CN112920988A - 一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法 - Google Patents

一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及外泌体提取领域，更具体地说，它涉及一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法，通过先对毛乳头细胞进行培养和初步分离后，通过PEG修饰壳聚糖偶联其中的外泌体，再通过蛋白酶对大分子蛋白进行消化，离心分离后再通过酶解法降解壳聚糖，最终得到外泌体。上述方案可以有效提高制备分离得到的外泌体的产量和纯度。

Description

一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法
技术领域
本申请涉及外泌体提取领域，更具体地说，它涉及一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法。
背景技术
毛乳头细胞是一类位于毛囊底部的细胞，在毛囊的形成和毛发生长方面发挥核心作用。通过毛乳头细胞提取得到的毛乳头细胞外泌体是一类30～150nm的细胞外囊泡，富含mRNA、微小RNA和蛋白质，头皮注射具有促进头发再生以及生长的功能，可在基因和蛋白质水平调节毛囊的生发功能，几乎不会引起同种异体排斥现象，因此被认为是毛发移植和干细胞疗法的最佳替代方法。
差速离心法也称超速离心法，是一种用于从细胞中分离外泌体的重要方法，也是目前最常用的方法之一。其原理在于通过不同的离心速率，对细胞培养后的上清液进行逐步分离，通过不同的离心速率分离其中的不同成分，进而得到外泌体。
在采用差速离心法的过程中，体系中部分较大分子的蛋白容易混杂于外泌体中，难以通过差速离心法进行分离，进而影响了制得的外泌体的纯度。且在上述过程中，分离过程外泌体较难从体系中离心出来，产量有待提升。
发明内容
为了提高外泌体分离后的纯度，减少分离过程的损失，本申请提供一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法。
本申请提供的一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法采用如下的技术方案：
一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法，具体包括如下步骤：
S1、采用悬浮培养的方式对毛乳头细胞进行扩增培养；
S2、将扩增培养后的毛乳头细胞换用无血清培养基，进行饥饿培养；
S3、取饥饿培养体系中的培养基部分，过滤除去细胞和细胞碎片，得到第一分离液；
S4、在4±0.5℃下，对第一分离液，250～300g离心5～15min，保留上清液，得到第二分离液；
S5、在4±0.5℃下，对第二分离液，1500～2500g离心18～25min，保留上清液，得到第三分离液；
S6、对4±0.5℃下，对第三分离液，8000～10000g离心25～35min，保留上清液，得到第四分离液，
S7、向第四分离液中，以30～200μg/mL的量加入PEG修饰壳聚糖，充分混合，通过PEG修饰壳聚糖对外泌体进行连接；
S8、加入蛋白酶，对体系中大分子蛋白进行消化；
S9、重新降温至4±0.5℃，离心分离连接有PEG修饰壳聚糖的外泌体；
S10、对步骤S8中离心得到的沉淀进行重新分散，通过酶解法，分解外泌体表面连接的 PEG修饰壳聚糖；
S11、再次离心，保留底部沉淀，得到外泌体。
在上述技术方案中，首先对毛乳头细胞进行扩增和饥饿培养，在饥饿培养过程中，毛乳头细胞会分泌外泌体，这构成了毛乳头外泌体的产生基础。
通过提取培养基部分，并过滤除去细胞和细胞碎片，得到的第一分离液中含有外泌体和其他杂质，随后第一分离液通过初步的梯度离心得到第四分离液，目的在于除去其中的残留的细胞碎片和较大的蛋白团，过滤完成之后加入PEG修饰壳聚糖，充分混合后，通过壳聚糖表面的PEG链与外泌体上的结合点位进行结合，形成外泌体-壳聚糖复合结构。
上述结构形成后，加入蛋白酶进行消化，从而将体系中大分子蛋白切分为小分子，消化后的小分子通过离心即可与连接有PEG修饰壳聚糖的外泌体分离开。将分离得到的连接有PEG修饰壳聚糖的外泌体重新分散后，再通过酶解法分解外泌体表面所连接的壳聚糖结构，并再次离心分离，即可得到外泌体。
在上述过程中，由于通过蛋白酶处理，可以将体系中游离的大分子蛋白水解为小分子的蛋白，因此在离心过程中，大分子蛋白不易混杂于外泌体中，提高了制得的外泌体的纯度，同时在PEG修饰壳聚糖的保护下，外泌体受到蛋白酶的影响较小，随后通过酶解和再次离心分离外泌体，最终获得较纯的外泌体，且具有较好的产率。
另外，选用悬浮培养的方式，相较于贴壁培养，可以更好地刺激毛乳头细胞分泌外泌体，实现更高的外泌体产量。
