CN118028229A - 一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法 - Google Patents
一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118028229A CN118028229A CN202410431874.6A CN202410431874A CN118028229A CN 118028229 A CN118028229 A CN 118028229A CN 202410431874 A CN202410431874 A CN 202410431874A CN 118028229 A CN118028229 A CN 118028229A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture medium
- stem cells
- mesenchymal stem
- cells
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 88
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 title claims abstract description 54
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 title claims abstract description 31
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 117
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 105
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims abstract description 77
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 24
- PIPZGJSEDRMUAW-VJDCAHTMSA-N hydron;methyl (1s,15r,18s,19r,20s)-18-hydroxy-1,3,11,12,14,15,16,17,18,19,20,21-dodecahydroyohimban-19-carboxylate;chloride Chemical compound Cl.C1=CC=C2C(CCN3C[C@@H]4CC[C@H](O)[C@@H]([C@H]4C[C@H]33)C(=O)OC)=C3NC2=C1 PIPZGJSEDRMUAW-VJDCAHTMSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 229940090523 yocon Drugs 0.000 claims abstract description 22
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 51
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 44
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 44
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- XQQUSYWGKLRJRA-RABCQHRBSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-methylbutanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XQQUSYWGKLRJRA-RABCQHRBSA-N 0.000 claims description 17
- 108010088381 isoleucyl-lysyl-valyl-alanyl-valine Proteins 0.000 claims description 17
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 16
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 12
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229960002648 alanylglutamine Drugs 0.000 claims description 10
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 claims description 10
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 claims description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 108010038862 laminin 10 Proteins 0.000 claims description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 claims description 7
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 claims description 6
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 6
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 claims description 5
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 5
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 claims description 5
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 claims description 5
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 claims description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 8
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 30
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 14
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 12
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 10
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 108020004201 indoleamine 2,3-dioxygenase Proteins 0.000 description 8
- 102000006639 indoleamine 2,3-dioxygenase Human genes 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 8
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 7
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 230000009274 differential gene expression Effects 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 7
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 7
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 7
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 5
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 4
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 4
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 4
- 230000009815 adipogenic differentiation Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000009816 chondrogenic differentiation Effects 0.000 description 4
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 3
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 3
- 102000014172 Transforming Growth Factor-beta Type I Receptor Human genes 0.000 description 3
- 108010011702 Transforming Growth Factor-beta Type I Receptor Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102100034134 Activin receptor type-1B Human genes 0.000 description 2
- 102100034135 Activin receptor type-1C Human genes 0.000 description 2
- 102100030091 Dickkopf-related protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 description 2
