CN104726407B - 一种利用器官培养以增加成年神经组织中神经干细胞收获率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用器官培养以增加成年神经组织中神经干细胞收获率的方法，所述方法包括器官培养和细胞培养两部分，所有操作都在无菌操作台里完成。本发明采取器官培养，七天之后再进行木瓜蛋白酶消化和吹打分散，结果获得的活细胞量要高于直接酶消化的三倍以上；另外一个参与因素是神经干细胞在器官培养过程中大量的增殖，从而增加了干细胞的总数；本发明的另一个技术改进是在分散组织之后直接将细胞接种在多聚鸟氨酸(PLO)被覆的细胞培养板中，数小时后通过更换培养液来去除组织残渣(包括细胞碎片)，这样做就不经过梯度离心的费时繁琐步骤，也免除了大多数梯度离心溶液所带来的细胞毒性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是一种利用器官培养以增加成年神经组织中神经干细胞收获率的方法。
背景技术
神经干细胞(neural stem cell，NSC)是可以分化成为任何一种神经细胞的多潜能干细胞。神经前体细胞(neural precursor cell，NPC)是初步分化的神经干细胞，只能分化成神经元。这两种细胞通常都被称为神经干细胞，在本发明中沿袭此称法，以求简洁。
主要源于本世纪的研究结果表明：神经干细胞(neural stem cell，NSC)和神经前体细胞(neural precursor cell，NPC)不只存在于人的胚胎发育期，而且也有少量存在于成人的部分脑区和脊髓的中心部位。这些神经干细胞可以被从捐献的尸体中提取出来用于科学研究和临床治疗。
现有技术是直接对成年的神经组织进行胰酶或木瓜蛋白酶消化，然后经过机械吹打使得组织分散。但是，由于成年神经组织含有大量的纤维为主的结缔组织成分，以及细胞间的紧密连接，都造成组织结构远比胚胎组织坚硬，使得酶消化作用差，进而机械吹打时组织不易分散，造成组织分散不完全和强力分散严重损伤细胞，因此获得的活细胞量极少(low yield)。
现有技术中存在因成年神经组织坚硬，酶消化作用差而导致的的活细胞获得率极低的技术难题，因此亟需一种新的方法来解决该技术难题。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的克服现有技术的不足之处，提供一种方法简单、操作方便、获得率极高的利用器官培养以增加成年神经组织中神经干细胞收获率的方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的的技术方案如下：
一种利用器官培养以增加成年神经组织中神经干细胞收获率的方法，所述方法包括器官培养和细胞培养两部分，所有操作都在无菌操作台里完成，具体步骤如下：
⑴器官培养：
解剖取材个人供体脊髓或脑区，横切断脊髓为2-3mm厚，然后进一步解剖显微镜下将神经组织切成2-3立方毫米的组织块，加磷酸缓冲盐水(PBS)清洗三次，然后转移到未涂覆的塑料平皿中，在37℃，5％CO2水套式二氧化碳培养箱里培养7天，即得培养后神经组织；
其中，培养基的组成是DMEM和DMEM/F12加N2添加剂和B27添加剂，其中，DMEM和DMEM/F 12的质量比为1:1，培养基还包含10μM N-乙酰半胱氨酸，10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和20ng/ml表皮生长因子，每两天作四分之三总培养基的换液；
⑵木瓜蛋白酶消化、吹打分散、贴壁分散细胞培养
①DMEM洗涤培养后神经组织一次，在10单位/毫升木瓜蛋白酶溶液中，37℃消化45分钟；
②加入4毫克/ml DNA酶后用吸管轻轻地吹打5-7次以分散组织；
③1000-2000转/分钟离心5-10分钟，加磷酸缓冲盐溶液清洗三次后，接种在多聚鸟氨酸被覆的细胞培养板中，在37℃，5％CO2水套式二氧化碳培养箱里培养，培养基的组成与上述器官培养的培养基相同；
