CN111944761B - 促进表皮干细胞分化和生长的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及促进表皮干细胞分化和生长的方法。本发明通过分离表皮干细胞，并制备获得了转CLL基因的表皮干细胞，该转基因的表皮干细胞能够特异性的促进Brn4蛋白的高表达。将所述的转基因表皮干细胞通过含有化合物的诱导剂进行诱导，获得了表皮干细胞来源的神经元细胞，通过检测所述神经元细胞的增殖活性以及神经元电特性，证明了诱导后的神经元细胞具有较好的增殖效果以及相应的神经元特性，具有较好的应用前景。

Description

促进表皮干细胞分化和生长的方法
技术领域
本发明属于干细胞领域，具体的涉及促进表皮干细胞分化和生长的方法。
背景技术
大脑中枢神经系统的细胞包括维持脑功能的功能性神经细胞和神经干细胞(Neural Stem Cell,NSCs)。功能性神经细胞主要包括神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞等。神经干细胞具有自我増殖能力和多向分化的潜能的成体干细胞M。在生理状态下,死亡或者调亡的功能性神经细胞,由神经干细胞分化而来的功能性神经细胞取代。神经干细胞因其所具有的自我增殖能力和多向分化潜能,为神经系统的损伤修复和脑缺血疾病的治疗带来了新的曙光。大量实验研究证明,成年哺乳动物中枢神经系统内侧脑室室管膜下区和齿状回的颗粒下区都存在神经干细胞,脑缺血不仅可引发缺血细胞的局部死亡,同时也启动缺血周围组织的再生反应。神经干细胞通过増殖、迁移、分化、进一步整合到现存的神经系统网络来完成神经再生及修复损伤。内源性神经干细胞的修复作用不大，原因是干细胞的数量有限，微环境的不允许。此外，也有研究显示，移植的神经干细胞进入体内后，由于受到多种因素的影响，常保持未分化状态或大部分分化为胶质细胞。所以，促进神经干细胞向神经元分化的比例及增加神经元之间功能性突触的数量将成为神经功能修复的一条重要途径。
近年来，人们在NSC增殖分化的调节因素、调控机制及应用方面做了大量的工作，取得了一些研究成果。但是，神经干细胞向神经元的分化是一个非常复杂的过程，受内外因素共同的调控。决定其分化的除内在的基因程序外，体内各种细胞因子的分泌和相互作用、细胞与细胞间的相互作用及环境因素都可能对之产生影响。更加具体的证实神经干细胞向神经元分化的过程、机制及影响因素仍旧是我们面临的复杂课题。
骨髓间充质干细胞BMSCs可从成体.的非造血干细胞、骨髓、脂肪组织、皮肤中分离得到。在体外培养条件下,BMSCs具有贴壁性且可向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化。hMSCs能够移植到大鼠大脑并分化成星形胶质细胞,MSCs为中枢神经系统(CentralNervous System,CNS)疾病的治疗提供了一个新的思路。在过去的几年里,来自不同物种如人(Human)、大鼠(Rat)、小鼠(Mouse)的MSCs向神经细胞分化都有相关的研究。诱导MSCs向神经细胞分化主要有三种方法:化合物诱导法,生长因子诱导法和神经样细胞培养方法。
MSCs是属于中胚层的一类多能干细胞，具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌(肌腱)细胞、骨髓基质甚至肝脏细胞和神经细胞等多种细胞分化的能力。近几年来国内外已有多位学者证明骨髓组织中存在一类可分化为骨、软骨、脂肪、心肌、血管、神经等的MSCs。已有众多的体外试验研究表明MSCs具有多分化的潜能。实验证实脂肪组织中可能存在着一类干细胞，通过诱导可以使本来不表达NSE的细胞表达NSE，并在形态上表现为神经元。但是文献中报道诱导分化后的细胞最多只能说是早期幼稚神经元，它不具备成熟神经元的功能；也有一些学者认为，尽管证明诱导后的细胞可表达多种神经元非特异性标志物，但认为细胞的突起是由于细胞在外界刺激下胞浆皱缩，或者是由于细胞贴附在培养平面的结果，未发现成熟的神经元标志物，如微管相关蛋白-2、胶质神经元酸性原纤维蛋白等的表达。郑亚妮等证实了：用Trichostatin A(TSA)、RG-108、8-BrcAMP和Rolipram 4种小分子物质对SD大鼠的ADSCs进行诱导分化，用免疫荧光形态学、免疫印迹和qRT-PCR等方法分别检测诱导前、后ADSCs神经元标志的表达，结果证明了小分子化合物可将ADSCs诱导分化为神经元样细胞，其可作为治疗神经系统疾病及损伤的干细胞移植的种子细胞。