- 102000002254 Glycogen Synthase Kinase 3 Human genes 0.000 description 2
- 101000799189 Homo sapiens Activin receptor type-1B Proteins 0.000 description 2
- 101000799193 Homo sapiens Activin receptor type-1C Proteins 0.000 description 2
- 101000864647 Homo sapiens Dickkopf-related protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101001096065 Homo sapiens Plexin domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 102100025751 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710143123 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 2
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 2
- 102100037891 Plexin domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101800000618 Protein kinase C delta type catalytic subunit Proteins 0.000 description 2
- 102100021004 Protein sidekick-1 Human genes 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N dorsomorphin Chemical compound C=1C=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C=CN=CC=2)C=CC=1OCCN1CCCCC1 XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 2
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 2
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- QNDVLZJODHBUFM-WFXQOWMNSA-N okadaic acid Chemical compound C([C@H](O1)[C@H](C)/C=C/[C@H]2CC[C@@]3(CC[C@H]4O[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]4O3)=C)[C@@H](O)C[C@H](C)[C@@H]3[C@@H](CC[C@@]4(OCCCC4)O3)C)O2)C(C)=C[C@]21O[C@H](C[C@@](C)(O)C(O)=O)CC[C@H]2O QNDVLZJODHBUFM-WFXQOWMNSA-N 0.000 description 2
- VEFJHAYOIAAXEU-UHFFFAOYSA-N okadaic acid Natural products CC(CC(O)C1OC2CCC3(CCC(O3)C=CC(C)C4CC(=CC5(OC(CC(C)(O)C(=O)O)CCC5O)O4)C)OC2C(O)C1C)C6OC7(CCCCO7)CCC6C VEFJHAYOIAAXEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 2
- 230000007839 spinal cord development Effects 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- BKZOUCVNTCLNFF-IGXZVFLKSA-N (2s)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-2-hydroxy-6-[(1s)-1-[(2s,5r,7s,8r,9s)-2-[(2r,5s)-5-[(2r,3s,4r,5r)-5-[(2s,3s,4s,5r,6s)-6-hydroxy-4-methoxy-3,5,6-trimethyloxan-2-yl]-4-methoxy-3-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-7-methoxy-2,8-dimethyl-1,10-dioxaspiro[4.5]dec Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]2O[C@H]([C@@H](C)[C@H]2OC)[C@@]2(C)O[C@H](CC2)[C@@]2(C)O[C@]3(O[C@@H]([C@H](C)[C@@H](OC)C3)[C@@H](C)[C@@H]3[C@@H]([C@H](OC)[C@@H](C)[C@](O)([C@H](C)C(O)=O)O3)C)CC2)[C@](C)(O)[C@H](C)[C@@H](OC)[C@@H]1C BKZOUCVNTCLNFF-IGXZVFLKSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- ROFMCPHQNWGXGE-SFHVURJKSA-N (3s)-n-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]-4-(1h-pyrazol-4-yl)phenyl]-6-methoxy-3,4-dihydro-2h-chromene-3-carboxamide Chemical compound O=C([C@@H]1COC2=CC=C(C=C2C1)OC)NC(C(=C1)OCCN(C)C)=CC=C1C=1C=NNC=1 ROFMCPHQNWGXGE-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- 102100034111 Activin receptor type-1 Human genes 0.000 description 1
- 101000889335 Bombyx mori Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102100025423 Bone morphogenetic protein receptor type-1A Human genes 0.000 description 1
- 102100027052 Bone morphogenetic protein receptor type-1B Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102100024829 DNA polymerase delta catalytic subunit Human genes 0.000 description 1
- 101000876610 Dictyostelium discoideum Extracellular signal-regulated kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 description 1
- 102100022975 Glycogen synthase kinase-3 alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100038104 Glycogen synthase kinase-3 beta Human genes 0.000 description 1
- 101000799140 Homo sapiens Activin receptor type-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000934638 Homo sapiens Bone morphogenetic protein receptor type-1A Proteins 0.000 description 1
- 101000984546 Homo sapiens Bone morphogenetic protein receptor type-1B Proteins 0.000 description 1
- 101000868333 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000909198 Homo sapiens DNA polymerase delta catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- 101001052493 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- BKZOUCVNTCLNFF-UHFFFAOYSA-N Lonomycin Natural products COC1C(C)C(C2(C)OC(CC2)C2(C)OC3(OC(C(C)C(OC)C3)C(C)C3C(C(OC)C(C)C(O)(C(C)C(O)=O)O3)C)CC2)OC1C1OC(C)(O)C(C)C(OC)C1C BKZOUCVNTCLNFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100025744 Mothers against decapentaplegic homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102100039313 Rho-associated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710088411 Rho-associated protein kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101700032040 SMAD1 Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000012592 cell culture supplement Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 108010049611 glycogen synthase kinase 3 alpha Proteins 0.000 description 1
