CN110042082B - 视网膜色素上皮细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及一种视网膜色素上皮细胞及其制备方法和应用。所述视网膜色素上皮细胞，其表达MITF和ZO‑1。所述制备视网膜色素上皮细胞的方法，包括以下步骤：S1：培养人多能干细胞；S2：将S1得到的人多能干细胞向视网膜色素上皮前体细胞分化；S3：将S2得到的视网膜色素上皮前体细胞向未成熟视网膜色素上皮细胞分化；S4：将S3得到的未成熟视网膜色素上皮细胞分化得到视网膜色素上皮细胞。所述制备方法可快速、高效、简便从多能干细胞分化获得视网膜色素上皮细胞。此外，本发明提供的制备方法未使用含有血清或血清替代物的体系；分化效率高，分化效果稳定；纯化方法简便，获得的细胞纯度高。

Description

视网膜色素上皮细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及一种视网膜色素上皮细胞及其制备方法和应用。

背景技术

眼睛黄斑病变是一种慢性眼病，多发生于45岁以上的老年人，年龄越大，发病率也越高。黄斑病变可分为两类：湿性和干性。湿性黄斑病变，占总发病率的10％，是由于视网膜下有异常的血管生长，新生血管破裂，并引起疤痕组织生长。干性黄斑病变，占总发病率的90％，是由于黄斑随年龄增长而发生的一种老化，表现为色素上皮或神经上皮脱离进入玻璃体，形成玻璃疣。不论是湿性，还是干性黄斑病变，都会引起位于脉络膜与视网膜之间的一类单层细胞——视网膜色素上皮细胞，发生明显的病变和丢失。视网膜色素上皮细胞维持着光感受器的更新和再生，光感受器将光转变成大脑可识别的电信号。因此，视网膜色素上皮细胞功能下降，会导致光感受器退化，从而引发视力退化甚至失明。黄斑病变的治疗，目前现代医学并没有特效的治疗方法，临床也常根据病程的阶段，使用抗血管新生、抗氧化、维生素，以及视神经营养类药物进行治疗，以延缓病情进程，但无法治愈或逆转病情发展。

细胞移植治疗黄斑病变是通过选择适当的细胞群，移植于患者的视网膜内，替代受损的视网膜色素上皮细胞以重建或恢复其功能。多能干细胞包括人胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)，具有无限增殖的能力，并且在体外可以分化为几乎所有功能细胞，包括视觉细胞。因此，多能干细胞为临床上获得体外来源的视网膜色素上皮细胞进行临床移植提供了可能性。

目前已有多篇研究报道了体外诱导人多能干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，大体包括两类：自发连续贴壁培养(Spontaneous continuously adherent culture，SCAC)分化和直接诱导分化。前者SCAC分化方法持续的时间较长(大于90天)，且产率和纯度很低(Klimanskaya,I.,2004；Buchholz,D.E.,2009)。后者直接分化的方法虽然可以缩短诱导分化培养的时间，但最终需手动将视网膜色素上皮细胞从培养皿中挑出以和杂细胞进行分离，使得效率低，且极易造成细胞污染；此外，目前很多直接分化的方法大多是联合使用多种细胞因子进行诱导培养，使得每批次实验数据的稳定性较差，且成本相对较高，最主要的是细胞因子大多来源于动物细胞或细菌，成分复杂，很难应用于临床(Idelson M.,etal.,2009；LeachLL.,et al.,2015)。

简而言之，虽然从人多能干细胞体外分化为视网膜色素上皮细胞的过程在原理层面一经较为明确，但具体到现有的分化方法则或者存在分化时间较长、效果不稳定、效率低的问题，以及大多使用了含有血清的培养体系，因而不适于后续临床级细胞制剂的生产。

