CN110885881A - 去神经支配海马外泌体研究海马神经再生微环境的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种去神经支配海马外泌体研究海马神经再生微环境的方法，包括如下步骤：(1)应用立体定位技术切割大鼠穹窿海马伞，阻断隔区胆碱能神经纤维向海马的投射，制备去神经支配海马模型；(12)选取与全转录组测序相一致的miRNA、circRNA、LncRNA或mRNA进一步实验；(13)通过体外细胞培养实验，证实所选miRNA、circRNA、LncRNA及mRNA对海马神经干细胞增殖和向神经元或胆碱能神经元分化的作用。本发明涉及中枢神经海马结构中的神经再生研究方法，精准地明确海马神经再生微环境中所含物质，为促进海马结构中神经干细胞更多地向神经元和胆碱能神经元分化，改善神经退行性疾病患者的认知功能奠定基础。

Description

去神经支配海马外泌体研究海马神经再生微环境的方法

技术领域

本发明属于神经生物技术领域，具体涉及一种去神经支配海马外泌体研究海马神经再生微环境的方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以认知功能进行性减退为特征的中枢神经系统退行性疾病。随着当今社会人口老龄化的日益严重，AD呈上升趋势，已严重影响人类健康和生活质量，给社会和患者家庭带来了沉重的负担。

中枢神经前脑内侧隔核胆碱能神经元发出的纤维，通过穹隆海马伞投射到海马，向海马结构输送神经递质乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)，从而保证动物正常的认知功能。一旦隔区胆碱能神经元及其投射通路出现病变，阻断了向海马的ACh输送，动物将会出现学习记忆等认知功能障碍。而此时海马微环境将会发生变化，变化的微环境将会激发海马结构中处于静止期的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖，继而向神经元或胆碱能神经元分化，产生神经递质ACh，以弥补海马结构中ACh的缺失。但这种神经干细胞向胆碱能神经元分化的数量极其有限，所分泌的ACh也是微不足道的，远远不能适应动物正常认知功能的需求。因此必须研究海马神经再生微环境，在阻断了隔区胆碱能神经向海马的投射后，海马结构中的成分发生了哪些变化？这些变化的成分中哪些对海马神经干细胞增殖是有利的？哪些对海马神经干细胞向胆碱能神经元分化是有利的？哪些又是不利的因素？从而积极地利用有利因素，促进更多的神经干细胞增殖和向神经元或胆碱能神经元分化，以产生更多的ACh，适应发挥正常认知功能的需要。

此前研究海马神经再生微环境，是通过立体定位技术，应用针刀切断隔区投射到海马结构的胆碱能神经纤维(穹隆海马伞)，造成海马失去胆碱能神经支配，再通过分离海马组织，制备成混悬液，将混悬液加入到细胞培养液中观察是否能促进神经干细胞的增殖或向神经元、胆碱能神经元分化。进一步通过非变性凝胶电泳的方法，检测差异表达的蛋白条带，将这些差异表达的条带切下来与神经干细胞共培养，观察其增殖或向神经元分化情况，如图1所示，其中，图1A所示为切割穹隆海马伞14天时的56kD差异蛋白条带；图1B所示为56kD蛋白条带诱导神经干细胞迁移示意图；图1C为切割组14天56kD蛋白条带诱导神经干细胞向MAP2阳性神经元分化示意图。但这些方法仅能初步证明海马失去胆碱能神经支配后内环境发生了变化，这些变化确能促进海马神经干细胞的增殖或向神经元分化。已初步证实了这些物质是一类低分子量的蛋白质或多肽，但不能说明是哪一种或哪几种确切的分子发挥了作用。

外泌体(exosomes)是由细胞通过胞吐方式主动分泌到细胞外、直径在30～150nm的微囊泡，是细胞向外释放生物分子并发挥功能的新途径。外泌体中可包含蛋白质、mRNA、miRNA、LncRNA和circRNA等。那么，在失神经支配的海马神经再生微环境中是否存在外泌体？如果存在，这些外泌体是否能被海马神经干细胞摄取？如果能，这些外泌体中的内含物是否能影响海马的神经再生—神经干细胞增殖或向神经元或胆碱能神经元分化？如果确实能影响海马神经再生，那么是外泌体中的那些物质或分子起了作用？为解决上述问题，需要提供一种去神经支配海马外泌体研究海马神经再生微环境的方法。

发明内容

本发明的目的是解决上述技术问题，提供一种去神经支配海马外泌体研究海马神经再生微环境的方法，精准地明确海马神经再生微环境中所含物质，为促进海马结构中神经干细胞更多地向神经元和胆碱能神经元分化，改善神经退行性疾病患者的认知功能奠定基础。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种去神经支配海马外泌体研究海马神经再生微环境的方法，包括如下步骤：

(1)应用立体定位技术切割大鼠穹窿海马伞，阻断隔区胆碱能神经纤维向海马的投射，制备去神经支配海马模型；

(2)切割手术后1周，麻醉动物，去除颅骨取脑，分离海马结构，将海马组织用0.125％胰酶在37℃下消化30min，消化后将海马组织置于冰上，加入无外泌体血清终止消化；

(3)将消化的组织在4℃下离心，上清液转移至新管，用220nm滤器将上清过滤至30kD超滤管中，4℃3000g离心30min；

(4)将离心后的上清液转移至1.5ml EP管中，4℃10000g离心1h，上清液转移至新的EP管中，加入1/2体积的Invitrogen外泌体提取试剂，充分震荡混匀，4℃过夜；

(5)将浓缩液4℃10000g离心1h，充分去除上清液，管底沉淀即外泌体，用50μl D-PBS重悬；

(6)透射电镜制样-磷钨酸重染，红外线烤灯下干燥10min；

(7)透射电子显微镜观察、摄片；

(8)Western blot验证：取外泌体悬液制备样品，电泳、转膜、封闭，加入一抗和二抗，最后显色用Chemidoc XPS System采集图像；

(9)外泌体样本进行全转录组测序，构建差异表达谱：收集外泌体样本，液氮速冻5min，进行外泌体全转录组测序，构建miRNA差异表达谱，进行数据预处理，得到表达上调的miRNA；

(10)进行初步信息学技术分析；

(11)初筛验证：提取外泌体，应用real-time PCR对选取的miRNA、circRNA、LncRNA及mRNA进行初步验证；

(12)选取与全转录组测序相一致的miRNA、circRNA、LncRNA或mRNA进一步实验；

(13)通过体外细胞培养实验，证实所选miRNA、circRNA、LncRNA及mRNA对海马神经干细胞增殖和向神经元或胆碱能神经元分化的作用。

其中，步骤(5)中提取的外泌体呈典型的“茶托样”双层膜结构，直径90～110nm。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

