CN104774807B - 将脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
公开了将脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞的方法。该方法采用预诱导和诱导二步结合法，并配制了优化的预诱导培养液和诱导培养液，其中通过加入皂苷类化合物作为诱导物，成功诱导脐带间充质干细胞分化成少突胶质细胞，并且分化比例较高。
Description
技术领域
本发明涉及神经生物学领域，特别涉及一种将脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞的方法，本发明还涉及培养得到的少突胶质细胞。
背景技术
自2000年Erices等报道脐带血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞以来，因脐带血间充质干细胞的多向分化潜能，免疫调节作用和无伦理问题等优点，备受研究者的关注。随后，有学者分别报道了脐带血间充质干细胞在体外可诱导表达神经元标志物、神经胶质细胞标志物、以及少突胶质细胞。目前人们已经可以成功地体外分离培养脐带血间充质干细胞，并且对其生物学特性、表面标志和免疫原性有了进一步的了解。近年来成功地诱导脐带血间充质干细胞分化为骨、脂肪、软骨、肝脏及神经等成体细胞，展示了脐带血间充质干细胞的无限分化潜能和广阔的应用前景，从而为体外诱导脐带血间充质干细胞分化各种成体细胞和各种疾病的治疗提供了新的思路。
脐带间充质干细胞(MSC)是中胚层起源的，能够进行自我更新，并具备向成骨、软骨和脂肪三种中胚层系细胞分化潜能的一种成体干细胞。近年来研究发现MSC在中胚层之外，还可以跨胚层进行转分化，如分化成外胚层系的神经细胞和上皮细胞以及内胚层系的肝细胞和胰腺细胞。因为MSC来源广泛，易于分离培养，免疫原性较低，且不存在胚胎干细胞所面临的伦理学问题，这使其在再生医学方面的应用具备了其他干细胞所没有的优势。中枢神经系统的神经退行性疾病如帕金森氏综合征以及外部创伤造成的神经损伤等长期困扰人类的问题也因此将有更为现实可行的解决之道。
CN104004713A公开了一种将脐带间充质干细胞诱导培养为神经细胞的方法，采用预诱导和诱导二步结合法，并配制了优化的预诱导培养液和诱导培养液，通过该诱导方式，诱导周期短、细胞分化均一度高，而且电生理检测发现该神经细胞具有诱导放电功能，成功得到诱导的神经细胞。
CN101451123A公开了一种诱导人骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化的方法。本发明的目的是提供一种获得大量少突胶质细胞以用于治疗髓鞘损伤或脱髓鞘等疾病。本发明通过简易的平板黏附法获取大量的自体人骨髓间充质干细胞，用黏附分子F3/Contactin诱导人骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化。
CN101831401A公开了一种体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，在添加了bFGF、成纤维细胞生长因子FGF8、SHH和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培养体系中预诱导间充质干细胞；在添加了bFGF、FGF8和SHH的无血清neurobasal medium培养体系中将预诱导的细胞定向分化为神经干细胞。
CN102337246A公开了一种刺五加苷处理人间充质干细胞得到少突胶质前体细胞及其增殖的分化培养基，所述分化培养基包括液体基础培养基，其中，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述分化培养基还含有1-500ug/mL的刺五加苷、1-20体积％的胎牛血清、5-300ng/mL人表皮生长因子(EGF)和5-300ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；还提供了使用前述分化培养基的制备该刺五加苷处理试剂盒的方法；还提供了包括前述的方法获得的少突胶质前体细胞的用于治疗神经系统疾病的药物组合物。
CN102716467A公开了肝细胞生长因子（HGF）及含有HGF的骨髓间充质干细胞（MSC）条件培养液（MSC-CM）在制备治疗多发性硬化症（MS）的药物中的应用，研究结果显示，在髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55多肽片段（MOG35-55）诱导的MS动物模型EAE中，给予含有人MSC旁分泌物质的MSC-CM能够降低EAE功能缺陷，并在功能性细胞损伤时促进少突胶质细胞和神经元的发育，其中发挥主要作用的是MSC释放的HGF；单独给予HGF的作用与MSC-CM相似，同样可以刺激少突胶质细胞和神经元的发育及迁移，增强髓鞘修复能力，减少MS动物模型EAE的病变负荷，促进疾病功能恢复，且给予EAE模型短暂的HGF治疗即能持续地引导疾病功能改善。