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000006951 hyperphosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003585 interneuronal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000409 membrane extraction Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000030363 nerve development Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N protoneodioscin Natural products O(C[C@@H](CC[C@]1(O)[C@H](C)[C@@H]2[C@]3(C)[C@H]([C@H]4[C@@H]([C@]5(C)C(=CC4)C[C@@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@H](CO)O4)CC5)CC3)C[C@@H]2O1)C)[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N 0.000 description 1
- GPTFURBXHJWNHR-UHFFFAOYSA-N protopine Chemical compound C1=C2C(=O)CC3=CC=C4OCOC4=C3CN(C)CCC2=CC2=C1OCO2 GPTFURBXHJWNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 230000019800 sensory organ development Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- -1 small molecule compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
- C12N2500/33—Amino acids other than alpha-amino carboxylic acids, e.g. beta-amino acids, taurine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及干细胞技术领域,具体涉及一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法。使用培养基A、培养基B培养iPSCs形成的细胞球分化获得神经球;使用水凝胶包裹神经球,然后使用培养基B对包裹后的神经球进行培养;将神经球从水凝胶中剥离,使用培养基C对神经球继续培养,获得神经类器官;消化神经类器官获得细胞,使用ncMission培养基结合VTN包被对细胞进行原代培养;当细胞代次达到P2/P3代时,再换用Yocon培养基进行继代培养获得标准的诱导间充质干细胞。本技术方案可以解决在无动物源性成分的条件下如何有效地将诱导多能干细胞分化形成诱导间充质干细胞的技术问题,具有理想的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域,具体涉及一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源广泛,具有分化为三胚层谱系细胞的能力,也具有免疫调节和组织修复的作用,在再生医学和细胞治疗领域应用广泛。MSCs可从人体多个组织类型中提取,但提取过程往往会对供体造成一定程度的损伤,且细胞性能受不同供体以及年龄等因素严重影响。同时也存在细胞数量有限、体外扩增能力有限、易衰老、细胞异质性、伦理限制等缺陷,严重制约了MSCs相关药品的开发。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)为解决上述成体MSCs在临床应用中的限制提供了新的思路。许多研究者致力于在体外将人iPSCs诱导分化为MSCs,不仅表现出与组织来源MSCs相似的生物学特点与功能,而且还具有均一性更好、没有数量限制、体外增殖能力强、免疫原性更低等优点。
现有iPSCs分化为诱导间充质干细胞(induced mesenchymal stem cells,iMSCs)的方法大多采用自分化途径并使用含血清的诱导培养基,存在非定向诱导、分化效率低、成分不明确、纯度不高等问题。前期研究发现,相比其他分化途径,iPSCs通过脑类器官分化获得的nMSCs还具有独特的神经修复功能,但在分化过程中脑类器官3阶段培养基引入了matrigel。Matrigel来自于小鼠肉瘤基底膜抽提,动物源性成分的存在极大地增加了nMSCs生物安全风险。因此,如何在无动物源性以及其他成分明确的条件下,通过定向诱导分化而高效地获取均一、性能稳定、安全性好的iMSCs是亟待解决的科学问题。
发明内容
本发明意在提供一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法,以解决在无动物源性成分的条件下如何有效地将诱导多能干细胞诱导分化形成诱导间充质干细胞的技术问题。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法,包括以下依次进行的步骤:
S1:使用含有Y-27632的iPSC培养基培养诱导多能干细胞,获得细胞球;
S2:先使用培养基A培养细胞球,然后将一半的培养基置换为培养基B继续培养,再将一半的培养基置换为培养基B继续培养,获得神经球;
S3:使用水凝胶包裹神经球,然后使用培养基B对包裹后的神经球进行培养;水凝胶的原料为体积比3:2的VitroGel ORGANOID-3和培养基B;或者为体积比3:2的VitroGelIKVAV和培养基B;或者为体积比3:6:7:4的IV型胶原、层粘连蛋白511、Biozellen A和培养基B;
S4:将神经球从水凝胶中剥离,使用培养基C对神经球继续培养,获得神经类器官;
S5:消化神经类器官获得贴壁细胞,使用ncMission培养基结合VTN包被对细胞进行原代培养;当细胞代次达到P2代或者P3代时,再换用Yocon间充质干细胞无血清培养基进行连续培养至细胞表面标志物检测合格,获得诱导间充质干细胞。
进一步,培养基A包括基础培养基和添加成分;基础培养基为DMEM/F12;
添加成分包括:0.5-1.5%的非必需氨基酸、0.5-1.5%的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、75-125μM的β-巯基乙醇、15-25%的KnockOut血清替代物、0.5-1.5μM的Dorsomorphin、0.5-1.5μM的A83-01。
进一步,培养基B包括基础培养基和添加成分;基础培养基为DMEM/F12;
添加成分包括:0.5-1.5%的非必需氨基酸、0.5-1.5%的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、75-125μM的β-巯基乙醇、0.5-1.5%的N2添加剂、0.5-1.5μM的SB-431542、0.5-1.5μM的CHIR-99021。
进一步,培养基C包括基础培养基和添加成分;基础培养基为DMEM/F12;
添加成分包括:0.5-1.5%的非必需氨基酸、0.5-1.5%的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、5-125μM的β-巯基乙醇、0.5-1.5%的N2添加剂、1.5-2.5%的不含维生素A的B27添加剂、2-3μg/mL的胰岛素。
进一步,S1和S5进行静置培养;S2、S3和S4进行摇动培养,转速为60-80 rpm。
进一步,在S5中,消化神经类器官获得细胞,然后在VTN包被的培养瓶中使用ncMission培养基对细胞进行培养,获得P0代诱导间充质干细胞;P0代诱导间充质干细胞在VTN包被的培养瓶中使用ncMission培养基对细胞进行培养,获得P1代诱导间充质干细胞;使用ncMission培养基培养P1代诱导间充质干细胞,获得P2代诱导间充质干细胞;诱导间充质干细胞继续传代使用Yocon间充质干细胞无血清培养基进行培养。
本技术方案还提供了一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法获得的诱导间充质干细胞。
本技术方案还提供了诱导间充质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病(如I型糖尿病)或者神经退行性疾病(如阿尔茨海默病)的药物中的应用。
本技术方案还提供了水凝胶在制备诱导间充质干细胞中的应用,所述水凝胶用于包裹由iPSCs细胞形成的神经球;水凝胶的原料由体积比3:2的VitroGel ORGANOID-3和培养基B组成;或者由体积比3:2的VitroGel IKVAV和培养基B组成;或者由体积比3:6:7:4的IV型胶原、层粘连蛋白511、Biozellen A和培养基B组成。
本技术方案还提供了一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的诱导方法获得的真皮乳头细胞在制备促进毛发生长的产品中的应用。
进一步,使用含有Y-27632的iPSC培养基培养诱导多能干细胞,获得细胞球;依次使用培养基A、培养基B培养细胞球,获得神经球;使用水凝胶包裹神经球,然后使用培养基B对包裹后的神经球进行培养;将神经球从水凝胶中剥离,使用培养基C对神经球继续培养,获得神经类器官;消化神经类器官获得贴壁细胞,使用ncMission培养基结合VTN包被对细胞进行原代培养,当细胞代次达到P2或者P3代时再换用Yocon间充质干细胞无血清培养基进行继代培养至细胞表面标志物检测合格。
综上所述,本技术方案的原理在于:
本发明源于前期研究发现神经类器官里存在一群具有独特神经修复功能的间充质干细胞(MSCs),通过再次优化培养条件,如采用100%无动物源性成分的商品化水凝胶、自配水凝胶等进行matrigel替代,成功制备得到无动物源性成分、生物安全性更好、功能更强的iMSCs。本发明一轮分化即可得到数量众多、大小均一的神经类器官,经贴壁培养能够获得梭形或纺锤形的iMSCs细胞,产量更大,经鉴定完全符合2006年国际细胞治疗协会(International Society for Cellular Therapy,ISCT)MSCs鉴定标准,且转录组测序结果还揭示其具有高水平的神经相关基因表达。