本发明涉及中枢神经海马结构中的神经再生研究方法，精准地明确海马神经再生微环境中所含物质，为促进海马结构中神经干细胞更多地向神经元和胆碱能神经元分化，改善神经退行性疾病患者的认知功能奠定基础。

附图说明

图1为本发明背景技术中非变性凝胶电泳差异蛋白条带及诱导神经干细胞向神经元的分化示意图；

图2为本发明中去神经支配海马中提取到的外泌体及其鉴定结果示意图；

图3为本发明中神经干细胞摄取外泌体后抑制神经干细胞增殖、促进其向神经元和胆碱能神经元分化的示意图；

图4为本发明的外泌体中miR-3559-3p、miR-6324抑制神经干细胞增殖、促进其向神经元分化的示意图；

图5为本发明的外泌体中miR-3559-3p、miR-6324过表达或抑制分别增加或减少分化中海马神经干细胞的神经元特异性标志物mRNA的表达示意图；

图6为本发明的外泌体中miR-3559-3p、miR-6324增加海马神经干细胞向MAP2阳性神经元分化的示意图；

图7为本发明的外泌体中circAcbd6抑制神经干细胞增殖的示意图；

图8为本发明的外泌体中circAcbd6增加神经干细胞向神经元分化的示意图；

图9为本发明的外泌体中circAcbd6增加神经干细胞向VAChT阳性的胆碱能神经元分化的示意图；

图10为本发明中切割穹窿海马伞海马组织外泌体miRNA的差异分析图；

图11为本发明中切割穹窿海马伞海马组织外泌体差异miRNAs的GO分析和Pathway分析图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

本发明提供了一种去神经支配海马外泌体研究海马神经再生微环境的方法，包括如下步骤：

(1)应用立体定位技术切割大鼠穹窿海马伞，阻断隔区胆碱能神经纤维向海马的投射，制备去神经支配海马模型；

(2)切割手术后1周，麻醉动物，去除颅骨取脑，分离海马结构，将海马组织用0.125％胰酶在37℃下消化30min，消化后将海马组织置于冰上，加入无外泌体血清终止消化；

(3)将消化的组织在4℃下离心，上清液转移至新管，用220nm滤器将上清过滤至30kD超滤管中，4℃3000g离心30min；

(4)将离心后的上清液转移至1.5ml EP管中，4℃10000g离心1h，上清液转移至新的EP管中加入1/2体积的Invitrogen外泌体提取试剂，充分震荡混匀，4℃过夜；

(5)将浓缩液4℃10000g离心1h，充分去除上清液，管底沉淀即外泌体，用50μl D-PBS重悬；

(6)透射电镜制样-磷钨酸重染，红外线烤灯下干燥10min；

(7)透射电子显微镜观察、摄片；

(8)Western blot验证：取外泌体悬液制备样品，电泳、转膜、封闭，加入一抗和二抗(指第一抗体和第二抗体，第一抗体根据所检测的物质而定，这里指的是抗CD9、抗CD43和抗Alix,第二抗体要根据第一抗体的种属而定，一般第一抗体如果是小鼠的，则用山羊抗小鼠二抗，如果第一抗体是兔的，则第二抗体就用山羊抗兔的二抗)，最后显色用ChemidocXPS System采集图像；

(9)外泌体样本进行全转录组测序，构建差异表达谱：收集外泌体样本，液氮速冻5min，送上海烈冰生物医药科技有限公司，进行外泌体全转录组测序，构建miRNA差异表达谱，由公司进行数据预处理，得到表达上调的miRNA。结果如图10所示，其中图10A为miRNA差异火山图，红点为上调基因，蓝点为下调基因；图10B为差异miRNA的层次聚类分析，红色代表基因上调，绿色代表基因下调。

(10)进行初步信息学技术分析

GO(Gene ontology)数据库从功能、参与的生物学过程及细胞定位对基因进行了标准化描述。通过GO富集分析，我们能够对差异基因所参与的生物学过程、信号转导途径和在细胞中的定位有一个基本了解。Pathway分析能够使我们对在实验因素刺激下发生明显变化的代谢途径和信号通路有初步的认识。我们通过GO和Pathway分析进一步了解了测序得到的差异miRNAs的生物学功能。GO分析结果表明，这些差异miRNAs主要集中在转录调节、磷酸化作用和神经系统发育等生物学进程(图11A)；Pathway分析可知这些miRNAs主要参与了胰岛素信号通路、Wnt信号通路、cGMP-PKG信号通路等(图11B)。其中，图11A为差异表达miRNAs GO分析图，这些差异miRNAs主要集中在转录调节、磷酸化作用和神经系统发育等生物学进程；图11B为差异表达miRNAs Pathway分析，可知这些miRNAs主要参与了胰岛素信号通路、Wnt信号通路、cGMP-PKG信号通路等。

RNA-seq结果显示，海马组织外泌体中有24个miRNAs的表达呈现明显差异，其中上调的miRNAs有9个，下调的miRNAs有15个，我们选择其中表达量上调且差异倍数>1.5且P<0.05的miRNAs构成差异表达谱(如下表所示)。

表miRNAs差异表达谱

(11)初筛验证：提取外泌体，应用real-time PCR对选取的miRNA、circRNA、LncRNA及mRNA进行初步验证；

(12)选取与全转录组测序相一致的miRNA、circRNA、LncRNA或mRNA进一步实验；

(13)通过体外细胞培养实验，证实所选miRNA、circRNA、LncRNA及mRNA对海马神经干细胞增殖和向神经元或胆碱能神经元分化的作用。

本发明取得了如下技术效果：

1、已成功地从去神经支配海马中提取到外泌体，外泌体呈典型的“茶托样”双层膜结构，直径100nm左右；纳米颗粒跟踪分析结果显示样品囊泡平均粒径105.3nm；粒径主峰在146.5nm附近，粒子分布系数0.08-0.7之间，说明体系分散度合适，检测结果置信度高，样品20-200nm范围内的粒径占80.5％。Western blot结果检测到外泌体特异性CD9、CD63和Alix条带，如图2所示，其中图2A所示为Western blot检测到外泌体特异性蛋白条带；图2B为外泌体电镜照片；图2C为外泌体样品粒径分布图；图2D为外泌体样品粒径柱状图。