CN103388007A公开了一种利用人源性真皮多能干细胞制备组织工程脊髓的方法，包括如下步骤：1)分离dMSCs，传代得dMSCs原代细胞；2)将分离得到的dMSCs原代细胞移入扩增培养基中进行扩增；3)将组织工程脊髓材料饱和水溶液，滴加到含深神经营养素、维甲酸和Neuregulin的生理盐水溶液中，静置，梯度酒精脱水后，真空干燥；将扩增后的dMSCs，以脑源性神经营养素腺病毒表达载体感染，将细胞接种到工程脊髓材料材料上，进行培养。
CN104046589A公开了一种细胞共培养诱导干细胞体外定向分化的方法，在培养皿底部装一环形垫片，先将干细胞接种在环形区域内，于培养箱内培养，待细胞贴壁后再将琼脂糖/海藻酸钠混合溶液加到该环形区域，溶液固化后，加CaCl2溶液钙化，再加入壳聚糖溶液反应，在干细胞上形成一层琼脂糖/海藻酸钠/壳聚糖平板复合凝胶。
CN101831401A公开了一种体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，在添加了bFGF、成纤维细胞生长因子FGF8、SHH和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培养体系中预诱导间充质干细胞；在添加了bFGF、FGF8和SHH的无血清neurobasal-medium培养体系中将预诱导的细胞定向分化为神经干细胞。
CN103146642A公开了一种定向诱导干细胞分化的方法，包括如下步骤：将离体的诱导细胞接种并吸附于聚碳酸酯膜的下表面，将离体的间充质干细胞接种至所述聚碳酸酯膜的上表面，然后将所述诱导细胞和所述间充质干细胞共培养，促使所述间充质干细胞分化为目标细胞；所述间充质干细胞和所述诱导细胞均不能通过所述聚碳酸酯膜的孔径。
CN102191217A公开了一种诱导脐带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法，该方法将脐带间充质干细胞与许旺细胞用0.4μm孔径的Transwell小室隔离共培养，所用培养液为许旺细胞培养液；每三天全量或者半量换一次液，培养两周即可得到类神经细胞。
“IGF-1诱导脐血间充质干细胞向少突胶质样细胞分化的研究”，全国优秀硕士学位论文，林凌，福建医科大学，2011年，公开了体外培养获得足够数量的脐血间充质干细胞（mesenchymAlstem cells,MSCs）并对其进行诱导分化，应用胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)、新生大鼠少突胶质细胞∕Ⅱ型星形胶质祖细胞（oligodendrocyte∕typeⅡastrocyte,O2A祖细胞，也称少突胶质祖细胞）培养上清液共培养等方法提高诱导分化的效率，在体外培养获得更多的少突胶质细胞，为少突胶质细胞相关疾病的研究提供实验基础。
MSC定向诱导分化为少突胶质细胞的实验研究尚处于开始阶段，而且现有报道的诱导分化方法诱导周期长，得到的少突胶质细胞分化效率低、细胞分化均一度低。在上述现有技术中，CN104004713A公开的方法通过该诱导方式，诱导周期短、细胞分化均一度高，而且电生理检测发现该少突胶质细胞具有诱导放电功能，成功得到诱导的少突胶质细胞，是一种可行性比较高的方法。然而，该专利文献没有公开如何有效地将MSC定向诱导分化为少突胶质细胞，并且如何将MSC有效地定向诱导分化为少突胶质细胞的研究在其它现有技术中也非常少。
发明内容
为克服现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种将脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞的方法，本发明还涉及培养得到的少突胶质细胞。
为此，本发明提供了如下方法，该方法包括如下步骤：
(1)、脐带间充质干细胞的培养和扩增：获得脐带间充质干细胞单体，将脐带间充质干细胞单体按1-5×105/ml接种于脐带间充质干细胞培养液中，在35-38℃、体积分数为5-10%的CO2饱和湿度培养箱内培养，每3-8天换液传代一次，得到培养的细胞；
所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12基本培养基，2％B27（重量），2-4mM L-谷氨酰胺，1mM硫代甘油， EGF 20-40ng/ml，bFGF 20-30ng/ml，80-90U/ml青霉素，60-70μg/ml链霉素。优选地，所述培养液中可以加入非必需的氨基酸，其含量可以为1-2％（重量），更优选1％（重量）。