但是在以上研究中，没有针对人表皮干细胞向神经元分化的研究，更没有涉及能够又好、又快、效率更高的诱导方法。
发明内容
为了解决现有的表皮干细胞没有诱导成为神经元细胞的问题，本发明的目的是提供一种表皮干细胞来源的神经元细胞、制备方法及其在治疗中枢神经系统损伤中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种促进Brn4表达的CLL基因的高表达的转基因表皮干细胞。
所述的CLL基因如SEQ ID NO：1所示。该基因是研究表皮干细胞诱导分化时，通过分析诱导后的神经元细胞与诱导前的表皮干细胞的蛋白质表达谱的差异，筛选得到的。
本发明的一个方面，提供一种诱导剂，组成为DMEM/F12+1％penicillin+20μg/LbFGF+20μg/L式(1)化合物。
其中本发明涉及的式(1)化合物是在研究干细胞诱导剂时，筛选得到的具有诱导干细胞向神经元细胞诱导功能的化合物，该化合物作用的原理初步推定是提高细胞的代谢活性，从而提高某些控制分化的基因的转录表达水平。具体的作用机理，发明人后续会展开研究。
进一步的，所述式(1)化合物结构式如式(1)所示。
Figure GDA0002693384950000031
按照CN101437785B的方法合成制备得到式(1)化合物，也可以采用本领域常规的化合物合成的方法来制备所述的化合物。
本发明的第二方面，提供采用上述诱导剂将表皮干细胞分化成神经元细胞的方法，包括以下步骤：
取制备的表皮干细胞，经0.25％胰酶-EDTA消化后接种于多聚赖氨酸包被的24孔板中，细胞贴壁后更换培养液为诱导剂(实验组)：DMEM/F12+1％penicillin+20μg/L bFGF+20μg/L式(1)化合物，隔天半量换液。诱导7d。
本发明的第三方面，提供表皮干细胞来源的神经元细胞的用途，用于制备治疗中枢神经系统损伤的药物。
本发明的第四方面，提供一种药物组合物，上述的表皮干细胞来源的神经元细胞和药学上可接受的载体，所述表皮干细胞来源的神经元细胞的存在量足以在给予患者所述表皮干细胞来源的神经元细胞后促进中枢神经系统损伤患者的功能恢复。
其中，所述表皮干细胞来源的神经元细胞的数量为1×106～1×107个。
其中，所述药学上可接受的载体为生理盐水。
有益效果
与现有技术相比，本发明实现的有益效果：本发明通过分离表皮干细胞，并制备获得了转CLL基因的表皮干细胞，该转基因的表皮干细胞能够特异性的促进Brn4蛋白的高表达。将所述的转基因表皮干细胞通过含有化合物的诱导剂进行诱导，获得了表皮干细胞来源的神经元细胞，通过检测所述神经元细胞的增殖活性以及神经元电特性，证明了诱导后的神经元细胞具有较好的增殖效果以及相应的神经元特性，具有较好的应用前景。
附图说明
图1PCR结果图
图2Brn4蛋白相对表达量结果图
图3基因表达量图
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。
实施例1表皮干细胞的制备
取皮肤标本,无菌条件下将皮片标本用含庆大霉素800u/ml D-hank’s液漂洗3遍。用眼科剪将皮片剪成1cm*1cm大小皮片,置入培养瓶,滴加0.25％Trypsin-0.02％EDTA,两者体积比为1:6,置4摄氏度条件消化10h。取出皮片，滴加少许胎牛血清终止消化，D-hank’s液漂洗2遍。分离表皮和真皮，用眼科镊轻轻揭开表皮；加入K-SFM，用吸管小心反复吹打表皮15min。200目筛网过滤，1000rpm，离心5min，弃去上清，加入K-SFM制成细胞悬液。将细胞接种于预处理好的IV型胶原培养板中，置37℃，5％CO2饱和湿度恒温培养箱中培养；20min弃去培养液和未黏附细胞，加入含10％胎牛血清，10ng/ml的EGF K-SFM的表皮干细胞培养液；置于37℃，5％CO2饱和湿度恒温培养箱中培养；倒置相差显微镜观察细胞的生长情况，每3d换液1次，细胞约70％-80％融合后，按1:3传代。待第二代表皮干细胞形成明显克隆后,以两步法分别行β1整合素、K19、p63免疫细胞化学染色进行鉴定，免疫细胞化学染色结果如表1所示。
表1分离的表皮干细胞免疫细胞化学染色结果
待测靶标 结果
β1整合素 阳性
K19 阳性
p63 阳性
显示,β1整合素、K19、p63均呈阳性表达。体外分离培养人的表皮干细胞成功。
实施例2转基因表皮干细胞的制备
1、基因的获得及质粒构建
