CN109852578A - 一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞分泌物提取技术领域，公开了一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体(DPC‑Exos)提取方法；通过可控电阻式脉冲感应(TRPS)分析、电镜、WesternBlot鉴定DPC‑Exos；将DPC‑Exos加入离体培养的人毛囊外根鞘细胞(ORSCs)的培养基中。鉴定发现DPC‑Exos直径约为105nm，表达肿瘤易感基因(TSG)101，分化簇(CD)9和CD63；DPC‑Exos促进人ORSCs的增殖和迁移，并检测到ORSCs中β‑catenin和Sonichedgehog(Shh)的mRNA和蛋白质水平经处理后上调；经皮注射DPC‑Exos加速了小鼠HF生长期启动并延缓了退行期发生。免疫组织化学分析显示β‑catenin和Shh表达水平在实验组毛囊中上调。DPC‑Exos有助于调节HF的生长发育和生长周期，并为临床脱发的治疗提供了新的潜在途径。

Description

一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法

技术领域

本发明属于细胞分泌物提取技术领域，尤其涉及一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法。

背景技术

毛囊毛乳头细胞(DPC)来源于毛囊(HF)间充质，在HF上皮-间充质相互交流中起关键作用。DPC被认为通过旁分泌机制调节HF生长发育，其中外泌体可能起重要作用。在雄激素性脱发中，毛发表现为HF变细软，毛球部变小，生长期变短，导致脱发。脱发十分影响外在形象、自信和生活质量，但目前FDA批准的药物主要有两种，内服的非那雄胺和外用的米诺地尔，随着用药停止，毛囊逐渐恢复并继续原先的脱发状态。而HF移植费用昂贵且来源有限。因此需要更有效和新颖的治疗方法。

HF上皮细胞和间充质细胞之间的相互作用对HF生长发育和周期调控起着十分关键的作用。这种相互作用不仅对胚胎发育过程中的分化很重要，而且对成人HF细胞增殖和迁移的调节也很重要。DPC来源于间充质，ORSC来源于上皮，是HF发育和生长的关键调节因子。作为一种特殊的间充质细胞，DPCs不仅可以促进HF上皮功能，调节HF的发生、生长和周期循环，还参与脱发的发病机制。有研究报道，DPC调节ORSC的增殖和迁移，并调节ORSC的分化以及HF特异性结构和功能。

近期报道表明，DPC主要通过旁分泌机制发挥其对HF生长的调节作用。DPC释放各种因子，包括表皮生长因子，转化生长因子-β和角质形成细胞生长因子，以刺激毛囊上皮细胞的增殖和分化，并调节间充质-上皮相互作用。

外泌体是纳米级小囊泡，是旁分泌信号传导的重要组成部分。外泌体几乎由各种类型的细胞分泌，内含蛋白质、mRNA和microRNA等，能够促进细胞间交流。来自间充质干细胞的外泌体(MSC-Exos)已被证明可刺激皮肤成纤维细胞的增殖和迁移并调节瘢痕形成；由角质形成细胞释放的外泌体影响黑素细胞色素沉着；而来自人羊膜上皮细胞的外泌体可促进伤口愈合。基于这些研究结果，我们推测DPC分泌的分泌物(外泌体)在HF生长和发育中具有调节作用，目前国内外尚未发表相关文献。

综上所述，现有技术存在的问题是：DPC分泌的外泌体在HF生长和发育中是否具有调节作用尚未被研究过。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法。

本发明是这样实现的，一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法包括以下步骤：

步骤一，健康人头皮中DPC和ORSC的分离培养；

步骤二，DPC-Exos的分离和鉴定；

步骤三，DPC-Exos经皮注射小鼠背部；

步骤四，组织形态学和免疫组化分析；

步骤五，细胞增殖试验；

步骤六，通过流式周期试验对ORSC进行细胞周期分析；

步骤七，通过划痕实验和Transwell实验对ORSC进行愈合和迁移能力检测；

步骤八，RT-PCR检测毛囊生长关键信号分子β-catenin和Shh基因表达水平；

步骤九，Western Blot检测毛囊生长关键信号分子β-catenin和Shh蛋白表达水平；

步骤十，统计分析。

进一步，所述步骤一的健康人头皮中DPC和ORSC的分离培养具体包括：

从没有全身性疾病且正在接受整形手术的患者知情情况下获得健康人头皮标本；通过两步酶消化法从头皮HF中分离出ORSC和DPC；头皮沿真皮-表皮交界处偏下剪开，浸泡于dispase，4℃过夜，将HF拔出后放入胰酶消化5-10分钟；经滤器筛后用预冷PBS洗涤ORSC悬浮液并以800×g离心5分钟，然后重悬于完全角质形成细胞培养基(CKSFM)中；将真皮部分由胶原酶37℃消化3-6小时，经滤器筛DPC由PBS洗涤并重悬于含有10％FBS的DMEM/F-12(1：1)(Hyclone,Logan,UT,USA)中；将ORSC和DPC转移至25ml培养瓶中，并在37℃，5％CO₂的潮湿培养箱中培养；

进一步，所述步骤二的DPC-Exos的分离和鉴定具体包括：

当培养瓶中细胞长到70％-80％时，弃培养液用预冷PBS洗涤DPC两次，将培养基替换成不含外泌体的血清培养基，在37℃，5％CO₂下继续培养48小时。收集上清液以2000×g,4℃，离心30分钟，吸上清(留管底0.5-1cm液体)以10000×g离心30分钟，然后用0.22-μm过滤器(Steritop；Millipore,Billerica,MA,USA)过滤；收集到的液体上超离机，以100,000×g超离心2小时；将沉淀的外泌体重悬于15mLPBS中，以100000×g离心70分钟，弃上清，将沉淀(DPC-Exos)溶于100ulPBS中储存在-80℃直至使用；