可选的，所述PEG修饰壳聚糖在制备时，壳聚糖的分子量范围在20～50kda，壳聚糖表面经羧基化处理。
在上述技术方案中，选用10～50kda的壳聚糖，离心过程中，壳聚糖与壳聚糖之间不易团聚，且后续酶解过程较为容易，最终制得的外泌体具有较好的纯度。
可选的，所述PEG的端基为巯基或羧基。
巯基和羧基具有较好的反应性，可以与外泌体表面的位点发生较好的结合，进而提高外泌体本身与PEG修饰壳聚糖的连接程度，使外泌体可以更好地受到壳聚糖的保护，减少蛋白酶对外泌体本身的影响。经过上述连接后，对外泌体的聚沉效果也较好，在离心时外泌体只需要采用较低的转速即可，减少离心过程对外泌体结构的损伤。
可选的，PEG链的分子量为1～5kda。
PEG链为1～5kda时，在经过水解酶处理外泌体表面的残疾对外泌体本身的性质影响较小，也不易发生团聚，且上述范围的PEG链在修饰壳聚糖后，PEG修饰壳聚糖对外泌体具有较好的偶联效果。
可选的，在步骤S9中，离心时采用5000～6000g，离心时间为25～30min。
在选用50000～60000g的离心速率进行离心，既可以将连接有PEG-壳聚糖结构的外泌体较好地分离出来，也有助于保护外泌体结构不易因长时间快速离心而破坏，提高最终得到的外泌体的产量和质量。
可选的，在步骤S8中，选用胰蛋白酶，通过磷酸缓冲溶液调节pH值大于6，工作浓度为0.4～0.8U/mL，工作温度为25～30℃，处理时间为20～30min。
选用胰蛋白酶并调节pH至6以上，胰蛋白酶可以较好地分解体系中的蛋白质，且在中性至碱性条件下对壳聚糖的分解效果较差。因此，采用上述条件，在反应过程中，可以有效分解体系中的残留的大分子蛋白，实现较好的分离效果的同时，对带有PEG- 壳聚糖结构的外泌体则没有明显的分解效果，因此在上述条件下分离得到的外泌体具有更好的纯度，且不易损伤外泌体，也不易破坏外泌体上连接的PEG-壳聚糖结构。
可选的，在步骤S10中，选用壳聚糖酶对壳聚糖进行分解，壳聚糖酶的工作温度设置为27～30℃，0.2～0.5U/mL，处理时间为40～50min。
在上述技术方案中，通过壳聚糖酶可以高效分解壳聚糖的结构，使壳聚糖被水解为寡糖或短链多糖，随后通过离心即可分离外泌体和残留的寡糖和短链多糖，有助于减少体系中的壳聚糖残留量。由于壳聚糖体系本身具有一定的聚沉效果，因此通过上述酶解过程，可以使外泌体的悬浮性能更好，更加有利于保存。
可选的，在步骤S10中，体系通过醋酸缓冲溶液，将pH调整至4.8～5.5。
在弱酸性条件下，壳聚糖可以更好地在壳聚糖酶的作用下水解，进一步减少壳聚糖在外泌体外的吸附，进一步提高制得的外泌体在重悬后的稳定性，提高外泌体的质量。且上述条件下，外泌体本身也不易被外界环境所破坏。
可选的，在步骤S11中，重新将体系降至4±0.5℃，再在70000～80000g下离心60～70min。
在上述技术方案中，将温度重新下降至4±0.5℃，可以使外泌体更加稳定地存在，同时也有助于立高分离效率。采用70000～80000g的速率进行离心，可以有效分离外泌体的同时，也保持外泌体不易在离心过程中发生裂解，进而提高外泌体的产率。
可选的，在步骤S7中，采用磷酸缓冲溶液，调节pH值为5.5～5.8，温度为25～ 30℃，反应时间为30～60min。
选用pH值为5.5～5.8的磷酸缓冲溶液，可以使外泌体整体较为稳定，同时乙二醇修饰的壳聚糖也具有较好的分散性，有助于提高反应效率，进一步提高分离得到的外泌体的产率和纯度。
综上所述，本申请至少包括如下一种有益效果：
1.在本申请中，通过PEG修饰壳聚糖对外泌体进行连接和修饰，再通过蛋白酶消化体系中残留的大分子蛋白，再进行离心，可以有效将外泌体与培养基中的大分子蛋白分离，随后通过酶解分解壳聚糖，最终得到外泌体具有较好的纯度、较高的产量和较好的质量。
2.在本申请进一步设置中，采用胰蛋白酶在偏中性条件下对大分子蛋白进行消化，减少蛋白酶对壳聚糖的降解，进一步提高外泌体的分离纯度和产量。
3.在本申请进一步设置中，在弱酸性条件下采用壳聚糖酶对壳聚糖进行消化，有助于提高壳聚糖的降解速率，进而使最终得到的外泌体具有较好的稳定性。
附图说明
图1-A是本申请实验1中对照组的毛囊情况图。
图1-B是本申请实验1中实验组的毛囊情况图。
图2-C是本申请实验2中对照组的毛囊情况图。
图2-D是本申请实验2中对照组的毛囊情况图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
制备例1～15，PEG修饰壳聚糖的制备，称取1.0g壳聚糖，溶解于20mL0.1M的盐酸溶液中，作为溶液A；将一端羧基化的PEG溶解于50mM的MES缓冲溶液50mL 中，搅拌均匀后，将两倍于PEG分子当量的EDC盐酸盐加入到上述缓冲溶液中，作为溶液B；随后将溶液B滴加到溶液A中，室温反应40h，再使用透析分子量为8000～ 14000的透析袋过滤24h，透析液冻干后得到粉末，即为PEG修饰壳聚糖。制备例1～ 15中所用的壳聚糖和PEG如表1所示
