CN105567635A - 一种改良的Neurobasal B27培养基、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种改良的Neurobasal？B27培养基，每升Neurobasal培养液中含有以下组分：生物素0.09-0.11g、皮质酮18-22μg、L-肉毒碱1-3g、亚油酸0.9-1.1g、乙醇胺0.9-1.1g、亚麻酸0.9-1.1g、D(+)-半乳糖13-17g、孕酮6-7μg、腐胺二盐酸盐15-17g、视黄醇乙酸酯0.08-0.12g、去甲状腺激素牛血清蛋白2.2-2.8g、DL-α-生育酚0.8-1.5g、过氧化氢酶2-3g、DL-α-生育酚乙酸酯0.9-1.2g、还原型谷胱甘肽0.8-1.3g、硫辛酸42-52μg、超氧化物歧化酶2-3g、转铁蛋白4-6g、人胰岛素3-5g、亚硒酸钠0.12-0.16mg。本发明还公开了一种改良的Neurobasal？B27培养基的制备方法及应用。本发明可以用于研究甲状腺激素对胚胎干细胞分化为神经细胞的影响。

Description

一种改良的Neurobasal B27培养基、制备方法及应用
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种改良的NeurobasalB27培养基，本发明还涉及一种改良的NeurobasalB27培养基的制备方法及应用。
背景技术
胚胎干细胞(EmbryonicStemCell，ES细胞)源于着床前囊胚期内细胞团(InnerCellMass，ICM)，具有自我更新能力和发育全能性，胚胎干细胞的体外分化为研究胚胎早期发育的细胞和分子机制提供了良好的模型。
甲状腺激素是胎儿脑发育的必需激素，在碘缺乏地区，由于碘缺乏导致的母体妊娠期甲状腺激素缺乏，可以导致胎儿生长发育停滞、智力低下、运动失调，严重者发生呆小症。因此，研究甲状腺激素对胚胎干细胞分化为神经细胞的影响，以及探讨甲状腺激素对胎儿早期的大脑皮层发育的影响，具有重要的意义。
现有技术中，培养胚胎干细胞时主要采用的是市售的NeurobasalB27培养基，然而市售的NeurobasalB27培养基中含有甲状腺激素，无法用于研究甲状腺激素对胚胎干细胞分化为神经细胞的影响。
发明内容
本发明提供的一种改良的NeurobasalB27培养基、制备方法及应用，可以用于研究甲状腺激素对胚胎干细胞分化为神经细胞的影响。
本发明的第一个目的是提供一种改良的NeurobasalB27培养基，每升Neurobasal培养液中含有以下组分：生物素0.09-0.11g、皮质酮18-22μg、L-肉毒碱1-3g、亚油酸0.9-1.1g、乙醇胺0.9-1.1g、亚麻酸0.9-1.1g、D(+)-半乳糖13-17g、孕酮6-7μg、腐胺二盐酸盐15-17g、视黄醇乙酸酯0.08-0.12g、去甲状腺激素牛血清蛋白2.2-2.8g、DL-α-生育酚0.8-1.5g、过氧化氢酶2-3g、DL-α-生育酚乙酸酯0.9-1.2g、还原型谷胱甘肽0.8-1.3g、硫辛酸42-52μg、超氧化物歧化酶2-3g、转铁蛋白4-6g、人胰岛素3-5g、亚硒酸钠0.12-0.16mg。
优选的，本发明一种改良的NeurobasalB27培养基，每升Neurobasal培养液中含有以下组分：生物素0.1g、皮质酮20μg、L-肉毒碱2g、亚油酸1g、乙醇胺1g、亚麻酸1g、D(+)-半乳糖15g、孕酮6.3μg、腐胺二盐酸盐16.1g、视黄醇乙酸酯0.1g、去甲状腺激素牛血清蛋白2.5g、DL-α-生育酚1g、过氧化氢酶2.5g、DL-α-生育酚乙酸酯1g、还原型谷胱甘肽1g、硫辛酸47μg、超氧化物歧化酶2.5g、转铁蛋白5g、人胰岛素4g、亚硒酸钠0.μ46mg。
优选的，本发明一种改良的NeurobasalB27培养基，每升Neurobasal培养液中含有以下组分：生物素0.09g、皮质酮18μg、L-肉毒碱1g、亚油酸1.1g、乙醇胺1.1g、亚麻酸1.1g、D(+)-半乳糖17g、孕酮6.1μg、腐胺二盐酸盐15g、视黄醇乙酸酯0.12g、去甲状腺激素牛血清蛋白2.8g、DL-α-生育酚1.5g、过氧化氢酶3g、DL-α-生育酚乙酸酯1.2g、还原型谷胱甘肽1.3g、硫辛酸51μg、超氧化物歧化酶2.8g、转铁蛋白5g、人胰岛素4g、亚硒酸钠0.15mg。