④四小时后，当活细胞已经贴附在培养板上时，吸除所有培养基，包括细胞碎片，并清洗一遍后，加入新鲜培养基继续培养；
⑤每两天作总量四分之三培养基的换液，直至细胞长满培养板时，即得成年神经组织中神经干细胞。
而且，所述步骤⑵③中为在1000转/分钟离心5分钟。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明采取先将剪碎的成年神经组织在体外培养(称作器官培养，organotypicculture)，七天之后再进行木瓜蛋白酶消化和吹打分散，结果获得的活细胞量要高于直接酶消化的三倍以上(high yield)，这种促进的主要原因在于器官培养过程中结缔组织大量降解，明显地软化了组织，使得酶消化和吹打分散都更加容易和彻底；另外一个参与因素是神经干细胞在器官培养过程中大量的增殖，从而增加了干细胞的总数；本发明的另一个技术改进是在分散组织之后直接将细胞接种在多聚鸟氨酸(PLO)被覆的细胞培养板中，数小时后通过更换培养液来去除组织残渣(包括细胞碎片)，这样做就不经过梯度离心的费时繁琐步骤，也免除了大多数梯度离心溶液所带来的细胞毒性。
2、本发明方法较之于传统的直接使用木瓜蛋白酶消化所获得的活细胞量要高三倍以上，因为成人神经组织只含有很少量的神经干细胞，故而高收获率就更为关键，该方法可以应用于脑组织或脊髓组织。
附图说明
图1为本发明方法的操作工艺流程图；
图2为本发明方法和传统直接消化法的神经干细胞收获率的对比图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的试剂，如无特殊规定，均为本领域内常用试剂；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域内常用的方法。
本发明的原理如下：
本发明采取先将剪碎的成年神经组织在体外培养(称作器官培养，organotypicculture)，七天之后再进行木瓜蛋白酶消化和吹打分散。结果获得的活细胞量要高于直接酶消化的三倍以上(high yield)。这种促进的主要原因在于器官培养过程中结缔组织大量降解，明显地软化了组织，使得酶消化和吹打分散都更加容易和彻底。另外一个参与因素是神经干细胞在器官培养过程中大量的增殖，从而增加了干细胞的总数。本发明的另一个技术改进是在分散组织之后直接将细胞接种在多聚鸟氨酸(PLO)被覆的细胞培养板中。数小时后通过更换培养液来去除组织残渣(包括细胞碎片)。这样做就不经过梯度离心的费时繁琐步骤，也免除了大多数梯度离心溶液所带来的细胞毒性。
一种利用器官培养以增加成年神经组织中神经干细胞收获率的方法，所述方法包括器官培养和木瓜蛋白酶消化，吹打分散后贴壁分散细胞培养两大部分，所有操作都在无菌操作台里完成；具体步骤如下：
⑴器官培养：
解剖取材个人供体脊髓或脑区，横切断脊髓或脑组织成2-3mm厚的切片，然后进一步在解剖显微镜下将神经组织切成2-3立方毫米的组织块，加磷酸缓冲盐水(PBS)清洗三次，然后转移到未涂覆的塑料平皿中，在37℃，5％CO2水套培养箱里培养7天；
培养基的组成是合成培养基DMEM和DMEM/F 12(1:1)加N2和B27培养添加剂(生命科学，Invitrogen)，10μM N-乙酰半胱氨酸(NAC)，10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，和20ng/ml表皮生长因子(EGF)，每两天作总培养基四分之三量的换液；
*注：合成培养基DMEM和DMEM/F 12(1:1)，N2和B27培养添加剂都是购自生命科学(Invitrogen)的现成产品。合成培养基DMEM和DMEM/F 12(1:1)含有细胞存活所必须的无机盐，氨基酸，糖和维生素。N2和B27培养添加剂含有其他促进细胞生长的蛋白质，激素，维生素和酯类等成分。
N2成分包括：胰岛素，转铁蛋白，孕酮，腐胺，和亚硒酸钠。