2、用获取的外泌体与神经干细胞共培养，证实外泌体可被神经干细胞摄取，并能抑制神经干细胞增殖，促进其向神经元或胆碱能神经元分化，如图3所示，其中，图3A所示为用Dil标记的外泌体几乎百分百被神经干细胞摄取的示意图；图3B为外泌体促进神经干细胞向Tuj1阳性的神经元分化示意图；图3C为外泌体促进神经干细胞向VAChT阳性的胆碱能神经元分化示意图。

3、高通量RNA-seq检测，和对照组相比，去神经支配海马外泌体中内含物出现了以下变化：

3.1差异数达1.5倍以上的miRNA具有统计学意义，共有24个出现表达差异，其中上调的有9个，下调的有15个。聚类分析显示，每组miRNA的三个生物学数据有较好的聚集，功能分析(Go)和信号通路分析(Pathway)提示，这些差异miRNAs主要集中在转录调节、磷酸化作用和神经系统发育等生物学进程，主要参与了胰岛素信号通路、Wnt信号通路、cGMP-PKG信号通路等。

3.2在切割穹窿海马伞后的海马神经再生微环境中，有19个上调的circRNA呈显著性差异表达，长度大约为100-1100个核苷酸，没有差异显著性下调的circRNA。对与circRNAs有显著差异的宿主基因进行GO功能富集分析和KEGG途径富集分析。结果显示，在差异表达的circRNA中，海绵滋养细胞的分化、蛋白质的负调控、蛋白质的自身泛素化和突触小泡胞吐作用最丰富。通路分析表明，在这些基因中，胰岛素分泌、囊泡转运中的SNARE相互作用和基础转录因子最丰富。

3.3有统计学意义差异表达的lncRNA共有39个，其中上调的29个，下调的有10个。通过调控网络分析，受上调lncRNA直接调控的miRNA有21个。

3.4mRNA差异表达基因共770个，其中上调的有764个，下调的有6个。GO分析提示这些差异表达的基因主要富集于蛋白质转运、基因表达、细胞代谢和通过剪接体进行mRNA剪接等生物学过程。Pathway分析提示这些差异表达的基因主要富集于氧化磷酸化、剪接体、泛素介导的蛋白水解、非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)和柠檬酸盐(Citrate,TCA)循环等途径。

下面通过两个体外细胞培养实验进一步验证本发明的步骤(13)，具体实验如下：

实验一、外泌体中miR-3559-3p、miR-6324抑制海马神经干细胞增殖、促进其向神经元分化，具体步骤去下：

1-1、检测miR-3559-3p、miR-6324在切割穹窿海马伞后1、3、7、14d海马中的相对表达量

(1-1-1)切割大鼠穹窿海马伞

取成年SD大鼠15只，随机分为5组，每组3只。分别为正常对照组、切割后1d、3d、7d和14d组，切割实验组大鼠穹窿海马伞。

取230～260g SPF级健康成年雌性SD大鼠6只，随机分为正常对照组(Control)和实验组，每组3只。将实验组大鼠用腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent(0.2ml/100g体重)进行麻醉。动物麻醉后，将其固定于脑立体定位仪，用弯剪剪除颅顶毛备皮，依次用2％碘酊和75％酒精进行消毒。无菌条件下切开颅顶部皮肤，分离骨膜充分暴露前囟，记录前囟A(矢状轴)、L(冠状轴)和V(垂直轴)的坐标，参考Paxinos《大鼠脑立体定位图谱》确定双侧穹窿海马伞的切割范围。首先，在颅骨上确定左侧两点，即①A1＝A-1.4、L1＝L+1和②A2＝A-1.4、L2＝L+4，右侧两点，即③A3＝A-1.4、L3＝L-1和④A4＝A-1.4、L4＝L-4；然后，颅骨钻在每点位置各钻一个小孔，①、②和③、④两点间用刀片分别将颅骨划开一条骨缝，将针刀插入脑内，深度为V＝V+5.4，针刀来回切割3次后退出。待颅骨内无明显出血后用骨蜡封闭骨缝；最后，缝合皮肤，肌注青霉素，放回笼内饲养。

(1-1-2)海马组织外泌体提取

①将剪刀、镊子、玻璃皿等金属和玻璃器皿在180℃烘箱烘烤4h，塑料器皿在DEPC水中浸泡过夜，120℃高压蒸汽灭菌后备用；

②将正常对照组大鼠与切割后7d的大鼠模型麻醉、颅顶部皮肤消毒、去颅盖骨，无菌环境下剥去大脑皮质和胼胝体，分离出海马组织，用PBS洗涤后在盛有基础培养基的培养皿中，于冰上用眼科剪将组织剪成1mm³左右大小的组织块；

③脑组织块用0.125％的胰酶在37℃条件下消化30min。消化后立即将组织放回冰上，加入无外泌体血清终止消化；

④将组织在4℃下以300g离心5min(沉淀用作脑匀浆+胰酶对照)，将上清液转移至新管，用D-PBS稀释至30ml，在4℃下以3000g离心30min，用220nm滤器将上清过滤至30kD的超滤管中，4℃以下3000g离心30min；

⑤将含有细胞外囊泡的浓缩上清液移至1.5ml EP管中，4℃下10000g离心1h，得到的上清移至新管中，加入1/2体积的Invitrogen外泌体提取试剂，充分震荡混匀，4℃过夜；

⑥将浓缩液4℃下10000g离心1h，充分去除上清液，管底沉淀即外泌体，用50μl D-PBS重悬。

(1-1-3)miRNA实时定量PCR

1-1-3-1)外泌体中RNA提取

①取100μl外泌体悬液，加入500μl的Trizol后用移液器吹打均匀，将裂解后的匀浆转移至1.5ml EP管中，置于冰上；

②加入100μl氯仿，盖紧冠盖，充分震荡15sec，室温放置2～3min，4℃12000g离心15min；

③将上清转移至新的EP管中，加入250μl异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，4℃12000g离心10min；

④弃上清，加入1ml 75％乙醇，4℃7600g离心10min；

⑤弃上清，倒扣，晾干沉淀，室温放置5～10min，加入12μl RNase-freeddH₂O溶解沉淀，65℃水浴5～10min；

⑥RNA浓度测定：由NANODROP 2000软件分析，利用紫外微量分光光度计在260nm和280nm测定的吸光度来确定样品的浓度和纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀应在1.8～2.1之间。