优选的，本发明一种改良的NeurobasalB27培养基，每升Neurobasal培养液中含有以下组分：生物素0.11g、皮质酮22μg、L-肉毒碱3g、亚油酸0.9g、乙醇胺0.9g、亚麻酸1g、D(+)-半乳糖14g、孕酮7μg、腐胺二盐酸盐17g、视黄醇乙酸酯0.09g、去甲状腺激素牛血清蛋白2.2g、DL-α-生育酚0.9g、过氧化氢酶2.2g、DL-α-生育酚乙酸酯1g、还原型谷胱甘肽0.8g、硫辛酸43μg、超氧化物歧化酶2.3g、转铁蛋白4.2g、人胰岛素3.2g、亚硒酸钠0.12mg。
本发明的第二个目的是提供一种改良的NeurobasalB27培养基的制备方法，每升改良的NeurobasalB27培养基按照以下步骤制备：
步骤1，称取0.09-0.11g的生物素、18-22μg的皮质酮、1-3g的L-肉毒碱、0.9-1.1g的亚油酸、0.9-1.1g的乙醇胺、0.9-1.1g的亚麻酸、13-17g的D(+)-半乳糖、6-7μg的孕酮、15-17g的腐胺二盐酸盐、0.08-0.12g的视黄醇乙酸酯、2.2-2.8g的去甲状腺激素牛血清蛋白、0.8-1.5g的DL-α-生育酚、2-3g的过氧化氢酶、0.9-1.2g的DL-α-生育酚乙酸酯、0.8-1.3g的还原型谷胱甘肽、42-52μg的硫辛酸、2-3g的超氧化物歧化酶、4-6g的转铁蛋白、3-5g的人胰岛素、0.12-0.16mg的亚硒酸钠；
步骤2，将步骤1中各组分混合后加入到1000mL的Neurobasal培养液中，震荡搅拌，充分溶化各组分，获得溶液；
步骤3，将步骤2中获得的溶液，以孔径为0.22μm的滤菌膜过滤除菌，得到改良的NeurobasalB27培养基。
本发明的第三个目的是提供一种改良的B27的培养基，在胚胎干细胞培养中的应用。
本发明一种改良的NeurobasalB27培养基，可以用于研究甲状腺激素对胚胎干细胞分化为神经细胞的影响。
附图说明
图1为本发明中小鼠胚胎干细胞的200倍显微视图；
图2为本发明中神经元前体细胞的200倍显微视图；
图3为本发明中神经细胞的200倍的显微视图；
图4为采用对照组神经细胞培养基获得的神经细胞的200倍显微视图；
图5为采用实验组神经细胞培养基获得的神经细胞的200倍显微视图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行，或按照商品说明书选择；下面实施例中，小鼠胚胎干细胞购自美国ATCC公司，10％明胶包被培养皿和多聚鸟氨酸/层粘连蛋白/明胶(polylysine/laminin/gelatin)包被培养皿均购自美国lifeinvitrogen，其余所有的试剂和原料购自Sigma公司或者美国lifeinvitrogen公司。
本发明一种改良的NeurobasalB27培养基，每升Neurobasal培养液中含有以下组分：生物素(Biotin)0.09-0.11g、皮质醇(Corticosterone)18-22μg、L-肉毒碱(L-camitine)1-3g、亚油酸(Linoleicacid)0.9-1.1g、乙醇胺(Ethanolamine)0.9-1.1g、亚麻酸(Linolenicacid)0.9-1.1g、D(+)-半乳糖(D(+)-galactose)13-17g、孕酮(Progesterone)6-7μg、腐胺二盐酸盐(Putrescinedihydrochloride)15-17g、视黄醇乙酸酯(Retinylacetate)0.08-0.12g、去甲状腺激素牛血清蛋白(Albumine，bovine)2.2-2.8g、DL-α-生育酚(DL-α-tocopherol)0.8-1.5g、过氧化氢酶(Catalase)2-3g、DL-α-生育酚乙酸酯(DL-α-tocopherolacetate)0.9-1.2g、还原型谷胱甘肽(Glutathione，reduced)0.8-1.3g、硫辛酸(Lipoicacid)42-52μg、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)2-3g、转铁蛋白(apo-transferrin)4-6g、人胰岛素(Insulin，human)3-5g、亚硒酸钠0.12-0.16mg。
需要说明的是所述牛血清蛋白需要经过AG1-X8树脂过滤。
基于同一发明构思，本发明提供了一种改良的NeurobasalB27培养基的制备方法，每升改良的NeurobasalB27培养基按照以下步骤制备：
