセス抵抗、キャパシタンスおよび膜抵抗をオンラインで連続的にモニターし、記録した。本発明者らが使用したガラス製ピペットの抵抗は、約５ＭＯｈｍであった。本発明者らの試料中の細胞のアクセス抵抗は、約４０ＭＯｈｍであった。全ての試験した溶液のパッチクランプ法の結果は、対照と匹敵するレベルへの回復によって確認された。自発性シナプスのＡＭＰＡ事象をＣｌ−の逆転電位で記録し、ＡＭＰＡ受容体アンタゴニスト（１０ｕＭのＮＢＱＸ、Ｓｉｇｍａ Ｒｅｆ＃Ｎ１８３）によって可逆的に遮断することができた。自発性シナプスのＧＡＢＡ事象をＮａ＋の逆転電位で記録し、ＧＡＢＡａ受容体アンタゴニスト（１０ｕＭのＳＲ９５５３１、Ｓｉｇｍａ Ｒｅｆ＃Ｓ１０６）によって可逆的に遮断することができた。全ての実験にわたり、２９２のニューロンを、パッチし、分析した。

マルチウェルＭＥＡプレート：微小電極アレイ（ＭＥＡ）プレートは、全部で７６８のチャネルについて４個の統合型接地電極を伴う一連の１６個の個々の包埋されたナノテクスチャの金微小電極（約４０〜５０μｍの直径；３５０μｍの中心−中心間距離）を含有する各ウェルを有する４８ウェルからなった（Ａｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。培養の前に、各ウェルを、ホウ酸緩衝液（１ｌの蒸留水中の３．１０ｇのホウ酸（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および４．７５ｇの四ホウ酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ））中の２００μｌの濾過滅菌したポリエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の０．１％溶液で室温にてコーティングした。この溶液を１時間後に除去し、ウェルを滅菌水で４回洗浄し、無菌の生物学的安全キャビネット中で一晩空気乾燥させた。

ＭＥＡ上の細胞培養物：凍結保存したヒトｉＰＳＣに由来するｉＣｅｌｌニューロン（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の１つのバイアルを解凍し、製造業者のプロトコルに従い遠心分離によってペレット化し、１０μｇ／ｍｌのラミニン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を有するｉＣｅｌｌニューロン維持培地に２８，０００個の生存ニューロン／μｌの濃度で再懸濁した。５μｌ液滴の細胞懸濁液（１４０，０００個のニューロン）を、ＭＥＡ内の各ウェルの中央に、電極エリアにわたって直接加えた。滅菌水をウェルの周りのエリアに加え、蒸発を低減させ、播種したニューロンを含むＭＥＡを細胞培養インキュベーター中３７℃および５％ＣＯ_２にて１時間インキュベートした。次いで、３００μｌのｉＣｅｌｌニューロン維持培地を各ウェルに穏やかに加え、ウェルを囲む水を除去した。細胞を蒔いた２日後（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの日（ＤＩＶ２））、培地を８種の異なる培地の１つで置き換えた：規定された１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ）を有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；１０％ＦＢＳを有するＢｒａｉｎＰｈｙｓ；１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ）、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＧＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、アスコルビン酸（２００ｎＭ；Ｓｉｇｍａ）、ｃＡＭＰ（１ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）、およびラミニン（１ｕｇ／ｍｌ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ；上記の補充物を有するＢｒａｉｎＰｈｙｓ；上記の補充物を有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；上記の補充物を有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ／ＤＭＥＭの１：１混合物；または新鮮なｉＣｅｌｌニューロン維持培地（各培地６ウェル）。ＤＩＶ６、９、および１３において、各ウェル中の培地の５０％を新鮮な培地と交換した。ＤＩＶ１６において、全ての培地を、補充されたＢｒａｉｎＰｈｙｓで置き換えた。

ＭＥＡ記録およびデータ分析：ＤＩＶ２および２１の間に、自発活性を、Ｍａｅｓｔｒｏ ＭＥＡシステム（Ａｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および関連するＡｘｉｏｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｔｕｄｉｏ（ＡｘＩＳ１．８．１．５）を使用して、毎日３７℃にて１０分間記録した。７６８チャネルのＭＥＡを、１２００×のゲイン、および１２．５ｋＨｚ／チャネルのサンプリング速度で同時にサンプリングした。全ての記録について、６×標準偏差に設定した適応閾値スパイク検出器（ａｄａｐｔｉｖｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｓｐｉｋｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）と共にバターワースバンドパスフィルター（２００Ｈｚ〜３ｋＨｚ）を適用した。記録からのデータを、３つの異なるファイルタイプに同時に保存した。全てのデータを含んだ生データファイル（^＊．生ファイル）、１ｓのビン時間を伴って電極毎にスパイクを含んだスパイクカウントファイル（^＊．ｃｓｖファイル）、ならびにスパイクタイミングおよびプロファイル情報を含んだアルファマップ（^＊．マップファイル）。分析において報告する周波数は、それぞれの試験した条件についての、９６〜１９２個の電極（６〜１２ウェル）の平均周波数を表す。活性電極の百分率は、スパイク周波数＞０．００５Ｈｚを伴う電極の数を表す。