发明内容

本发明提供了一种可快速、高效、简便的从多能干细胞分化获得视网膜色素上皮细胞的方法及其应用，解决了现有技术中实验人员制备和培养视网膜色素上皮细胞的方法以及使用的试剂中因为种种局限性造成了获得的视网膜色素上皮细胞的数量和质量无法达到实验要求、浪费了实验室研究人员的时间和研发经费等问题。

本发明具体的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种视网膜色素上皮细胞，其表达MITF(小眼球相关转录因子)和ZO-1(紧密连接蛋白)。

优选的，所述视网膜色素上皮细胞还表达OTX2(弓形虫同源框2)、RPE65(视网膜色素上皮特异性65kD蛋白)、BEST1(卵黄状黄斑病蛋白1)、MERTK(C-MER原癌基因酪氨酸蛋白激酶)、CRALBP(细胞视网膜醛结合蛋白)和PEDF(色素上皮衍生因子)。

本发明第二个方面公开了一种制备视网膜色素上皮细胞的方法，包括以下步骤：

S1：培养人多能干细胞；

S2：将S1得到的人多能干细胞向视网膜色素上皮前体细胞分化；

S3：将S2得到的视网膜色素上皮前体细胞向未成熟视网膜色素上皮细胞分化；

S4：将S3得到的未成熟视网膜色素上皮细胞分化得到视网膜色素上皮细胞。

应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤S1之前、步骤S1和S2之间、步骤S2和S3之间、步骤S3和S4之间，步骤S4之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。

优选的，在S2中，所述人多能干细胞在第一分化培养基中贴壁培养，所述第一分化培养基包括BMP抑制剂、Nodal抑制剂、MEK抑制剂、SHH信号通路激活剂、IGF-1和Wnt抑制剂中的任意一种或者其任意组合。

BMP抑制剂：抑制BMP信号通路的物质。可选择Chordin、Noggin、Follistatin、LDN193189、Dorsomorphin等。本发明中使用的BMP抑制剂优选为Dorsomorphin。培养基中Dorsomorphin的浓度只要是能够阻碍BMP即可，没有特别的限定，例如为0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM，但不限于此。优选为0.1μM。

Nodal抑制剂：抑制Nodal信号通路的物质。可选择Lefty-A、Lefty-B、Lefty-1、Lefty-2、SB431542、SB202190、SB505124、NPC30345、SD093、SD908、SD208、LY2109761、LY364947、LT580276、A83-01，以及它们的衍生物。本发明中使用的Nodal抑制剂优选为SB431542。培养基中SB431542浓度只要是阻碍Nodal信号通路即可，没有特别的限定，例如为1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM，但不限于此。优选为10μM。

Wnt抑制剂：抑制Wnt信号通路的物质。可选择DKK-1、D4476、IWR1、CKI-7和Cerberus protein等。本发明中使用的Wnt抑制剂优选为IWR1。培养基中IWR1浓度只要是阻碍Wnt信号通路就没有特别的限定，例如为1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM，但不限于此。优选为2μM。

SHH信号激动剂：引起SHH结合于作为受体的Patched(Ptch1)而导致的Smoothenod(Smo)的脱抑制和进一步引起Gli2的活化的物质，可选择SHH、SHH C25II，Purmorphamine，SAG，SAG 21K、Hh-Ag1.5、20a-羟基胆固醇、嘌吗啡胺和它们的衍生物等。本发明中使用的SHH信号激动剂优选为Purmorphamine。培养基中Purmorphamine的浓度只要是使Gli2活化的浓度就没有特别的限定，例如为0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM，但不限于此。优选为2μM。

MEK抑制剂：可选择PD184352、PD318088、PD325901、PD98059、MEK162和SL-327等。本发明中使用的MEK抑制剂优选为PD318088。培养基中PD318088浓度只要是阻碍MEK信号通路就没有特别的限定，例如为0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM，但不限于此。优选为1μM。