本方案获得的iMSCs相比于发明人在先专利CN113025569B的nMSCs(神经来源的间充质干细胞,采用matrigel包裹细胞球制备),不仅能有效去除matrigel等动物源性成分带来的终产品生物安全风险,iMSCs还比原包胶方案的nMSCs具有更强的免疫调控和神经修复能力,该结果在测序结果中也得到印证,iMSCs在基因层面表现出更强的促突触结构组装能力以及细胞外基质合成与组装等细胞增殖活力。
本方案获得的iMSCs相比于发明人在先的申请号为2024102036976(脑类器官获得间充质干细胞分化方法和应用)的专利获得的nMSCs(神经来源的间充质干细胞),在免疫调控能力和神经修复能力方面,具有相似的作用效果。并且,本方案采用了包胶分化方案,更加真实模拟体内神经发育环境,分化时间相对更短,诱导形成神经类器官仅需25天,专利(2024102036976)虽然不包含包胶过程所以操作简便,但分化形成脑类器官需要36天。
本方案的有益效果在于:
(1)由于针对组织来源的MSCs存在异质性与体外扩增受限导致数量、质量和性能不稳定,本发明使用的iPSCs可以无限扩增,通过构建细胞库等策略能够保证源头细胞的均一性,从而大幅度提高了iMSCs批次间均一性和稳定性,并且质量可控。
(2)iPSCs体外诱导分化形成的神经类器官接近体内自然发育状态,从类器官中分离培养出一群可能具有治疗价值的iMSCs,整体制备流程不受来源和伦理等因素影响。
(3)针对Biozellen A和自配水凝胶可能因缺乏matrigel特殊成分如TGF-β、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、组织纤溶酶原及其他生长因子等信号刺激,存在低代次iMSCs表面标志物CD19或CD34未达到ISCT标准的情况,可通过ncMission原代培养后切换至间充质干细胞无血清培养基(友康生物Yocon)进行连续培养纯化至合格水平。
(4)本发明在前期研究的基础上还创意性地用VTN替换明胶包被细胞培养瓶,大幅提高了低代次iMSCs的形态和增殖速度,从而提高了iMSCs的筛选和扩增效率。
(5)本发明制备的iMSCs在抑制T细胞增殖、T细胞炎症因子释放、IFN-γ刺激后免疫调节基因表达等功能上也表现出相比之前nMSCs更好的趋势,并能高效促进损伤的HT-22等神经元细胞重新连接。另外,经转录组测序发现,iMSCs相比nMSCs还高表达SDK1(突触连接)、DKK2(胚胎发育与骨形成)、MX1(抗病毒反应)、PLXDC1(血管生成与脊髓发育)等相关基因,提示iMSCs在基因层面表现出更强的促突触结构组装能力以及细胞外基质合成与组装等细胞增殖活力。
附图说明
图1为实施例1的从iPSC经神经类器官诱导培养获得iMSCs的制备流程图。
图2为实施例1的细胞球到神经球的形态变化的显微图片。
图3为实施例1的采用不同水凝胶的传代培养过程中iMSCs的形态变化。
图4为实施例1的以VitroGel IKVAV包裹制备的iMSCs流式检测结果。
图5为实施例1的以自配水凝胶包裹制备的iMSCs流式检测结果。
图6为实施例1的iMSCs分化能力检测结果。
图7为实验例1的水凝胶筛选结果(组1-3)。
图8为实验例1的水凝胶筛选结果(组4-6)。
图9为实验例2的玻连蛋白和明胶对于iMSCs的形态均一性和增殖速度的影响的对比试验结果图(A:显微图像;B:增殖速度统计图)。
图10为实验例3的iMSCs对T细胞增殖抑制效果的实验结果图。
图11为实验例4的iMSCs对T细胞分泌炎症因子抑制效果的实验结果图。
图12为实验例5的iMSCs诱导IDO和HLA-G分泌效果的实验结果图(A:IDO;B:HLA-G)。
图13为实验例6的iMSCs和ucMSCs差异基因表达火山图。
图14为实验例6的iMSCs和ucMSCs差异表达基因热图.
图15为实验例6的iMSCs和ucMSCs差异表达基因的GO富集条形图。
图16为实验例6的iMSCs和nMSCs差异基因表达火山图。
图17为实验例6的iMSCs和nMSCs差异表达基因热图。
图18为实验例6的iMSCs和nMSCs差异表达基因的GO富集条形图。
图19为实验例7的iMSCs促进神经元细胞间形成连接的效果的实验结果图。
图20为实施例7的WB实验结果图像。
图21为对比例1的实验5的流式细胞术检测结果图。
图22为对比例1的实验2的流式细胞术检测结果图。
图23为对比例2的使用不同培养基进行传代培养的细胞显微图像。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明,但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明,下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,且所用的材料、试剂等,均可从商业途径得到。
实施例1:
(1)诱导iPSCs形成细胞球(D0:初始4000个/孔,96孔板静置培养1天)
第0天:检查iPSCs状态,满足95%的细胞为未分化状态,使用Accutase于37℃消化10min,将iPSCs细胞消化吹打为单细胞。300g离心3min后取适量hiPSC培养基mTeSR Plus(商家:Stemcell,mTeSR™,货号:100-0276)添加10-20μM(具体实验过程采用10 μM)Y-27632重悬细胞,按4000个/孔的细胞量接种至U底超低吸附96孔板,300g离心5min,于37℃,5%CO2细胞培养箱中静置培养16-24h(具体实验过程的培养时间控制在16h左右)。
其中,iPSCs可以采用STEMCELL公司货号05924的Erythroid ProgenitorReprogramming Kit(红系祖细胞重编程试剂盒)的试剂诱导多能干细胞。使用该试剂盒按照说明书操作要求,对采用现有技术常规手段获取的红系祖细胞进行诱导,获得稳定的红系祖细胞来源的人源的诱导多能干细胞。上述iPSCs的获取方法也记载在了申请人的在先专利CN113025569B中,是一种现有技术的常规方式。Y27632是一种ATP竞争性的ROCK-I和ROCK-II抑制剂,CAS号为146986-50-7。
(2)第一阶段培养(D1-D7:初始200-300μm细胞球,6孔板60rpm摇动培养7天)
第1天:16-24h后,观察形成的细胞球形状是否为边界清晰的圆形,且大小为200-300μm最佳,通过自然沉降法和倾斜法去掉散落的细胞和不合格的细胞球。巴氏吸管将细胞球转移至六孔板中培养,向每孔中加入4 mL第一阶段培养基(培养基A),在显微镜下拍照记录。然后放入摇床60rpm摇动培养。
第3天:将培养孔中的培养基全部更换为新鲜的培养基A。
第5天:将培养孔中的培养基的一半替换为培养基B。
第6天:将培养孔中的培养基的一半替换为培养基B。
第5-6天半换培养基B相比第5天全换培养基B提高了分化过程中细胞球的适应性,确保更多的球内深处细胞在双Smad抑制剂(A83-01和Dorsomorphin)条件下进入神经外胚层分化命运,同时避免了培养环境的剧烈变化导致分化过程中不稳定的细胞球细胞不适应产生脱落。
第7天:观察神经球生长情况,拍照记录,在培养结束时可以获得400-500μm的神经球。
其中,培养基A的组成包括基础培养基和添加成分。基础培养基为DMEM/F12;添加成分包括:0.5-1.5%的NEAA(非必需氨基酸溶液,为现有技术常规细胞培养添加物,为现成产品,商家:Gibco,CAS号:11140050)、0.5-1.5%的GlutaMAX(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺,商家:Gibco,CAS号:10565018)、75-125μM的2-Mercaptoethanol(β-巯基乙醇,商家:Sigma,CAS号:M7522)、15-25%的KnockOut血清替代物(Knockout™ SR,商家:Gibco,CAS号:10828010)、0.5-1.5μM的Dorsomorphin(Compound C或BML-275,商家:Stemcell,CAS号:72102)、0.5-1.5μM的A83-01(商家:Tocris,CAS号:2939)。在具体的实验操作中,培养基A的添加成分包括:1%的NEAA、1%的GlutaMAX、100μM的2-Mercaptoethanol、20%的KnockOut血清替代物、1μM的Dorsomorphin、1μM的A83-01。A83-01和Dorsomorphin均为小分子化合物。A83-01可有效阻断TGF-β Ⅰ型受体ALK5、ALK4和ALK7,抑制Smad2/3磷酸化。而Dorsomorphin可靶向阻断TGF-β Ⅰ型受体ALK2、ALK3和ALK6,抑制Smad1/5/8磷酸化。
培养基B的组成包括基础培养基和添加成分。基础培养基为DMEM/F12;添加成分包括:0.5-1.5%的NEAA、0.5-1.5%的GlutaMAX、75-125μM的2-Mercaptoethanol、0.5-1.5%的N2添加剂(为现有技术常规细胞培养添加物,为现成产品,商家:Gibco,CAS号:17502048)、0.5-1.5μM SB-431542(商家:MedChemExpress,CAS号:HY-10431)、0.5-1.5μMCHIR-99021(GSK-3α/β抑制剂,商家:Tocris,CAS号:TB4423-GMP)。在具体的实验操作中,培养基B的添加成分包括:1%的NEAA、1%的GlutaMAX、100μM的2-Mercaptoethanol、1%的N2、1μM SB-43154、1μM CHIR-99021。CHIR-99021是一种选择性GSK-3α/β抑制剂,对GSK-3的选择性比CDC2、ERK2和其他蛋白激酶高500倍以上,主要用于激活WNT信号通路。SB-431542是一种高效的小分子抑制剂,选择性抑制TGF-β I型受体ALK5、ALK4和ALK7,通过特异性阻断ALK/SMAD信号通路而抑制Smad2/3磷酸化。
(3)第二阶段培养(D8-D15:初始400-500μm神经球,6孔板70rpm摇动培养7天)
第8天:配制水凝胶预混液,使用水凝胶预混液对神经球进行包被。水凝胶预混液可由如下方式配制:
