CN115927186B - 一种培养基及其在胎猴神经干细胞分离培养中的应用 - Google Patents
一种培养基及其在胎猴神经干细胞分离培养中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种培养基及其在胎猴神经干细胞分离培养中的应用，所述培养基的基底培养基是DMEM/F12，此外还含有1％L‑谷氨酰胺、2％B27无血清添加剂、5‑20ng/mL bFGF、5‑20ng/ml EGF、5‑10μg/mL肝素、0.2mM NEAA、1.5μg/mL CHIR99021、10ng/mL hLIF、0.1mM维C、抗生素适量。本发明培养基中，hLIF可抑制胚胎干细胞分化，促进细胞自我更新，可用于培养胎猴神经干细胞；同时CHIR99021是GSK3抑制剂，起到WNT激活剂的作用。与hLIF结合使用可从人类ES细胞中生成原始神经干细胞并维持神经干细胞自我更新能力和神经原性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种培养基及其在胎猴神经干细胞分离培养中的应用。
背景技术
神经干细胞(neural stem cell,NSC)是基础科学研究和细胞替代疗法治疗神经疾病的重要科研基础。尽管成年哺乳动物(包括人)的大脑中存有一定量的神经干细胞，但是，数量非常有限，难以被大规模应用。
虽然，由胚胎干细胞可诱导分化出NSC,理论上可获得无穷多的NSC。但是体外培养诱导分化出的NSC与体内自然发育过程中的NSC仍有一定的差异。例如，在帕金森病的临床治疗中，移植胎儿间脑神经组织可有效改善病症，而移植胚胎干细胞诱导分化出的NSC看不到治疗效果。因此，规模数量的胎儿NSC分离培养具有重要意义。
非人灵长类动物(实验猴)具有与人类高度相似的脑结构和脑功能，其神经发育过程也与人类非常相近。因此，分离培养灵长类动物(食蟹猴)胎儿期规模数量的神经干细胞具有重要的价值。
分离培养啮齿类动物胚胎期神经干细胞的研究报道比较普遍，小鼠的大脑神经发生期主要集中在胎儿发育的9-13天，普遍使用E11(怀孕11天)的胎儿进行NSC分离培养，培养方式主要是悬浮式培养。
目前，有少量人的胎儿期神经干细胞的报道。因为人的样本资源较难获取，胎儿的孕期时间随机不可控，样本质量会受到流产药物的影响，所以，在非人灵长类动物上进行胎儿期NSC分离培养可提升NSC的基础和临床转化研究。
发明内容
为了提高胎猴神经干细胞的获取效率、分化干性和传代稳定性，本发明的目的在于提供一种培养基及其在胎猴神经干细胞分离培养中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种培养基，其基底培养基是DMEM/F12，此外还含有1％ L-谷氨酰胺(L-glutamine)、2％ B27无血清添加剂(不含维生素A)、5-20ng/mL bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、5-20ng/ml EGF(表皮细胞生长因子)、5-10μg/mL肝素、0.2mM NEAA(非必需氨基酸)、1.5μg/mL CHIR99021、10ng/mL hLIF(人白血病抑制因子)、0.1mM维C、抗生素适量；
所述的抗生素优选青霉素和链霉素；
所述的培养基可用于胎猴神经干细胞的分离培养。
胎猴神经干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
A、取孕期70-90天的母猴，此时胎猴脑形成完整结构，体积增大又不至于过于成熟，且神经干细胞较多，干性较好，并可以得到较多组织；剖腹产获取胎猴，在无菌环境中分离胎猴的脑组织，然后剪碎为小组织块，消化分离细胞；
步骤A所述的消化分离细胞包括以下步骤：
(1)将胎猴脑小组织块用含双抗的DPBS(无钙镁磷酸盐缓冲液)清洗若干次，去掉血清和冻存液中的DMSO(二甲基亚砜)；
(2)将小组织块剪碎，加入37℃水浴的Accutase酶和DNA酶，置于37℃消化20-30分钟；
(3)吹打解离细胞，加入基础培养基稀释终止消化反应，用70um的滤网过滤，收集含有细胞的悬浮液；
(4)将悬浮液离心，所得沉淀加入DPBS重悬；再次离心，最后加入基础培养基重悬细胞；
