CN107119010A - 一种用于细胞培养的合成粘附培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于细胞培养的合成粘附培养基，每升合成粘附培养基中含有以下组分：生物素0.08g、皮质酮20μg、L‑肉毒碱2g、亚油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亚麻酸0.8g、D‑葡萄糖13‑17g、孕酮5μg、丙酮酸钠1.2g、视黄醇乙酸酯0.08g、过氧化氢酶4g、叶酸0.9‑1.2g、还原型谷胱甘肽0.8‑1.3g、硫辛酸60‑70μg、转铁蛋白2‑3g、人胰岛素6‑8g、亚硒酸钠0.1mg、香蕉皮提取物500‑600mL、萘乙酸1.2‑2g、维生素C 0.8‑1.5g。本发明提供的一种用于细胞培养的合成粘附培养基及其制备方法，不含动物血清，大幅度的缩短的干细胞分化培养的时间，节约了实验成本。

Description

一种用于细胞培养的合成粘附培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种用于细胞培养的合成粘附培养基及其制备方法。
背景技术
动物细胞培养，尤其是干细胞培养一直是医学疾病研究领域的基本实验手段之一，干细胞既可以自我复制更新，也有潜力分化为其他类型的细胞，所以，其在疑难疾病的治疗领域具有良好的应用前景。干细胞培养过程中需要依赖特殊的培养环境，要求达到干细胞贴壁培养或者增殖效果。
由于干细胞的培养通源于少数细胞的接种，初始接种量不多，所以，目前干细胞的培养主要采用的是含有胎牛血清和氨基酸的培养基，通过胎牛血清对干细胞的刺激，以达到使干细胞快速分裂分化的目的，然而应用这些细胞培养基扩增、分化干细胞需要经过一个漫长的过程，常常需要数周的时间，再者胎牛血清的提取需要经过复杂的工序，实验成本高，因此有必要开发一种新的培养基，以快速促进细胞培养。
发明内容
本发明提供的一种用于细胞培养的合成粘附培养基及其制备方法，不含动物血清，且大幅度的缩短的干细胞分化培养的时间，节约了实验成本。
本发明的第一个目的是提供一种用于细胞培养的合成粘附培养基，每升合成粘附培养基中含有以下组分：生物素0.08g、皮质酮20μg、L-肉毒碱2g、亚油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亚麻酸0.8g、D-葡萄糖13-17g、孕酮5μg、丙酮酸钠1.2g、视黄醇乙酸酯0.08g、过氧化氢酶4g、叶酸0.9-1.2g、还原型谷胱甘肽0.8-1.3g、硫辛酸60-70μg、转铁蛋白2-3g、人胰岛素6-8g、亚硒酸钠0.1mg、香蕉皮提取物500-600mL、萘乙酸1.2-2g、维生素C0.8-1.5g；
所述香蕉皮提取物是香蕉皮115℃下焙炒10-20min后，再经含有维生素B12和维生素B1的溶液浸泡、过滤收集得到的滤液。
优选的，上述用于细胞培养的合成粘附培养基中，每升合成粘附培养基中含有以下组分：生物素0.08g、皮质酮20μg、L-肉毒碱2g、亚油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亚麻酸0.8g、D-葡萄糖15g、孕酮5μg、丙酮酸钠1.2g、视黄醇乙酸酯0.08g、过氧化氢酶4g、叶酸1g、还原型谷胱甘肽1.0g、硫辛酸65μg、转铁蛋白2.5g、人胰岛素7g、亚硒酸钠0.1mg、香蕉皮提取物550mL、萘乙酸1.5g、维生素C1.2g。
本发明还提供了一种用于细胞培养的合成粘附培养基的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1，制备香蕉提皮取物
步骤1.1，收集新鲜的香蕉皮，115℃下焙炒10-20min，得到碳化香蕉皮；
步骤1.2，按以下配方制备浸泡液，其中每升浸泡液中含有以下组分：0.3-0.5g的维生素B12、1-2g的维生素B1，余量为蒸馏水；