通过qNano仪器(Izon Science,Christchurch,New Zealand)上的TRPS确定DPC-Exo浓度和直径大小范围分布。通过透射电子显微镜观察外泌体形态；通过WesternBlot检测细胞表面标志蛋白：CD9、CD63和TSG101(全部为：Abcam,Cambridge,MA,USA)；

进一步，所述步骤三的DPC-Exos经皮注射小鼠背部具体包括：

将雌性C57B/L6小鼠背部蜜蜡脱毛后随机分为：PBS对照组和DPC-Exo实验组；将100μl(1.0x10¹⁰/ml)DPC-Exos分别于休止期(脱毛后0天：p.d 0)和生长期VI期(p.d 12)经皮注射到C57BL/6小鼠的背部，对照组小鼠注射等体积PBS(100μl)；连续每日注射，在进入下一个HF生长周期阶段之前(分别在p.d 3和p.d 18)取材注射部位的皮肤毛囊组织样品。

进一步，所述步骤四的组织形态学和免疫组化分析具体包括：

将固定在4％多聚甲醛中的背部皮肤组织脱水包埋在石蜡中，切成5μm厚的切片，用苏木素和伊红染色，根据毛囊长度、毛球部直径、HF百分比和毛发周期评分以及皮肤厚度这四个参数评估HF生长及周期；每组至少分析50个HF；免疫组化染anti-β-catenin(1:100；Cell Signaling Technology)和anti-shh(1:100；Santa Cruz Biotechnology)。

进一步，所述步骤五的细胞增殖试验具体包括：

将人ORSC以1.5×10⁴/ml的密度接种在96孔板中,用含有DPC-Exos的SFM(Promega,Madison,WI,USA)处理24小时后，用MTS试剂盒(Promega，USA)处理30分钟后并在ELX808酶标仪(BioTek，Winooski，VT，USA)上测量490nm处的吸光度对细胞增殖进行评估；

进一步，所述步骤六的通过流式周期试验对ORSC进行细胞周期分析具体包括：

将DPC-Exo处理24小时的ORSC和对照组ORSC消化，并用80％预冷乙醇固定ORSC单细胞悬浮液，并细胞周期试剂盒(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)进行检测；

进一步，所述步骤七的通过划痕实验和Transwell实验对ORSC进行愈合和迁移能力检测具体包括：

ORSC在六孔板中长满后，用200μl枪头进行划痕，用PBS冲洗后，在SFM中加入DPC-Exos对细胞进行处理，分别在0,3,6,12,24,48h在显微镜下对划痕进行拍照，使用Image JPlus对划痕距离进行测量与分析；在24孔板进行Transwell实验，24孔板中加入500ulSFM(含或不含DPC-Exos)，Transwell小室上室中加入200ulORSC悬液，共培养24h后，进行结晶紫染色，在显微镜下计穿到下室的ORSC数并进行分析；

进一步，所述步骤八的RT-PCR检测毛囊生长关键信号分子β-catenin和Shh基因表达水平具体包括：

ORSC长至70％-80％密度，然后用DPC-Exos处理，用TRI-zol试剂(Ambion,NewYork,NY,USA)提取对照组和实验组ORSCs的总RNA，使用逆转录试剂盒(Takara Bio,Otsu,Japan)进行逆转录。用SYBRGreenIMas-terMix(Takara Bio,Otsu,Japan)和以下上下游引物(synthesizedby Sangon Biotech,Shanghai,China)进行RT-PCR：

β-catenin，5'-CGGTCGGTTGATGAGACTACT-3'和5'-CAGGGCTCTGTCAAGATCACC-3'；Shh，5'-CTCGCTGCTG-GTATGCTCG-3'和5'-ATCGCTCGGAGTTTCTGGAGA-3'；和GAPDH，5'-TGAAG-GTCGGAGTCAACGG-3'和5'-TGGAAGATGGT-GATGGGAT-3'；PCR进行40个循环，并进行2^-ΔΔCt方法用于比较目的基因的相对mRNA表达水平与内参GAPDH的相对mRNA表达水平；

进一步，所述步骤九的Western Blot检测毛囊生长关键信号分子β-catenin和Shh蛋白表达水平具体包括：

ORSC长至70％-80％密度，然后用DPC-Exos处理，用细胞裂解液(RIPA)((BeyotimeInstitute ofBiotechnology,Beijing,China)试剂提取对照组和实验组ORSCs的蛋白，经Western Blot对β-catenin(1:250；Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA)和Shh(1:250；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)，结合内参GAPDH(1:1000；CellSignaling Technology)的表达水平进行检测与分析；

进一步，所述Western Blot实验步骤和分析方法如下：

用细胞裂解液(Beyotime Instatute of Biotechnology，Beijing，China)提取细胞总蛋白，并取40ug蛋白在10％聚丙烯酰胺凝胶上通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore)上，然后用以下一抗在4℃下进行过夜孵育：兔多克隆抗β-catenin(1：250；Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)和兔多克隆抗Shh(1：250；Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，CA，USA)。将膜用二抗(1：5000；JacksonLaboratories，WestGrove，PA，USA)常温下孵育2小时。GAPDH用作内参对照，并用兔单克隆抗GAPDH抗体(1：1000；CellSignalingTechnology)检测。

进一步，所述步骤十的统计分析具体包括：

使用SPSS软件(版本17.0；SPSSInc.，Chicago，IL，USA)统计分析数据。使用t检验和单因素ANOVA比较结果。所有数据表示为平均值±标准差。