步骤(3)和(4)所述的基础培养基为90％DMEM+10％FBS；
步骤(4)所述的离心，优选以300×g离心5分钟；
步骤A所述的小组织块，若不立即消化分离细胞，则应加入冻存液置于液氮中保存；
所述的冻存液由40％DMEM培养基、40％PBS(磷酸盐缓冲液)、10％FBS(胎牛血清)和10％DMSO组成；
B、将消化所得细胞接种到低粘附培养皿，加入本发明所述的培养基，培养3-5天可形成神经干细胞球(NESTIN阳性)，其神经球直径大于100微米，此时可传代培养；待神经球长至大于200微米时方便处理并切片染色，此时神经球中95％以上的细胞仍为神经干细胞；
步骤B所述的接种，细胞密度优选1×104个细胞/cm2；
步骤B所述的培养，起初3天每天半换液，3天后每3天更换一次培养基；
需要传代培养时，用Accutase酶消化神经干细胞球进行传代，为避免产生大量星形胶质细胞，P1代培养可以减半使用EGF；P2代开始，EGF用量可再减半，因为高浓度EGF会降低后期少突胶质细胞祖细胞的数量；但要保留EGF，因为EGF是维持神经干细胞自我更新，细胞多能性及抑制凋亡所必需。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明的培养基配方中，人LIF蛋白(hLIF)可抑制胚胎干细胞分化，促进细胞自我更新，可用于培养胎猴神经干细胞；同时培养基中的CHIR99021是一种极其有效的糖原合酶激酶(GSK)3抑制剂，可抑制GSK3β和GSK3α。而GSK3是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是WNT通路的关键抑制剂；因此CHIR99021起到WNT激活剂的作用。CHIR99021与hLIF结合使用可促进人类胚胎干细胞(ESC)生成原始神经干细胞并维持神经干细胞自我更新能力和神经原性，此处使用hLIF帮助维持胎猴神经干细胞干性；采用去除维生素A的B27补充剂，有利于降低神经干细胞分化效力且维持神经细胞正常增殖能力。
附图说明
图1是培养基A传代培养体系条件下第7代神经干细胞球切片免疫荧光染色神经干细胞标记蛋白NESTIN和SOX2染色结果。
图2是采用培养基A或B传代培养至第3代时，比较神经球体外分化成神经元(TUJ1阳性)效果的免疫荧光染色结果。
图3是比较采用培养基A或B传代培养至第3代时神经球的直径差异。
图4是神经球体外分化成星形胶质细胞(GFAP阳性)和少突胶质细胞(OLIG2阳性)的免疫荧光染色结果。
图5是采用培养基A或C传代培养至第3代时NESTIN阳性细胞的比例。
图6是神经球小头症疾病基因ASPM染色及打靶分析结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
胎猴神经干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
实验用食蟹猴购买并饲养于广州蓝岛生物科技有限公司。通过月经观察，在母食蟹猴排卵期安排与公食蟹猴合笼交配并结合B超孕检的方法，在孕期70-90天的时候剖腹产获取非人灵长类实验动物胎儿，在无菌环境中分离胎猴的脑组织，然后机械剪碎为小组织块(约1mm3),加入20ml冻存液(40％DMEM+40％PBS+10％FBS+10％DMSO)吹匀，用无菌巴斯德吸管分1ml/管后，置于4℃冰箱10分钟平衡避免冻坏，转入程序冷冻器缓慢降温过夜至﹣80℃，最后转入液氮中长期保存。
分离培养胎猴神经干细胞时，将冷冻的胎猴脑组织取出，消化分离细胞步骤如下：
1.将解冻的胎脑组织倒入塑料培养皿中用10ml含双抗的DPBS清洗2-3次，去掉血清和DMSO；
2.将组织用剪刀剪碎，并加入37℃水浴的商品化Accutase酶+DNA酶(200U/ml)，置于37℃消化20-30分钟，每10分钟摇匀一次；
3.使用无菌、火抛光玻璃巴斯德吸管吹打解离细胞；
4.加入3倍体积的基础培养基(90％DMEM+10％FBS)稀释终止消化反应，用70um的滤网过滤；
5.将悬浮液以300×g离心5分钟；
6.去除上清，以2ml DPBS重悬；
7.细胞计数，台盼蓝检测细胞活率(解冻组织细胞85％以上是活性细胞)；
8.离心，加入DPBS重悬细胞，调节细胞密度为1×104个细胞/cm2接种到低粘附培养皿，取2个培养皿的细胞分别加入培养基A或B，持续观察比较。