1-1-3-2)miRNA RT反应

①取PCR管置于冰上，加入下列反应物：

RNA Template 1μg

Bulge-LoopTM miRNA RT Primer(5μM) 1μl

5×Reverse Transcription Buffer 2μl

RTase Mix 2μl

RTase-free H2O 至10μl；

②轻轻混匀，短暂离心；

③ABI 9700型PCR仪上42℃保温60min使逆转录反应完全后，70℃10min终止反应；

④将EP管插入冰中，1：2稀释分装，-20℃备用。

miRNA和U6引物由广州锐博生物科技股份有限公司合成(根据合同协议，引物序列公司保留密，未提供给我实验室)。

1-1-3-3)miRNA qPCR反应

取等量的cDNA模板置于管中，加入扩增引物，总体积20μl，于PCR仪中进行反应。用2^-△CT相对定量法分析数据，标准化的内参使用U6，每组3个复孔，方法如下：

①取出200μl EP管，依次加入：

RT Product 2μl

Bulge-LoopTM miRNA Foward Primer(5μM) 0.8μl

Bulge-LoopTM Reverse Primer(5μM) 0.8μl

2×SYBR Green Mix 10μl

ddH2O 6μl

ROX 0.4μl；

②将混合物轻轻混匀后，稍加离心；

③应用Corrbett RG 6000 PCR仪进行扩增，每组3个样品，程序如下：

95℃ 10min(预变性)

95℃ 2sec，60℃20sec，70℃10sec(扩增反应循环40次)

72℃ 10min(溶解曲线分析)；

④仪器自动读取CT值后采用2^-△CT法对得到的结果进行处理，数据用GraphPadPrism 5.0软件进行统计学分析。

1-2、检测miR-3559-3p、miR-6324组织特异性

(1-2-1)相关组织Total RNA的提取

①将研磨器、剪刀、镊子、玻璃皿等金属和玻璃器皿在180℃烘烤4h，塑料制品在DEPC水中浸泡过夜，再高压灭菌；

②将成年大鼠麻醉、消毒、去颅盖骨，无菌条件下仔细分离端脑、小脑、脑干、海马、心肌、肝脏、胰腺和肺组织，用PBS清洗后放置于RNase Free的研磨器中，加入1ml提前预冷的Trizol，置于冰上充分研磨；

③将悬液加入1.5ml EP管中，用于提取RNA。

(1-2-2)miRNA实时定量PCR方法同步骤(1-1-3-3)。

1-3、培养海马神经干细胞

(1-3-1)原代培养

①无菌条件下，孕17d SD大鼠腹腔注射Chlorpent复合麻醉剂1ml；

②动物麻醉后，酒精棉球消毒腹部，暴露腹腔，敷料镊(无钩)和组织剪(直头)取出含胚胎的子宫，放置于含75％酒精的培养皿中；

③用弯镊将子宫移至DMEM/F12培养液中，用两把弯镊取出胚胎至另一含DMEM/F12的10cm培养皿中，于冰板上，在新的含DMEM/F12的10cm培养皿里用两把显微镊将胚大鼠全脑取出；

④在冰板上分离海马原基，注意尽量除去脑膜、血管等其他组织结构；

⑤用1ml移液枪将海马组织转移至含1ml DMEM/F12的15ml离心管中，轻轻吹打数下，1200rpm离心3min；

⑥弃上清，加入DMED/F12+1％PS，轻轻吹打数下，1200rpm离心3min；

⑦重复步骤(6)2次；

⑧弃上清，加入神经干细胞培养液，轻轻吹打数下，过40μm细胞过滤器至50ml离心管；

⑨充分混匀后，取10μl细胞悬液，再取10μl台盼蓝染液，充分混合后，用计数板计数，按3～5×10⁶个/T25培养瓶种植细胞；5～6d后形成神经球，进行传代。

(1-3-2)神经干细胞传代

①培养瓶中的细胞悬液转移至50ml离心管中，1000rpm离心3min；

②弃上清，加入2～3ml DMEM/F12+1％PS，轻轻吹打数下，1200rpm离心3min；

③弃上清，加入2ml 0.25％的胰蛋白酶，轻轻吹打，37℃培养箱静置2～5min；

④加入2倍体积含10％FBS的基础培养液，吹打数下，形成细胞悬液，1200rpm离心3min；

⑤弃上清，加入DMED/F12+1％PS，轻轻吹打数下，1200rpm离心3min；

⑥重复步骤步骤⑤两次；

⑦弃上清，加新鲜NSC培养液重悬细胞，P0:P1以2：3的比例传代种植于T25培养瓶中，放置培养箱中培养，5～6d后铺板。

1-4、海马神经干细胞鉴定

(1-4-1)细胞种板

①将培养瓶中的P1代神经球悬液转移至50ml离心管中，1000rpm离心3min；

②弃上清，加入2～3ml DMEM/F12+1％PS，轻轻吹打数下，1200rpm离心3min；

③弃上清，加入2ml 0.25％的胰蛋白酶，轻轻吹打，37℃培养箱静置2～5min；

④加入2倍体积含10％FBS的基础培养液，吹打数下，形成细胞悬液，1200rpm离心3min；

⑤弃上清，加入DMED/F12+1％PS，轻轻吹打数下，1200rpm离心3min；

⑥重复步骤(5)2次；

⑦弃上清，分别加入NSC培养液和分化液2ml重悬细胞，轻轻吹打数下，过40μm细胞过滤器至50ml离心管；

⑧充分混匀后，取10μl细胞悬液，再取10μl台盼蓝染液，充分混合后，用计数板计数，按1×10⁵个/孔的密度接种于置有细胞爬片的24孔培养板中，按5×10⁵个/孔的密度接种于6孔培养板中用于RNA和蛋白的提取。