更优选的，所述第一分化培养基为无血清培养基。

更优选的，每天更换第一分化培养基，第一分化培养基的使用量为0.2-0.3mL/cm²。

在本发明的一个具体实施例中，步骤S2：当多能干细胞培养至聚合度70％的时候，将其维持培养基(E8或TeSR或其它类似培养基)吸除，加入第一分化培养基，所述第一分化培养基中加入：BMP抑制剂、Nodal抑制剂、MEK抑制剂、SHH信号通路激活剂、IGF-1(胰岛素生长因子-1)和Wnt抑制剂，继续于37℃，5％CO₂浓度，饱和湿度的培养箱内培养，每天更换培养基，培养5-6天。

优选的，在S3中，所述视网膜色素上皮前体细胞在第二分化培养基中贴壁培养，所述第二分化培养基含有FGFR抑制剂和Nodal信号通路激活剂中的一种或者其任意组合。

优选的，所述第二分化培养基为无血清培养基。

FGFR抑制剂可以是PD161570、PD173074、LY2874455、SU5402、FIN-2、AZD4547、BGJ398和Nintedanib等；Nodal信号通路激活剂可以是TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3和Activin A等。

更优选的，所述FGFR抑制剂为SU5402，Nodal信号通路激活剂为TGFβ-1。

应当理解，所述FGFR抑制剂并不限于SU5402，本领域技术人员可选择任何合适的FGFR抑制剂来完成本发明的技术方案，且在本发明的保护范围之内。

应当理解，所述Nodal信号通路激活剂并不限于TGFβ-1，本领域技术人员可选择任何合适的Nodal信号通路激活剂来完成本发明的技术方案，且在本发明的保护范围之内。

优选的，步骤S1-S4的培养时间为30-55天。

本发明第三个方面公开了一种由上述方法制备得到的视网膜色素上皮细胞。

本发明第四个方面公开了一种细胞群，富集上述的视网膜色素上皮细胞。

细胞群是指由许许多多个细胞组成的部分(集体)。多个形态形似，结构、功能相同的细胞群还能组成组织。

本发明第五个方面公开了一种治疗眼睛黄斑病变的药物，所述药物包含上述的视网膜色素上皮细胞。

本发明第六个方面公开了上述的视网膜色素上皮细胞在制备治疗眼睛黄斑病变的药物中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

(1)本发明公开的方法是基于小分子化合物的联合使用，该方法快速、高效且成本低，可在短期内获得数量多，且纯度高的成熟视网膜色素上皮细胞，即50天之内就可获得50-60倍的、纯度高达95％以上的、具有功能性的成熟视网膜色素上皮细胞，因此，具有极大的临床及科研应用潜力；

(2)本方法的整个分化过程均使用无血清(或血清替代物)的成分，适于后续临床级细胞制剂的生产；

(3)本方法的分化诱导方式为贴壁的固定化状态培养，这种诱导方式更加利于操作和观察细胞状态，且可显著提高分化效率，且采用贴壁式培养代替传统的悬浮式培养大大降低了更换培养基时的细胞损失；