步骤1.3，将所述碳化香蕉皮与浸泡液按照1:10的质量比例混合，超声提取30-50min，然后经孔直径为1-3μm的滤纸过滤，得到香蕉提皮取物；
步骤2，每升用于细胞培养的合成粘附培养基按照以下步骤制备：
步骤2.1，称取生物素0.08g、皮质酮20μg、L-肉毒碱2g、亚油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亚麻酸0.8g、D-葡萄糖13-17g、孕酮5μg、丙酮酸钠1.2g、视黄醇乙酸酯0.08g、过氧化氢酶4g、叶酸0.9-1.2g、还原型谷胱甘肽0.8-1.3g、硫辛酸60-70μg、转铁蛋白2-3g、人胰岛素6-8g、亚硒酸钠0.1mg、香蕉皮提取物500-600mL、萘乙酸1.2-2g、维生素C0.8-1.5g；
步骤2.2，将步骤2.1中称取的各组分混合后，震荡搅拌，充分溶化各组分，然后将得到的溶液经孔直径为0.22μm的滤菌膜过滤除菌，得到用于细胞培养的合成粘附培养基。
优选的，上述用于细胞培养的合成粘附培养基的制备方法中，所述超声提取的超声波频率为20kHz，功率为500W。
与现有技术相比，本发明一种用于细胞培养的合成粘附培养基包括以下有益效果：
(1)培养基中不含动物血清，而是选用了香蕉皮提取物和萘乙酸，我们对香蕉皮进行115℃焙炒处理后，使香蕉皮中的有机物发生碳化，从而有机成分的结构发生了变化，实验证明其生成的物质能够有效存细胞的分裂和分化，且培养时间大大缩短；
培养基中添加的萘乙酸原本是植物组织培养常用的物质，在此，我们首次将其用于动物干细胞的培养分化，其与香蕉皮提取物配合使用能够缩短干细胞的分裂分化时间，效果良好。
(2)本发明使用的培养基在提高细胞培养效果的同时减少了培养基组分的用量，大大降低的物质成本和时间成本，在干细胞培养基领域具有显著的应用前景。
附图说明
图1为采用实施例1的培养基培养获得的心脏肌球衍生细胞的×10倍显微视图；
图2为采用常规培养基培养获得的心脏肌球衍生细胞的×10倍显微视图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行，或按照商品说明书选择；下面实施例中，其余所有的试剂和原料购自Sigma公司或者美国lifeinvitrogen公司。
实施例1
一种用于细胞培养的合成粘附培养基，每升合成粘附培养基中含有以下组分：生物素0.08g、皮质酮20μg、L-肉毒碱2g、亚油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亚麻酸0.8g、D-葡萄糖15g、孕酮5μg、丙酮酸钠1.2g、视黄醇乙酸酯0.08g、过氧化氢酶4g、叶酸1g、还原型谷胱甘肽1.0g、硫辛酸65μg、转铁蛋白2.5g、人胰岛素7g、亚硒酸钠0.1mg、香蕉皮提取物550mL、萘乙酸1.5g、维生素C1.2g，具体按照以下步骤制备：
步骤1，制备香蕉提皮取物
步骤1.1，收集新鲜的香蕉皮，115℃下焙炒15min，得到碳化香蕉皮；
步骤1.2，按以下配方制备浸泡液，其中每升浸泡液中含有以下组分：0.3-0.5g的维生素B12、1-2g的维生素B1，余量为蒸馏水；
步骤1.3，将所述碳化香蕉皮与浸泡液按照1:10的质量比例混合，超声提取40min，然后经孔直径为1-3μm的滤纸过滤，得到香蕉提皮取物；
其中，所述超声提取的超声波频率为20kHz，功率为500W；
步骤2，每升用于细胞培养的合成粘附培养基按照以下步骤制备：
步骤2.1，称取生物素0.08g、皮质酮20μg、L-肉毒碱2g、亚油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亚麻酸0.8g、D-葡萄糖15g、孕酮5μg、丙酮酸钠1.2g、视黄醇乙酸酯0.08g、过氧化氢酶4g、叶酸1g、还原型谷胱甘肽1.0g、硫辛酸65μg、转铁蛋白2.5g、人胰岛素7g、亚硒酸钠0.1mg、香蕉皮提取物550mL、萘乙酸1.5g、维生素C1.2g；