本发明的优点及积极效果为：本发明提供的DPC-Exos直径约为105nm，表达肿瘤易感基因101，分化簇(CD)9和CD63。将DPC-Exos在不同HF生长周期阶段经皮下注射，并通过组织形态学和免疫组织化学分析评估效果。DPC-Exos可加速小鼠HF生长期的发生并延缓退行期。对体外培养液的人ORSCs进行处理，评估了DPC-Exos对人ORSCs的增殖、迁移和细胞周期状态的影响。检测到DPC-Exo处理增强了ORSC的增殖和迁移；ORSC中β-catenin和Sonichedgehog(Shh)的mRNA和蛋白质水平的变化；注射DPC-Exos免疫组织化学分析显示β-catenin和Shh水平在皮肤中上调。DPC-Exos有助于调节HF的生长和发育，并为脱发的治疗提供了潜在的途径。

附图说明

图1是本发明实施提供的人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法流程图。

图2是本发明提供的DPC-Exos经局部皮下注射加速了小鼠HF从休止期进入毛发生长初期并延迟进入退行期图。

图3是本发明实施提供的小鼠皮肤组织中的β-catenin和Shh表达图。

图4是本发明实施提供的DPC-Exos刺激ORSC增殖，迁移并增加S和S/G1期图。

图5是本发明实施提供的DPC-Exos在ORSC中上调Shh和β-catenin表达图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作进一步描述。

如图1所示，本发明提供一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法包括以下步骤：

S101：健康人头皮中DPC和ORSC的分离培养；

S102：DPC-Exos的分离和鉴定；

S103：DPC-Exos经皮注射小鼠背部；

S104：组织形态学和免疫组化分析；

S105：细胞增殖试验；

S106：通过流式周期试验对ORSC进行细胞周期分析；

S107：通过划痕实验和Transwell实验对ORSC进行愈合和迁移能力检测；

S108：RT-PCR检测毛囊生长关键信号分子β-catenin和Shh基因表达水平；

S109：Western Blot检测毛囊生长关键信号分子β-catenin和Shh蛋白表达水平；

S110：统计分析。

下面结合附图对本发明的应用原理作进一步的描述。

如图1所示，本发明提供一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法具体包括以下步骤：

步骤一，健康人头皮中DPC和ORSC的分离培养；

从没有全身性疾病且正在接受整形手术的患者知情情况下获得健康人头皮标本；通过两步酶消化法从头皮HF中分离出ORSC和DPC；头皮沿真皮-表皮交界处偏下剪开，浸泡于dispase，4℃过夜，将HF拔出后放入胰酶消化5-10分钟；经滤器筛后用预冷PBS洗涤ORSC悬浮液并以800×g离心5分钟，然后重悬于完全角质形成细胞培养基(CKSFM)中；将真皮部分由胶原酶37℃消化3-6小时，经滤器筛DPC由PBS洗涤并重悬于含有10％FBS的DMEM/F-12(1：1)(Hyclone,Logan,UT,USA)中；将ORSC和DPC转移至25ml培养瓶中，并在37℃，5％CO₂的潮湿培养箱中培养；研究方案经浙江大学医学院附属第二医院机构审查委员会批准。

步骤二，DPC-Exos的分离和鉴定；

根据已建立的方案分离和纯化DPC-Exos。简而言之，当培养瓶中细胞长到70％-80％时，弃培养液用预冷PBS洗涤DPC两次，将培养基替换成不含外泌体的血清培养基，在37℃，5％CO2下继续培养48小时。收集上清液以2000×g,4℃，离心30分钟，吸上清(留管底0.5-1cm液体)以10000×g离心30分钟，然后用0.22-μm过滤器(Steritop；Millipore,Billerica,MA,USA)过滤；收集到的液体上超离机，以100,000×g超离心2小时；将沉淀的外泌体重悬于15mLPBS中，以100000×g离心70分钟，弃上清，将沉淀(DPC-Exos)溶于100ulPBS中储存在-80℃直至使用；

通过qNano仪器(Izon Science,Christchurch,New Zealand)上的TRPS确定DPC-Exo浓度和直径大小范围分布。通过透射电子显微镜观察外泌体形态；通过Western Blot检测细胞表面标志蛋白：CD9、CD63和TSG101(全部为：Abcam,Cambridge,MA,USA)；

步骤三，DPC-Exos经皮注射小鼠背部；

涉及动物的实验经浙江大学医学院附属第二医院伦理委员会批准。DPC-Exos经皮注射小鼠背部；将雌性C57B/L6小鼠背部蜜蜡脱毛后随机分为：PBS对照组和DPC-Exo实验组；将100μl(1.0x1010/ml)DPC-Exos分别于休止期(脱毛后0天：p.d 0)和生长期VI期(p.d12)经皮注射到C57BL/6小鼠的背部，对照组小鼠注射等体积PBS(100μl)；连续每日注射，在进入下一个HF生长周期阶段之前(分别在p.d 3和p.d 18)取材注射部位的皮肤毛囊组织样品。

步骤四，组织形态学和免疫组化分析；

将固定在4％多聚甲醛中的背部皮肤组织脱水包埋在石蜡中，切成5μm厚的切片，用苏木素和伊红染色，根据毛囊长度、毛球部直径、HF百分比和毛发周期评分以及皮肤厚度这四个参数评估HF生长及周期；每组至少分析50个HF；免疫组化染anti-β-catenin(1:100；Cell Signaling Technology)和anti-shh(1:100；Santa Cruz Biotechnology)。结果表示为平均值±标准差，P<0.05被认为具有统计学意义。