将SEQ ID NO：1所示的CLL基因通过全基因序列合成的方法进行合成，并且在基因二端分别添加了酶切位点：HindIII和EcoRI。将pcDNA3.1质粒以及CLL基因分别用HindIII和EcoRI进行双酶切。产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收DNA。将双酶切后回收产物在T4 DNA连接酶的作用下，获得CLL表达质粒pcDNA3.1-CLL。取适量DH5α感受态细胞,向其中加入9μl连接反应物后的CLL表达质粒pcDNA3.1-CLL,混匀,冰浴30min；放入42℃水浴，热休克2min；立即转移到冰水浴中冷却1min；冷却后向其中加入400μl LB液体培养液，37℃,180rpm,震荡培养1h，使其活化。涂布于含X-gal,IPT,Amp的LB固体培养基上，置于37℃生化培养箱15min，待菌液吸收完全后，倒置培养20h。挑取白色菌落接种于5ml LB液体培养基(含氨苄抗性)中，过夜培养，根据质粒小提取试剂盒提取质粒，采用PCR鉴定显示，可以观察到扩增出的1116bp左右的特异性目的条带(如图1)，与实验前预期结果一致。说明质粒pcDNA3.1-CLL构建成功。
2、pcDNA3.1-CLL的转染及表达
取实施例1制备得到的表皮干细胞制备成单细胞悬液。将4μL Lipofectamine2000转染试剂加入75μL不含血清含有干细胞的新鲜RPMI 1640培养基中混匀，同时将1μg质粒pcDNA3.1-CLL加入150μL不含血清的新鲜RPMI 1640培养基中孵育5min后与前述制备的含有转染试剂的干细胞溶液两溶液混匀，培养5h后收集细胞，换成新鲜含5％胎牛血清、10％小牛血清的RPMI 1640培养基，每室300μL，再培养48h，通过pcDNA3.1质粒特异性的测序引物5’测序引物ctagagaacccactgcttac和3’测序引物tagaaggcacagtcgagg进行鉴定，选择阳性细胞株即为获得的转基因的干细胞，扩增备用。
采用Western blot检测Brn4蛋白表达量的差异。结果如图2所示。从结果可以看出CLL基因能够正向调控Brn4蛋白的高表达。而Brn4是与神经细胞分化密切相关的。
实施例3化合物对表皮干细胞向神经元的诱导分化
按照CN101437785B的方法合成制备得到式(1)化合物。
分別取第4代的实施例1制备的表皮干细胞以及实施例2制备的转基因表皮干细胞，经0.25％胰酶-EDTA消化后接种于多聚赖氨酸包被的24孔板中，细胞贴壁后更换培养液为诱导液(实验组)：DMEM/F12+1％penicillin+20μg/L bFGF+20μg/L式(1)化合物，隔天半量换液。分别于诱导后7d后进行检测。另外以加入DMEM/F12+1％penicillin+20μg/L bFGF作为诱导液的第4代的实施例1制备的表皮干细胞组作为对照1，以不加诱导液的第4代的实施例1制备的表皮干细胞组作为对照2。
将24孔板中诱导后的细胞用0.1mol/L PBS清洗后加Radio-ImmunoprecipitationAssay(RIPA)buffer进行细胞裂解。低温离心取上清液，用Bradford法测蛋白浓度，于100℃沸水中煮沸5min，离心备用。制备分离胶，加样，SDS-PAGE电泳，取出胶板进行转膜，染膜，然后用封闭液稀释的nestin(1：1000)、β-tubulinIII(1：1000)、MAP2(1：2000)、ChAT(1：1000)和GAPDH(1：2000)，4℃孵育过夜。二抗(1：2000)室温孵育2h。取出膜，TBST漂洗，用保鲜膜包好PVDF膜，暗室中用X胶片感光、显影、定影。结果显示，用免疫印迹检测诱导后表皮干细胞神经元性标志蛋白的表达变化如图3所示，诱导7d后，无论是转基因的表皮干细胞还是不转基因的表皮干细胞的神经元性标记蛋白β-tubulinIII、MAP2、ChAT、以及nestin均高于诱导前，其中MAP2、ChAT这二者升高更为显著。而且转基因的实验组与对照组1相比，这些标记物也是升高比未转基因的更加显著，也充分说明转基因能够促进干细胞向神经元分化。通过镜检发现，实验组诱导后的细胞形态较为成熟，细胞胞体较大，凸起细长丰富。选取转基因实验组的神经元性标记蛋白表达上升最高的孔对应的诱导后的细胞进行下一步实验。
实施例4诱导后细胞增殖
MTT法检测诱导前后的细胞的增殖作用：实施例2标记蛋白表达上升最高的神经元细胞稀释成细胞浓度约5×106L-1，将细胞悬液接种于96孔板，每孔加入200μL，细胞贴壁后，吸出每孔中的培养液，实验共分为4组：分别对应实施例2的转基因实验组和未转基因实验组，对照1，对照2，每组6孔。空白组：在有细胞孔内加新配制的含体积分数10％小牛血清的DMEM培养基，200μL/孔。培养72h后取出96孔板，加入MTT25μL/孔，避光孵育4h，吸出液体，将20％的十二烷基硫酸钠溶于50％的二甲基甲酰胺，96孔板每孔加入100μL的上述混合液，放入37℃，体积分数5％CO2避光孵育24h然后放入酶联免疫监测仪中震荡10min，在570nm处测定各时相点各孔吸光度值(A值)；计算相对存活率，相对存活率＝待测样品A值/正常组A值×100％。根据相对存活率均值，按照细胞相对存活率评分标准，对样品细胞作用程度进行评价。结果如表2所示。
表2细胞的吸光度及相对活力
组别 570nm吸光度 细胞相对活力(％)
对照1分化的细胞 0.693±0.13 103.12<sup>a</sup>
对照2的细胞 0.672±0.09 100
未转基因实验组分化的细胞 0.793±0.05 118.0<sup>a</sup>
转基因实验组分化的细胞 0.854±0.02 127.1<sup>a</sup>
与对照2相比，aP≤0.05。
实验结果显示对照2组细胞在570nm处的吸光度为0.672±0.09，未转基因实验组细胞在570nm处的吸光度为0.793±0.05，转基因实验组分化的细胞在570nm处的吸光度为0.854±0.02，对照1组细胞570nm处的吸光度为0.693±0.13，无论是转基因实验组还是未转基因实验组细胞吸光度显著高于对照1组和对照2组细胞，说明含有化合物的诱导剂不仅能够促进细胞的诱导分化，还能对神经元细胞具有促进生长的作用，特别是针对转基因的干细胞效果更加显著。
实施例5神经细胞功能验证
膜片钳检测全细胞膜片钳模式下选取具有典型神经元形态的细胞以及未分化细胞进行电生理检测。检测对象与实施例4相同。在电压钳模式下记录细胞膜离子通道电流；电流钳模式下记录细胞的静息电位。记录用玻璃微电极采用水平玻璃微电极拉制仪两步拉制，充灌电极液后阻抗在2～4MΩ之间，通过微操纵器接触到细胞后给负压形成高阻封接(1-5GΩ)，补偿电极电容后给予瞬时较强负压击破细胞膜形成全细胞式膜片钳。保持电压(holdingpotential，HP)设置为-60mV，膜电流用10kHz(-3dB)低通滤过，以上所得资料用PC计算机记录(pClamp 10.2)。检测时所用电极液如下：①细胞外液：NaCl 150mmol/L；KCI5mmol/L；CaCI2 2.5mmol/L MgC12 1mmol/L；Glucose 5mmol/L；HEPPS 10mmol/L；pH＝7.4(用1mol/L NaCI溶液调定)。②电极内液：KCI 140mmol/L；CaC12 1mmol/L；MgC12 2mmol/L；EGTA 1mmol/L；HEPPS 10mmol/L；pH＝7.4(用1mol/L KC1溶液调定)，实验在室温下(20-25℃)进行。结果如下表3所示。
表3细胞分化前后膜特性的比较
Figure GDA0002693384950000081
从表3的结果可以看出，检测对照2细胞和转基因实验组以及未转基因实验组分化的细胞发现细胞的膜电容(Cm)，串连电阻值(Rs)，静息膜电位(RMP)在细胞分化前后有显著差异性(P<0.01)。(见表3)，细胞定向分化的神经元样细胞具有活跃的电生理特性。分化的神经元样细胞和未分化细胞的在膜特性上有了显著的改变，分化后的细胞在膜特性上趋近于正常神经细胞的生理特性。而且转基因实验组的神经细胞特性更强，更好。
应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。
这样，本领域技术人员将了解在基于本公开时的概念可容易用作设计用于执行本发明的若干目的的其他结构、方法和系统的基础。因此，重要的是权利要求书应被认为是包括此类等效结构至它们不背离本发明的精神和范围的程度。
序列表
<110> 北京广未生物科技有限公司
<120> 促进表皮干细胞分化和生长的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1116