步骤2.2，将步骤2.1中称取的各组分混合后，震荡搅拌，充分溶化各组分，然后将得到的溶液经孔直径为0.22μm的滤菌膜过滤除菌，得到用于细胞培养的合成粘附培养基。
实施例2
一种用于细胞培养的合成粘附培养基，每升合成粘附培养基中含有以下组分：生物素0.08g、皮质酮20μg、L-肉毒碱2g、亚油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亚麻酸0.8g、D-葡萄糖15g、孕酮5μg、丙酮酸钠1.2g、视黄醇乙酸酯0.08g、过氧化氢酶4g、叶酸0.9g、还原型谷胱甘肽0.8g、硫辛酸60μg、转铁蛋白2g、人胰岛素6g、亚硒酸钠0.1mg、香蕉皮提取物600mL、萘乙酸2g、维生素C1.5g。制备方法同实施例1，区别仅在于培养基的配方改为实施例2的配方。
实施例3
一种用于细胞培养的合成粘附培养基，每升合成粘附培养基中含有以下组分：生物素0.08g、皮质酮20μg、L-肉毒碱2g、亚油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亚麻酸0.8g、D-葡萄糖15g、孕酮5μg、丙酮酸钠1.2g、视黄醇乙酸酯0.08g、过氧化氢酶4g、叶酸1.2g、还原型谷胱甘肽1.3g、硫辛酸70μg、转铁蛋白3g、人胰岛素8g、亚硒酸钠0.1mg、香蕉皮提取物500mL、萘乙酸1.2g、维生素C0.8g。制备方法同实施例1，区别仅在于培养基的配方改为实施例3的配方。
实施例4
一种用于细胞培养的合成粘附培养基，每升合成粘附培养基中含有以下组分：生物素0.08g、皮质酮20μg、L-肉毒碱2g、亚油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亚麻酸0.8g、D-葡萄糖15g、孕酮5μg、丙酮酸钠1.2g、视黄醇乙酸酯0.08g、过氧化氢酶4g、叶酸1.1g、还原型谷胱甘肽1.2g、硫辛酸62μg、转铁蛋白2.8g、人胰岛素7.5g、亚硒酸钠0.1mg、香蕉皮提取物580mL、萘乙酸1.8g、维生素C1.4g。制备方法同实施例1，区别仅在于培养基的配方改为实施例4的配方。
实施例5
一种用于细胞培养的合成粘附培养基，每升合成粘附培养基中含有以下组分：生物素0.08g、皮质酮20μg、L-肉毒碱2g、亚油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亚麻酸0.8g、D-葡萄糖15g、孕酮5μg、丙酮酸钠1.2g、视黄醇乙酸酯0.08g、过氧化氢酶4g、叶酸0.95g、还原型谷胱甘肽1.25g、硫辛酸68μg、转铁蛋白2.2g、人胰岛素7.8g、亚硒酸钠0.1mg、香蕉皮提取物520mL、萘乙酸1.65g、维生素C1.35g。制备方法同实施例1，区别仅在于培养基的配方改为实施例5的配方。
需要说明的是，上述所有实施例仅给出了每升用于细胞培养的合成粘附培养基的配制方法，实际应用过程中，根据用于细胞培养的合成粘附培养基的体积用量需要，按每升培养基中含有上述各组分的比例，称取各组分，然后制备相应体积的培养基即可。
对比实验：
实验组处理方式如下：应用本发明实施例1的培养基，研究整个心脏肌球衍生细胞分化过程，具体如下：
步骤1，预处理培养皿和培养瓶
步骤1.1，纤维粘连蛋白预处理培养瓶
步骤1.1.1，从4℃冰箱取出纤维粘连蛋白，在瓶中加入5ml蒸馏水放入37℃水浴箱，充分溶解。
步骤1.1.2，目测瓶中没有絮状和颗粒，与双蒸水混合，配置成20μg/ml液体。
步骤1.1.3，将混合液铺满培养瓶底，在CO2恒温培养箱放置至少1小时。
步骤1.1.4，使用前用PBS液冲洗两次，放入实施例1的培养基备用。
步骤1.2，经多聚右旋赖氨酸氢溴酸盐(PDL)预处理培养皿
步骤1.2.1，从4℃冰箱取出多聚右旋赖氨酸氢溴酸盐，在瓶中加入10ml DMEM/F12培养基放入37℃水浴箱，充分溶解。