(2)、预诱导分化：将步骤(1)得到的培养细胞按1～5×104/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3-4天时终止诱导；其中在该步骤的培养过程中，在培养液中添加皂苷类诱导物，并且保持培养液中所述诱导物的浓度为5-10μg/mL；
在步骤(1)中，所述体积分数为5-10%的CO2饱和湿度培养箱在本领域中也通常可称作5-10% CO2培养箱。
所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nM～50nM的维生素C，10-20U/ml人白细胞抑制因子，15-25μg/L bFGF，15-25μg/L EGF，1-8mM L-谷氨酰胺，2-5mM硫代甘油，80-100U/ml青霉素，80-100μg/ml链霉素，所述预诱导培养液另外任选含有0.01M磷酸盐缓冲液（PBS），即含有0.01M磷酸盐进行缓冲。
所述皂苷类诱导物的神经性活性在以前没有报导，本发明人经过研究发现，其可促进干细胞向少突胶质细胞的分化，并且可促进干细胞表达与神经生长、分化有关的如NGF、NT-3 和BDNF 等细胞因子，这些细胞因子能诱导干细胞向少突胶质细胞定向分化，同时能够抑制向星形角质细胞AST的分化。
在一个最优选的实施方式中，为了促进脐带间充质干细胞向少突胶质细胞分化的有效性例如分化效率和选择性，本发明人经过大量筛选、分离、分析和提纯获得了下文结构式（I）～（III）所示的皂苷类物质，发现其能够使得脐带间充质干细胞向少突胶质细胞分化的效率和选择性得到明显提高。换言之，本发明人经过大量试验和复杂的结构分析和筛选，提供具有如下结构式（I）～（III）任一种所示的皂苷类物质：
（I）
（II）
（III）
所述化合物的使用可以激活电压调控Ca2+通道并且引起细胞间[Ca2+]的提高，从而促进脐带间充质干细胞向少突胶质细胞的分化。此处应指出的是，筛选并使用这样的皂苷类化合物应用于所述脐带间充质干细胞向少突胶质细胞的分化在现有技术中没有任何记载，现有技术中也不存在任何相关技术启示或教导，同时也不是本领域技术人员容易想到的。
具有结构式（I）～（III）的物质可以通过如下方法获得：将经干燥的高丽参的根茎进行粉碎，然后使用索氏提取器，采用石油醚、CH2Cl2和MeOH（例如体积比为2:1:1）的混合溶剂进行提取，获得含有40多种物质的混合物，采用柱层析方法将该混合物进行分离和收集。所述物质通过HPLC-MS、1-D NMR、2D NMR、IR进行结构进行分析和结构确认。
特别优选地，在本发明中，上述结构式（I）-（III）的皂苷类物质按这3种物质的混合物使用，本发明人出乎意料地发现，当采用上述三种物质的混合物作为诱导物时，可以在相同使用总量的情况下获得比单独物质更好的分化效果。经研究发现，当使用所述三种物质的混合物时（例如1～5:2～10:2～10的重量比，优选1～2:2～6:2～6的重量比），可以获得最佳的分化效果，经研究发现起原因在于，三种物质之间通过羟基形成了氢键，从而发生相互之间的缔合，使得所述物质的稳定性得到提高，另外当发生缔合后，所述物质分子结构的多环部分的空间结构发生扭转，更容易发生分子内的双键迁移，从而可有利于NSCs簇的分化活性和选择性。
优选地，所述方法还包括步骤(3)诱导分化：将步骤(2)得到的细胞按1～5×104/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行诱导培养，3天后半量换液，第3-6天时终止诱导，得到少突胶质细胞；所述诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nmol～50nmol的维生素C，30nM～40nM的维生素B1，0.01-0.02％的二甲基亚砜，0.1mM2-β-巯基乙醇，10-20U/ml人白细胞抑制因子，10-30U/ml碱性成纤维细胞生长因子，1-8mM L-谷氨酰胺，2-5mM硫代甘油，80-100U/ml青霉素，80-100μg/ml链霉素。所述培养液中可以加入1％（重量）的非必需氨基酸。
另外地或优选地，所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12，2％B27，4mM L-谷氨酰胺，1mM硫代甘油，1％非必需氨基酸，EGF20ng/ml，bFGF20ng/ml90U/ml青霉素，70μg/ml链霉素；所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生素C，20U/ml人白细胞抑制因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油，80U/ml青霉素，80μg/ml链霉素；所述诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生素C，30nmol的维生素B1，0.01％的二甲基亚砜，0.1mM2-β-巯基乙醇，10U/ml人白细胞抑制因子，30U/ml碱性成纤维细胞生长因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素。所述培养液中可以加入1％（重量）的非必需氨基酸。