表1、制备例1～15中所用的壳聚糖和PEG一览
编号 PEG端基 PEG数均分子量 壳聚糖 壳聚糖数均分子量
制备例1 羧基-PEG-羧基 2kda 普通壳聚糖 20kda
制备例2 巯基-PEG-羧基 2kda 普通壳聚糖 20kda
制备例3 羟基-PEG-羧基 2kda 普通壳聚糖 20kda
制备例4 甲醚-PEG-羧基 2kda 普通壳聚糖 20kda
制备例5 羧基-PEG-羧基 4kda 普通壳聚糖 20kda
制备例6 羧基-PEG-羧基 5kda 普通壳聚糖 20kda
制备例7 羧基-PEG-羧基 1kda 普通壳聚糖 20kda
制备例8 羧基-PEG-羧基 10kda 普通壳聚糖 20kda
制备例9 羧基-PEG-羧基 0.5kda 普通壳聚糖 20kda
制备例10 羧基-PEG-羧基 2kda 普通壳聚糖 30kda
制备例11 羧基-PEG-羧基 2kda 普通壳聚糖 50kda
制备例12 羧基-PEG-羧基 2kda 普通壳聚糖 10kda
制备例13 羧基-PEG-羧基 2kda 普通壳聚糖 100kda
制备例14 羧基-PEG-羧基 2kda 羧甲基壳聚糖 20kda
制备例15 羧基-PEG-羧基 2kda 羧乙基壳聚糖 20kda
其中，羧甲基壳聚糖CAS号为83512-85-0，羧乙基壳聚糖的CAS号为123938- 86-3，普通壳聚糖CAS号为9012-76-4，三种壳聚糖均选用脱乙酰度80％的规格，不同规格的壳聚糖和不同规格的PEG分子均可在各大试剂公司中购买得到(如上海阿拉丁或sigma-Aldrich等)。
在以下实施例中，通过毛乳头外泌体的产量、外泌体的尺寸，及外泌体的纯度衡量方法的有效性。
外泌体的产量通过以固定比例稀释后测定其单位体积溶液中所含的外泌体数量，具体采用如下方式：
在如下实施例和对比例中，将最终配制得到的外泌体重悬液，经过一定比例稀释后，通过NanoSight LM10颗粒跟踪分析技术计算其中的外泌体个数，并进一步计算折合样本中的外泌体浓度。
外泌体的尺寸具体测定方式如下：
按照外泌体的浓度，将外泌体用pH值为7.4、浓度为0.5mM的PBS溶液配制成108个/mL的溶液，并通过Nanosight LM10动态光散射试验仪，测定其粒径主峰值。
外泌体的纯度无具体定量测定方式，选取其中部分有代表性的样本，进行适量稀释后，通过TEM观察其中外泌体的形态，并识别其中是否混有大分子蛋白。
实施例1，一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法，具体包括如下步骤：
S1、在超低附着烧瓶(75cm2)中加入DMEM培养基和低血清生长剂LSGS(体积比100:1)，将100万个(量级)毛乳头细胞加入到上述培养液中，培养三天形成悬浮细胞体；
S2、换用无血清DMEM培养基，饥饿培养两天；
S3、收集饥饿培养体系中的培养基上清液，用0.22μm滤膜过滤，除去细胞和细胞碎片，得到第一分离液；
S4、在4±0.5℃下，对第一分离液，300g离心10min，保留上清液，得到第二分离液；
S5、在4±0.5℃下，对第二分离液，2000g离心20min，保留上清液，得到第三分离液；
S6、对4±0.5℃下，对第三分离液，10000g离心30min，保留上清液，得到第四分离液，
S7、对第四分离液，通过0.1mM磷酸缓冲溶液调节pH至5.5，以100μg/mL的浓度加入制备例1中制备得到的PEG修饰壳聚糖，在25℃下反应30min，使PEG修饰壳聚糖与外泌体相连接；
S8、经步骤S7处理后的溶液通过0.5mM磷酸缓冲溶液调节pH至大于6(一般调整至6.2)，以0.6U/mL的浓度加入胰蛋白酶，并在25℃下处理30min，以消化体系中的大分子蛋白；
S9、将步骤S8处理后的溶液降温至4±0.5℃，以5000g离心30min，保留底部沉淀；
S10、上述沉淀用50mL0.5mM醋酸缓冲溶液，将pH调制5.2，并以0.5U的工作浓度加入壳聚糖酶，保持温度在27℃，处理40min；
S11、壳聚糖酶处理完毕后，重新将体系降至4±0.5℃，并于70000g下离心60min，离心后保留底部沉淀，加入1mLpH为7.4浓度为0.5mM的磷酸缓冲溶液重悬，并冻存于 -80℃，即得到可以长期保存的外泌体。
实施例2～15，一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，所用的PEG修饰壳聚糖分别为制备例2～15中的PEG修饰壳聚糖。
实施例16，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，对步骤 S4～S6中的参数做一定调节，具体如下：