(4)本方法的分化纯化操作更简便，无需特殊的仪器或者特殊的抗体，且对细胞伤害小，适于推广于临床及科研应用。

附图说明

图1为本发明实施例1的流程图。

图2为本发明实施例1中从多能干细胞诱导分化为成熟视网膜色素上皮细胞的显微镜图(分别为第0天、第5天、第15天、第25天、第35天、第45天)。

图3为本发明实施例2中RT-QPCR对第45天的成熟视网膜色素上皮细胞的特异性指标进行检测的结果示意图。

图4为本发明实施例2中流式细胞仪检测视网膜色素上皮细胞的MITF+/ZO-1+表型所占的比例图。

图5为本发明实施例2中细胞免疫荧光图。

图6为本发明实施例3中视网膜色素上皮前体细胞的特异性指标柱形图。

图7为本发明实施例4中RT-QPCR的方法检测视网膜色素上皮前体细胞的指标表达图。

图8为本发明实施例5中在第6天、第10天和第15天用RT-QPCR的方法检测视网膜色素上皮细胞的特异性指标图。

图9为本发明实施例5中第8天和第15天的细胞显微镜图。

图10为本发明实施例6中RT-QPCR的方法检测视网膜色素上皮细胞的指标表达图。

图11为本发明实施例7中在第15天、第25天、第35天和第40天用RT-QPCR的方法检测视网膜色素上皮细胞的特异性指标。

图12为本发明实施例7中细胞的显微镜图和明场下色素生成的图片。

图13为本发明实施例8中，使用纯化工作液之后，杂细胞去除过程中的显微镜图。

图14为本发明实施例9中流式细胞仪检测细胞纯度图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例1

本实施例公开了一种制备视网膜色素上皮细胞的方法，设计流程图如图1所示，具体包括以下步骤：

一、D0：多能干细胞的培养

通过专利CN108085299A公开的方法制备得到多能干细胞，接着将多能干细胞进行细胞培养，待其聚合度达到70-80％的时用TrypLE(胰酶)或Accutase(细胞消化液)消化成完全的单细胞，重悬于多能干细胞维持培养基中，并接种在Matrigel板上，置于37℃，5％CO₂浓度，饱和湿度的培养箱内培养。

上述D0实验操作细节及优化如下：

实验中所用的多能干细胞经过严格的多能性验证(表达各种多能性标志物，并可在免疫缺陷型小鼠体内形成包含内、中、外三个胚层的畸胎瘤)。多能干细胞在其维持培养基中正常培养，所用的维持培养基为E8或TeSR或其它类似培养基。

按上述方法培养多能干细胞至70-80％聚合度时，使用TrypLE(胰酶)或Accutase(细胞消化液)消化成完全的单细胞，重悬于多能干细胞维持培养基中，并向培养基中加入Rock抑制剂。将细胞悬液接种在Matrigel板上，置于37℃，5％CO₂浓度，饱和湿度的培养箱内培养，每天换液。Rock抑制剂是Y-27632，浓度为10μM；细胞密度为1-10x 10⁴/cm²。

二、D0-D5：多能干细胞向视网膜色素上皮前体细胞分化

当多能干细胞培养至聚合度70％的时候，将其维持培养基吸除，加入特异性成熟分化培养基，并向特异性成熟分化培养基中加入：BMP抑制剂、Nodal抑制剂、MEK抑制剂、SHH信号通路激活剂、IGF-1(胰岛素生长因子-1)和Wnt抑制剂，继续于37℃，5％CO₂浓度，饱和湿度的培养箱内培养。

上述D0-D5实验操作细节及优化如下：

从培养箱中取出培养皿，去除上清，加入新鲜的特异性成熟分化培养基(特异性成熟分化培养基的成分如下表1所示)，并添加小分子BMP抑制剂、Nodal抑制剂、MEK抑制剂和IGF-1和Wnt抑制剂。本实施例中使用的BMP抑制剂为Dorsomorphin；Nodal抑制剂为SB431542；MEK抑制剂为PD318088；SHH激活剂为Purmorphamine；Wnt抑制剂为IWR1。每天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.2-0.3mL/cm²(培养皿底面积)。

表1特异性成熟分化培养基的成分

三、D6-D15：视网膜色素上皮前体细胞向未成熟视网膜色素上皮细胞分化

将上述D5的培养基吸除，加入新鲜的特异性成熟分化培养基，并添加小分子FGFR抑制剂和Nodal信号通路激活剂，继续于37℃，5％CO₂浓度，饱和湿度的培养箱内培养。

上述D6-D15实验操作细节及优化如下：

从培养箱中取出培养皿，去除上清，加入新鲜的特异性成熟分化培养基，并添加小分子FGFR抑制剂和Nodal信号通路激活剂。本实施例中使用的FGFR抑制剂为SU5402；Nodal信号通路激活剂为TGFβ-1。每天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.2-0.3mL/cm²(培养皿底面积)。