步骤五，细胞增殖试验；

将人ORSC以1.5×10⁴/ml的密度接种在96孔板中,用含有DPC-Exos的SFM(Promega,Madison,WI,USA)处理24小时后，用MTS试剂盒(Promega，USA)处理30分钟后并在ELX808酶标仪(BioTek，Winooski，VT，USA)上测量490nm处的吸光度对细胞增殖进行评估。

步骤六，通过流式周期试验对ORSC进行细胞周期分析；

通过流式周期试验对ORSC进行细胞周期分析；将DPC-Exo处理24小时的ORSC和对照组ORSC消化，并用80％预冷乙醇固定ORSC单细胞悬浮液，并细胞周期试剂盒(BDBiosciences,San Jose,CA,USA)进行检测；

步骤七，通过划痕实验和Transwell实验对ORSC进行愈合和迁移能力检测；

ORSC在六孔板中长满后，用200μl枪头进行划痕，用PBS冲洗后，在SFM中加入DPC-Exos对细胞进行处理，分别在0,3,6,12,24,48h在显微镜下对划痕进行拍照，使用Image JPlus对划痕距离进行测量与分析；在24孔板进行Transwell实验，24孔板中加入500ulSFM(含或不含DPC-Exos)，Transwell小室上室中加入200ulORSC悬液，共培养24h后，进行结晶紫染色，在显微镜下计穿到下室的ORSC数并进行分析；

步骤八，RT-PCR检测毛囊生长关键信号分子β-catenin和Shh基因表达水平；

ORSC长至70％-80％密度，然后用DPC-Exos处理，用TRI-zol试剂(Ambion,NewYork,NY,USA)提取对照组和实验组ORSCs的总RNA，使用逆转录试剂盒(Takara Bio,Otsu,Japan)进行逆转录。用SYBRGreenIMas-terMix(Takara Bio,Otsu,Japan)和以下上下游引物(synthesizedby Sangon Biotech,Shanghai,China)进行RT-PCR：

β-catenin，5'-CGGTCGGTTGATGAGACTACT-3'和5'-CAGGGCTCTGTCAAGATCACC-3'；Shh，5'-CTCGCTGCTG-GTATGCTCG-3'和5'-ATCGCTCGGAGTTTCTGGAGA-3'；和GAPDH，5'-TGAAG-GTCGGAGTCAACGG-3'和5'-TGGAAGATGGT-GATGGGAT-3'；PCR进行40个循环，并进行2^-ΔΔCt方法用于比较目的基因的相对mRNA表达水平与内参GAPDH的相对mRNA表达水平；

步骤九，Western Blot检测毛囊生长关键信号分子β-catenin和Shh蛋白表达水平；

ORSC长至70％-80％密度，然后用DPC-Exos处理，用细胞裂解液(RIPA)((BeyotimeInstitute ofBiotechnology,Beijing,China)试剂提取对照组和实验组ORSCs的蛋白，经Western Blot对β-catenin(1:250；Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA)和Shh(1:250；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)，结合内参GAPDH(1:1000；CellSignaling Technology)的表达水平进行检测与分析；

步骤十，统计分析；

本发明提供的Western Blot实验和分析方法如下：

用细胞裂解液(BeyotimeIn-stituteofBiotechnology，Beijing，China)提取总细胞蛋白，并取40ug蛋白在10％聚丙烯酰胺凝胶上通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore)上，然后在4℃下用以下一抗进行过夜孵育：兔多克隆抗β-catenin(1：250；CellSignalingTechnology，Danvers，MA，USA)和兔多克隆抗Shh(1：250；SantaCruzBiotechnology，SantaCruz，CA，USA)。将膜与二抗(1：5000；JacksonLaboratories，WestGrove，PA，USA)一起常温下孵育2小时。并用兔单克隆抗GAPDH抗体(1：1000；CellSignalingTechnology)作为内参进行检测分析。

本发明提供的统计分析方法如下：

使用SPSS软件(版本17.0；SPSSInc.，Chicago，IL，USA)统计分析数据。使用t检验和单因素ANOVA比较结果。所有数据表示为平均值±标准偏差。

实施例：

1、材料和方法

1.1、健康人头皮中DPC和ORSC的分离培养；

从没有全身性疾病且正在接受整形手术的患者知情情况下获得健康人头皮标本；通过两步酶消化法从头皮HF中分离出ORSC和DPC；头皮沿真皮-表皮交界处偏下剪开，浸泡于dispase，4℃过夜，将HF拔出后放入胰酶消化5-10分钟；经滤器筛后用预冷PBS洗涤ORSC悬浮液并以800×g离心5分钟，然后重悬于完全角质形成细胞培养基(CKSFM)中；将真皮部分由胶原酶37℃消化3-6小时，经滤器筛DPC由PBS洗涤并重悬于含有10％FBS的DMEM/F-12(1：1)(Hyclone,Logan,UT,USA)中；将ORSC和DPC转移至25ml培养瓶中，并在37℃，5％CO₂的潮湿培养箱中培养；研究方案经浙江大学医学院附属第二医院机构审查委员会批准。

1.2、DPC-Exos的分离和鉴定

根据已建立的方案分离和纯化DPC-Exos。简而言之，当培养瓶中细胞长到70％-80％时，弃培养液用预冷PBS洗涤DPC两次，将培养基替换成不含外泌体的血清培养基，在37℃，5％CO2下继续培养48小时。收集上清液以2000×g,4℃，离心30分钟，吸上清(留管底0.5-1cm液体)以10000×g离心30分钟，然后用0.22-μm过滤器(Steritop；Millipore,Billerica,MA,USA)过滤；收集到的液体上超离机，以100,000×g超离心2小时；将沉淀的外泌体重悬于15mLPBS中，以100000×g离心70分钟，弃上清，将沉淀(DPC-Exos)溶于100ulPBS中储存在-80℃直至使用；