(1-4-2)细胞免疫荧光检测

①出细胞爬片，用D-PBS洗3遍，每次5min，放置于摇床上缓慢摇动；

②固定：加入4％多聚甲醛，固定15～30min，0.1％BSA-PBS洗涤3遍，每次5min，置于摇床上缓慢摇动；

③破膜封闭：加入破膜封闭液，室温放置2h，置于摇床上缓慢摇动；

④一抗孵育：加入一抗覆盖细胞表面，4℃过夜，0.1％BSA-PBS洗涤3遍，每次5min，置于摇床上缓慢摇动；

⑤二抗孵育：加入二抗覆盖细胞表面，室温避光孵育2h，0.1％BSA-PBS洗涤3遍，每次5min，置于摇床上缓慢摇动；

⑥核染：按1：1000工作体积配置好DAPI，覆盖细胞表面，室温避光孵育10min，0.1％BSA-PBS洗涤3遍，每次5min置于摇床上缓慢摇动；

⑦封片：在载玻片上滴加封片液，将细胞爬片倒扣于载玻片上；

⑧镜检：ZEISS Axio Scope A1显微镜观察细胞并摄片，应用Photoshop处理软件处理图像。

⑨计数：每个小圆片取5个视野计数阳性细胞个数和总细胞个数，计算阳性细胞百分比，求百分比平均值。

1-5、检测mimics和inhibitros转染、过表达和抑制效率

(1-5-1)海马神经干细胞培养同步骤(1-3)。

(1-5-2)细胞铺板

①将培养瓶中的P1代细胞悬液转移至50ml离心管中，1200rpm离心3min；

②弃上清，加入2～3ml DMEM/F12+1％PS，轻轻吹打数下，1200rpm离心3min；

③弃上清，加入2ml 0.25％的胰蛋白酶，轻轻吹打，37℃培养箱静置2～5min；

④加入2倍体积含10％FBS的基础培养液，吹打数下，形成细胞悬液，1200rpm离心3min；

⑤弃上清，加入DMED/F12+1％PS，轻轻吹打数下，1200rpm离心3min；

⑥重复步骤步骤⑤2次；

⑦弃上清，分别加入分化液2ml重悬细胞，轻轻吹打数下，过40μm细胞过滤器至50ml离心管；

⑧充分混匀后，取10μl细胞悬液，再取10μl台盼蓝染液，充分混合后，用计数板计数，按1×10⁵个/孔的密度接种于置有细胞爬片的24孔培养板中，按5×10⁵个/孔的密度接种于6孔培养板中用于RNA和蛋白的提取。

(1-5-3)神经干细胞转染

1-5-3-1)分别接种1×10⁵和5×10⁵细胞至含分化液24孔板和6孔板中，当细胞密度达到60～70％进行转染；

1-5-3-2)过夜后更换培养液，24孔板加入400μl分化液，6孔板加入1.7ml分化液，置于37℃CO₂培养箱中；

1-5-3-3)对于每个转染样品，按以下步骤准备：

①稀释LipofectamineTM3000 Reagent：24孔板用25μl Opti-MEM稀释0.75μlLipofectamineTM3000 Reagent，6孔板125μl Opti-MEM稀释3.75μlLipofectamineTM3000Reagent轻轻混匀，室温孵育5min，短暂离心；

②稀释mimic和inhibitor：24孔板用25μl Opti-MEM将miR-3559-3p、miR-6324mimic和inhibitor稀释成10、20、50、100nmol/L四个浓度，6孔板125μl Opti-MEM将miR-3559-3p、miR-6324mimic和inhibitor稀释成10、20、50、100nmol/L四个浓度，轻轻混匀，室温孵育5min，短暂离心；

③混合液制备：将miR-3559-3p、miR-6324mimic和inhibitor稀释液缓慢加入LipofectamineTM3000 Reagent稀释液中，轻轻混匀，室温孵育15min，短暂离心；

1-5-3-4)将制备的混合液悬滴于24孔板和6孔板中，置于37℃CO₂培养箱中孵育。

(1-5-4)miRNA实时定量PCR方法同1中步骤(1-1-3-3)。

1-6、miR-3559-3p、miR-6324mimics或inhibitors转染后神经元特异性分子的表达

(1)海马神经干细胞培养方法同步骤(1-3)。

(2)细胞铺板方法同步骤(1-5-2)。

(3)神经干细胞转染方法同步骤(1-5-3)。

(4)mRNA实时定量PCR检测。

(1-6-1)RNA提取

①将6孔板中培养基吸出，用DPBS清洗2次，加入500μl的Trizol后用移液器吹打均匀，将裂解后的匀浆转移至1.5ml EP管中，置于冰上；

②加入100μl氯仿，充分震荡15sec，室温放置2～3min，4℃12000g离心15min；

③将上清转移至新的EP管中，加入250μlTrizol异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，4℃12000g离心10min；

④去上清，加入1ml 75％乙醇，4℃7500g离心5min；

⑤去上清，倒扣，晾干沉淀，室温放置5～10min，加入12μl RNase-freeddH₂O溶解沉淀，65℃水浴5～10min；

⑥RNA浓度

由NANODROP 2000软件分析，利用紫外微量分光光度计在260nm和280nm测定的吸光度来确定样品的浓度和纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀应在1.8～2.1之间。

(1-6-2)cDNA第一链的合成

①取PCR管置于冰上，加入下列反应物：

总RNA 3μg

Oligo dT18(0.5μg/μL) 1μl

Water，Nuclease-free 加至12μl；

②轻轻混匀，离心3～5sec；

③置于PTC-100PCR仪中，65℃加热5min，立即将EP管移至冰盒中；

④每管加入

RT(200U/μL)

⑤轻轻混匀，短暂离心；

⑥ABI 9700型PCR仪上42℃保温60min使逆转录反应完全后，72℃5min终止反应；将EP管插入冰中，1:10稀释分装，-20℃备用。

(1-6-3)引物设计

mRNA和GAPDH引物由生工生物股份有限公司合成。引物序列如下：

(1-6-4)Real-time PCR扩增

取等量的cDNA模板置于管中，加入扩增引物，总体积25μl，于PCR仪中进行反应。用2^-△CT相对定量法分析数据，标准化的内参使用GAPDH，每组3个复孔，方法如下：

①取出200μl EP管，依次加入：

②将混合物轻轻混匀后，稍加离心；

③应用Corrbett RG 6000PCR仪进行扩增，每组3个样品，程序如下：

95℃ 10min(预变性)

95℃ 30sec，60℃30sec，72℃40sec(扩增反应循环40次)

72℃ 10min(溶解曲线分析)

④仪器自动读取CT值后采用2^-△CT法对得到的结果进行处理，数据用GraphPadPrism 5.0软件进行统计学分析。

1-7、检测神经干细胞增殖

(1-7-1)细胞铺板

①培养瓶中的P1代细胞悬液转移至50ml离心管中，1200rpm离心3min；

②弃上清，加入2～3ml DMEM/F12+1％PS，轻轻吹打数下，1200rpm离心3min；

③弃上清，加入2ml 0.25％的胰蛋白酶，轻轻吹打，37℃培养箱静置2～5min；加入2倍体积含10％FBS的基础培养液，吹打数下，形成细胞悬液，1200rpm离心3min；