四、D16-D35-40：未成熟视网膜色素上皮细胞进一步成熟分化

将上述D15的分化培养基吸除，加入特异性成熟分化培养基，继续于37℃，5％CO₂浓度，饱和湿度的培养箱内培养。

上述D16-D35-40实验操作细节及优化如下：

1)视网膜色素上皮细胞的特异性成熟分化培养基

从培养箱中取出培养皿，去除上清，加入新鲜的特异性成熟分化培养基。每两天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.4mL/cm²(培养皿底面积)。

2)视网膜色素上皮细胞的纯化

在第25天左右，镜下观察发现视网膜色素上皮细胞贴壁生长，杂细胞呈纤维丝状。将特异性成熟分化培养基吸除，用1x DPBS(w/o，含Ca²⁺和Mg²⁺)洗一遍，加入纯化工作液0.2mL/cm²(培养皿底面积)，置于37℃，5％CO₂浓度，饱和湿度的培养箱中孵育6-8分钟，使得杂细胞彻底脱离培养皿底部。待杂细胞全部漂起后，吸除上清，加入1x DPBS(w/o，含Ca²⁺和Mg²⁺)洗3遍，以确保完全去除杂细胞。纯化后的视网膜色素上皮细胞继续于特异性成熟分化培养基中培养直至完全成熟。

分化培养的第0天(hPSC)、第5天、第15天、第25天、第35天和第45天的具体细胞形态图见图2。

实施例2

本实施例对实施例1得到的视网膜色素上皮细胞(RPE)进行检测，包括以下方法：

方法一：使用RT-QPCR检测，将hPSC细胞作为对照组，实施例1得到的视网膜色素上皮细胞(RPE)作为实验组，证明所得的视网膜色素上皮细胞为OTX2+/MITF+/RPE65+/BEST1+/ZO-1+/MERTK+/CRALBP+/PEDF+，具体数据见图3所示。

其中，OTX2为神经管发育前端的指标；MITF、RPE65、BEST1为成熟视网膜色素上皮细胞的指标；ZO-1为细胞紧密连接的指标(成熟标志)；MERTK为吞噬功能的指标；CRALBP为视觉物质再循环蛋白的指标；PEDF为分泌功能的指标。抽提RNA所用的试剂盒是RNAprepPure Cell/Bacteria Kit，厂家为TIANGEN，货号是DP430；逆转录所用试剂盒是ReverseTranscriptase，厂家为Vazyme，货号是R223-01；RT-QPCR所用试剂盒是TransStart TopGreen qPCR SuperMix，厂家为Transgen，货号是AQ131。

方法二：使用流式细胞仪检测细胞表型，证明所得细胞的表型为：MITF+/ZO-1+；分化效率达到95％以上。说明分化所得的细胞群是视网膜色素上皮细胞，且纯度很高。具体数据见图4。

其中，流式的抗体信息如下：MITF，Abcam，#ab12039；Goat anti-Mouse IgG H&L(FITC)，Abcam，#ab60721；ZO-1，Sigma，#SAB1306492；Goat anti-Rabbit IgG H&L(APC)，Abcam，#ab130805。

方法三：使用细胞免疫荧光检测细胞表型，证明所得细胞表型为：MITF+/ZO-1+；两种特异性标志物的重合度达95％以上，进一步说明分化所得的细胞群视网膜色素上皮细胞的纯度很高。图像结果见图5。

其中，免疫荧光的抗体信息如下：MITF，Abcam，#ab12039；ZO-1，Sigma，#SAB1306492；Alexa Fluor 488Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)Antibody，Thermofisher，#A11029；Alexa Fluor 594Donkey Anti-Rab IgG(H+L)Antibody，Thermofisher，#A11012。

