CN114369574A - 一种人神经干细胞的培养方法 - Google Patents

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杨印祥
陈小威
周莹
赵成
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Beijing Yinfeng Dingcheng Biological Engineering Technology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种人神经干细胞的培养方法，包括以下步骤：(1)选取人工流产胚胎组织，剥离脑组织，浸入冻存保护液中迅速冷冻，使脑组织定型；(2)精准分离前脑部位，剥离脑膜，得到纯净的前脑组织；(3)通过机械法分离得到纯净的神经干细胞组织；(4)获得单细胞悬液：分离得到的神经干细胞组织，接种至完全神经干培养基中，培养细胞，获得单细胞悬液；(5)传代培养：培养的第4天换液一次，第8天换液一次，第10～12天传代培养。本发明的方法从流产的胚胎中取材，不存在伦理问题，本发明的方法能够实现精准分离胚胎前脑，实现准确取材，本发明对人神经干细胞系的建立、研究和应用具有重要意义。

Description

一种人神经干细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及一种人神经干细胞的培养方法，属于干细胞技术领域。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。神经干细胞(neural stem cell，NSC)是一类具有多方向分化潜能的干细胞，能够长期自我更新，且在一定条件下可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
以往认为，中枢神经系统的神经元在出生前或出生后不久，就失去再生能力。但近年的一些研究表明，成年哺乳动物的脑组织仍可不断产生新的神经元，成人脑组织中同样存在NSC，主要是在侧脑室下层(SVZ)和海马齿状回两处。神经干细胞在神经发育和修复受损神经组织中发挥重要作用。神经干细胞移植是修复和代替受损脑组织的有效方法，能重建部分环路和功能。此外神经干细胞可作为基因载体，用于颅内肿瘤和其它神经疾病的基因治疗，利用神经干细胞作为基因治疗载体，弥补了病毒载体的一些不足。
目前，神经干细胞的应用中存在以下问题：建立的神经干细胞系绝大多数来源于鼠，而鼠与人之间存在着明显的种属差异；病例数量有限，神经干细胞的来源不足，且无法分离纯净的神经干细胞；取材来源往往是大月份引产的完整胎儿，存在伦理问题；胚胎脑组织块较小且十分脆弱，操作中难以实现准确取材，造成分离得到的神经干细胞中杂细胞较多。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种人神经干细胞的培养方法，本发明的方法从流产的胚胎中取材，不存在伦理问题，本发明的方法能够实现精准分离胚胎前脑，实现准确取材，本发明对人神经干细胞系的建立、研究和应用具有重要意义。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种人神经干细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1)选取完好无破损、无瘀血、脱离母体不超过4小时的人工流产胚胎组织，在无菌条件下剥离脑组织，冲洗残留血液，然后将脑组织浸入冻存保护液中迅速冷冻，使脑组织定型；
(2)精准分离前脑部位，剥离脑膜，得到纯净的前脑组织；
(3)通过机械法分离得到纯净的神经干细胞组织；
(4)获得单细胞悬液：分离得到的神经干细胞组织，以0.8×107～1.2×107/T75培养瓶接种至完全神经干培养基中，培养细胞，获得单细胞悬液；
(5)传代培养：培养的第4天换液一次，第8天换液一次，第10～12天传代，传代时利用酶消化分离法分散细胞，以保证细胞增殖。
进一步地，所述步骤(1)中，选择妊娠9周～10周的胚胎组织，其母体的年龄在20～35周岁，常规术前检查无禁忌症，流产方式为：米非司酮提前两天用药流产。
进一步地，所述步骤(2)中，具体操作如下：采用无菌镊子和解剖刀在显微镜的观察下精确分离前脑，再利用无菌镊子剥离脑膜，得到纯净的前脑组织。
进一步地，所述步骤(3)中，具体操作如下：前脑组织用生理盐水清洗后，利用剪刀将前脑组织剪切为1mm×1mm×1mm的小组织块。
进一步地，所述步骤(4)中，具体操作如下：利用1ml完全神经干培养基，将神经干细胞组织进行重悬，并利用移液枪吹打成无肉眼可见组织块的单细胞，以1×107/T75培养瓶接种于完全神经干培养基中，在湿度100％、温度37℃、5％CO2条件下培养细胞。
进一步地，所述步骤(5)中，每隔4天在显微镜下观察神经干细胞生长情况及直径大小，培养基颜色为橙黄，第4天换液时直径为50～100微米，第8天换液时直径为100～200微米；不可频繁挪动细胞，不可晃动培养箱以保证细胞静止培养，避免神经球结团导致细胞死亡；根据神经球直径大小、边缘毛刺、神经球明亮程度来判断神经干细胞的生长状态。
利用上述培养方法建立的人神经干细胞系。