所述的培养基A为本发明的培养基，其基底培养基是DMEM/F12，此外还含有1％ L-谷氨酰胺(L-glutamine)、2％ B27无血清添加剂(不含维生素A)、5-20ng/mL bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、5-20ng/ml EGF(表皮细胞生长因子)、5μg/mL肝素、0.2mM NEAA(非必需氨基酸)、1.5μg/mL CHIR99021、10ng/mL hLIF(人白血病抑制因子)、0.1mM维C、0.5×Penicillin/Streptomycin(青霉素/链霉素)；
所述培养基B，其基底培养基是DMEM/F12，此外还含有1％ L-谷氨酰胺(L-glutamine)、1％ N2无血清添加剂、2％ B27无血清添加剂、20ng/mL bFGF、20ng/mL EGF、5ug/mL肝素和1×penicillin/streptomycin(青霉素/链霉素)；
起初3天每天半换液，3天后每3天更换一次培养基。培养基A体系条件下，3-5天可形成神经球(直径大于200微米)，此时可传代培养；
传代培养时，用Accutase酶消化神经干细胞球进行传代，为避免产生大量星形胶质细胞，P1代培养可以减半使用EGF；P2代开始，EGF用量可再减半，因为高浓度EGF会降低后期少突胶质细胞祖细胞的数量；但要保留EGF，因为EGF是维持神经干细胞自我更新，细胞多能性及抑制凋亡所必需。
图1是培养基A传代培养体系条件下，第7代神经干细胞球切片染色图；图1A中，绿色为NESTIN蛋白染色，定位于胞质，阳性细胞比例大于95％，说明神经干细胞干性维持的较好；图1B中，绿色为Ki67蛋白染色，定位于细胞核，阳性细胞比例大于95％，说明神经干细胞增殖能力较好，传代7代以上仍可保持干性。
取普通3.5cm直径培养皿，并将培养皿底覆盖50μg/ml Poly-D-lysine(多聚赖氨酸)于37℃包被过夜。次日，将每皿接种100-200枚神经球(由培养基A或B传代至第3代的神经球)，分别用A或B培养基培养过夜，细胞球贴壁，于次日换成神经元分化培养基(Neurobasal+1％ N2无血清添加剂+2％ B27无血清添加剂(含维生素A)+0.2mM NEAA(非必需氨基酸)+0.5×Penicillin/Streptomycin(青霉素/链霉素)；此后每隔一天半换液。分化至第10天，通过免疫荧光染色TUJ1蛋白分析神经球向神经元分化能力。
由图2可见，培养孕期70天(D70)和孕期90天(D90)的A培养基和B培养基NSC，传代至第3代后定向诱导向神经元10天分化效果，红色为TUJ1阳性的神经元细胞。说明A培养基(本发明培养基)所得神经球维持神经元分化能力更好，定向分化成神经元效率更高。
取普通3.5cm直径培养皿，并将培养皿底覆盖50μg/ml Poly-D-lysine(多聚赖氨酸)于37℃包被过夜。次日，将每皿接种100-200枚神经球(由培养基A或B传代至第3代的神经球)，分别用A或B培养基培养过夜，细胞球贴壁，于次日换成星形胶质细胞分化培养基(DMEM/F12+1％ N-2+1％ FBS+0.5×Penicillin/Streptomycin(青霉素/链霉素))或少突胶质细胞分化培养基(Neurobasal+2％ B27+1％ L-glutamine+30ng/mL T3(3,3′,5-三碘-L-甲状腺原氨酸))；此后每隔一天半换液。分化至第10天，通过免疫荧光染色GFAP蛋白和OLIG2蛋白分析神经球向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化能力。
由图3可以看出，传代至第3代时，A培养基细胞比B培养基细胞长势更快，直径更大，可继续传代。而B培养基NSC神经球3代后停止增殖。
由图4可以看出，传代至第3代后定向诱导，A培养基细胞也可定向分化出星形胶质细胞(GFAP阳性，绿色)和少突胶质细胞(Oligo 2阳性，绿色)，证明其具有分化的多能性。
由以上结果可见，使用培养基A与B同时培养比较，同时传代，培养基B传至第3代，干性(分化能力)显著下降，NSC扩增速度较低，神经球变小，无法继续传代，而A培养基的神经球可以继续传代。提示培养基A比培养基B更能维持神经干细胞多能性。