分析および統計：電気生理学データおよびカルシウムイメージングの統計解析は、Ｃｌａｍｐｆｉｔ１０．３、Ｍａｔｌａｂ２０１１ｂ、Ｉｇｏｒ Ｐｒｏ６、Ｐｒｉｓｍ５、ＭｉｎｉＡｎａｌｙｉｓおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで補助した。平均値の標準誤差を報告した。統計的有意性は、両側ノンパラメトリック一対（ウィルコクソン）または対応のない（マンホイットニー）検定で評価した。

機能タイプの分類：「タイプ０細胞」は、電圧依存性ナトリウム電流を生じさせず、分析から除外された。「タイプ１ニューロン」は小さなＮａｖ電流を生じさせたが、−１０ｍＶ超の活動電位を発射することができなかった。Ｎａ＋の逆転電位（０ｍＶ）に近いため、−１０ｍＶの任意の限界（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｌｉｍｉｔ）を選択した。好ましい活動電位は通常、Ｎａ＋の逆転電位に達し、または超える。「タイプ２ニューロン」は、−１０ｍＶ超の１つの活動電位を発射し、その後にプラトーとなった。「タイプ３ニューロン」はまた、−１０ｍＶ超の１つの活動電位、および−１０ｍＶ未満の１つまたは少数の中断されたスパイクを発射した。「タイプ４ニューロン」は、−１０ｍＶ超の複数の活動電位を発射したが、１０Ｈｚ未満の周波数であった。「タイプ５ニューロン」は、１０Ｈｚまたはそれ超にて−１０ｍＶ超の活動電位を発射した。本発明者らのニューロンの機能タイプ分類は、ニューロンの成熟度のステージと関連し得る連続体に従った。タイプ１ニューロンは未成熟であると考えられる一方、タイプ５ニューロンはより成熟し、機能的であるとみなし得る。興味深いことに、本発明者らは、本発明者らが注目した大部分の分化の時点（２〜６週齢の範囲）において細胞の全ての機能タイプを見出した。この知見は、同じ年齢の培養物内でさえニューロンの機能的成熟度における高い程度の可変性を示唆する。注目すべきことに、本発明者らの試料中で、活性興奮性シナプスを受ける細胞の大多数は、タイプ５ニューロンであり、本発明者らは、タイプ１〜２のニューロンにおいて自発的活性ＡＭＰＡおよびＧＡＢＡシナプス入力を見出さなかった。

カルシウムイメージング：ガラス製カバースリップ上に付着したニューロンを、神経分化培地中で４ｕＭのカルシウム感受性色素Ｆｌｕｏ−４ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｆ１４２０１）と共に約２０分間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ_２、および９５％湿度）。Ｆｌｕｏ−４を洗浄し、カバースリップを加熱した記録チャンバー中に移し、ＣＯ_２（５％）およびＯ_２（９５％）の混合物を通気した基礎培地またはＡＣＳＦのいずれかで連続的に灌流し（１ｍｌ／分）、チャンバーにおいて３５℃にて維持した。本発明者らは、カバースリップを移動させた後、記録を開始する前に少なくとも１５分待った。カルシウムイメージング動画は、４７１ｎｍでのレーザー走査顕微鏡（オリンパス株式会社、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ＦＶ１０００ＭＰＥ）および２５×対物レンズ（オリンパス株式会社、ＸＬＰＬＮ ＮＡ１．０５）で得た。５分の少なくとも２つの連続動画を、各条件（対照、試験培地、回復）で記録した。多くの場合において、対照および回復培地として定義された細胞外培地はＡＣＳＦであったが、培地灌流の順序を変更したときに同様の結果が得られた（例えば、対照＝ＢｒａｉｎＰｈｙｓ、試験＝ＡＣＳＦ、回復＝ＢｒａｉｎＰｈｙｓ）。必要なとき、ゲイン感度および焦点を、動画間で調整した。レーザー出力は変化させなかった（約２％）。各灌流液を変更した後、本発明者らはまた、少なくとも５分待って、浴溶液全体が記録の前に置き換えられたことを確認した。本発明者らは、カバースリップ毎に３つ以下の視野を分析した。

少なくとも１つの明らかなニューロンのカルシウム事象が細胞体上に検出されたとき、対象とする領域（ＲＯＩ）は自発的活性として分類した。ニューロンのカルシウム事象は、蛍光強度の鋭い一過的増加として定義した（Ｆｌｕｏ−４ＡＭ、ｄＦ／Ｆ＞５％、速い上昇、より遅い減衰）。各ＲＯＩについての時系列は、オリンパス株式会社のＦｌｕｏｖｉｅｗ ＦＶ１０００ソフトウェアで計算した。