S4、在4±0.5℃下，对第一分离液，300g离心5min，保留上清液，得到第二分离液；
S5、在4±0.5℃下，对第二分离液，2500g离心18min，保留上清液，得到第三分离液；
S6、对4±0.5℃下，对第三分离液，10000g离心25min，保留上清液，得到第四分离液。
实施例17，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，对步骤 S4～S6中的参数做一定调节，具体如下：
S4、在4±0.5℃下，对第一分离液，250g离心15min，保留上清液，得到第二分离液；
S5、在4±0.5℃下，对第二分离液，1500g离心25min，保留上清液，得到第三分离液；
S6、对4±0.5℃下，对第三分离液，8000g离心35min，保留上清液，得到第四分离液。
实施例18，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤 S7中，PEG修饰壳聚糖的加入量为30μg/mL。
实施例19，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤 S7中，PEG修饰壳聚糖的加入量为200μg/mL。
实施例20～22，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤S7中，pH值分别为5.2、5.8、6.1。
实施例23，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤 S7中，反应温度为30℃，反应时间为60min。
实施例24，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤 S7中，反应温度为35℃，反应时间为15min。
实施例25，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤 S7中，反应温度为20℃，反应时间为180min。
实施例26～29，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤S8中，胰蛋白酶的工作浓度分别为0.2U/mL、0.4U/mL、0.8U/mL、1.2U/mL。
实施例30，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤 S8中，工作温度为30℃，处理时间为25min。
实施例31，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤 S8中，工作温度为20℃，处理时间为60min。
实施例32，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤 S8中，工作温度为37℃，处理时间为5min。
实施例33～35，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤S9中，离心速率分别为4000g、6000g、7000g。
实施例36～38，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤S9中，离心时间分别为20min、25min、40min。
实施例39～42，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤S10中，壳聚糖酶的工作浓度依次为0.1U/mL、0.2U/mL、0.5U/mL、0.8U/mL。
实施例43，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤 S10中，工作温度为27℃，处理时间为40min。
实施例44，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤 S10中，工作温度为25℃。
实施例45，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤 S10中，工作温度为32℃。
实施例46～47，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤S10中，分别换用同样工作浓度的大豆蛋白酶、纤维素酶对壳聚糖进行催化降解，其余条件保持不变。
实施例48～51，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤S10中，调节后的体系pH值分别为4.5、4.8、5.5、6.0。
实施例52～54，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤S11中，离心速率依分别为50000g、80000g、100000g。
实施例55，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤 S11中，离心时间为70min。
针对上述实施例，设置对比例如下。
对比例1，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例1的区别在于，在步骤S7 中，加入等质量浓度的羧甲基壳聚糖。
对比例2，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例1的区别在于，在步骤S7 中，加入与实施例1中加入的PEG修饰壳聚糖中所含的PEG当量相等的PEG，由于较难精确判定PEG修饰壳聚糖中所含PEG的量，因此以加入的PEG修饰壳聚糖在制备过程中所消耗的PEG的量计算在本对比例中所需要加入的PEG的量。
对比例3，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例1的区别在于，略过步骤 S8。
对比例4，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例1的区别在于，略过步骤S10。
对比例5，一种毛乳头外泌体制备分离方法，与实施例14的区别在于，在步骤S1中，采用底面积175cm2的普通铁壁培养瓶对毛乳头细胞进行贴壁培养。
对于上述实施例和对比例，其最终的外泌体浓度及测定得到的外泌体粒径如表2所示。
表1、制备例1～15中所用的壳聚糖和PEG一览
编号 PEG端基 PEG数均分子量 壳聚糖 壳聚糖数均分子量
制备例1 羧基-PEG-羧基 2kda 普通壳聚糖 20kda
制备例2 巯基-PEG-羧基 2kda 普通壳聚糖 20kda
制备例3 羟基-PEG-羧基 2kda 普通壳聚糖 20kda
制备例4 甲醚-PEG-羧基 2kda 普通壳聚糖 20kda
制备例5 羧基-PEG-羧基 4kda 普通壳聚糖 20kda
制备例6 羧基-PEG-羧基 5kda 普通壳聚糖 20kda
制备例7 羧基-PEG-羧基 1kda 普通壳聚糖 20kda
制备例8 羧基-PEG-羧基 10kda 普通壳聚糖 20kda
制备例9 羧基-PEG-羧基 0.5kda 普通壳聚糖 20kda
制备例10 羧基-PEG-羧基 2kda 普通壳聚糖 30kda
制备例11 羧基-PEG-羧基 2kda 普通壳聚糖 50kda
制备例12 羧基-PEG-羧基 2kda 普通壳聚糖 10kda
制备例13 羧基-PEG-羧基 2kda 普通壳聚糖 100kda
制备例14 羧基-PEG-羧基 2kda 羧甲基壳聚糖 20kda
制备例15 羧基-PEG-羧基 2kda 羧乙基壳聚糖 20kda
另外，出于成本原因，对实施例1、实施例14、实施例26～29、实施例46～47 及对比例2～4，通过TEM观察其外泌体微观形态，并判定其纯度，具体结果如表3所示。
表3、部分实施例及对比例中样本在TEM下微观形态
Figure RE-GDA0003016096940000091
Figure RE-GDA0003016096940000101
通过上述实验数据可知，相较于对比例，选用本申请中方式制备外泌体，相较于对比例1～5，具有较好的外泌体产量和纯度。通过PEG修饰壳聚糖对外泌体进行偶联，改变外泌体的离心性能，并通过蛋白酶处理其中的大分子蛋白，并通过PEG修饰壳聚糖保护外泌体，从而实现提高产率和纯度的效果。
在实施例1～15中，证明了由于端基为羧基和巯基的乙二醇具有更好的偶联效果，因此选用该类乙二醇修饰的壳聚糖在使用过程中，可以进一步提高外泌体的产率。实施例18～25对步骤S7进行了调整，限定了反应的pH值、反应温度、反应时间和 PEG修饰壳聚糖的浓度，意外发现当PEG修饰壳聚糖添加量达到一定程度时，得到的外泌体含量反而降低。申请人推测此处原因可能是由于壳聚糖量过大导致壳聚糖之间通过氢键作用发生聚沉，进而导致外泌体在离心重悬时难以均匀分散，进一步导致了外泌体产量的降低。
实施例26～32对蛋白酶消化大分子蛋白的步骤进行了调整，整体反应在偏中性的环境下进行，使胰蛋白酶的工作效率更佳。蛋白酶的工作浓度过高会导致外泌体本身的结构受到一定程度的破坏。实施例33～38在上述基础上，确定了经过胰蛋白酶处理后的体系的离心速率和离心时间，相较于常规处理方式，离心速率和离心时间均略有缩短。
实施例39～55中，对经过胰蛋白酶处理并经过离心沉淀的外泌体与PEG修饰壳聚糖的偶联体系进行进一步处理，通过壳聚糖酶降解壳聚糖，以分离外泌体。壳聚糖酶的工作环境需要弱酸性和较高的温度，但是过高的温度也会破坏外泌体本身的结构。另外，壳聚糖酶浓度太高时，可能会对外泌体表面一些糖蛋白等活性成分产生影响。
选取本申请中，实施例1中所提取得到的外泌体，进行如下实验，以验证外泌体的有效性。
实验1、小鼠生长中期毛发处理实验。
取20只5周龄的C57BL/6小鼠，背部完全剃毛，实施例1中制得的外泌体重悬液经冻干后，取500μg分散于于1mLPBS溶液中，制得药液I，在10只小鼠背部均匀注射100mL药液I；另10只背部注射100μL的PBS，作为对照组，两组每天注射一次，连续注射4天。在40日龄时活检小鼠背部治疗的区域皮肤，对照结果如图1-A和图1-B所示。
实验2、小鼠休止期毛发处理实验。
取20只7周龄的C57BL/6小鼠，背部完全剃毛，实施例1中制得的外泌体重悬液经冻干后，取500μg分散于1mLPBS溶液中，制得药液I，在10只小鼠背部均匀注射100mL药液I；另10只背部注射100μL的PBS，作为对照组，两组每周注射三次，连续注射四周。在40日龄时活检小鼠背部治疗的区域皮肤，对照结果如图2-C和图2-D所示。
通过上述实验数据可知，参照本申请中所提取的毛乳头外泌体，对于生长中期和休止期的毛发，均可以使之逆转重新回到生长早期的模式，意味着本申请中制得的外泌体，有效性具有较好的保证，可以运用于脱发治疗中。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1、采用悬浮培养的方式对毛乳头细胞进行扩增培养；
S2、将扩增培养后的毛乳头细胞换用无血清培养基，进行饥饿培养；
S3、取饥饿培养体系中的培养基部分，过滤除去细胞和细胞碎片，得到第一分离液；
S4、在4±0.5℃下，对第一分离液，250～300g离心5～15min，保留上清液，得到第二分离液；
S5、在4±0.5℃下，对第二分离液，1500～2500g离心18～25min，保留上清液，得到第三分离液；
S6、对4±0.5℃下，对第三分离液，8000～10000g离心25～35min，保留上清液，得到第四分离液，
S7、向第四分离液中，以30～200μg/mL的量加入PEG修饰壳聚糖，充分混合，通过PEG修饰壳聚糖对外泌体进行连接；
S8、加入蛋白酶，对体系中大分子蛋白进行消化；
S9、重新降温至4±0.5℃，离心分离连接有PEG修饰壳聚糖的外泌体；
S10、对步骤S8中离心得到的沉淀进行重新分散，通过酶解法，分解外泌体表面连接的PEG修饰壳聚糖；
S11、再次离心，保留底部沉淀，得到外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法，其特征在于，所述PEG修饰壳聚糖在制备时，壳聚糖的分子量范围在20～50kda，壳聚糖表面经羧基化处理。
3.根据权利要求2所述的一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法，其特征在于，所述PEG的端基为巯基或羧基。
4.根据权利要求3所述的一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法，其特征在于，PEG链的分子量为1～5kda。
5.根据权利要求4所述的一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法，其特征在于，在步骤S9中，离心时采用5000～6000g，离心时间为25～30min。
6.根据权利要求1所述的一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法，其特征在于，在步骤S8中，选用胰蛋白酶，通过磷酸缓冲溶液调节pH值大于6，工作浓度为0.4～0.8U/mL，工作温度为25～30℃，处理时间为20～30min。
7.根据权利要求1所述的一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法，其特征在于，在步骤S10中，选用壳聚糖酶对壳聚糖进行分解，壳聚糖酶的工作温度设置为27～30℃，0.2～0.5U/mL，处理时间为40～50min。
8.根据权利要求7所述的一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法，其特征在于，在步骤S10中，体系通过醋酸缓冲溶液，将pH调整至4.8～5.5。
9.根据权利要求8所述的一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法，其特征在于，在步骤S11中，重新将体系降至4±0.5℃，再在70000～80000g下离心60～70min。
10.根据权利要求1所述的一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法，其特征在于，在步骤S7中，采用磷酸缓冲溶液，调节pH值为5.5～5.8，温度为25～30℃，反应时间为30～60min。
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