B27成分包括：生物素，左旋肉碱，胆固醇，皮质酮，乙醇胺，D(+)-半乳糖，谷胱甘肽，卵磷脂，亚油酸，亚麻酸，磷脂酰胆碱，孕酮，腐胺，视黄醇，视黄醇乙酸酯，亚硒酸钠，三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)，DL-维生素E，DL-醋酸维生素E，牛血清白蛋白，过氧化氢酶，胰岛素，超氧化物歧化酶，转铁蛋白。
⑵木瓜蛋白酶消化，吹打分散，贴壁分散细胞培养
①DMEM洗涤组织一次。在10单位/毫升木瓜蛋白酶溶液中，37℃消化45分钟，置于摇床上。
②加入4毫克/ml DNA酶后用吸管轻轻地吹打5-7次以分散组织。
③在1000转/分钟离心5分钟，加PBS清洗三次后，接种在多聚鸟氨酸(PLO)被覆的细胞培养板中，在37℃，5％CO2水套培养箱里培养。培养基的组成与上述器官培养相同。
④四小时后，当活细胞已经贴附在培养板上时，吸除所有培养基(包括细胞碎片)并用PBS清洗一遍后，加入新鲜培养基继续培养。
⑤每两天作总量四分之三培养基的换液，直至细胞长满培养板时需要作传代，即得成年神经组织中神经干细胞。
为了比较本方法和传统直接消化法的神经干细胞收获率，本申请人作了一项对比试验：在最初取材时，将两份同样重量的脊髓组织分别按照本发明方法和传统的直接酶消化方法进行培养。在培养结束时进行细胞数定量以决定神经干细胞的产量。其具体做法是将分散培养的细胞经过0.25％胰酶+EDTA消化5分钟以将细胞脱壁悬浮，用0.1％胰酶抑制剂中和胰酶的作用后在1000转/分钟离心5分钟。加PBS清洗三次后，将两份细胞制备再悬浮在等体积的培养基中，并从中各自取出20微升滴在血球计数仪上，在显微镜下计数。计数结果表明，本发明方法较之于传统的直接使用木瓜蛋白酶消化所获得的活细胞量要高三倍以上(见附图2，每一个处理的样本数是4，来自2个独立的实验)，p小于0.01，所以结果具有显著意义。因为成人神经组织只含有很少量的神经干细胞，故而高收获率就更为关键，而此方法达到了这个目的，可以应用于成人脑和脊髓组织。
Claims (2)
1.一种利用器官培养以增加成年神经组织中神经干细胞收获率的方法，其特征在于：所述方法包括器官培养和细胞培养两部分，所有操作都在无菌操作台里完成，具体步骤如下：
⑴器官培养：
解剖取材个人供体脊髓或脑区，横切断脊髓或脑组织成2-3mm厚的切片，然后进一步在解剖显微镜下将神经组织切成2-3立方毫米的组织块，加磷酸缓冲盐水清洗三次，然后转移到未涂覆的塑料平皿中，在37℃，5％CO2水套培养箱里培养7天
其中，培养基的组成是DMEM和DMEM/F12加N2添加剂和B27添加剂，其中，DMEM和DMEM/F12的质量比为1:1，培养基还包含10μM N-乙酰半胱氨酸，10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和20ng/ml表皮生长因子，每两天作四分之三总培养基的换液；
⑵木瓜蛋白酶消化、吹打分散、贴壁分散细胞培养
①DMEM洗涤培养后神经组织一次，在10单位/毫升木瓜蛋白酶溶液中，37℃消化45分钟；
②加入4毫克/ml DNA酶后用吸管轻轻地吹打5-7次以分散组织；
③1000-2000转/分钟离心5-10分钟，加磷酸缓冲盐溶液清洗三次后，接种在多聚鸟氨酸被覆的细胞培养板中，在37℃，5％CO2水套式二氧化碳培养箱里培养，培养基的组成与上述器官培养的培养基相同；
④四小时后，当活细胞已经贴附在培养板上时，吸除所有培养基，包括细胞碎片，并清洗一遍后，加入新鲜培养基继续培养；
⑤每两天作总量四分之三培养基的换液，直至细胞长满培养板时，即得成年神经组织中神经干细胞。
2.根据权利要求1所述的利用器官培养以增加成年神经组织中神经干细胞收获率的方法，其特征在于：所述步骤⑵③中为在1000转/分钟离心5分钟。
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