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagaggta gaagttggca ctgggcagct tggagaggac aagcacatcg gtccacacac 60
acatggcaat gtcctcttgg ggatttgtgt ccaagacacc agctgggtgg acagctctgc 120
cgcaagtggt gggagagtgg acaaacgtgg ccttggcggc tggagctccc aatgctcagc 180
gattggctgc aaggcagctt tgtgtgggcg aggaaagggc caattggacc tggtgaacct 240
ctcgagctgt tgtgcaatgt ctccggtgca ttgcctcccg ctggacgaca cgctgcttac 300
tccgtaggat gggaaatggc tccagctggc gcaccaggtc ctggaagatt ggtggcacag 360
ctcgatacag aaggcgtcgg cagccttgga cctggatacg aagggcgcca catcgccatg 420
gaaaaggtgg catctagaac atatcgattg cggttggaag cagccagacc aggtgacgca 480
gggacctatc ggtgccttgc aaaagcctat gtgagaggat ctggaacaag actgcgagaa 540
gccgcaagtg ccagaagtcg ccctctgcct gtacatgtgc gggaagaagg cgtggtcctg 600
gaagctgtgg catggcttgc ggggggaact gtttatagag gggagaccgc gtctctgctg 660
tgtaatatct ctgtaagggg cggtccacca ggccttaggc ttgcagcatc ttggtgggtt 720
gaaagacccg aagacggaga gttgtcatca gtgccagccc agttggtggg aggtgtggga 780
caagatggag ttgctgagtt gggcgtcaga cctggaggag ggccagtttc cgtggagttg 840
gtaggcccca ggagtcacag actcagactg cattcccttg gcccggagga tgaaggcgta 900
taccattgcg ccccaagcgc ttgggtacaa catgctgatt actcctggta ccaagcggga 960
tctgccagat ctgggcctgt gactgtttac ccctatatgc acgcactcga tacactcttt 1020
gttcctctcc ttgtaggaac aggcgtggct ctggttaccg gagccacagt gcttgggact 1080
attacctgct gttttatgaa gcgactgagg aagcga 1116

Claims (5)

1.一种转基因的表皮干细胞，其特征在于将核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的基因导入到表皮干细胞中获得。
2.一种促进表皮干细胞分化和生长的方法，包括以下步骤：
取权利要求1所述的转基因的表皮干细胞，经0.25%胰酶-EDTA消化后接种于多聚赖氨酸包被的24孔板中，细胞贴壁后更换培养液为诱导剂，所述诱导剂组成为：DMEM／F12+1%penicillin+20μg/L bFGF+20μg/L式（1）化合物，隔天半量换液，诱导7d；表皮干细胞分化为神经元细胞；所述式（1）化合物如下
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
3.一种药物组合物，含有根据权利要求2所述方法制备得到的神经元细胞和药学上可接受的载体，所述神经元细胞的存在量足以在给予患者所述神经元细胞后促进中枢神经系统损伤患者的功能恢复。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于所述神经元细胞的数量为1×106～1×107个。
5.如权利要求3所述组合物，其特征在于所述药学上可接受的载体为生理盐水。
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