④弃上清，加入DMED/F12+1％PS，轻轻吹打数下，1200rpm离心3min；

⑤重复步骤步骤④两次；

⑥弃上清，分别加入NSC培养液2ml重悬细胞，轻轻吹打数下，过40μm细胞过滤器至50ml离心管；

⑦充分混匀后，取10μl细胞悬液，再取10μl台盼蓝染液，充分混合后，用计数板计数，按1×10⁵个/孔的密度接种于置有细胞爬片的24孔培养板中，置于37℃温箱过夜。

⑧弃去原培养液，分别加入NSC培养液和含1mmol/L VPA的NSC培养液，置于37℃温箱培养24h，用于检测细胞增殖情况。

(1-7-2)神经干细胞增殖实验

①EdU增殖实验

a)用细胞培养基按1:1000的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μmol/L EdU培养基；

b)每孔加入200μl 50μmol/L EdU培养孵育2h后，弃培养基；PBS清洗细胞2～3次，每次5min；

c)每管加入500μl 4％多聚甲醛，室温孵育30min，弃固定液；

d)PBS清洗细胞2～3次，每次5min，置于摇床上缓慢摇动；

e)每管加入200μl渗透液(含0.5％TritonX-100的PBS)，脱色摇床孵育10min，PBS清洗1次，每次5min；

f)每孔加入

染色反应液，避光、室温摇床孵育30min后，离心弃染色液；

g)每孔加入500μl甲醇清洗1～2次，每次5min，PBS清洗细胞1次，每次5min；

h)取200μl 1×Hoechst 33342反应液，避光室温条件下孵育10min后，离心弃染色反应液；

i)PBS清洗3遍，在载玻片上滴加封片液，将细胞爬片倒扣于载玻片上；

j)EISS Axio Scope A1荧光显微镜观察细胞并摄片，应用Photoshop处理软件处理图像。

②细胞免疫荧光检测一抗用兔抗Ki67多克隆抗体，二抗用Alexa Fluor568标记的羊抗兔IgG方法同步骤(1-4-2)。

1-8、神经干细胞分化检测

(1-8-1)细胞铺板方法同步骤(1-5-2)；

(1-8-2)细胞免疫荧光检测一抗用鼠抗MAP-2单克隆抗体，二抗用AlexaFluor 568标记的羊抗鼠IgG方法同步骤(1-4-2)。

(1-8-3)Western blot

1-8-3-1)样品制备

①在外泌体悬液中加入25％的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液；

②充分混匀后，水浴100℃加热5min备用；

1-8-3-2)电泳

①制胶

a)上层胶灌入玻璃板夹层中，直至侧面绿色夹板的上边缘；

b)迅速轻柔地在胶上加一层异丙醇；

c)静置约1h，异丙醇和分离胶之间出现明显的折射线，说明下层胶已凝固；

d)倒去异丙醇并用吸水纸将残余的的异丙醇吸干；

e)配制上层浓缩胶，将下层胶以上的剩余空间灌满；

f)把干净的梳齿轻轻插入浓缩胶中。室温约1h后，浓缩胶凝固。

②将胶板放入电泳槽中，每孔加入20μl蛋白样品；

③调节电压，上层浓缩胶电压100V，待marker跑到上下胶分界处，将电压调为150V，继续电泳，待marker刚好跑至胶底部时终止电泳。

1-8-3-3)转膜

①配置转膜缓冲液；

②将剪至合适尺寸的PVDF置于无水乙醇中激活数秒；

③电泳结束后取出胶板，双蒸水冲洗干净，撬开两层玻璃板。去除上层浓缩胶，留取下层分离胶；

④取干净的搪瓷盘，加入转膜液没过PVDF膜、滤纸和分离胶。转膜仪从下至上依次垫：滤纸、PVDF膜、分离胶、滤纸，最后扣上转膜仪的盖子。每放置一层要用玻璃棒轻轻滚动，去除气泡；

⑤调节恒压25V，恒流2.5mA，7min。

1-8-3-4)封闭

①转膜结束后，将PVDF膜置于TBST洗液中于摇床上摇洗3次，每次5min；

②加入5％脱脂奶粉，轻摇封闭2h。

1-8-3-5)一抗孵育

①取出PVDF膜，置于TBST溶液中摇洗3次，每次5min；

②用5％脱脂奶粉封闭液配置一抗，加在膜上，4℃过夜。

1-8-3-6)二抗孵育

①膜取出，适量TBST摇洗3次，每次5min；

②用5％脱脂奶粉封闭液配置二抗，加在膜上，室温孵育2h。

1-8-3-7)显色

①等体积混合ECL试剂盒中的A液和B液，轻微振荡混匀；

②在PVDF膜上滴上显影剂，应用Chemidoc XPS System采集图像。

1-8-3-8)条带分析

应用Quantity One软件作光密度分析，结果用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析，观察各组蛋白表达情况。

1-9、统计学分析

数据以平均值±标准差

表示，用软件GraphPad Prism 5.0对数据进行分析，运用Student's t检验对两组之间数据进行比较，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。

实验结果表明：

1.1、miR-3559-3p和miR-6324的mimics和inhibitors分别减少和增加培养神经干细胞中的EdU和Ki67阳性细胞的数量，结果如图4所示，其中，图4A、图4B、图4E、图4F显示:miR-3559-3p、miR-6324mimics减少EdU和Ki67阳性细胞数量；图4C、图4D、图4G、图4H显示:miR-3559-3p、miR-6324inhibitors增加EdU和Ki67阳性细胞数量。

1.2、miR-3559-3p和miR-6324的mimics和inhibitors分别增加和减少神经元特异性标志物MAP2、Synt、Neurod1和Stmn2 mRNA的表达，结果如图5所示，其中，图5A、图5B显示:过表达miR-3559-3p、miR-6324；图5C、图5D显示:抑制miR-3559-3p、miR-6324表达。

1.3、miR-3559-3p和miR-6324的mimics和inhibitors分别增加和减少海马神经干细胞向MAP2阳性神经元分化的比例及神经元标记物MAP2蛋白的表达，结果如图6所示，其中，图6A～图6D显示:miR-3559-3p、miR-6324过表达增加神经干细胞向MAP2阳性神经元的分化；图6E～图6H显示:抑制miR-3559-3p、miR-6324表达减少神经干细胞向MAP2阳性神经元分化。