商品化水凝胶VitroGel ORGANOID-3(多糖水凝胶,商家:The Well Bioscience;货号:VHM04-3)与培养基B以3:2的体积比配制;或者,商品化水凝胶VitroGel IKVAV(多糖水凝胶,商家:The Well Bioscience;货号:TWG007)与培养基B以3:2的体积比配制;或者,Collagen IV(IV型胶原,商家:Sigma;货号:C5533)、Laminin 511(层粘连蛋白511,商家:Shownin;货号:RP01025)、Biozellen A(植物源水凝胶,商家:Biozellen;货号:B-P-00002)与培养基B以3:6:7:4的比例配制(简称自配水凝胶)。上述水凝胶预混液中不含有Matrigel,即不含有来自于小鼠肉瘤基底膜抽提物,可以通过上述水凝胶培养得到无动物源性成分、生物安全性更好、功能更强的iMSCs。但是,自配水凝胶预混液缺乏matrigel,matrigel中含有的特殊成分如TGF-β、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、组织纤溶酶原及其他生长因子等信号刺激。因此,本方案的自配水凝胶预混液会存在低代次iMSCs表面标志物CD19或CD34未达到ISCT标准的情况。该问题可通过后续的传代培养方式克服。
上述预混液轻轻混匀后,使用剪去枪尖的200μL枪头向洁净六孔板每孔中不同位置分别加入80 μL形成含神经球5-10个的水凝胶集落。10μL枪头分离集落中不同的神经球后置于培养箱37℃,5%CO2静置培养30 min待水凝胶凝固。轻轻加入4mL培养基B,用细胞铲将水凝胶包裹的神经球集落铲起,放入摇床70rpm摇动培养。
第9天-第15天:放入摇床70rpm摇动培养,每两天换液培养基B。观察神经球生长情况,拍照记录。
VitroGel ORGANOID-3或VitroGel-IKVAV或自配水凝胶在分化过程中主要表现在神经球分化第16天出现不同的形态特征,可能源于三种水凝胶形成的包裹压力和透过孔径不同,在适当的培养参数选用以及后续传代方式采用的情况下,最终都能获得标准且合格的iMSCs。
现有神经类器官及脑类器官分化技术均源自文献“Madeline A Lancaster.Nature. 2013. Doi:10.1038/nature12517”,基本采用matrigel包裹神经球的方法。本方案采用的商品化水凝胶VitroGel ORGANOID-3和VitroGel IKVAV为多糖水凝胶,模拟天然ECM结构和组成。而本方案采用的Biozellen A则为植物源水凝胶,来源不同。
除了本方案的三种水凝胶外,发明人还尝试过VitroGel ORGANOID-1/2,会导致获得的细胞的CD90和/或CD105不合格,未获得合格的iMSCs细胞。在自配水凝胶中,还尝试过其他的比例,如在原本体积比3:6:7:4的IV型胶原、层粘连蛋白511、Biozellen A和培养基B体系中,增加培养基B的比例,以期降低球体压力,促进细胞增殖,但发现增加培养基B的比例会导致凝固效果不好,凝胶易碎无法包裹神经球,或包裹后无法经受流体剪切力而破裂。
(4)第三阶段培养(D16-D25:初始600-700μm神经球,6孔板80rpm摇动培养10天)
第16天:巴氏吸管轻柔吹打包裹在水凝胶中的神经球,或用针头剥离,使其成为单个不相互粘连且无水凝胶包裹的神经球,吸弃上清并用DPBS清洗三次。转移至新的六孔板,向每孔中加入4mL培养基C,放入摇床80rpm摇动培养。
第17天-第25天:每两天换液培养基C。观察神经球生长情况,拍照记录。通过该步骤培养获得的神经球即为神经类器官。
其中,培养基C的组成包括基础培养基和添加成分。基础培养基为DMEM/F12;添加成分包括:0.5-1.5%的NEAA、0.5-1.5%的GlutaMAX、75-125μM的2-Mercaptoethanol、0.5-1.5%的N2添加剂、1.5-2.5%的B27添加剂(不含维生素A,细胞培养添加剂,为现有技术常规细胞培养添加物,为现成产品,商家:Gibco,货号:12587-010)、2-3μg/mL的Insulin(胰岛素,商家:MedChemExpress,货号:HY-P0035)。在具体的实验操作中,培养基C的添加成分包括:1%的NEAA、1%的GlutaMAX、100μM的2-Mercaptoethanol、1%的N2添加剂、2%的B27添加剂(不含维A)、2.5μg/mL的胰岛素。B27(不含维生素A)是一种无血清添加剂,包含抗氧化剂、神经细胞所需生长因子、维生素(不含维生素A)和神经元所需的脂肪酸等,以最优比例配比,可应用于大多数神经细胞培养。无维生素A可抑制MSCs细胞向神经细胞分化,促进MSCs细胞体外增殖。胰岛素是一种蛋白质激素,促进细胞增殖和生长。
(5)消化为单细胞贴壁培养(P0-P4,T25/75瓶,ncMission原代与低代次培养再换用Yocon间充质干细胞无血清培养基连续培养)
P0代:吸弃培养基,DPBS清洗三次后每孔加入2mL Accutase(商家:YEASEN,货号:40506ES60)37℃消化神经球30min。加入2mL ncMission hMSC培养基(商家:Shownin,货号:RP02010)终止消化。轻柔吹打使神经球成为单个细胞并混匀,取10μL计数,然后以1×105个/cm2的细胞密度接种至预先用1μg/cm2的VTN(玻连蛋白,商家:Shownin,货号:RP01002)包被的T25培养瓶,添加4-5mL ncMission hMSC培养基培养3-4天,细胞代次记为:iMSCs-P0。
P1代:待细胞融合度达到90%,吸弃培养基,DPBS清洗三次后加入2 mL TrypleTMExpress酶(商家:Gibco,货号:12604021)于37℃消化细胞2-3min,加入2mL ncMissionhMSC培养基终止消化,300g离心3 min。重悬后计数,以8×103个/cm2的细胞密度接种至VTN(1 μg/cm2)包被的T75培养瓶,添加12-14 mL ncMission hMSC培养基培养3-4天,细胞代次记为:iMSCs-P1。
P2代:消化和离心操作同iMSCs-P1,以8×103个/cm2的细胞密度接种至T75培养瓶(不再包被VTN),添加12-14 mL ncMission hMSC培养基培养3-4天,细胞代次记为:iMSCs-P2。
P3代:消化和离心操作同iMSCs-P2,加入2mL间充质干细胞无血清培养基(商家:Yocon,货号:NC0106)终止消化,以8×103个/cm2的密度接种至T175(不再包被VTN),添加22-26 mL 间充质干细胞无血清培养基培养3-4天,细胞代次记为:iMSCs-P3。
P4代以及后续次代:Yocon间充质干细胞无血清培养基进行后续连续培养确保iMSCs所有细胞表面标志物均符合2006年ISCT的MSCs鉴定标准且细胞群体均一。密切观察细胞生长状态,以细胞融合度不超过95%进行传代,防止密集生长。收集细胞进行iMSCs相关表面标志物和多向分化潜能鉴定。
使用ncMission培养基(首宁生物Shownin)结合VTN包被进行原代培养,当细胞代次达到P2/3时再换用间充质干细胞无血清培养基(友康生物Yocon)进行继代培养至细胞表面标志物检测合格。
综上,制备流程示意图可参见图1。培养第1天和第8天时细胞球到神经球的形态变化显微图像参见图2。使用不同的水凝胶预混液包被神经球后,培养至第16天和第25天的神经球的显微图像也参见图2。使用不同的水凝胶预混液包被神经球后,传代过程中iMSCs细胞的显微图像参见图3。分化第1天形成的iPSC细胞球形态、大小均一,且批次间高度稳定,在培养基A和培养基B的诱导条件下第8天球体直径明显增大,部分球体还可见突出的“神经上皮芽”结构,提示已进入神经诱导阶段。在VitroGel ORGANOID-3或VitroGel IKVAV或自配水凝胶包裹和培养基B的诱导条件下完成神经分化阶段。三种水凝胶在分化过程中主要表现在第16天(神经分化)和第25天(神经成熟)出现不同的神经球形态特征,可能源于三种水凝胶形成的包裹压力和透过孔径不同,VitroGel IKVAV形成的神经球直径最大,浅色“脑回”样神经组织结构相对更多。VitroGel ORGANOID-3形成的神经球直径居中,浅色“脑回”样神经组织结构数量中等。而自配水凝胶形成的神经球直径最小,浅色“脑回”样神经组织结构数量最少。另外,三种水凝胶包裹后获得的iMSCs增殖速度虽无明显差异,但相比在先专利CN113025569B(P3代次获得合格nMSCs),VitroGel IKVAV 及VitroGel ORGANOID-3包裹后获得的iMSCs纯度相对更高,在P2代次即可达到合格水平。自配水凝胶分化获得的iMSCs-P2代次细胞偶见表面标志物CD19或CD34未达到2006年ISCT标准的情况,该问题可通过更换为Yocon间充质干细胞无血清培养基培养纯化解决。
以VitroGel-IKVAV包裹制备的iMSCs流式检测结果参见图4。以自配水凝胶包裹制备的iMSCs流式检测结果参见图5。
检测了获得的iMSCs的三系分化能力,成骨、成脂、成软骨分化试剂盒均购自Oricell,严格按照试剂盒操作步骤进行。检测方法大致为:成骨分化(货号:HUXMX-90021,操作步骤:取2×104个/cm2的 iMSCs接种至1μg/cm2VTN包被的35mm细胞培养皿,于37℃、5%CO2条件下培养至细胞融合度达到70%。吸弃培养基后加入2mL Oricell人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基。每3天更换新鲜的成骨诱导分化培养基,诱导2周后根据细胞形态变化用茜素红进行染色)。成脂分化(货号:HUXMX-90031,操作步骤:取2×104个/cm2的iMSCs接种至1μg/cm2VTN包被的35mm细胞培养皿,于37℃、5%CO2条件下培养至细胞融合度达到100%。吸弃培养基后加入2mL Oricell人骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基A液。诱导3天后更换为成脂诱导分化培养基B液,维持1天后换回A液。以A液3天,B液1天的模式诱导4周后可见明显脂滴再用油红O染色)。成软骨分化(货号:HUXMX-90041,操作步骤:将3×105个细胞转移至15mL离心管,离心后用成软骨诱导分化完全培养基重悬,于37℃、5%CO2条件下培养。每隔3天更换新鲜的成软骨诱导分化完全培养基,持续诱导3周至管内形成直径2mm的软骨球,石蜡包埋切片后阿利辛蓝染色)。三种水凝胶包裹分化获得的iMSCs具有相似的三系分化能力,以VitroGel IKVAV包裹制备的iMSCs(P3代)分化结果参见图6,说明本方案获得的iMSCs具有良好的三系分化潜能。
实验例1:水凝胶的筛选
针对实施例1采用的水凝胶,发明人也进行了大量的筛选尝试,具体如下:
组1(VitroGel ORGANOID-3):水凝胶成分和比例参见实施例1的VitroGelORGANOID-3组,iMSCs的制作过程参见实施例1。
组2(VitroGel IKVAV):水凝胶成分和比例参见实施例1的VitroGel-IKVAV组,iMSCs的制作过程参见实施例1。