免疫組織化学：免疫組織化学実験を、２４ウェルプレート中のガラス製カバースリップ上に蒔いたニューロンで行った。培地条件の間の比較は、同じ当初の細胞密度を伴う同じプレート中で並列させて成長させた同じ細胞系で行った。標準的免疫組織化学プロトコルを使用した。カバースリップを、ＤＡＰＩ、および下記の抗体：マウス−Ｍａｐ２（２ａ＋２ｂ）（１：５００、Ｓｉｇｍａ）、マウス−ＴＵＪ１（１：１０００、Ｃｏｖａｎｃｅ）、ウサギ−シナプシン１（１：５００、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ウサギ−ＴＨ（１：５００、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ）、ウサギ−ＧＦＡＰ（１：２００、Ｄａｋｏ）、ウサギ−ＧＡＢＡ（１：５００、Ｓｉｇｍａ）、ヤギ−ＤＣＸ（１：５００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）の組合せで染色した。

参照文献

Claims (24)

1. （ａ）約７０〜約１５０ｍＭの濃度で塩化ナトリウム；
   （ｂ）約０．０００００１〜約１０ｍＭの濃度で神経活性無機塩；
   （ｃ）約０．０００１〜約０．０５ｍＭの濃度でグリシン；
   （ｄ）約００００１〜約０．０５ｍＭの濃度でＬ−アラニン；および
   （ｅ）約０．００１〜約０．０３ｍＭの濃度でＬ−セリン
   を含む、細胞培地。
2. 前記神経活性無機塩が、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硝酸第二鉄、硫酸亜鉛、硫酸第二銅、硫酸第二鉄、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の細胞培地。
3. 約０．００００１〜約０．００３ｍＭの濃度でＬ−アスパラギン酸をさらに含む、請求項１に記載の細胞培地。
4. 約０．００００１〜約０．０２ｍＭの濃度でＬ−グルタミン酸をさらに含む、請求項１に記載の細胞培地。
5. ｐＨ調節剤をさらに含み、該調節剤が、無機塩である、請求項１に記載の細胞培地。
6. 前記無機塩が、約０．００１〜約１ｍＭの濃度であり、該無機塩が、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項５に記載の細胞培地。
7. 前記無機塩が、約１〜約３５ｍＭの濃度であり、該無機塩が、炭酸水素ナトリウムである、請求項５に記載の細胞培地。
8. １種または複数のアミノ酸をさらに含み、各アミノ酸が、約０．００１〜約１ｍＭの濃度である、請求項１に記載の細胞培地。
9. 前記１種または複数のアミノ酸が、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−アスパラギン−Ｈ２Ｏ、Ｌ−システイン塩酸塩−Ｈ２Ｏ、Ｌ−シスチン２ＨＣｌ、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩−Ｈ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩二水和物、Ｌ−バリン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項８に記載の細胞培地。
10. １種または複数のビタミンをさらに含み、各ビタミンは、約０．００００１〜約１ｍＭの濃度で存在する、請求項１に記載の細胞培地。
11. 前記１種または複数のビタミンが、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム（Ｂ５）、葉酸（Ｂ９）、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド（Ｂ３）、ピリドキシン塩酸塩、チアミン塩酸塩、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、リボフラビン（Ｂ２）、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の細胞培地。
12. タンパク質、神経栄養因子、ステロイド、ホルモン、脂肪酸、脂質、ビタミン、硫酸塩鉱物、有機化学化合物、単糖、ヌクレオチド、およびこれらの組合せからなる群から選択される補充剤をさらに含む、請求項１に記載の細胞培地。
13. ０．１〜約５ｍＭの濃度でエネルギー基質をさらに含む、請求項１に記載の細胞培地。
14. 前記エネルギー基質が、糖、ピルビン酸ナトリウム、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１３に記載の細胞培地。
15. 光増感剤をさらに含む、請求項１に記載の細胞培地。
16. 前記光増感剤が、約０．０００１〜約０．０００６ｍＭの濃度のリボフラビン（Ｂ２）である、請求項１５に記載の細胞培地。
17. 前記光増感剤が、約１〜約１０ｍＭの濃度のＨＥＰＥＳである、請求項１５に記載の細胞培地。
18. 血清を含まない、請求項１に記載の細胞培地。
19. 前記培地の容量オスモル濃度が、約２８０〜約３３０Ｏｓｍ／Ｌである、請求項１に記載の細胞培地。
20. ニューロン細胞と、請求項１から１９のいずれか一項に記載の培地とを接触させることを含む、ニューロン細胞を培養する方法。
21. 前記ニューロン細胞が、初代ニューロン細胞である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ニューロン細胞が、ｉＰＳＣに由来するニューロン細胞である、請求項２０に記載の方法。
23. 請求項１から１９のいずれか一項に記載の培地中で培養した哺乳動物細胞。
24. ニューロン細胞である、請求項２３に記載の哺乳動物細胞。