步骤1，称取0.09-0.11g的生物素、18-22μg的皮质酮、1-3g的L-肉毒碱、0.9-1.1g的亚油酸、0.9-1.1g的乙醇胺、0.9-1.1g的亚麻酸、13-17g的D(+)-半乳糖、6-7μg的孕酮、15-17g的腐胺二盐酸盐、0.08-0.12g的视黄醇乙酸酯、2.2-2.8g的去甲状腺激素牛血清蛋白、0.8-1.5g的DL-α-生育酚、2-3g的过氧化氢酶、0.9-1.2g的DL-α-生育酚乙酸酯、0.8-1.3g的还原型谷胱甘肽、42-52μg的硫辛酸、2-3g的超氧化物歧化酶、4-6g的转铁蛋白、3-5g的人胰岛素、0.12-0.16mg的亚硒酸钠；
步骤2，将步骤1中各组分混合后加入到1000mL的Neurobasal培养液中，震荡搅拌，充分溶化各组分，获得溶液；
步骤3，将步骤2中获得的溶液，以孔径为φ0.22μm的滤菌膜过滤除菌，得到改良的NeurobasalB27培养基。
优选的，本发明一种改良的NeurobasalB27培养基，还包括以下实施例：
实施例1
实施例1的改良的NeurobasalB27培养基，每升Neurobasal培养液中含有以下组分：生物素0.1g、皮质酮20μg、L-肉毒碱2g、亚油酸1g、乙醇胺1g、亚麻酸1g、D(+)-半乳糖15g、孕酮6.3μg、腐胺二盐酸盐16.1g、视黄醇乙酸酯0.1g、去甲状腺激素牛血清蛋白2.5g、DL-α-生育酚1g、过氧化氢酶2.5g、DL-α-生育酚乙酸酯1g、还原型谷胱甘肽1g、硫辛酸47μg、超氧化物歧化酶2.5g、转铁蛋白5g、人胰岛素4g、亚硒酸钠0.146mg。
每升改良的NeurobasalB27培养基按照以下步骤配制：
步骤1，称取0.1g的生物素、20μg的皮质酮、2g的L-肉毒碱、1g的亚油酸、1g的乙醇胺、1g的亚麻酸、15g的D(+)-半乳糖、6.3μg的孕酮、16.1g的腐胺二盐酸盐、0.1g的视黄醇乙酸酯、2.5g的去甲状腺激素牛血清蛋白、1g的DL-α-生育酚、2.5g的过氧化氢酶、1g的DL-α-生育酚乙酸酯、1g的还原型谷胱甘肽、47μg的硫辛酸、2.5g的超氧化物歧化酶、5g的转铁蛋白、4g的人胰岛素、0.146mg的亚硒酸钠；
步骤2，将步骤1中各组分混合后加入到1000mL的Neurobasal培养液中，震荡搅拌，充分溶化各组分，获得溶液；
步骤3，将步骤2中获得的溶液，以孔径为φ0.22μm的滤菌膜过滤除菌，得到改良的NeurobasalB27培养基。
实施例2
实施例2的改良的NeurobasalB27培养基，每升Neurobasal培养液中含有以下组分：生物素0.09g、皮质酮18μg、L-肉毒碱1g、亚油酸1.1g、乙醇胺1.1g、亚麻酸1.1g、D(+)-半乳糖17g、孕酮6.1μg、腐胺二盐酸盐15g、视黄醇乙酸酯0.12g、去甲状腺激素牛血清蛋白2.8g、DL-α-生育酚1.5g、过氧化氢酶3g、DL-α-生育酚乙酸酯1.2g、还原型谷胱甘肽1.3g、硫辛酸51μg、超氧化物歧化酶2.8g、转铁蛋白5g、人胰岛素4g、亚硒酸钠0.15mg。
每升改良的NeurobasalB27培养基按照以下步骤配制：
步骤1，称取0.09g的生物素、18μg的皮质酮、1g的L-肉毒碱、1.1g的亚油酸、1.1g的乙醇胺、1.1g的亚麻酸、17g的D(+)-半乳糖、6.1μg的孕酮、15g的腐胺二盐酸盐、0.12g的视黄醇乙酸酯、2.8g的去甲状腺激素牛血清蛋白、1.5g的DL-α-生育酚、3g的过氧化氢酶、1.2g的DL-α-生育酚乙酸酯、1.3g的还原型谷胱甘肽、51μg的硫辛酸、2.8g的超氧化物歧化酶、5g的转铁蛋白、4g的人胰岛素、0.15mg的亚硒酸钠；
步骤2，将步骤1中各组分混合后加入到1000mL的Neurobasal培养液中，震荡搅拌，充分溶化各组分，获得溶液；
步骤3，将步骤2中获得的溶液，以0.22μm的滤菌膜过滤除菌，得到改良的NeurobasalB27培养基。
实施例3的改良的NeurobasalB27培养基，每升Neurobasal培养液中含有以下组分：生物素0.11g、皮质酮22μg、L-肉毒碱3g、亚油酸0.9g、乙醇胺0.9g、亚麻酸1g、D(+)-半乳糖14g、孕酮7μg、腐胺二盐酸盐17g、视黄醇乙酸酯0.09g、去甲状腺激素牛血清蛋白2.2g、DL-α-生育酚0.9g、过氧化氢酶2.2g、DL-α-生育酚乙酸酯1g、还原型谷胱甘肽0.8g、硫辛酸43μg、超氧化物歧化酶2.3g、转铁蛋白4.2g、人胰岛素3.2g、亚硒酸钠0.12mg。
每升改良的NeurobasalB27培养基按照以下步骤配制：