实施例3

本实施例研究多能干细胞向视网膜色素上皮前体细胞分化中小分子的作用。

本实施例发现多能干细胞培养第0-5天，加入特异性成熟分化培养基和联合小分子之后，可加速多能干细胞向视网膜色素上皮前体细胞分化，且效果稳定。

加入特异性成熟分化培养基和联合小分子之后，在第0天、第3天和第5天用RT-QPCR的方法检测视网膜色素上皮前体细胞的特异性指标，结果见图6所示(其中，PAX6为泛神经指标；OTX2为神经分化前端指标，可最终分化为眼区；TLL1、LHX2、TYR和RAX为眼部特异性指标)。

使用的小分子包括：BMP抑制剂、Nodal抑制剂、Wnt抑制剂、SHH激活剂和MEK抑制剂，以及细胞因子IGF-1(insulin-like growth factors)。

本实施例中使用的BMP抑制剂为Dorsomorphin，浓度为0.1μM。使用的Nodal抑制剂为SB431542，浓度为10μM。使用的SHH信号激动剂优选为Purmorphamine，浓度为2μM。使用的MEK抑制剂为PD318088，浓度为1μM。

从图6可知，第0-5天，使用特异性成熟分化培养基，并联合使用小分子化合物对多能干细胞进行定向诱导，会明显加快分化效率。

实施例4 IWR1的浓度影响多能干细胞向视网膜色素上皮前体细胞分化的效率

当对多能干细胞进行分化时，其他条件方法如实施例3所述，对IWR1的浓度进行梯度优化，即在第0-5天，分别使用0μM、1μM、2μM和5μM的IWR1处理细胞，并在第5天使用RT-QPCR的方法检测视网膜色素上皮前体细胞的指标表达，结果见附图7。

从图7可知IWR1的浓度会影响分化效率。当IWR1浓度为0时，前体细胞特异性指标都很低，且有后脑的表达，说明分化不具有特异性、效率低；当IWR1浓度为1μM、2μM和5μM时，前体细胞特异性指标皆表达，但较优浓度为2μM。

实施例5

本实施例将实施例3得到的视网膜色素上皮前体细胞(D0-D5)进一步分化培养，发现第6-15天(即D6-D15)，加入特异性成熟分化培养基和添加剂之后，可明显加速前体细胞向未成熟视网膜色素上皮细胞分化。

加入特异性成熟分化培养基和添加剂之后，在第6天、第10天和第15天用RT-QPCR的方法检测视网膜色素上皮细胞的特异性指标，结果见附图8(其中，MITF、RPE65、和BEST1为视网膜色素上皮细胞特异性指标；ZO-1为细胞紧密连接特异性指标)。细胞形态渐清晰，逐渐出现六边形结构。结果见附图9。

使用的添加剂包括：FGFR抑制剂和Nodal信号通路激活剂。

本实施例中使用的FGFR抑制剂为SU540。Nodal信号通路激活剂为TGFβ-1，浓度为2ng/ml。

可见，第6-15天，使用特异性成熟分化培养基和添加剂(FGFR抑制剂和Nodal激活剂)会明显加快视网膜色素上皮前体细胞分化的效率，并在第15天获得数量多、比例高的未成熟的视网膜色素上皮细胞。

实施例6 SU5402的加入和其浓度影响前体细胞向视网膜色素上皮细胞分化的效率

当继续对视网膜色素上皮前体细胞进行分化时，其他条件方法如实施例5所述，对SU5402的浓度进行梯度优化，即在第6-15天，分别使用0μM、5μM、10μM和15μM的SU5402处理细胞，并在第15天使用RT-QPCR的方法检测视网膜色素上皮细胞的指标表达，结果见附图10。

可见，SU5402的浓度会影响分化效率。当SU5402浓度为0时，视网膜色素上皮细胞的特异性指标都很低，说明分化效率低；当SU5402浓度为5μM、10μM和15μM时，视网膜色素上皮细胞的特异性指标皆表达，且与浓度具有相关性，较优浓度为10μM。