本发明的人神经干细胞的培养方法，采用全新的原代材料(流产胚胎)取材，不存在伦理问题。本发明的方法首次将组织冻存与组织分离联合使用，对于胎脑组织的精准取材有重大作用。本发明提供了一种方便简洁的分离培养神经干细胞的方法，为广大的临床和科研工作者提供了可供参考的取材体外培养神经干细胞的方案，为治疗疾病如癫痫、脑瘫、脑损伤、脑出血后遗症等带来了福音，对人神经干细胞系的建立、研究和应用具有重要意义。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：培养的神经干细胞的照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1人神经干细胞的分离及培养
步骤如下：
(1)选取完好无破损、无瘀血、脱离母体不超过4小时的人工流产胚胎组织，在无菌条件下剥离脑组织，冲洗残留血液，然后将脑组织浸入冻存保护液中迅速冷冻，使脑组织定型。
所述胚胎组织为妊娠9周～10周的胚胎组织，其母体的年龄在20～35周岁，常规术前检查无禁忌症，流产方式为：米非司酮提前两天用药流产。
(2)采用无菌镊子和解剖刀在显微镜的观察下精确分离前脑，再利用无菌镊子剥离脑膜，得到纯净的前脑组织。
(3)前脑组织用生理盐水清洗后，利用剪刀将前脑组织剪切为1mm×1mm×1mm的小组织块。
(4)获得单细胞悬液：利用1ml完全神经干培养基，将神经干细胞组织进行重悬，并利用移液枪吹打成无肉眼可见组织块的单细胞，以1×107/T75培养瓶接种于完全神经干培养基中，在湿度100％、温度37℃、5％CO2条件下培养细胞。
(5)传代培养：培养的第4天换液一次，第8天换液一次，第10～12天传代，传代时利用酶消化分离法分散细胞，以保证细胞增殖。
每隔4天在显微镜下观察神经干细胞生长情况及直径大小，培养基颜色为橙黄，第4天换液时直径为50～100微米(如图1所示)，第8天换液时直径为100～200微米；不可频繁挪动细胞，不可晃动培养箱以保证细胞静止培养，避免神经球结团导致细胞死亡；根据神经球直径大小、边缘毛刺、神经球明亮程度来判断神经干细胞的生长状态。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种人神经干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选取完好无破损、无瘀血、脱离母体不超过4小时的人工流产胚胎组织，在无菌条件下剥离脑组织，冲洗残留血液，然后将脑组织浸入冻存保护液中迅速冷冻，使脑组织定型；
(2)精准分离前脑部位，剥离脑膜，得到纯净的前脑组织；
(3)通过机械法分离得到纯净的神经干细胞组织；
(4)获得单细胞悬液：分离得到的神经干细胞组织，以0.8×107～1.2×107/T75培养瓶接种至完全神经干培养基中，培养细胞，获得单细胞悬液；
(5)传代培养：培养的第4天换液一次，第8天换液一次，第10～12天传代培养。
2.根据权利要求1所述的人神经干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(1)中，选择妊娠9周～10周的胚胎组织，其母体的年龄在20～35周岁，常规术前检查无禁忌症，流产方式为：米非司酮提前两天用药流产。
3.根据权利要求1所述的人神经干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中，具体操作如下：采用无菌镊子和解剖刀在显微镜的观察下精确分离前脑，再利用无菌镊子剥离脑膜，得到纯净的前脑组织。
4.根据权利要求1所述的人神经干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中，具体操作如下：前脑组织用生理盐水清洗后，利用剪刀将前脑组织剪切为1mm×1mm×1mm的小组织块。
5.根据权利要求1所述的人神经干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(4)中，具体操作如下：利用1ml完全神经干培养基，将神经干细胞组织进行重悬，并利用移液枪吹打成无肉眼可见组织块的单细胞，以1×107/T75培养瓶接种于完全神经干培养基中。
6.根据权利要求1所述的人神经干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(4)中，培养的具体条件为：在湿度100％、温度37℃、5％CO2条件下培养细胞。
7.根据权利要求1所述的人神经干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(5)中，每隔4天在显微镜下观察神经干细胞生长情况及直径大小，培养基颜色为橙黄，第4天换液时直径为50～100微米，第8天换液时直径为100～200微米。
8.根据权利要求1所述的人神经干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(5)中，传代时利用酶消化分离法分散细胞。
9.根据权利要求1所述的人神经干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(5)中，培养过程中，不可频繁挪动细胞，不可晃动培养箱以保证细胞静止培养，避免神经球结团导致细胞死亡；根据神经球直径大小、边缘毛刺、神经球明亮程度来判断神经干细胞的生长状态。
10.利用权利要求1～9中任一项所述的人神经干细胞的培养方法建立的人神经干细胞系。
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