步骤1，称取0-11g的生物素、22μg的皮质酮、3g的L-肉毒碱、0-9g的亚油酸、0-9g的乙醇胺、1g的亚麻酸、14g的D(+)-半乳糖、7μg的孕酮、17g的腐胺二盐酸盐、0-09g的视黄醇乙酸酯、2-2g的去甲状腺激素牛血清蛋白、0-9g的DL-α-生育酚、2-2g的过氧化氢酶、1g的DL-α-生育酚乙酸酯、0-8g的还原型谷胱甘肽、43μg的硫辛酸、2-3g的超氧化物歧化酶、4-2g的转铁蛋白、3-2g的人胰岛素、0-12mg的亚硒酸钠；
步骤2，将步骤1中各组分混合后加入到1000mL的Neurobasal培养液中，震荡搅拌，充分溶化各组分，获得溶液；
步骤3，将步骤2中获得的溶液，以0-22μm的滤菌膜过滤除菌，得到改良的NeurobasalB27培养基。
需要说明的是，上述所有实施例仅给出了每升改良的NeurobasalB27培养基的配制方法，实际应用过程中，根据改良的NeurobasalB27培养基的体积用量需要，按每升培养基中含有上述各组分的比例，称取各组分，然后溶于相应体积的Neurobasal培养液中即可。
对比实验：
应用本发明实施例1的培养基，研究甲状腺激素对小鼠胚胎干细胞分化为神经细胞的影响，整个小鼠胚胎干细胞神经细胞分化过程如下：
步骤1，根据小鼠胚胎干细胞培养常规，采用胚胎干细胞的培养基，扩增培养小鼠胚胎干细胞，扩增培养天数为3-4d，获得扩增培养的的小鼠胚胎干细胞，小鼠胚胎干细胞的200倍的显微视图如图1所示。
其中，胚胎干细胞的培养基，每250mL培养基中含有以下组分：195mL的KnockoutTMDMEM培养液、体积分数为20％KnockoutTM血清替代品50mL、50μL的白血病抑制因子、2.5mL的非必需氨基酸、2.5mL的谷氨酸盐、2.5mL的青链霉素；0.5mL的巯基乙醇；所述白血病抑制因子的浓度为1000U/mL，所述青链霉素的浓度50U/mL。
步骤2，将步骤1中扩增培养的小鼠胚胎干细胞，按5000-5500cell/cm2的密度，接种在10％明胶包被培养皿中，并加入小鼠神经前体细胞的培养基，培养10-12d，获得小鼠神经元前体细胞集落，小鼠神经元前体细胞的200倍的显微视图如图2所示。
其中，神经元前体细胞的培养基，又称为DDM培养液，每250mL培养基中含有以下组分：236.5mL的DMEM-F12-Glumax、2.5mL的N2添加剂、2.5mL的非必需氨基酸、2.5mL的丙酮酸钠、2.5mL的青链霉素、0.5mL的巯基乙醇、3mL的胎牛血清；所述青链霉素的浓度为50U/mL，所述胎牛血清的浓度为500μg/mL。
步骤3，将步骤2中获得的小鼠神经元前体细胞集落，用胰蛋白酶消化为多个单细胞。
步骤4，将步骤3中获得的多个单细胞，接种在多聚鸟氨酸/层粘连蛋白/明胶包被培养皿中，并加入神经细胞培养基，培养10-12d，获得分化好的神经细胞，神经细胞的200倍的显微视图如图3所示。
其中，神经细胞的培养基，分为对照组神经细胞培养基和实验组神经细胞培养基，其中对照组神经细胞培养基为，每250mL培养基中含有以下组分组：120mL的DDM培养基、120mL的改良的NeurobasalB27培养基、1.2mL的谷氨酸盐、1.2mL的青链霉素，所述青链霉素的浓度为50U/mL；
实验组神经细胞培养基为，每250mL培养基中含有以下组分组：120mL的DDM培养基、120mL的改良的NeurobasalB27培养基、1.2mL的谷氨酸盐、适量甲状腺激素、1.2mL的青链霉素，所述青链霉素的浓度为50U/mL。需要说明的是，在实验组神经细胞培养基中，甲状腺激素的添加量根据研究需要添加均可，在本实施例中，甲状腺激素的添加量为0.15ng/mL。
应用对照组神经细胞培养基，培养神经元前体细胞，其分化而成的神经细胞如图4所示，由图4可以看出，神经元前体细胞已经很好的分化为神经细胞，即小鼠胚胎干细胞成功的分化为神经细胞；应用实验组神经细胞培养基，培养神经元前体细胞，其分化而成的神经细胞如图5所示，通过对比图4和图5可以看出，图5中神经细胞之间的连接紧密，而图4中神经细胞之间的连接疏松，说明甲状腺激素促进了神经元前体细胞分化为神经细胞，同样也说明了甲状腺激素对胚胎干细胞分化为神经细胞具有重要影响。在该实验基础之上，更改实验组神经细胞培养基中甲状腺激素的含量，可以继续研究不同甲状腺激素的含量对胚胎干细胞分化为神经细胞的影响。需要说明的是，为了更加精确的获得实验结果，实验中除了额外添加甲状腺激素外，其余使用的所有材料都应排除甲状腺激素的影响。
类似的，本发明所有实施例，包括实施例2和实施例3，均可达到上述效果，由于实验结果类似，此处不再赘述。
本发明改良的NeurobasalB27培养基，在保证了胚胎干细胞分化为神经细胞的基础上，还能够用于研究甲状腺激素对胚胎干细胞分化为神经细胞的影响。此外由于本发明改良的NeurobasalB27培养基也不含维甲酸，本发明也可以用于维甲酸对胚胎干细胞分化为神经细胞的影响。。
本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种改良的NeurobasalB27培养基，其特征在于，每升Neurobasal培养液中含有以下组分：生物素0.09-0.11g、皮质酮18-22μg、L-肉毒碱1-3g、亚油酸0.9-1.1g、乙醇胺0.9-1.1g、亚麻酸0.9-1.1g、D(+)-半乳糖13-17g、孕酮6-7μg、腐胺二盐酸盐15-17g、视黄醇乙酸酯0.08-0.12g、去甲状腺激素牛血清蛋白2.2-2.8g、DL-α-生育酚0.8-1.5g、过氧化氢酶2-3g、DL-α-生育酚乙酸酯0.9-1.2g、还原型谷胱甘肽0.8-1.3g、硫辛酸42-52μg、超氧化物歧化酶2-3g、转铁蛋白4-6g、人胰岛素3-5g、亚硒酸钠0.12-0.16mg。
2.根据权利要求1所述的改良的NeurobasalB27培养基，其特征在于，每升Neurobasal培养液中含有以下组分：生物素0.1g、皮质酮20μg、L-肉毒碱2g、亚油酸1g、乙醇胺1g、亚麻酸1g、D(+)-半乳糖15g、孕酮6.3μg、腐胺二盐酸盐16.1g、视黄醇乙酸酯0.1g、去甲状腺激素牛血清蛋白2.5g、DL-α-生育酚1g、过氧化氢酶2.5g、DL-α-生育酚乙酸酯1g、还原型谷胱甘肽1g、硫辛酸47μg、超氧化物歧化酶2.5g、转铁蛋白5g、人胰岛素4g、亚硒酸钠0.146mg。
3.根据权利要求1所述的改良的NeurobasalB27培养基，其特征在于，每升Neurobasal培养液中含有以下组分：生物素0.09g、皮质酮18μg、L-肉毒碱1g、亚油酸1.1g、乙醇胺1.1g、亚麻酸1.1g、D(+)-半乳糖17g、孕酮6.1μg、腐胺二盐酸盐15g、视黄醇乙酸酯0.12g、去甲状腺激素牛血清蛋白2.8g、DL-α-生育酚1.5g、过氧化氢酶3g、DL-α-生育酚乙酸酯1.2g、还原型谷胱甘肽1.3g、硫辛酸51μg、超氧化物歧化酶2.8g、转铁蛋白5g、人胰岛素4g、亚硒酸钠0.15mg。
4.根据权利要求1所述的改良的NeurobasalB27培养基，其特征在于，每升Neurobasal培养液中含有以下组分：生物素0.11g、皮质酮22μg、L-肉毒碱3g、亚油酸0.9g、乙醇胺0.9g、亚麻酸1g、D(+)-半乳糖14g、孕酮7μg、腐胺二盐酸盐17g、视黄醇乙酸酯0.09g、去甲状腺激素牛血清蛋白2.2g、DL-α-生育酚0.9g、过氧化氢酶2.2g、DL-α-生育酚乙酸酯1g、还原型谷胱甘肽0.8g、硫辛酸43μg、超氧化物歧化酶2.3g、转铁蛋白4.2g、人胰岛素3.2g、亚硒酸钠0.12mg。
5.根据权利要求1所述的改良的NeurobasalB27培养基的制备方法，其特征在于，每升改良的NeurobasalB27培养基按照以下步骤制备：
步骤1，称取0.09-0.11g的生物素、18-22μg的皮质酮、1-3g的L-肉毒碱、0.9-1.1g的亚油酸、0.9-1.1g的乙醇胺、0.9-1.1g的亚麻酸、13-17g的D(+)-半乳糖、6-7μg的孕酮、15-17g的腐胺二盐酸盐、0.08-0.12g的视黄醇乙酸酯、2.2-2.8g的去甲状腺激素牛血清蛋白、0.8-1.5g的DL-α-生育酚、2-3g的过氧化氢酶、0.9-1.2g的DL-α-生育酚乙酸酯、0.8-1.3g的还原型谷胱甘肽、42-52μg的硫辛酸、2-3g的超氧化物歧化酶、4-6g的转铁蛋白、3-5g的人胰岛素、0.12-0.16mg的亚硒酸钠；
步骤2，将步骤1中各组分混合后加入到1000mL的Neurobasal培养液中，震荡搅拌，充分溶化各组分，获得溶液；
步骤3，将步骤2中获得的溶液，以孔径为0.22μm的滤菌膜过滤除菌，得到改良的NeurobasalB27培养基。
6.如权利要求1中所述的改良的NeurobasalB27培养基，在胚胎干细胞培养中的应用。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107119010A (zh) * 2017-07-14 2017-09-01 郑州大学第附属医院 一种用于细胞培养的合成粘附培养基及其制备方法
CN107760649A (zh) * 2017-11-02 2018-03-06 北京全式金生物技术有限公司 一种用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂
CN113151165A (zh) * 2021-05-14 2021-07-23 河北驰熙科技发展有限公司 一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基及培养方法
WO2022077784A1 (zh) * 2020-10-16 2022-04-21 武汉睿健医药科技有限公司 一种化学培养体系及其应用
WO2022233080A1 (zh) * 2021-05-07 2022-11-10 澳门大学 一种脂类物质添加剂及其应用
WO2023007943A1 (ja) * 2021-07-30 2023-02-02 株式会社リコー 細胞培養方法、細胞培養用容器、細胞培養用容器の製造方法及び細胞含有構造物

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090304647A1 (en) * 2008-05-30 2009-12-10 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Production of Neural Stem Cells from Bone Marrow Tissue and Use Thereof
CN103555660A (zh) * 2013-09-09 2014-02-05 依科赛生物科技（太仓）有限公司 一种胚胎干细胞无血清培养基及其应用
WO2014145108A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Advanced Cell Technology, Inc. Photoreceptors and photoreceptor progenitors produced from pluripotent stem cells
US20140302599A1 (en) * 2009-04-23 2014-10-09 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Method of Co-Culturing Mammalian Muscle Cells and Motoneurons
WO2014172580A1 (en) * 2013-04-17 2014-10-23 Salk Institute For Biological Studies Media compositions for neuronal cell culture
WO2014200339A1 (en) * 2013-06-11 2014-12-18 Pluriomics B.V. Culture medium compositions for maturating cardiomyocytes derived from pluripotent mammalian stem cells

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090304647A1 (en) * 2008-05-30 2009-12-10 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Production of Neural Stem Cells from Bone Marrow Tissue and Use Thereof
US20140302599A1 (en) * 2009-04-23 2014-10-09 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Method of Co-Culturing Mammalian Muscle Cells and Motoneurons
WO2014145108A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Advanced Cell Technology, Inc. Photoreceptors and photoreceptor progenitors produced from pluripotent stem cells
WO2014172580A1 (en) * 2013-04-17 2014-10-23 Salk Institute For Biological Studies Media compositions for neuronal cell culture
WO2014200339A1 (en) * 2013-06-11 2014-12-18 Pluriomics B.V. Culture medium compositions for maturating cardiomyocytes derived from pluripotent mammalian stem cells
CN103555660A (zh) * 2013-09-09 2014-02-05 依科赛生物科技（太仓）有限公司 一种胚胎干细胞无血清培养基及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G.J. BREWER: "《Serum-Free B27lNeurobasal Medium Supports Differentiated Growth of Neurons From the Striatum, Substantia Nigra, Septum, Cerebral Cortex, Cerebellum, and Dentate Gyrus》", 《JOURNAL OF NEUROSCIENCE RESEARCH》 *
G.J. BREWER等: "《Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination》", 《JOURNAL OF NEUROSCIENCE RESEARCH》 *
XIAOCHUN TENG等: "《COUP-TF1 Modulates Thyroid Hormone Action in an Embryonic Stem-Cell Model of Cortical Pyramidal Neuronal Differentiation》", 《THYROID》 *
滕晓春等: "《甲状腺激素在小鼠胚胎干细胞分化为大脑皮层锥体细胞过》", 《中华医学会第十一次全国内分泌学学术会议论文汇编》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107119010A (zh) * 2017-07-14 2017-09-01 郑州大学第附属医院 一种用于细胞培养的合成粘附培养基及其制备方法
CN107760649A (zh) * 2017-11-02 2018-03-06 北京全式金生物技术有限公司 一种用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂
CN107760649B (zh) * 2017-11-02 2021-03-30 北京全式金生物技术有限公司 一种用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂
WO2022077784A1 (zh) * 2020-10-16 2022-04-21 武汉睿健医药科技有限公司 一种化学培养体系及其应用
WO2022233080A1 (zh) * 2021-05-07 2022-11-10 澳门大学 一种脂类物质添加剂及其应用
CN113151165A (zh) * 2021-05-14 2021-07-23 河北驰熙科技发展有限公司 一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基及培养方法
CN113151165B (zh) * 2021-05-14 2022-06-21 山西北科生物科技有限公司 一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基及培养方法
WO2023007943A1 (ja) * 2021-07-30 2023-02-02 株式会社リコー 細胞培養方法、細胞培養用容器、細胞培養用容器の製造方法及び細胞含有構造物

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