组3(Biozellen):水凝胶成分为Biozellen A和培养基B以3:2的体积比配制,iMSCs的制作过程参见实施例1。
组4(自配1):水凝胶成分参见实施例1的自配水凝胶组,只是比例发生改变,为Biozellen A:50%、培养基B:20%、Laminin 511:20%、Collagen Ⅳ:10%。iMSCs的制作过程参见实施例1。
组5(自配2):水凝胶成分参见实施例1的自配水凝胶组,只是比例发生改变,为Biozellen A:40%、培养基B: 15%、Laminin 511:30%、Collagen Ⅳ:15%。iMSCs的制作过程参见实施例1。
组6(自配3):水凝胶成分和比例参见实施例1的自配水凝胶组,iMSCs的制作过程参见实施例1。
上述实验组,第25天获得的神经类器官的显微图片,以及iMSCs第3代的显微图片参见图7和图8;iMSCs-P3代的间充质干细胞标志物的阳性率参见表1。
表1:不同水凝胶包裹神经球获得的iMSCs表面标志物的阳性率
其中,组3、组4、组5均未获得合格的iMSCs。结果提示,VitroGel ORGANOID-3、VitroGel IKVAV及自配3是该分化方案的有效matrigel替代水凝胶。
实验例2:
在获得神经类器官后的iMSCs贴壁培养过程中(P0和P1代)特别采用VTN包被培养瓶。本实验例对比了使用VTN包被和使用明胶(Gelatin)包被的效果。明胶包被组的明胶使用浓度采用推荐浓度0.1%(约100μg/cm2),VTN包被组的使用浓度采用推荐浓度1μg/cm2。实验结果参见图9。实验结果显示VTN相比Gelatin更促进iMSCs形态均一性和增殖速度。
实验例3:iMSCs对T细胞增殖抑制效果的研究
第一天按1×105细胞量将ucMSCs(脐带来源的间充质干细胞,为现有技术常规细胞,可通过商业手段购置)、iMSCs(诱导间充质干细胞,实施例1制备获得,VitroGel-IKVAV)、nMSCs(神经来源的间充质干细胞,在先专利CN113025569B方案通过matrigel包裹神经球制备获得,具体详见该专利的实施例1)铺板贴壁培养。第二天采用淋巴细胞分离液分离供者外周血单个核细胞(PBMC),收集PBMC进行CytoTell Blue染色。染色完成后取1×106细胞量的Cyto-PBMC与MSCs进行共培养,同时加入2μg/mL的植物血凝素(PHA)进行刺激,设置未刺激对照组。培养5天后取上清中的悬浮细胞标记Zombie、CD3染色后进行流式细胞术检测。T细胞增殖抑制率=(子代细胞百分比刺激对照组-子代细胞百分比MSC共培养组)/子代细胞百分比刺激对照组×100%。实验结果如图10所示,实验结果说明本方案获得的iMSCs对T细胞增殖的抑制率可达72.03%,而ucMSCs和nMSCs对T细胞增殖抑制率分别为56.35%和66.39%,iMSCs相比之前的nMSCs具有更高的T细胞增殖抑制效果,在免疫调控等自身免疫性疾病治疗领域表现出巨大潜力。
实验例4:iMSCs对T细胞分泌炎症因子抑制效果的研究
第一天按2×105细胞量将ucMSCs(脐带间充质干细胞)、iMSCs(实施例1制备,VitroGel-IKVAV)、nMSCs(matrigel包裹神经球制备)铺板贴壁培养。第二天采用淋巴细胞分离液分离供者外周血单个核细胞(PBMC),每组加入5×106细胞量的PBMC细胞,共培养45h后加入50ng/mL的植物血凝素(PHA)、1μg/mL的离子霉素(Lonomycin)和10μg/mL的布雷非德菌素A(BFA)进行刺激,设置未刺激组。刺激5h后收集上清中悬浮细胞,细胞表面标志物CD3和胞内因子IFN-γ、TNF-α染色后进行流式细胞术检测。细胞因子抑制率 =(该因子阳性率刺激对照组-该因子阳性率MSC共培养组)/ 该因子阳性率刺激对照组×100%。实验结果参见图11和表2。
表2:抑制率统计数据
实验结果显示,相比ucMSCs和nMSCs,iMSCs更加高效抑制T细胞炎症因子释放,提示iMSCs在降低疾病等因素导致的T细胞炎症反应方面的卓越能力。
实验例5:iMSCs诱导IDO和HLA-G分泌效果实验
第一天按2×105细胞量将ucMSC(脐带间充质干细胞)、nMSC(matrigel包裹神经球制备)、iMSCs(实施例1制备获得,VitroGel-IKVAV)、铺板贴壁培养。第二天在培养体系中添加30ng/mL的IFN-γ,于37℃,5%CO2培养箱中培养24h后收集细胞提取RNA,逆转录为cDNA进行荧光定量PCR检测,计算IDO(吲哚胺2,3-双加氧酶)和HLA-G(人类白细胞抗原-G)的相对表达量。结果如图12所示,在IFN-γ刺激下,三种MSC细胞IDO和HLA-G基因均表达上调,但iMSCs具有更高的IDO和HLA-G表达水平,提示iMSCs的免疫调节能力最佳。两种免疫调节因子均在正常组织中表达水平较低,但在一些特殊情况下(如妊娠、炎症、肿瘤等,本实验例中采用炎症因子IFN-γ刺激)表达水平会显著升高。iMSCs表达IDO(色氨酸代谢酶)是一种重要的免疫调节机制,主要在细胞表面表达,通过调节色氨酸代谢途径来抑制T细胞的活化和增殖、抑制树突状细胞(DCs)的成熟和活化、诱导调节性T细胞(Treg)的生成和活化等,从而抑制免疫反应。而iMSCs表达HLA-G是另一种重要的免疫调节机制。HLA-G是一种非经典的人类白细胞抗原(HLA),HLA-G可与免疫细胞表面的抑制性受体结合抑制免疫细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞)的活化和增殖,诱导Treg的生成和活化,调节免疫平衡。
实验例6:差异基因表达研究
收集连续培养至P5的ucMSCs(脐带间充质干细胞)、nMSCs(matrigel包裹神经球制备)与iMSCs(实施例1制备)共同送上海天昊生物科技有限公司进行转录组mRNA测序。iMSCs相比ucMSCs差异基因表达火山图参见图13、差异表达基因热图参见图14、GO富集条形图参见图15。经转录组测序发现,iMSCs相比ucMSCs上调感觉器官发育、突触结构形成与组装、轴突发生、神经元结构形成等促进神经结构再生的相关基因,提示iMSCs可参与调控突触组装与突触间神经信号传递,可用于治疗突触损伤导致的疾病。
表3:iMSCs相比ucMSCs差异基因GO富集条形图注释(针对图15)
iMSCs相比nMSCs差异基因表达火山图参见图16、差异表达基因热图参见图17、GO富集条形图参见图18。测序结果提示,iMSCs相比nMSCs还高表达SDK1(突触连接)、DKK2(胚胎发育与骨形成)、MX1(抗病毒反应)、PLXDC1(血管生成与脊髓发育)等相关基因,提示iMSCs在基因层面表现出更强的促突触结构组装能力以及细胞外基质合成与组装等细胞增殖活力。
表4:iMSCs相比nMSCs差异基因GO富集条形图注释(针对图18)
实验例7:iMSCs促进神经元细胞间形成连接的效果的研究
第一天按1.2×104个/cm2的密度将小鼠海马神经元细胞HT22铺板T25培养瓶贴壁培养。第二天加入60nM的冈田酸(OA)处理诱导细胞发生类似阿尔茨海默病(AD)神经元病理变化。使用Yocon间充质干细胞无血清培养基培养以VitroGel IKVAV配制水凝胶参照实施例1制备的iMSCs 48h后,取培养液上清部分。加入准备好的iMSCs上清治疗6h后镜下观察HT22的形态变化,并收集蛋白Western blotting检测tau蛋白磷酸化水平。结果如图19所示,iMSCs治疗后明显促进OA损伤的神经元之间重新形成连接。治疗组1和治疗组2分别为以VitroGel IKVAV水凝胶参照实施例1制备的两批次iMSCs的重复实验。Tau蛋白是神经元中稳定微管的一类蛋白,主要存在于轴突当中, 在一些神经退行性疾病如AD中,tau蛋白过度磷酸化后从微管上脱落,导致神经元间损伤。如图20所示,iMSCs处理后大幅降低了tau蛋白T181、S396及T231多个位点的磷酸化水平,提示iMSCs可通过抑制tau蛋白磷酸化而抑制AD进展。
对比例1:单细胞贴壁培养阶段的培养基使用方式的筛选
实验1:参照实施例1,使用VitroGel ORGANOID-3包裹神经球,P0-P4代培养全部采用Yocon间充质干细胞无血清培养基,检测P3代时各指标的阳性率。
实验2:参照实施例1,使用VitroGel IKVAV包裹神经球,P0-P4代培养全部采用Yocon间充质干细胞无血清培养基,检测P3代时各指标的阳性率。
实验3:参照实施例1,使用自配水凝胶包裹神经球,P0-P4代培养全部采用Yocon间充质干细胞无血清培养基,检测P3代时各指标的阳性率。
实验4:参照实施例1,使用VitroGel ORGANOID-3包裹神经球,P0-P4代培养全部采用ncMission培养基,检测P3代时各指标的阳性率。
实验5:参照实施例1,使用VitroGel IKVAV包裹神经球,P0-P4代培养全部采用ncMission培养基,检测P3代时各指标的阳性率。
实验6:参照实施例1,使用自配水凝胶包裹神经球,P0-P4代培养全部采用ncMission培养基,检测P3代时各指标的阳性率。
实验结果参见表5、图21和图22。结果发现,ncMission培养基在iMSCs原代细胞培养方面具有独特优势,但连续传代培养容易导致该方案分化出的iMSCs细胞CD90分群,如图21所示。从流式结果来看,细胞可能分化出两群不同的iMSCs细胞。而Yocon间充质干细胞无血清培养基在细胞连续培养时可稳定维持iMSCs细胞表面标志物表达和其他特性,如图22所示,但在细胞原代培养方面不具优势,不能定向诱导iMSCs获得生长优势,导致后续代次细胞可能出现CD105不达标的情况。因此,结合ncMission培养基优化原代iMSCs细胞群体、Yocon间充质干细胞无血清培养基维持iMSCs的稳定特性是最佳的iMSCs培养条件。
表5:间充质干细胞阳性率
对比例2:单细胞贴壁培养阶段的培养基类型的筛选
针对市面上常用的多款MSC培养基进行了筛选实验:ncMission培养基(商家:Shownin,货号:RP02010),StemProTM培养基(商家:Gibco,货号:A1067501),MSC-T4培养基(商家:CSTI,货号:04304P05),Yocon培养基(商家:Yocon,货号:NC0106),GF20培养基(商家:达优,货号:6914112),将iMSCs细胞(实施例1制备获得,VitroGel-IKVAV)分别从P0代次开始连续培养,观察细胞的生长状态,并对部分培养到P3代次的细胞进行了流式检测。细胞形态结果如图23所示。StemProTM培养基在P1代次未见贴壁细胞。MSC-T4培养基P3代细胞生长速度极其缓慢,并呈网状分布,形态和增殖速度明显异常,未获得iMSCs。GF20培养基的细胞增殖速度相比ncMission培养基和Yocon培养基也明显偏慢,形态未呈iMSCs梭形和纺锤形。
P3代流式细胞术检测间充质干细胞标志物的结果参见表6。