实施例7

多能干细胞培养至第16-40天，加入特异性成熟分化培养基之后，可明显加速视网膜色素上皮细胞的成熟分化。加入不含血清(包括血清替代物)的特异性成熟分化培养基之后，在第15天、第25天、第35天和第40天用RT-QPCR的方法检测视网膜色素上皮细胞的特异性指标，结果见附图11。(其中，MITF和RPE65为视网膜色素上皮细胞特异性指标；ZO-1为细胞紧密连接特异性指标；CRALBP为视环路相关蛋白；MERTK为细胞吞噬功能特异性指标；PEDF为分泌特异性指标；MERTK和PEDF为视网膜色素上皮细胞的功能性指标)

在第25天左右就可见部分细胞出现色素分泌；第36天左右，细胞色素分泌明显，成深褐色。见附图12。

可见，第16-40天，使用不含血清(包括血清替代物)特异性成熟分化培养基会明显加快视网膜色素上皮细胞成熟分化的效率，并在第40天获得数量多、纯度高，且具有功能性的视网膜色素上皮细胞。

实施例8

本实施例将实施例7得到的视网膜色素上皮细胞进行纯化，在第25天左右，镜下观察发现视网膜色素上皮细胞贴壁生长，杂细胞呈纤维丝状。将特异性成熟分化培养基吸除，用1x DPBS(w/o，含Ca2+/Mg2+)洗一遍，加入纯化工作液0.2mL/cm²(培养皿底面积)，置于37℃，5％CO₂浓度，饱和湿度的培养箱中孵育6-8分钟，使得杂细胞彻底脱离培养皿底部，见图13。待杂细胞全部漂起后，吸除上清，加入1x DPBS(w/o，Ca2+/Mg2+)洗3遍，以确保完全去除杂细胞。纯化后的视网膜色素上皮细胞继续于特异性成熟分化培养基中培养直至完全成熟。

该视网膜色素上皮细胞的纯化方法操作简便、对细胞无损伤，明显提高细胞纯度。

本实施例中能够发现使用视网膜色素上皮细胞纯化工作液不仅能使操作简化，还能得到纯度很高的视网膜色素上皮细胞。

实施例9 乙二胺四乙酸和胰蛋白水解酶的浓度(比例)会影响纯化效率。

本实施例对纯化工作液中乙二胺四乙酸和胰蛋白水解酶的浓度(比例)进行优化，即当目的细胞和杂细胞出现明显区分时(约第25天左右)，分别使用0.05mM乙二胺四乙酸、0.1mM乙二胺四乙酸、0.5mM乙二胺四乙酸、0.1g/L胰蛋白水解酶、0.2g/L胰蛋白水解酶、0.5g/L胰蛋白水解酶、0.05mM乙二胺四乙酸+0.1g/L胰蛋白水解酶、0.05mM乙二胺四乙酸+0.2g/L胰蛋白水解酶、0.05mM乙二胺四乙酸+0.5g/L胰蛋白水解酶、0.1mM乙二胺四乙酸+0.5g/L胰蛋白水解酶处理细胞，镜下观察分离的效果，并使用Vi-cell检测细胞的活力、流式细胞仪检测细胞纯度，结果见表2和图14。

表2

乙二胺四乙酸(mM)	胰蛋白水解酶(g/L)	细胞活力(％)
			0.05	0	95.6
0.1	0	95.3
			0.5	0	92.8
0	0.1	96.1
			0	0.2	96.2
0	0.5	89.8
			0.05	0.1	95.0
0.05	0.2	96.8
			0.05	0.5	91.2
0.1	0.5	90.2
			0.5	0.5	88.3

可见，纯化工作液中乙二胺四乙酸和胰蛋白水解酶的浓度(比例)会影响纯化效率。当乙二胺四乙酸和胰蛋白水解酶的浓度分别为：0.05mM和0.2g/L时，纯化效率最高，且细胞活力高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