同时，本发明的培养基的NSC培养7代时仍表现为95％以上的NESTIN+和Ki67+，说明神经干细胞干性及增殖能力较好，且形成的神经球(neurosphere)直径平均大约200um。解决了之前干细胞干性维持不理想，扩增能力不足的问题。
一只70和90天的食蟹猴胎猴分别可以收集冻存约40管(NUNC冻存管，每管装1ml)和80管样品(NUNC冻存管，每管装1ml)。解冻复苏并传代培养后可获得至少3×109个NSC，达到规模化研究使用的水平。
实施例2
胎猴神经干细胞的分离培养方法，胎猴及其脑组织的获取、细胞的消化分离均同实施例1；
调节细胞密度为1×104个细胞/cm2接种到低粘附培养皿，加入培养基C培养；
所述培养基C，其基底培养基是DMEM/F12，此外还含有1％ N2无血清添加剂、20ng/ml人bFGF、20ng/ml人EGF、1.55mg/ml glucose、0.073mg/ml L-谷氨酰胺、1.69mg/mlNaHCO3和100U/ml penicillin G/streptomycin。
按实施例1的方法，分别使用培养基A和C对消化分离得到的细胞做传代培养，第3代神经干细胞球切片染色结果如图5所示，与培养基A(95％ NESTIN阳性)相比，培养基C(76％ NESTIN阳性)培养下NSC细胞干性明显降低。
实施例3
ASPM基因在胎脑发育过程中维持神经干细胞数量及质量，主要定位于有丝分裂中期纺锤体端点(图6A，实线箭头)及分裂间期的细胞质(图6A，虚线箭头)，此基因缺失会导致新生儿小头症畸形，具体表现为前额叶塌陷，头围小于同年龄同性别个体3个标准差。
为了示踪不同发育阶段ASPM基因的调节作用，采用体外培养神经干细胞并诱导神经细胞定向分化方法进行研究。根据神经干细胞不同分化时间打靶ASPM基因可以及时发现此基因在神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞等不同细胞中的作用，比如影响其分化效率和成熟度等方面。
借助AAV病毒感染打靶神经球来实现对ASPM基因编辑。按照CAS9∶gRNA(gRNA1：gatgtctcaacagtgcagt；gRNA2：gccatgtattcctgaatatca；两者等体积混匀)＝3∶1的比例加入37℃温浴的本发明培养基中，换液第1代神经球感染72小时。经病毒感染后神经球状态和感染效果均良好，由于gRNA上带有EGFP序列，所以感染成功的神经球在荧光显微镜下会发出绿光(图6B)。将这些感染成功的神经球收集后提取基因组并进行聚合酶链式反应(PCR)实验。
当2条不同gRNA在ASPM基因位置上同时打靶时，会导致DNA片段脱落。将引物设计在2条不同gRNA打靶位置的中间区域，扩增产生162bp的片段。引物序列Primer-F：ctgcagttcaggatatttctag；Primer-R：cacccactgcactgttga。
Ko组神经球中会存在2种打靶类型细胞：1.双位点打靶成功的细胞，由于缺失这个片段PCR条带会缺失；2.未同时打靶的细胞则保有此片段；2种情况综合起来看是产生一条弱带(ASPM基因片段显著减少约80％)，预示基因编辑成功；而对照组(Ctrl)由于未打靶则有较强的条带(图6C)，提示本方法培养的神经干细胞可满足发育相关实验打靶需求。总之，此配方建立的胎猴神经干细胞球可成为规模数量的细胞源，并增加其应用性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种胎猴神经干细胞传代培养基，其特征在于：是由基底培养基DMEM/F12、1％L-谷氨酰胺、2％B27无血清添加剂、5-20ng/mL bFGF、5-20ng/ml EGF、5-10μg/mL肝素、0.2mMNEAA、1.5μg/mL CHIR99021、10ng/mL hLIF、0.1mM维C和0.5×抗生素组成；
所述的B27无血清添加剂不含维生素A。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述的抗生素为青霉素和链霉素。
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