通过qNano仪器(Izon Science,Christchurch,New Zealand)上的TRPS确定DPC-Exo浓度和直径大小范围分布。通过透射电子显微镜观察外泌体形态；通过Western Blot检测细胞表面标志蛋白：CD9、CD63和TSG101(全部为：Abcam,Cambridge,MA,USA)；

1.3、DPC-Exos经皮注射小鼠背部；

涉及动物的实验经浙江大学医学院附属第二医院伦理委员会批准。DPC-Exos经皮注射小鼠背部；将雌性C57B/L6小鼠背部蜜蜡脱毛后随机分为：PBS对照组和DPC-Exo实验组；将100μl(1.0x1010/ml)DPC-Exos分别于休止期(脱毛后0天：p.d 0)和生长期VI期(p.d12)经皮注射到C57BL/6小鼠的背部，对照组小鼠注射等体积PBS(100μl)；连续每日注射，在进入下一个HF生长周期阶段之前(分别在p.d 3和p.d 18)取材注射部位的皮肤毛囊组织样品。

1.4、组织形态学和免疫组化分析；

将固定在4％多聚甲醛中的背部皮肤组织脱水包埋在石蜡中，切成5μm厚的切片，用苏木素和伊红染色，根据毛囊长度、毛球部直径、HF百分比和毛发周期评分以及皮肤厚度这四个参数评估HF生长及周期；每组至少分析50个HF；免疫组化染anti-β-catenin(1:100；Cell Signaling Technology)和anti-shh(1:100；Santa Cruz Biotechnology)。结果表示为平均值±标准差，P<0.05被认为具有统计学意义。

1.5、细胞增殖试验；

将人ORSC以1.5×10⁴/ml的密度接种在96孔板中,用含有DPC-Exos的SFM(Promega,Madison,WI,USA)处理24小时后，用MTS试剂盒(Promega，USA)处理30分钟后并在ELX808酶标仪(BioTek，Winooski，VT，USA)上测量490nm处的吸光度对细胞增殖进行评估。

1.6、通过流式周期试验对ORSC进行细胞周期分析；

通过流式周期试验对ORSC进行细胞周期分析；将DPC-Exo处理24小时的ORSC和对照组ORSC消化，并用80％预冷乙醇固定ORSC单细胞悬浮液，并细胞周期试剂盒(BDBiosciences,San Jose,CA,USA)进行检测；

1.7、通过划痕实验和Transwell实验对ORSC进行愈合和迁移能力检测；

ORSC在六孔板中长满后，用200μl枪头进行划痕，用PBS冲洗后，在SFM中加入DPC-Exos对细胞进行处理，分别在0,3,6,12,24,48h在显微镜下对划痕进行拍照，使用Image JPlus对划痕距离进行测量与分析；在24孔板进行Transwell实验，24孔板中加入500ulSFM(含或不含DPC-Exos)，Transwell小室上室中加入200ulORSC悬液，共培养24h后，进行结晶紫染色，在显微镜下计穿到下室的ORSC数并进行分析；

1.8、RT-PCR检测毛囊生长关键信号分子β-catenin和Shh基因表达水平；

ORSC长至70％-80％密度，然后用DPC-Exos处理，用TRI-zol试剂(Ambion,NewYork,NY,USA)提取对照组和实验组ORSCs的总RNA，使用逆转录试剂盒(Takara Bio,Otsu,Japan)进行逆转录。用SYBRGreenIMas-terMix(Takara Bio,Otsu,Japan)和以下上下游引物(synthesizedby Sangon Biotech,Shanghai,China)进行RT-PCR：

β-catenin，5'-CGGTCGGTTGATGAGACTACT-3'和5'-CAGGGCTCTGTCAAGATCACC-3'；Shh，5'-CTCGCTGCTG-GTATGCTCG-3'和5'-ATCGCTCGGAGTTTCTGGAGA-3'；和GAPDH，5'-TGAAG-GTCGGAGTCAACGG-3'和5'-TGGAAGATGGT-GATGGGAT-3'；PCR进行40个循环，并进行2^-ΔΔCt方法用于比较目的基因的相对mRNA表达水平与内参GAPDH的相对mRNA表达水平；

1.9、Western Blot检测毛囊生长关键信号分子β-catenin和Shh蛋白表达水平；

ORSC长至70％-80％密度，然后用DPC-Exos处理，用细胞裂解液(RIPA)((BeyotimeInstitute ofBiotechnology,Beijing,China)试剂提取对照组和实验组ORSCs的蛋白，经Western Blot对β-catenin(1:250；Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA)和Shh(1:250；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)，结合内参GAPDH(1:1000；CellSignaling Technology)的表达水平进行检测与分析；

1.10、统计分析

使用SPSS软件(版本17.0；SPSSInc.，Chicago，IL，USA)统计分析数据。使用t检验和单因素ANOVA比较结果。所有数据表示为平均值±标准偏差。

2、结果

2.1、DPC-Exos的表征；

qNano分析显示，大多数DPC-Exos的粒径大小约为50-150nm(图2a)。透射电子显微镜分析显示DPC-Exos具有圆盘形形状，直径大小范围为50至150nm(图2b)。通过western-blot检测，DPC-Exos细胞膜表面标志蛋白(包括CD9，CD63和TSG101)呈阳性(图2c)。