D0：多能干细胞的培养，通过专利CN108085299A公开的方法制备得到多能干细胞，多能干细胞在其维持培养基中正常培养，所用的维持培养基为E8或TeSR；培养多能干细胞至70-80%聚合度时，使用TrypLE胰酶或Accutase细胞消化液消化成完全的单细胞，重悬于多能干细胞维持培养基中，并向培养基中加入Rock抑制剂；Rock抑制剂是Y-27632，浓度为10μM；细胞密度为1-10 x 10⁴/cm²；

D0-D5：多能干细胞向视网膜色素上皮前体细胞分化：当多能干细胞培养至聚合度70%的时候，将其维持培养基吸除，加入特异性成熟分化培养基，并向特异性成熟分化培养基中加入：BMP抑制剂、Nodal抑制剂、MEK抑制剂、SHH信号通路激活剂、IGF-1 和Wnt抑制剂，BMP抑制剂为Dorsomorphin；Nodal抑制剂为SB431542；MEK抑制剂为PD318088；SHH激活剂为Purmorphamine；Wnt抑制剂为IWR1，每天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.2-0.3 mL/cm²培养皿底面积；

D6-D15：视网膜色素上皮前体细胞向未成熟视网膜色素上皮细胞分化：将上述D5的培养基吸除，加入新鲜的特异性成熟分化培养基，并添加小分子FGFR抑制剂和Nodal信号通路激活剂，FGFR抑制剂为SU5402；Nodal信号通路激活剂为TGFβ-1，每天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.2-0.3 mL/cm²培养皿底面积；

D16- D35-40：未成熟视网膜色素上皮细胞进一步成熟分化：将上述D15的分化培养基吸除，加入特异性成熟分化培养基，每两天更换新鲜培养基，培养基的使用量为0.4 mL/cm²培养皿底面积；视网膜色素上皮细胞的纯化：在第25天左右，将特异性成熟分化培养基吸除，用1x DPBS含Ca²⁺和Mg²⁺洗一遍，加入纯化工作液0.2 mL/cm²培养皿底面积，孵育6-8分钟；待杂细胞全部漂起后，吸除上清，加入1x DPBS含Ca²⁺和Mg²⁺洗3遍，纯化后的视网膜色素上皮细胞继续于特异性成熟分化培养基中培养直至完全成熟；

所述特异性成熟分化培养基的成分为：Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 (DMEM:F-12)，浓度为100%；谷氨酰胺，浓度为1x；烟酰胺，浓度为0-15 mM；人类转铁蛋白，浓度为1-200μg/ml；胰岛素，浓度为1-10 μg/ml；孕酮，浓度为5-10ng/ml；腐胺，浓度为10-20 μg/ml；亚硒酸盐，浓度为1-10 ng/ml；天冬酰胺，浓度为1-20mM；天冬氨酸，浓度为1-20mM；谷氨酸，浓度为1-20mM；甘氨酸，浓度为1-20mM；脯氨酸，浓度为1-20mM；丝氨酸，浓度为1-20mM；丙酮酸钠，浓度为0.5-2mM；抗坏血酸，浓度为100-500 μM；过氧化氢酶，浓度为0.1-0.2mg/ml；微量谷胱甘肽，0.05-0.15mg/ml；视黄醇乙酯酸，浓度为5-10μg/ml；半乳糖，浓度为0.5-1.0 mg/ml；超氧化物歧化酶，浓度为0.3-0.5KU/ml；3,3’,5-三碘-甲状腺激素，浓度为0.1-1.0 μg/ml；肉碱，浓度为0.1-0.2mg/ml；乙醇胺，浓度为0.05-0.1x；皮质酮，浓度为1.0-2.0 μg/ml；

共轭亚油酸，浓度为50-100μg/ml；亚油酸，浓度为50-100μg/ml；醋酸生育酚，浓度为50-100μg/ml；油酸，浓度为50-100μg/ml；哌可酸，浓度为50-100μg/ml；生物素，浓度为0.1-0.2mg/ml。

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