实验二、外泌体中circAcbd6抑制海马神经干细胞增殖，促进其向胆碱能神经元分化，具体步骤如下：

2-1、海马神经干细胞培养

(2-1-1)、无菌条件下，Chlorpent复合麻醉剂1ml注射于孕鼠腹腔中，取孕15天SD大鼠胚胎；

(2-1-2)、动物麻醉后，酒精棉球消毒腹部，暴露腹腔，敷料镊(无钩)和组织剪(直头)取出含胚胎的子宫，放置于含75％酒精的培养皿中；

(2-1-3)、用弯镊将子宫移至含DMEM/F12中，用两把弯镊取出胚胎至另一含DMEM/F12的10cm培养皿中，于冰板上，在新的含DMEM/F12的10cm培养皿里用两把显微镊将胚大鼠全脑取出；

(2-1-4)、在冰板上分离海马原基，注意尽量除去脑膜等其他组织结构；

(2-1-5)、用1ml移液枪将海马组织转移至含1ml DMEM/F12的15ml离心管中，轻轻吹打数下，1200rpm离心3min；

(2-1-6)、弃上清，加入DMEM/F12+1％PS，轻轻吹打数下，1200rpm离心3min；

(2-1-7)、重复步骤(2-1-6)两遍；

(2-1-8)、弃上清，加入神经干细胞培养液，轻轻吹打数下，过40μm细胞过滤器至50ml离心管；

(2-1-9)、充分混匀后，取10μl细胞悬液，再取10μl台盼蓝染液，充分混合后，用计数板计数，按3～5×10⁶个/T25培养瓶种植细胞；5～6天后形成神经球，进行传代。

2-2、神经干细胞慢病毒感染

(2-2-1)由Genechem Company(中国上海)构建的慢病毒，包括circAcbd6过表达慢病毒(缩写为LV-circAcbd6)以及相应的阴性对照慢病毒(LV-NC)；

(2-2-2)分别接种1×10⁵和5×10⁵细胞至24孔板和6孔板中，当细胞密度达到50～80％进行感染；

(2-2-3)过夜后更换培养液，设置不同MOI，MOI＝5、10、20，每个梯度设两个复孔，置于37℃CO₂培养箱中；

(2-2-4)12h后更换新鲜培养液；

(2-2-5)72h后，倒置显微镜下观察荧光，计算感染效率，确定最佳MOI值为10。

2-3、实时定量PCR检测

(2-3-1)RNA抽提

①向外泌体中加入500μl的Trizol后用移液器吹打均匀，置于冰上；

②加入100μl氯仿，充分震荡15sec，室温放置2～3min，4℃12000g离心15min；

③将上清转移至新的EP管中，加入250μl异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，4℃12000g离心10min；

④去上清，加入1ml 75％乙醇，4℃7500g离心5min；

⑤去上清，倒扣，晾干沉淀，室温放置5～10min，加入12μl RNase-freeddH₂O溶解沉淀，65℃水浴5～10min；

⑥RNA浓度测定

由NANODROP 2000软件分析，利用260nm和280nm测定的吸光度来确定样品的浓度和纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀应在1.9～2.1之间。

(2-3-2)cDNA第一链的合成

①基因组DNA去除，在RNase-free的离心管中配制如下混合液：

总RNA 1pg-1μg

4×gDNA wiper Mix 4μl

RNase free ddH₂O 加至16μl；

②轻轻混匀，离心3～5sec；

③置于PTC-100PCR仪中，42℃加热2min，立即将EP管移至冰盒中；

④配制逆转录反应体系

第1步的反应液 16μl

5×qRT SuperMix II 4μl；

⑤轻轻混匀，短暂离心；

⑥ABI 9700型PCR仪上50℃保温15min使逆转录反应完全后，85℃2min终止反应；

⑦将EP管插入冰中，-20℃备用。

引物由广东锐博生物工程有限公司合成。

(2-3-3)实时定量PCR扩增

取等量的cDNA模板置于管中，加入扩增引物，总体积20μl，于PCR仪中进行反应。用2^-△CT相对定量法分析数据，标准化的内参使用GAPDH，每组两个复孔，方法如下：

①取出200μl EP管，依次加入：

②将混合物轻轻混匀后，稍加离心；

③应用Corrbett RG 6000 PCR仪进行扩增，每组三个样品，程序如下：

④仪器自动读取CT值后采用2^-△CT法对得到的结果进行处理，数据用GraphPadPrism 5.0软件进行统计学分析。

2-4、细胞免疫荧光检测

(2-4-1)取出细胞爬片，用D-PBS洗3遍，每次5min，放置于摇床上缓慢摇动；

(2-4-2)固定：加入4％多聚甲醛，固定15～30min，0.1％BSA-PBS洗涤3遍，每次5min，置于摇床上缓慢摇动；

(2-4-3)破膜封闭：加入破膜封闭液，室温放置2h，置于摇床上缓慢摇动；

(2-4-4)一抗孵育：加入一抗覆盖细胞表面，4℃过夜，0.1％BSA-PBS洗涤3遍，每次5min，置于摇床上缓慢摇动；

(2-4-5)二抗孵育：加入二抗覆盖细胞表面，室温避光孵育2h，0.1％BSA-PBS洗涤3遍，每次5min，置于摇床上缓慢摇动；

(2-4-6)核染：按1：1000工作体积配置好Hoechst，覆盖细胞表面，室温避光孵育10min，0.1％BSA-PBS洗涤3遍，每次5min置于摇床上缓慢摇动；

(2-4-7)封片：在载玻片上滴加封片液，将细胞爬片倒扣于载玻片上；

(2-4-8)镜检：ZEISS Axio Scope A1显微镜观察细胞并摄片，应用Photoshop处理软件处理图像。

2-5、EdU细胞增殖流式检测

(2-5-1)用细胞培养基按1:1000的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μmol/LEdU培养基；

(2-5-2)每孔加入200μl 50μmol/L EdU培养孵育2h后，弃培养基；

(2-5-3)用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，轻轻吹打，37℃培养箱静置1～4min；

(2-5-4)加入2倍体积含10％FBS的基础培养液，吹打数下，形成细胞悬液，1200rpm离心3min；

(2-5-5)每管加入500μl 4％多聚甲醛，室温孵育30min，1200rpm离心3min，弃固定液；

(2-5-6)PBS清洗细胞2～3次，1200rpm离心3min，弃上清；

(2-5-7)每管加入200μl渗透液(含0.5％TritonX-100的PBS)，脱色摇床孵育10min，1200rpm离心3min，弃上清，PBS清洗1次；

(2-5-8)每孔加入

染色反应液，避光、室温摇床孵育10min后，1200rpm离心3min，弃染色液；

(2-5-9)重复步骤(2-3-5-7)；

(2-5-10)流式细胞仪样本准备：500μl PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测并分析数据。