图2.2e-2q.DPC-Exos的局部皮下注射加速了小鼠HF从休止期(telogen)进入毛发生长期(anagen)并延迟进入退行期(catagen)。2d.脱毛诱导后毛囊进行telogen-anagen转换时间轴；2e.DPC-Exo处理组；2f.PBS治疗(对照组)；2g.皮肤厚度；2h.毛球部直径；2i.毛发周期分数；2j.毛发周期百分比(％)；比例尺：100μm。2k.脱毛诱导后毛囊进行anagen-catagen转换时间轴；2l.DPC-Exo处理组；2m.PBS治疗(对照组)；2n.皮肤厚度；2o.毛球部直径；2p.毛发周期分数；2q.HF百分比(％)；比例尺：100μm。结果代表平均值±SD(每组n＝6)。*P<0.05，**P<0.01。

2.2、局部皮下注射DPC-Exos可加速telogenHF进入毛发anagen；

DPC-Exo处理组的小鼠HF的形态大多属于anagen中期的特征，具有较厚的皮肤和较大的毛球部直径，后者出现增加的黑色素，更多毛球部位于皮下组织(图2e)。相反，对照组表现出早期anagen期形态，大多数毛球部存在于真皮-皮下组织边缘(图2f)。与对照组小鼠HF相比，DPC-Exo处理组的皮肤厚度和毛球部直径(图2g和h)以及HCS(图2i)数值更大。对照组中HF大多位于anagen IIIa，大多数DPC-Exo处理组的HF处于毛发anagen IIIb至IV期。超过70％的对照组HF保持在anagen早期，而DPC-Exo处理组HF近80％处于anagen IIIb至V期(图2j)。结果表明，DPC-Exos可加速毛发周期从telogen到anagen。DPC-Exo经皮下注射到anagen期的小鼠可延迟anagen进入catagen。H&E染色的组织形态学分析表明，用DPC-Exos(图21)处理的HF的形态是anagenVI阶段的形态，与对照组相比具有更大的毛球部直径(图2m))。而对照小鼠与DPC-Exo组相比DP直径小及皮肤薄(图2n和o)。计算HCS和HF(％)以更准确地确定毛发周期。anagen VI、catagen II-III和catagen IV-VHF分别代表100,200和300分。DPC-Exo中的总HCS低于对照组(图2p)；对照组中20％的HF进入了catagen IV-VI阶段，而DPC-Exos组中约为40％进入catagen(图2q)。这些结果表明，DPC-Exo处理可延迟小鼠HF从anagen进入catagen。

2.3、Shh和β-catenin在小鼠HF中的表达；

以往研究表明，β-catenin和Shh对HF的生长发育和毛发生长周期调控至关重要。DPC-Exos处理诱导小鼠HF进入生长期，该期β-catenin和Shh高表达。在DPC-Exo处理的小鼠HF中β-catenin表达水平(图3a-h)在p.d.3(图3c,d)和p.d.18(图3g,h)较对照组(图3a,b,e,f)高。β-Catenin在对照组主要定位于表皮，ORS和DP，在DPC-Exo处理组较对照组具有更高表达，特别是在ORS和DP中。在p.d.3，Shh主要定位于毛囊隆突部在DPC-Exo组中也较对照组(图3i)显示出更高的表达(图3j)。这些发现表明DPC-Exos在毛发生长周期中具有促进anagen的作用。

图3.小鼠皮肤组织中的β-catenin和Shh表达。a,b,e,f.通过免疫组织化学检测对照组小鼠p.d.3和p.d.18背部皮肤中β-catenin的表达；c,d,g,h.DPC-Exos组小鼠p.d.3和p.d.18背部皮肤中β-catenin的表达；i,j.p.d.3,Shh在对照组(i)和DPC-Exos组(j)的表达。比例尺：50μm(a-d，i，j)，100μm(e-h)。

2.4、DPC-Exos促进体外培养的人ORSC的增殖和迁移

在浓度为1.0×10⁸/ml和1.0×10⁹/ml时，DPC-Exos与对照组相比以剂量依赖性方式刺激ORSC增殖(图4a)。Transwell实验显示，当以1.0×10⁹/ml的浓度给药时，DPC-Exos更好地促进ORSC迁移(图4b和c)。划痕实验测定的结果显示DPC-Exos增强ORSC划痕“愈合”能力(图4d和e)。

图4.DPC-Exos促进ORSC增殖、迁移并增加ORSC的S和S/G1期比例。a.用0,1.0×10⁸和1.0×10⁹/ml DPC-Exos处理ORSC24小时，并用MTS测定评估细胞增殖能力。DPC-Exos促进ORSC增殖。b,c.将ORSCs接种在transwell小室的上室中，同时将1.0×10⁹/mlDPC-Exos加入下室共培养24小时。DPC-Exos促进ORSC的迁移速度。d，e.在用1.0×10⁹/mlDPC-Exos处理24小时后，划痕实验的划痕图像。f-i.对照组和DPC-Exos处理组中ORSCs的S期和G1期检测分析图。数值代表三次独立实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01。

2.5、DPC-Exos促进ORSC进入S-和S/G1期

浓度为1.0×10⁸和1.0×10⁹/ml的DPC-Exo处理分别促进S期比例增加2.9倍和5.4倍(图4f-h)，和S/G1比例增加1倍和6.1倍(图4i)。这些结果进一步证明DPC-Exos可促进ORSC增殖。