表6:P3代次流式细胞术检测实验结果
以上所述的仅是本发明的实施例,方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出,对于本领域的技术人员来说,在不脱离本发明技术方案的前提下,还可以作出若干变形和改进,这些也应该视为本发明的保护范围,这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准,说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (7)
1.一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法,其特征在于:包括以下依次进行的步骤:
S1:使用含有Y-27632的iPSC培养基培养诱导多能干细胞,获得细胞球;
S2:先使用培养基A培养细胞球,然后将一半的培养基置换为培养基B继续培养,再将一半的培养基置换为培养基B继续培养,获得神经球;
S3:使用水凝胶包裹神经球,然后使用培养基B对包裹后的神经球进行培养;水凝胶的原料为体积比3:2的VitroGel ORGANOID-3和培养基B;或者为体积比3:2的VitroGel IKVAV和培养基B;或者为体积比3:6:7:4的IV型胶原、层粘连蛋白511、Biozellen A和培养基B;
S4:将神经球从水凝胶中剥离,使用培养基C对神经球继续培养,获得神经类器官;
S5:消化神经类器官获得贴壁细胞,使用ncMission培养基结合VTN包被对细胞进行原代培养;当细胞代次达到P2代或者P3代时,再换用Yocon间充质干细胞无血清培养基进行连续培养至细胞表面标志物检测合格,获得诱导间充质干细胞;
其中,培养基A包括基础培养基和添加成分;基础培养基为DMEM/F12;
添加成分包括:0.5-1.5%的非必需氨基酸、0.5-1.5%的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、75-125μM的β-巯基乙醇、15-25%的KnockOut血清替代物、0.5-1.5μM的Dorsomorphin、0.5-1.5μM的A83-01;
培养基B包括基础培养基和添加成分;基础培养基为DMEM/F12;
添加成分包括:0.5-1.5%的非必需氨基酸、0.5-1.5%的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、75-125μM的β-巯基乙醇、0.5-1.5%的N2添加剂、0.5-1.5μM的SB-431542、0.5-1.5μM的CHIR-99021;
培养基C包括基础培养基和添加成分;基础培养基为DMEM/F12;
添加成分包括:0.5-1.5%的非必需氨基酸、0.5-1.5%的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、5-125μM的β-巯基乙醇、0.5-1.5%的N2添加剂、1.5-2.5%的不含维生素A的B27添加剂、2-3μg/mL的胰岛素。
2. 根据权利要求1所述的一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法,其特征在于:S1和S5进行静置培养;S2、S3和S4进行摇动培养,转速为60-80 rpm。
3.根据权利要求2所述的一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法,其特征在于:在S5中,消化神经类器官获得细胞,然后在VTN包被的培养瓶中使用ncMission培养基对细胞进行培养,获得P0代诱导间充质干细胞;P0代诱导间充质干细胞在VTN包被的培养瓶中使用ncMission培养基对细胞进行培养,获得P1代诱导间充质干细胞;使用ncMission培养基培养P1代诱导间充质干细胞,获得P2代诱导间充质干细胞;诱导间充质干细胞继续传代使用Yocon间充质干细胞无血清培养基进行培养。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法获得的诱导间充质干细胞。
5.根据权利要求4所述的诱导间充质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病或者神经退行性疾病的药物中的应用。
6. 水凝胶在制备诱导间充质干细胞中的应用,其特征在于:所述水凝胶用于包裹由iPSCs细胞形成的神经球;水凝胶的原料由体积比3:2的VitroGel ORGANOID-3和培养基B组成;或者由体积比3:2的VitroGel IKVAV和培养基B组成;或者由体积比3:6:7:4的IV型胶原、层粘连蛋白511、Biozellen A和培养基B组成;
其中,培养基B包括基础培养基和添加成分;基础培养基为DMEM/F12;
添加成分包括:0.5-1.5%的非必需氨基酸、0.5-1.5%的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、75-125μM的β-巯基乙醇、0.5-1.5%的N2添加剂、0.5-1.5μM的SB-431542、0.5-1.5μM的CHIR-99021。
7.根据权利要求6中所述的水凝胶在制备诱导间充质干细胞中的应用,其特征在于:使用含有Y-27632的iPSC培养基培养诱导多能干细胞,获得细胞球;依次使用培养基A、培养基B培养细胞球,获得神经球;使用水凝胶包裹神经球,然后使用培养基B对包裹后的神经球进行培养;将神经球从水凝胶中剥离,使用培养基C对神经球继续培养,获得神经类器官;消化神经类器官获得贴壁细胞,使用ncMission培养基结合VTN包被对细胞进行原代培养,当细胞代次达到P2或者P3代时再换用Yocon间充质干细胞无血清培养基进行继代培养至细胞表面标志物检测合格;
其中,培养基A包括基础培养基和添加成分;基础培养基为DMEM/F12;
添加成分包括:0.5-1.5%的非必需氨基酸、0.5-1.5%的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、75-125μM的β-巯基乙醇、15-25%的KnockOut血清替代物、0.5-1.5μM的Dorsomorphin、0.5-1.5μM的A83-01;
培养基C包括基础培养基和添加成分;基础培养基为DMEM/F12;
添加成分包括:0.5-1.5%的非必需氨基酸、0.5-1.5%的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、5-125μM的β-巯基乙醇、0.5-1.5%的N2添加剂、1.5-2.5%的不含维生素A的B27添加剂、2-3μg/mL的胰岛素。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410431874.6A CN118028229B (zh) | 2024-04-11 | 2024-04-11 | 一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410431874.6A CN118028229B (zh) | 2024-04-11 | 2024-04-11 | 一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN118028229A true CN118028229A (zh) | 2024-05-14 |
CN118028229B CN118028229B (zh) | 2024-06-21 |
Family
ID=90989785
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202410431874.6A Active CN118028229B (zh) | 2024-04-11 | 2024-04-11 | 一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN118028229B (zh) |
Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20140370600A1 (en) * | 2011-08-31 | 2014-12-18 | Sewon Cellontech Co., Ltd. | Method of preparing mesenchymal stem cell basic culturing medium, making of cellular therapy product with mesenchymal stem cell basic culturing medium, and the differentiated one by using the medium |
CN104419661A (zh) * | 2013-08-28 | 2015-03-18 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 神经干细胞的制备方法 |
CN108350427A (zh) * | 2015-08-28 | 2018-07-31 | 日本乐敦制药株式会社 | Ror1阳性的间充质干细胞及其制备方法、包含ror1阳性的间充质干细胞的药物组合物及其制备方法、以及使用ror1阳性的间充质干细胞的疾病的预防或治疗方法 |
US20180258403A1 (en) * | 2015-09-03 | 2018-09-13 | Ecole Polytechnique Fèdèrale De Lausanne | Three dimensional hydrogels for culturing organoids |
CN109628402A (zh) * | 2019-02-13 | 2019-04-16 | 妙顺(上海)生物科技有限公司 | 一种胃癌肿瘤原代类器官培养方法 |
US20200078493A1 (en) * | 2017-03-09 | 2020-03-12 | Georgia Tech Research Corporation | Synthetic hydrogel carriers for cellular structures, generation of organoids, and treatment of tissue injury |
CN111655269A (zh) * | 2017-12-04 | 2020-09-11 | 杜雷安教育基金会行政处 | 使用球状体的细胞系统以及制造和使用它们的方法 |
CN113025569A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-06-25 | 成都云测医学生物技术有限公司 | 人多能干细胞来源的间充质干细胞及其制备方法和应用 |