步骤1.2.2，目测瓶中没有絮状和颗粒，与DMEM/F12培养基配制成500μg/ml混合液体A，以2ml为单位分装后，放入-20℃冰箱内保存备用。
步骤1.2.3，取2ml500μg/ml混合液体A，再次与DMEM/F12培养基混合，配制浓度为20μg/ml的溶液并用一次性无菌过滤管过滤，得到混合液体B。
步骤1.2.4，用混合液体B覆盖培养皿底物，放入CO2恒温培养箱放置，3-30天可以使用。
步骤1.2.5，使用时用PBS液冲洗两次，放入实施例1的培养基备用。
步骤2，细胞培养
步骤2.1，大鼠心脏标本的取出：仰卧位，医用酒精消毒胸腹部，于上腹部中部开口并斜行向上切断肋骨，暴露整个心脏，注意避免损伤心脏组织。分离可见清晰心脏根部，取出完整心脏，立即放在置于湿冰上的盛有高钾心脏停跳液的培养皿中。心脏标本反复洗涤三次备用。上述过程都在超净工作台内无菌条件下进行。
步骤2.2，用纤维粘连蛋白预处理培养皿(同步骤1.1)。
步骤2.3，将心脏标本剪切成为1-2mm3，用胶原酶1mg/ml消化30-60min。
步骤2.4，将组织块按照两两间隔15-20mm放入100×20mm的纤维粘连蛋白预处理培养瓶中，用实施例1的培养基覆盖组织块，放入37℃，5％CO2恒温培养箱，30-45min后再加入实施例1的培养基持续培养。
步骤2.5，前2-3天内尽量避免移动培养瓶(静置利于组织块粘附培养盘和细胞铺展贴壁)。以后每日轻柔操作下观察，在组织块铺展出来的细胞接触即收获心脏外植体衍生细胞(EDCs，explant-derivedcells)，放入经PDL预处理的肌球细胞，2M细胞加入约20mlCSp培养基，继续培养，大概收获4次EDCs。此过程中可以观察到一般2-3天大鼠心脏标本中可见细胞从组织块中长出，5天完成第一次收获细胞。
实验组的心脏肌球衍生细胞的显微视图如图1所示。
对照组处理方式如下：与实验组的步骤大体相同，区别在于：(1)步骤1.1.4和步骤1.2.5加入的是DDM培养液，其中每250mLDDM培养液中含有以下组分：236.5mL的DMEM-F12-Glumax、2.5mL的N2添加剂、2.5mL的非必需氨基酸、2.5mL的丙酮酸钠、2.5mL的青链霉素、0.5mL的巯基乙醇、3mL的胎牛血清；所述青链霉素的浓度为50U/mL，所述胎牛血清的浓度为500μg/mL；
(2)步骤2.4是用神经细胞培养基覆盖组织块，其中每250mL神经细胞培养基中含有以下组分组：239.5mL的DMEM-F12-Glumax、2.5mL的N2添加剂、2.5mL的非必需氨基酸、2.5mL的丙酮酸钠、2.5mL的青链霉素、0.5mL的巯基乙醇；所述青链霉素的浓度为50U/mL，所述胎牛血清的浓度为500μg/mL；步骤2.5中12-13天完成第一次收获细胞。
对照组的心脏肌球衍生细胞的显微视图如图2所示。
通过对比图1和图2可以看出，实验组和对照组最终得到的形态规则的神经细胞，说明实施例1的培养基和常规培养基可以达到相同的细胞分化效果，与此同时，实施例1的培养基可使细胞分化时间缩短2倍以上，大大降低的物质成本和时间成本。
另外，我们分别利用实施例1的培养基对人体心脏组织细胞(分离于心脏标本)、人体骨髓干细胞(分离于骨髓组织器官)、小鼠胚胎干细胞进行细胞增殖实验。共设计以下分组：
实验一组：将心脏组织细胞接种于实施例1的培养基中，37℃、5％CO2条件下培养，每隔6小时测定一次细胞密度并记录；
实验二组：将人体骨髓干细胞接种于实施例1的培养基中，37℃、5％CO2条件下培养，每隔6小时测定一次细胞密度并记录；
实验三组：将小鼠胚胎干细胞接种于实施例1的培养基中，37℃、5％CO2条件下培养，每隔6小时测定一次细胞密度并记录；
对照一组：将心脏组织细胞接种于含10％胎牛血清的DMEM/F12基本培养基中，37℃、5％CO2条件下培养，每隔6小时测定一次细胞密度并记录；