2.6、DPC-Exos在ORSC中上调Shh和β-catenin表达

DPC-Exo以剂量依赖性方式增加ORSC中Shh和β-catenin的表达(图5)。在DPC-Exo浓度为1.0×10⁹/ml时，相对于对照组，Shh和β-catenin的水平分别增加1.6倍，3倍(图5a-c)。在mRNA水平中观察到类似的趋势，其分别增加150倍，60倍(图5d-e)。

图5.DPC-Exos在ORSC中上调Shh和β-catenin表达。a.ORSCs经0,1.0×10⁸/ml和1.0×10⁹/mlDPC-Exos处理24小时，Western blotting来检测Shh和β-catenin蛋白表达。b-d.Shh和β-catenin蛋白水平的定量分析。e-g.通过RT-PCR测定的Shh和β-catenin的相对mRNA表达。*P<0.05，**P<0.0。

3、讨论

DPCs处于皮肤真皮具有调节上皮行为和毛囊形态和功能的关键作用。来自DPC的信号可促进毛母质细胞增殖和调控位于毛囊隆突部上皮干细胞的分化。此外，通过信号和趋化因子，DPC诱导毛囊新生以维持毛发生长。因此，DPC在HF发育的调节中起十分关键作用。

直接移植DPC已被用于治疗动物模型中的脱发。来自刚出生的小鼠的毛囊和新鲜DPCs共同移植到小鼠，可诱导毛发形成，说明DPC具有毛囊诱导能力。将DPC和角质形成细胞共同移植到裸鼠上可形成上皮。然而，DPC移植中存在的主要限制是体外培养多代后的DPC会逐渐失去毛囊诱导能力。此外，DPC的供体来源有限，这限制了其广泛的应用。且，细胞移植治疗方法还与肿瘤形成，移植物排斥和伦理问题的风险相关。

进来研究证据表明，基于细胞的疗法的功效是由于外泌体发挥重要作用的旁分泌机制。在皮肤病领域，外泌体被证明可以防止皮肤疤痕形成，促进毛发生长，并调节黑素细胞色素沉着。因此，基于外泌体调控细胞间交流的旁分泌机制，其治疗方法可能比细胞移植治疗更安全和更有效。在临床应用中使用外泌体还有许多其他优点，包括获得方便和储存条件相对简单性以及免疫反应和其他副作用的较低风险。

从骨髓MSCs中分离的细胞外囊泡(包括微泡和外泌体)通过上调Akt/细胞外信号调节激酶信号传导来激活DPC的增殖、活力和迁移。我们研究了从DPC来源的外泌体的影响，因为它们不仅在胚胎HF生成中起着更重要的作用，而且在成人HF生长、形成和形态学中也起着更重要的作用。来自MSC的细胞外囊泡显示其诱导HF从休止期进入生长期；而DPC-Exos不仅诱导HF从休止期进入生长期，且延迟生长期进入退行期。

在本研究中，我们发现DPC-Exos上调β-catenin和Shh的表达，这两个蛋白在调节HF生长发育和毛发周期调控中起着十分重要的作用。Wnt/β-catenin信号调节HF上皮和间充质之间的交流，正向调节HF生长和诱导并维持毛发生长期和毛发再生。Shh信号是旁分泌信号传导的先决条件，并调节HF细胞增殖和形成、形态发生和毛发生长期的诱导。外泌体中含有RNA、miRNA和蛋白质等，介导细胞间的通讯并调控它们的功能。研究发现源自人脐带MSCs来源的外泌体激活Wnt/β-catenin信号通路以促进伤口愈合和血管生成。虽然DPC-Exos在HF生长发育中的确切作用机制仍不清楚，但我们认为其中包含的一种或多种成分(miRNA或蛋白质等)可激活ORSC中的β-catenin和Shh信号。需要进一步研究以确定调控这些功能的外泌体的性质及其作用方式。

总之，本研究的结果国际上初次提供了DPC-Exos有助于调节HF生长、发育和毛发生长周期调控的证据。我们从体内实验发现DPC-Exo经皮下注射，加速休止期的HFs进入生长期，且延迟HF从生长期进入退行期。此外，DPC-Exos促进体外培养的ORSC的增殖和迁移。因此，DPC-Exos可作为一种新型方案为治疗脱发提供了潜在的途径。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法，其特征在于，所述人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法包括以下步骤：

第一步，健康人头皮中DPC和ORSC的分离培养；

第二步，DPC-Exos的分离和鉴定；

第三步，DPC-Exos经皮注射小鼠背部；

第四步，组织形态学和免疫组化分析；

第五步，细胞增殖试验；

第六步，通过流式周期试验对ORSC进行细胞周期分析；

第七步，通过划痕实验和Transwell实验对ORSC进行愈合和迁移能力检测；

第八步，RT-PCR检测毛囊生长关键信号分子β-catenin和Shh基因表达水平；

第九步，Western Blot检测毛囊生长关键信号分子β-catenin和Shh蛋白表达水平；

第十步，统计分析。

2.如权利要求1所述的人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法，其特征在于，所述第一步的健康人头皮中DPC和ORSC的分离培养具体包括：

从没有全身性疾病且正在接受整形手术的患者知情情况下获得健康人头皮标本；通过两步酶消化法从头皮HF中分离出ORSC和DPC；头皮沿真皮-表皮交界处偏下剪开，浸泡于dispase，4℃过夜，将HF拔出后放入胰酶消化5-10分钟；经滤器筛后用预冷PBS洗涤ORSC悬浮液并以800×g离心5分钟，然后重悬于完全角质形成细胞培养基CKSFM中；将真皮部分由胶原酶37℃消化3-6小时，经滤器筛DPC由PBS洗涤并重悬于含有10％FBS的DMEM/F-12(1：1)中；将ORSC和DPC转移至25ml培养瓶中，并在37℃，5％CO₂的潮湿培养箱中培养。