2-6、细胞流式检测细胞周期

(2-6-1)弃培养基，用D-PBS洗2遍，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，轻轻吹打，37℃培养箱静置1～4min；

(2-6-2)加入2倍体积含10％FBS的基础培养液，吹打数下，形成细胞悬液，1200rpm离心3min；

(2-6-3)D-PBS清洗细胞2～3次，1200rpm离心3min，弃上清；

(2-6-4)每管加入1ml预冷的D-PBS，吹打数下，形成细胞悬液；

(2-6-5)每管滴加3ml预冷的无水乙醇，固定24h；

(2-6-6)重复步骤(2-6-3)；

(2-6-7)每管加入1ml细胞周期测试试剂，吹打数下，形成细胞悬液，室温避光孵育30min，上流式细胞仪检测并分析数据。

2-7、Western Blot

(2-7-1)样品制备

①每孔加入100μl的蛋白裂解液；反复吹打数次；

②高速离心：12000g 4℃离心30min，取上清；

③各样品取5μl，进行浓度测定。

(2-7-2)电泳

①制胶

a)下层胶灌入玻璃板夹层中，直至侧面绿色夹板的上边缘；

b)迅速轻柔的在胶上加一层ddH₂O；

c)约1h后，水和胶之间出现一条明显的折射线，说明胶已凝固；

d)倒去上层水并用吸水纸将水吸干；

e)配制浓缩胶，将玻璃板夹层中的剩余空间灌满；

f)把干净的梳齿轻轻插入浓缩胶中。室温约1h后，浓缩胶凝固。

②将胶板放入电泳槽中(小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，则电泳槽另一面需要垫一块塑料板，有字的一面向外)；

③调节电压，积层胶电压80V，待marker跑到上下胶分界处，将电压调为120V，继续电泳，待marker刚好跑出胶时终止电泳。

(2-7-3)转膜

①配置转膜缓冲液；

②裁剪合适大小的PVDF膜，乙醇中激活数分钟；

③电泳结束后取出胶板，纯净水冲洗干净，撬开两层玻璃板。去除上层浓缩胶，留取下层分离胶；

④取干净的搪瓷盘，加入转膜液没过PVDF膜、滤纸和分离胶。转膜仪从下至上依次垫：滤纸、PVDF膜、分离胶、滤纸，最后扣上转膜仪的盖子。注意：每放置一层要用玻璃棒轻轻滚动，去除气泡；

⑤调节恒压25V，恒流2.5mA，7min。

(2-7-4)封闭

①转膜结束后，取出PVDF膜，置于TBST溶液中摇洗3次，每次5min；

②加入5％脱脂牛奶，轻摇封闭2h。

(2-7-5)一抗孵育

①取出PVDF膜，置于TBST溶液中摇洗3次，每次5min；

②用5％脱脂牛奶封闭液配置一抗，加在膜上，4℃过夜。

(2-7-6)二抗孵育

①膜取出，适量TBST摇洗3次，每次5min；

②用5％脱脂牛奶封闭液配置二抗，加在膜上，室温孵育2h。

(2-7-7)显色

①将ECL试剂盒A液和B液等比例混合，轻微振荡、混匀；

②在PVDF膜上滴上显影剂，应用Chemidoc XPS System采集图像。

2-8、统计学分析

数据以平均值±标准差

表示，用软件GraphPad Prism 5.0对数据进行分析，运用Student's t检验对两组之间数据进行比较，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。

实验结果表明：

2.1circAcbd6慢病毒转染海马神经干细胞后可以抑制细胞的增殖指标PCNA、CDK2和CyclinD1的表达，免疫荧光和流式细胞检测均减少Ki67阳性细胞的比例，结果如图7所示。流式细胞技术进一步证明，circAcbd6可以显著减少S期神经干细胞的数量，增加G2期细胞的比例。

2.2circAcbd6可以增加神经元标记物Neurod1和MAP2的表达，而减少星形胶质细胞标志物GDAP的表达，Western blot检测显示，circAcbd6过表达可以显著增加胆碱能神经元标志物ChAT的表达量。

2.3免疫荧光结果显示，过表达circAcbd6可以促进海马神经干细胞向神经元分化(结果如图8所示)，增加ChAT阳性胆碱能神经元的比例(结果如图9所示)。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种去神经支配海马外泌体研究海马神经再生微环境的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)应用立体定位技术切割大鼠穹窿海马伞，阻断隔区胆碱能神经纤维向海马的投射，制备去神经支配海马模型；

(2)切割手术后1周，麻醉动物，去除颅骨取脑，分离海马结构，将海马组织用0.125％胰酶在37℃下消化30min，消化后将海马组织置于冰上，加入无外泌体血清终止消化；

(3)将消化的组织在4℃下离心，上清液转移至新管，用220nm滤器将上清过滤至30kD超滤管中，4℃3000g离心30min；

(4)将离心后的上清液转移至1.5ml EP管中，4℃10000g离心1h，上清液转移至新的EP管中，加入1/2体积的Invitrogen外泌体提取试剂，充分震荡混匀，4℃过夜；

(5)将浓缩液4℃10000g离心1h，充分去除上清液，管底沉淀即外泌体，用50μl D-PBS重悬；

(6)透射电镜制样-磷钨酸重染，红外线烤灯下干燥10min；

(7)透射电子显微镜观察、摄片；

(8)Western blot验证：取外泌体悬液制备样品，电泳、转膜、封闭，加入一抗和二抗，最后显色用Chemidoc XPS System采集图像；

(9)外泌体样本进行全转录组测序，构建差异表达谱：收集外泌体样本，液氮速冻5min，进行外泌体全转录组测序，构建miRNA差异表达谱，进行数据预处理，得到表达上调的miRNA；

(10)进行初步信息学技术分析；

(11)初筛验证：提取外泌体，应用real-time PCR对选取的miRNA、circRNA、LncRNA及mRNA进行初步验证；

(12)选取与全转录组测序相一致的miRNA、circRNA、LncRNA或mRNA进一步实验；

(13)通过体外细胞培养实验，证实所选miRNA、circRNA、LncRNA及mRNA对海马神经干细胞增殖和向神经元或胆碱能神经元分化的作用。

2.根据权利要求1所述的去神经支配海马外泌体研究海马神经再生微环境的方法，其特征在于，步骤(5)中提取的外泌体呈典型的“茶托样”双层膜结构，直径90～110nm。

Images