对照二组：将人体骨髓干细胞接种于含10％胎牛血清的DMEM/F12基本培养基中，37℃、5％CO2条件下培养，每隔6小时测定一次细胞密度并记录；
对照三组：将小鼠胚胎干细胞接种于含10％胎牛血清的DMEM/F12基本培养基中，37℃、5％CO2条件下培养，每隔6小时测定一次细胞密度并记录；
结果如表1所示，由表1可知，使用实施例1培养基的实验一组、实验二组、实验三组中细胞密度快速增殖，24h可达到40％左右，48h即可达到95％左右，而三个对照组在培养48h时只有40％左右，说明本发明实施例1的培养基可以有效缩短细胞增值时间。
类似的，本发明所有实施例，包括实施例2、实施例3、实施例4和实施例5均可达到上述效果，由于实验结果类似，此处不再赘述。
表1不同干细胞、不同时间的细胞增殖效果
本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.一种用于细胞培养的合成粘附培养基，其特征在于，每升合成粘附培养基中含有以下组分：生物素0.08g、皮质酮20μg、L-肉毒碱2g、亚油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亚麻酸0.8g、D-葡萄糖13-17g、孕酮5μg、丙酮酸钠1.2g、视黄醇乙酸酯0.08g、过氧化氢酶4g、叶酸0.9-1.2g、还原型谷胱甘肽0.8-1.3g、硫辛酸60-70μg、转铁蛋白2-3g、人胰岛素6-8g、亚硒酸钠0.1mg、香蕉皮提取物500-600mL、萘乙酸1.2-2g、维生素C 0.8-1.5g；
所述香蕉皮提取物是香蕉皮115℃下焙炒10-20min后，再经含有维生素B12和维生素B1的溶液浸泡、过滤收集得到的滤液。
2.根据权利要求1所述的用于细胞培养的合成粘附培养基，其特征在于，每升合成粘附培养基中含有以下组分：生物素0.08g、皮质酮20μg、L-肉毒碱2g、亚油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亚麻酸0.8g、D-葡萄糖15g、孕酮5μg、丙酮酸钠1.2g、视黄醇乙酸酯0.08g、过氧化氢酶4g、叶酸1g、还原型谷胱甘肽1.0g、硫辛酸65μg、转铁蛋白2.5g、人胰岛素7g、亚硒酸钠0.1mg、香蕉皮提取物550mL、萘乙酸1.5g、维生素C 1.2g。
3.根据权利要求1所述的用于细胞培养的合成粘附培养基的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1，制备香蕉提皮取物
步骤1.1，收集新鲜的香蕉皮，115℃下焙炒10-20min，得到碳化香蕉皮；
步骤1.2，按以下配方制备浸泡液，其中每升浸泡液中含有以下组分：0.3-0.5g的维生素B12、1-2g的维生素B1，余量为蒸馏水；
步骤1.3，将所述碳化香蕉皮与浸泡液按照1:10的质量比例混合，超声提取30-50min，然后经孔直径为1-3μm的滤纸过滤，得到香蕉提皮取物；
步骤2，每升用于细胞培养的合成粘附培养基按照以下步骤制备：
步骤2.1，称取生物素0.08g、皮质酮20μg、L-肉毒碱2g、亚油酸1.2g、乙醇胺1.2g、亚麻酸0.8g、D-葡萄糖13-17g、孕酮5μg、丙酮酸钠1.2g、视黄醇乙酸酯0.08g、过氧化氢酶4g、叶酸0.9-1.2g、还原型谷胱甘肽0.8-1.3g、硫辛酸60-70μg、转铁蛋白2-3g、人胰岛素6-8g、亚硒酸钠0.1mg、香蕉皮提取物500-600mL、萘乙酸1.2-2g、维生素C 0.8-1.5g；
步骤2.2，将步骤2.1中称取的各组分混合后，震荡搅拌，充分溶化各组分，然后将得到的溶液经孔直径为0.22μm的滤菌膜过滤除菌，得到用于细胞培养的合成粘附培养基。
4.根据权利要求3中所述的用于细胞培养的合成粘附培养基的制备方法，其特征在于，所述超声提取的超声波频率为20kHz，功率为500W。
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