3.如权利要求1所述的人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法，其特征在于，所述第二步的DPC-Exos的分离和鉴定具体包括：

当培养瓶中细胞长到70％-80％时，弃培养液用预冷PBS洗涤DPC两次，将培养基替换成不含外泌体的血清培养基，在37℃，5％CO₂下继续培养48小时。收集上清液以2000×g,4℃，离心30分钟，吸上清(留管底0.5-1cm液体)以10000×g离心30分钟，然后用0.22-μm过滤器过滤；收集到的液体上超离机，以100,000×g超离心2小时；将沉淀的外泌体重悬于15mLPBS中，以100000×g离心70分钟，弃上清，将沉淀(DPC-Exos)溶于100ulPBS中储存在-80℃直至使用；

通过qNano仪器上的TRPS确定DPC-Exo浓度和直径大小范围分布。通过透射电子显微镜观察外泌体形态；通过Western Blot检测细胞表面标志蛋白：CD9、CD63和TSG101。

4.如权利要求1所述的人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法，其特征在于，所述第三步的DPC-Exos经皮注射小鼠背部具体包括：

将雌性6-8周龄C57BL/6小鼠背部蜜蜡脱毛后随机分为：PBS对照组和DPC-Exos实验组；将100μl(1.0x10¹⁰/ml)DPC-Exos分别于休止期(脱毛后0天：p.d 0)和生长期VI期(p.d 12)经皮注射到C57BL/6小鼠的背部，对照组小鼠注射等体积PBS(100μl)；连续每日注射，在进入下一个HF生长周期阶段之前(分别在p.d 3和p.d 18)取材注射部位的皮肤毛囊组织样品。

5.如权利要求1所述的人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法，其特征在于，所述第四步的组织形态学和免疫组化分析具体包括：

将固定在4％多聚甲醛中的背部皮肤组织脱水包埋在石蜡中，切成5μm厚的切片，用苏木素和伊红染色，根据毛囊长度、毛球部直径、HF百分比和毛发周期评分以及皮肤厚度这四个参数评估HF生长及周期；每组至少分析50个HF；免疫组化染anti-β-catenin和anti-shh。

6.如权利要求1所述的人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法，其特征在于，所述第五步的细胞增殖试验具体包括：

将人ORSC以1.5×10⁴/ml的密度接种在96孔板中,用含有DPC-Exos的SFM处理24小时后，用MTS试剂盒(Promega，USA)对细胞增殖进行评估。

7.如权利要求1所述的人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法，其特征在于，所述第六步的通过流式周期试验对ORSC进行细胞周期分析具体包括：

将DPC-Exo处理24小时的ORSC和对照组ORSC消化，并用80％预冷乙醇固定ORSC单细胞悬浮液，并细胞周期试剂盒(Promega，USA)进行检测。

8.如权利要求1所述的人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法，其特征在于，所述第七步的通过划痕实验和Transwell实验对ORSC进行愈合和迁移能力检测具体包括：

ORSC在六孔板中长满后，用200μl枪头进行划痕，用PBS冲洗后，在SFM中加入DPC-Exos对细胞进行处理，分别在0,3,6,12,24,48h在显微镜下对划痕进行拍照，使用Image J Plus对划痕距离进行测量与分析；在24孔板进行Transwell实验，24孔板中加入500ulSFM(含或不含DPC-Exos)，Transwel小室上室中加入200ulORSC悬液，共培养24h后，进行结晶紫染色，在显微镜下计穿到下室的ORSC数并进行分析。

9.如权利要求1所述的人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法，其特征在于，所述第八步的RT-PCR检测毛囊生长关键信号分子β-catenin和Shh基因表达水平具体包括：

ORSC长至70％-80％密度，然后用DPC-Exos处理，用TRI-zol试剂提取对照组和实验组ORSCs的总RNA，使用逆转录试剂盒进行逆转录。用SYBRGreenIMas-terMix和以下上下游引物进行RT-PCR：

β-catenin，5'-CGGTCGGTTGATGAGACTACT-3'和5'-CAGGGCTCTGTCAAGATCACC-3'；Shh，5'-CTCGCTGCTG-GTATGCTCG-3'和5'-ATCGCTCGGAGTTTCTGGAGA-3'；和GAPDH，5'-TGAAG-GTCGGAGTCAACGG-3'和5'-TGGAAGATGGT-GATGGGAT-3'；PCR进行40个循环，并进行2^-ΔΔCt方法用于比较目的基因的相对mRNA表达水平与内参GAPDH的相对mRNA表达水平。

10.如权利要求1所述的人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法，其特征在于，所述第九步的Western Blot检测毛囊生长关键信号分子β-catenin和Shh蛋白表达水平具体包括：

ORSC长至70％-80％密度，然后用DPC-Exos处理，用细胞裂解液(RIPA)试剂提取对照组和实验组ORSCs的蛋白，经Western Blot对β-catenin和Shh的表达水平进行检测与分析；

所述Western Blot方法如下：用细胞裂解液提取细胞总蛋白，并在10％聚丙烯酰胺凝胶上通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离不同分子量的蛋白。将蛋白转移到PVDF膜上，在4℃下用以下一抗对膜进行过夜孵育：兔多克隆抗β-catenin和兔多克隆抗Shh；并以兔单克隆抗GAPDH抗体作为内参进行检测分析；

所述第十步的统计分析方法如下：

使用SPSS软件统计分析数据，使用t检验和单因素ANOVA比较结果；所有数据表示为平均值±标准差。