在一个特别优选的实施方式中，在所述步骤(2)中，培养液的pH维持在7.1-7.7。
本发明所用培养液可在常用的细胞基本培养基的基础上补充一种或多种成分而得到。可用于本发明的细胞基本培养基可以包括但不仅限于：DMEM，DMEM/F12，2％B27。这些培养基的配方是本领域所公知的，不仅在普通教科书和实验手册中有详细描述，而且还可以直接以成品的形式从公司购买获得。
作为补充物的成分可以是任何维持或促进细胞生长的成分。它们可以包括但不限于：氨基酸、维生素、蛋白、激素、金属离子、微量元素、脂肪酸、糖等等。
本发明所用的所有试剂均可通过商业途径购买得到。
本发明所述方法获得的少突胶质细胞至少具有如下特征之一：
(a)具有典型的细胞体、轴突和树突等细胞结构；
(b)至少表达蛋白：β-tublin III；
(c)少突胶质细胞占诱导细胞群体86-91％左右；
(d)对外界刺激具有放电功能。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：相比现有技术中使用的诱导物相比，脐带间充质干细胞向少突胶质细胞分化的效率和选择性（细胞分化均一度）大大提高，诱导周期缩短2-4天，细胞分化均一度高达65%以上，并且电生理检测发现该少突胶质细胞具有诱导放电功能。
附图说明
图1例示了根据本发明实施例2使用式I所示化合物作为诱导物时在不同时间获得的分化形态的SEM图像。
具体实施方式
实施例1：脐带间充质干细胞获取和培养
使用经产妇同意授权的新生儿脐带作为间充质干细胞的来源。
将新生儿脐带在含1％双抗的生理盐水中洗涤三次，去除表面的血污，然后剪成约1厘米长的小段。用眼科剪将脐带沿血管平行方向纵向剖开，将2根脐动脉和1根脐静脉血管从脐带中剥离干净。剥掉表面羊膜，华通胶部分用含1％双抗的生理盐水充分洗涤3次，剪碎至约1mm3大小。将剪碎的组织块均匀的平铺在75cm2培养瓶内，室温放置5-10min，使组织块贴紧。加入5ml培养基，培养基含DMEM/F12，2％B27，4mM L-谷氨酰胺，1mM硫代甘油(MTG)，1％非必需氨基酸，EGF20ng/ml，bFGF20ng/ml，90U/ml青霉素，70μg/ml链霉素，37℃5％CO2孵箱培养。每隔三天更换一次培养基，细胞生长至铺满培养皿后传代培养。
也可以使用市售或商售的合法来源的脐带间充质干细胞通过实施例1的方法直接进行培养。
实施例2：脐带间充质干细胞体外定向诱导分化
新鲜传代的P3-6代脐带间充质干细胞以5×104/ml接种于放置有包被多聚赖氨酸盖玻片的24孔板内，1ml/孔，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3天时终止诱导。
预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，此基础上还含有50nmol的维生素C，20U/ml人白细胞抑制因子，20μg/L bFGF，15μg/L EGF，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油(MTG)，80U/ml青霉素，80μg/ml链霉素，所述预诱导培养液另外含有0.01M磷酸盐进行缓冲。
将预诱导培养得到的细胞按5×104/ml的细胞密度接种进行单层贴壁诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行诱导培养，3天后半量换液，第3天时终止诱导，在培养液中不添加诱导物、添加胰岛素样生长因子-1(IGF-1)（市售获得）、添加上文结构式（I）～（III）所示的皂苷类诱导物及其混合物分别进行试验，并且在如果加入诱导物时，在培养过程中，保持培养液中所述诱导物的浓度为8μg/mL，得到少突胶质细胞；
诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生素C，30nmol的维生素B1，0.01％的DMSO，0.1mM2-β-巯基乙醇，10U/ml人白细胞抑制因子，30U/ml碱性成纤维细胞生长因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油(MTG)，100U/ml青霉素，80μg/ml链霉素。
采用免疫荧光化学染色法、流式细胞分析和电生理检测进行结果分析，结果表明上述诱导培养均产生了少突胶质细胞（图1显示了使用式I所示化合物时的分化形态SEM图像，a为诱导培养1天，d为诱导培养2天，g为诱导培养3天），其中实施例2中各种方法获得的少突胶质细胞的分化比例（即诱导细胞中少突胶质细胞比例）经测定，结果如下表1所示：
表1：诱导结果对照
| 序号 | 诱导方式 | 分化比例 |
| 1（对照） | 不加入诱导物 | 12.02% |
| 2（对照） | 加入胰岛素样生长因子-1(IGF-1) | 22.14% |
| 3（根据本发明） | 加入式I所示化合物 | 32.56% |
| 4（根据本发明） | 加入式II所示化合物 | 35.12% |
| 5（根据本发明） | 加入式III所示化合物 | 37.78% |
| 6（根据本发明） | 加入式I、II和III所示化合物1:2:2重量比的混合物 | 43.69% |
通过上述对比结果清楚地可知，皂苷类物质的加入明显可以诱导脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞，根据本发明的皂苷类化合物与IGF-1相比，使得诱导效果明显提高，特别地，当使三种化合物的混合物作为诱导物时，分化比例高达43.69%，这样的效果是本领域技术人员先前所预料不到的。
本书面描述使用实例来公开本发明，包括最佳模式，且还使本领域技术人员能够制造和使用本发明。本发明的可授予专利的范围由权利要求书限定，且可以包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这种其它实例具有不异于权利要求书的字面语言的结构元素，或者如果这种其它实例包括与权利要求书的字面语言无实质性差异的等效结构元素，则这种其它实例旨在处于权利要求书的范围之内。在不会造成不一致的程度下，通过参考将本文中参考的所有引用之处并入本文中。
Claims (2)
1.一种将脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1) 脐带间充质干细胞的培养和扩增：获得脐带间充质干细胞单体，将脐带间充质干细胞单体按1-5×105/ml接种于脐带间充质干细胞培养液中，在35-38℃、体积分数为5-10%的CO2饱和湿度培养箱内培养，每3-8天换液传代一次，得到培养的细胞；其中所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12基本培养基，2％B27，2-4mM L-谷氨酰胺，1mM硫代甘油，EGF20-40ng/ml，bFGF 20-30ng/ml，80-90U/ml青霉素，和60-70μg/ml链霉素；以及
(2) 预诱导分化：将步骤(1)得到的培养细胞按1～5×104/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3-4天时终止诱导；其中在该步骤的培养过程中，在培养液中添加皂苷类诱导物，并且保持培养液中所述诱导物的浓度为5-10μg/mL； 并且，其中所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nM～50nM的维生素C，10-20U/ml人白细胞抑制因子，15-25μg/L bFGF，15-25μg/L EGF，1-8mM L-谷氨酰胺，2-5mM硫代甘油，80-100U/ml青霉素，80-100μg/ml链霉素，所述预诱导培养液另外含有0.01M磷酸盐进行缓冲；
所述皂苷类诱导物为下面结构式（I）～（III）任一所示：
（I）
（II）
（III）
和
(3)诱导分化：将步骤(2)得到的细胞按1～5×104/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行诱导培养，3天后半量换液，第3-6天时终止诱导，得到少突胶质细胞；所述诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nmol～50nmol的维生素C，30nM～40nM的维生素B1，0.01-0.02％的二甲基亚砜，0.1mM 2-β-巯基乙醇，10-20U/ml人白细胞抑制因子，10-30U/ml碱性成纤维细胞生长因子，1-8mM L-谷氨酰胺，2-5mM硫代甘油，80-100U/ml青霉素，和80-100μg/ml链霉素。
2.根据权利要求1所述的将脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞的方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，培养液的pH维持在7.1-7.7。
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