CN113046309A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-06-29 | 成都云测医学生物技术有限公司 | 悬浮培养脑类器官的培养基及其应用 |
CN117778313A (zh) * | 2024-02-23 | 2024-03-29 | 成都云测医学生物技术有限公司 | 脑类器官获得间充质干细胞分化方法和应用 |
-
2024
- 2024-04-11 CN CN202410431874.6A patent/CN118028229B/zh active Active
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20140370600A1 (en) * | 2011-08-31 | 2014-12-18 | Sewon Cellontech Co., Ltd. | Method of preparing mesenchymal stem cell basic culturing medium, making of cellular therapy product with mesenchymal stem cell basic culturing medium, and the differentiated one by using the medium |
CN104419661A (zh) * | 2013-08-28 | 2015-03-18 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 神经干细胞的制备方法 |
CN108350427A (zh) * | 2015-08-28 | 2018-07-31 | 日本乐敦制药株式会社 | Ror1阳性的间充质干细胞及其制备方法、包含ror1阳性的间充质干细胞的药物组合物及其制备方法、以及使用ror1阳性的间充质干细胞的疾病的预防或治疗方法 |
US20180258403A1 (en) * | 2015-09-03 | 2018-09-13 | Ecole Polytechnique Fèdèrale De Lausanne | Three dimensional hydrogels for culturing organoids |
US20200078493A1 (en) * | 2017-03-09 | 2020-03-12 | Georgia Tech Research Corporation | Synthetic hydrogel carriers for cellular structures, generation of organoids, and treatment of tissue injury |
CN111655269A (zh) * | 2017-12-04 | 2020-09-11 | 杜雷安教育基金会行政处 | 使用球状体的细胞系统以及制造和使用它们的方法 |
CN109628402A (zh) * | 2019-02-13 | 2019-04-16 | 妙顺(上海)生物科技有限公司 | 一种胃癌肿瘤原代类器官培养方法 |
CN113025569A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-06-25 | 成都云测医学生物技术有限公司 | 人多能干细胞来源的间充质干细胞及其制备方法和应用 |
CN113046309A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-06-29 | 成都云测医学生物技术有限公司 | 悬浮培养脑类器官的培养基及其应用 |
CN117778313A (zh) * | 2024-02-23 | 2024-03-29 | 成都云测医学生物技术有限公司 | 脑类器官获得间充质干细胞分化方法和应用 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
MIGUEL ANTONIO JIMENEZ-ACOSTA等: "Mesenchymal stem cells:new alternatices for nervous system disorders", 《CURR STEM CELL RES THER》, vol. 18, no. 3, 20 August 2022 (2022-08-20), pages 299 - 321 * |
VASILIKI MACHAIRAKI: "Human pluripotent stem cells as in vitro models of neurodegenerative diseases", 《ADV EXP MED BIOL》, vol. 1195, 29 May 2020 (2020-05-29), pages 93 - 94 * |
YA ZHOU等: "Mesenchymal stem/stromal cells from human pluripotent stem cell-derived brain organoid enhance the ex vivo expansion and maintenace of hematopoietic stem/progeitor cells", 《STEM CELL RESEARCH & THERAPY》, vol. 15, no. 1, 5 March 2024 (2024-03-05), pages 68 * |
张秀秀等: "人诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞促进成体造血发生研究", 《中国输血杂志》, vol. 32, no. 02, 25 February 2019 (2019-02-25), pages 117 - 122 * |
谢芳莘: "人脑类器官来源间充质干细胞促进阿尔兹海默症小鼠功能恢复的模型研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊)医药卫生科技辑》, no. 2022, 15 March 2022 (2022-03-15), pages 071 - 20 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN118028229B (zh) | 2024-06-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6824267B2 (ja) | ヒト誘導多能性幹細胞からライディッヒ細胞への分化誘導方法及びその用途 | |
CN112608894A (zh) | 一种间充质干细胞培养基 | |
WO2022110180A1 (en) | Generation of neural progenitor cells from embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells | |
CN111826348A (zh) | 一种人诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞体外高效制备方法和应用 | |
KR101175175B1 (ko) | 인간 줄기세포에서 고활성 줄기세포를 분리하는 방법 및상기 방법에 의해 분리된 고활성 줄기 세포 | |
CN114752565B (zh) | 带有免疫细胞的视网膜类器官及其构建方法 | |
CN115011553A (zh) | 一种躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞的制备方法及用途 | |
CN117778313B (zh) | 脑类器官获得间充质干细胞分化方法和应用 | |
KR101896803B1 (ko) | 인간 만능줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도 생산율을 증가시키는 방법 및 이에 의해 생성된 중간엽 줄기세포 | |
CN106834223B (zh) | 诱导脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法 | |
JP5758061B2 (ja) | 細胞クラスターの生成法 | |
WO2020251348A1 (en) | Production of mesenchymal stem cells with therapeutic potential | |
CN112852709B (zh) | 小鼠肺类器官培养方法 | |
KR101119225B1 (ko) | 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용한 성장인자의 대량생산 방법 | |
CN118028229B (zh) | 一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法 | |
CN115354029A (zh) | 神经类器官的制备方法和神经类器官 | |
KR101910269B1 (ko) | 인간 뇌 조직 유래 신경줄기세포의 고효율 분리 방법 | |
CN105087475A (zh) | 一种细胞培养液及其应用以及诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化的方法 | |
CN115232788A (zh) | 一种定型内胚层细胞来源的间充质干细胞及其分化方法和应用 | |
KR101204894B1 (ko) | 줄기세포의 외배엽성 세포로의 분화 방법 | |
CN110592007B (zh) | 一种间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
CN111925986A (zh) | 一种脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法 | |
CN115927186B (zh) | 一种培养基及其在胎猴神经干细胞分离培养中的应用 | |
CN116836920B (zh) | 一种无血清培养基及其制备间充质干细胞的方法 | |
Zhang Ping et al. | Isolation and biological characterization of muscle-derived stem cells from sheep skeletal muscle. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |