CN117286106A - 一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系、其构建方法和应用 - Google Patents
一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系、其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医学视网膜类器官技术领域，具体公开了一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系、其构建方法和应用，所述小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法依次通过小鼠胚胎干细胞经体外诱导扩增、诱导小鼠胚胎干细胞团簇向视网膜原基分化、诱导视泡结构发育并出现视杯结构、进一步诱导视杯结构发育，从而获得成熟的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，并将视网膜祖细胞建库与储存，整个构建方法可形成标准化流程和质量控制体系，在产业化方面具备很强的自主研发的能力，与人视网膜类器官相比，耗时短、成本低，可标准化、规模化生产，实验成本大大压缩了90％以上。
Description
技术领域
本发明属于医学视网膜类器官技术领域，尤其涉及一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系、其构建方法和应用。
背景技术
类器官突破了细胞间单纯的物理接触联系，形成更加紧密的细胞间、细胞与基质间高度相互作用，从而发育成具有功能的“微器官”，能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态。2022年9月，美国参议院通过美国食品药品监督管理局现代化法案(FDAModernization Act 2.0)，不再要求药物进行动物试验，类器官在基础研究以及临床诊疗方面迎来了更广阔的应用前景。
视网膜类器官模型的建立为视网膜疾病机制的研究和干细胞替代疗法提供了强有力的工具。目前，人视网膜类器官研究不断取得突破。人诱导多能干细胞可在一定条件下分化成为具有人类视网膜特征的视网膜类器官，不仅包含多种视网膜细胞，而且能形成与体内形态非常接近的明显分层。然而，实验步骤多、周期长、耗费高、难以标准、规模化生产等不足，限制了人视网膜类器官的应用。
因此，发明人致力于设计一种类器官及其构建方法和应用以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，耗时短、成本低，可标准化、规模化生产小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系。
本发明的另一目的在于：提供一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，为构建视网膜色素变性(retinitispigmentosa,RP)疾病模型提供了新的工具。
本发明的又一目的在于：提供一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系在临床诊疗所需药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明所采用的一种技术方案为：
一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，包括以下步骤：
步骤1、扩增小鼠胚胎干细胞：将mESC细胞依次在MEF饲养层培养体系、无MEF饲养层培养体系条件下短期连续传代，制备mESC单细胞悬液；
步骤2、诱导小鼠胚胎干细胞团簇向视网膜原基分化：将mESC单细胞悬液以5000个/孔的密度接种到U型底细胞培养板进行三维体外培养，胚胎干细胞不断扩增、细胞团簇进一步堆叠向视网膜原基分化，直至出现视泡结构；
步骤3、诱导视泡结构发育并出现视杯结构：将培养基更换为视泡培养基，促使视泡结构进一步发育，直至出现视杯结构；
步骤4a-1、进一步诱导视杯结构发育：将培养基更换为视杯培养基，促使视杯结构进一步发育；
步骤4a-2、获得成熟的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系：将培养基更换为视网膜类器官培养基，获得成熟的视网膜类器官及其终末分化的细胞系；
步骤4b、视网膜祖细胞建库与储存：将步骤3获得的视泡结构进行组织消化，获得视网膜祖细胞悬液，添加视网膜祖细胞培养基传代培养3次，获得视网膜祖细胞系并使用视网膜祖细胞冻存液储存。
作为本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法的一种改进，所述MEF饲养层培养体系的构建方法为：将MEF细胞在MEF培养基培养条件下接种到细胞培养板培养至80％密度，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，加入含10-20μg/ml丝裂霉素-C的MEF培养基作用2小时，利用磷酸缓冲盐溶液冲洗丝裂霉素-C，加入胚胎干细胞培养基，构建成MEF饲养层培养体系。
作为本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法的一种改进，所述无MEF饲养层培养体系的构建方法为：细胞培养板在细胞接种前，预先用0.2％的明胶(Gelatine)处理2小时。
作为本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法的一种改进，所述终末分化的细胞系包括视细胞、双极细胞、节细胞、水平细胞、无长突细胞和Muller细胞。
作为本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法的一种改进，所述视细胞由CRX特异性标记，所述双极细胞由OTX2特异标记的、所述节细胞由EBF3特异标记、所述水平细胞和无长突细胞均由Calbindin特异标记、所述Muller细胞由GFAP特异标记。
作为本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法的一种改进，所述mESC细胞悬液接种到MEF饲养层培养体系后，需不断更换胚胎干细胞培养基进行培养，直至mESC细胞克隆的密度长到80％，传代形成mESC细胞悬液。
作为本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法的一种改进，所述mESC细胞悬液转移到无MEF饲养层培养体系中培养后，需不断更换胚胎干细胞培养基，直至mESC细胞克隆的密度长到80％，制备mESC单细胞悬液。
作为本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法的一种改进，所述步骤4b中，所述视网膜祖细胞由RAX特异性标记。
为了达到上述另一目的，本发明所采用的一种技术方案为：
一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，所述小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系由上述小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法构建而成。
为了达到上述又一目的，本发明所采用的一种技术方案为：
一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的应用，所述小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系作为制备治疗视网膜相关疾病药物的应用。
与现有技术相比，本发明的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，依次通过小鼠胚胎干细胞经体外诱导扩增、诱导小鼠胚胎干细胞团簇向视网膜原基分化、诱导视泡结构发育并出现视杯结构、进一步诱导视杯结构发育，从而获得成熟的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，并将视网膜祖细胞建库与储存，整个构建方法可形成标准化流程和质量控制体系，在产业化方面具备很强的自主研发的能力，与人视网膜类器官相比，耗时短、成本低，可标准化、规模化生产，实验成本大大压缩了90％以上。
与现有技术相比，本发明的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，由小鼠胚胎干细胞经体外诱导并培养而成，与人视网膜类器官相比，小鼠视网膜类器官同样具备与体内视网膜相似的细胞和形态特征，为构建视网膜色素变性(retinitispigmentosa,RP)疾病模型提供了新的工具。
与现有技术相比，本发明所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的应用，可将小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系用于视网膜相关疾病治疗等药物的应用中。
附图说明：
图1是本发明的视泡结构；
图2是本发明的视泡结构中表达Rax+的视网膜祖细胞；
图3是本发明的视杯结构；
图4是本发明的CRX+视细胞免疫染色图；
图5是本发明的OTX2+双极细胞免疫染色图；
图6是本发明的EBF3+节细胞免疫染色图；
图7是本发明的Calbindin+水平细胞和无长突细胞免疫染色图；
图8是本发明的视网膜类器官GFAP+Muller细胞标记物免疫染色图；
图9是本发明的Rax+视网膜祖细胞系；
图10是本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法流程图。
具体实施方式
下面结合附图，具体阐明本发明的实施方式，附图仅供参考和说明使用，不构成对本发明专利保护范围的限制。
参照图1至图10，本发明的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法涉及步骤包括：MEF饲养层培养体系构建、扩增小鼠胚胎干细胞、诱导小鼠胚胎干细胞团簇向视网膜原基分化、诱导视泡结构发育并出现视杯结构、进一步诱导视杯结构发育、获得成熟的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系和视网膜祖细胞建库与储存。
本发明的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，包括以下步骤：
步骤0、构建MEF饲养层培养体系
本步骤用于构建供小鼠胚胎干细胞快速增殖的MEF饲养层培养体系，其中，MEF细胞(即：小鼠胚胎成纤维细胞)，可以通过购买或使用本领域中已知的任何方法中的一种制备，MEF饲养层培养体系的具体构建方法如下：
1)把装有MEF细胞的冻存管从液氮罐或-80℃冰箱中取出，置于37℃恒温水箱，直至完全融化；
2)在15ml离心管中加入6ml MEF培养基并提前预热，待冻存管中的MEF细胞完全融化后，迅速将细胞液转移到离心管；
3)离心后弃去上清，加入MEF培养基轻轻吹打细胞，直至吹打成MEF单细胞悬液；
4)将MEF单细胞悬液接种到细胞培养板(6孔、12孔、24孔中的一种)；接种前细胞培养板应使用0.2％的明胶(Gelatine)预处理，接种后置于37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养；
5)每两天需更换一次MEF培养基，直至MEF细胞克隆密度长到约80％左右，弃前述MEF细胞培养基，用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗1次；
6)弃PBS，加入含10-20μg/ml丝裂霉素-C的MEF培养基，原条件培养2小时，经丝裂霉素-C处理后能够有效抑制MEF细胞分裂，并保持其正常活力，MEF细胞仍正常分泌激活素A(Activina)和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)，为维持小鼠胚胎干细胞未分化特性提供重要营养因子；
7)弃含丝裂霉素-C的MEF细胞培养基，用PBS冲洗3次，每次间隔5分钟，如果丝裂霉素-C冲洗不彻底，残余的丝裂霉素-C可能会影响下一步实验；
8)弃PBS，加入胚胎干细胞培养基，构建成MEF饲养层培养体系。
本步骤中，MEF培养基的基础成分为GMEM培养基，另外需添加占总体积1％的丙酮酸钠(Sodium Pyruvate，100μM)，占总体积1％的非必需氨基酸溶液(Non Essential AminoAcid，NEAA，100×)，占总体积15％的热灭活胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)，占总体积1‰的2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol)。可以根据需要添加占总体积1％的青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin，10,000U/mL)，以减少细菌污染风险。
本步骤中，胚胎干细胞培养基的基础成分为GMEM培养基，另外需添加终浓度为2.5ul/ml的LIF，占总体积1％的丙酮酸钠(Sodium Pyruvate，100μM)，占总体积1％的非必需氨基酸溶液(Non Essential Amino Acid，NEAA，100×)，占总体积1％的热灭活胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)，占总体积15％的KnockOutTM血清替代物(KnockOut SerumReplacement，KnockOutTMSR),占总体积1‰的2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol)。
GMEM培养基可购于GIBCO公司，产品货号是11710035。
步骤1、扩增小鼠胚胎干细胞
使用MEF作为饲养层细胞是一种比较早和常用的培养胚胎干细胞方法，由于使用MEF饲养层培养体系具有一定的缺陷，即：获得的胚胎干细胞夹杂着较多的MEF细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)，不利于后续胚胎干细胞分化以及视网膜类器官形成，因此，本步骤中，将小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell，mESC)依次在MEF饲养层培养体系、无MEF饲养层培养体系条件下短期连续传代，其中，无MEF饲养层培养体系发挥纯化小鼠胚胎干细胞的作用，本步骤的具体操作如下：
1)把装有mESC细胞的冻存管从液氮罐或-80℃冰箱中取出，置入37℃恒温水箱，直至完全融化；
2)在15ml离心管中加入6ml胚胎干细胞培养基并提前预热，待冻存管中的mESC细胞完全融化后，迅速将细胞液转移到离心管；
3)离心后弃去上清，加入胚胎干细胞培养基轻轻吹打细胞，直至吹打成mESC细胞悬液；
4)弃原培养板的培养基，将mESC细胞悬液接种到步骤0中的MEF饲养层培养体系，再加入新的胚胎干细胞培养基，并置于37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养；
5)每天更换一次胚胎干细胞培养基，直至mESC细胞克隆的密度长到约80％左右，可进行细胞传代；
6)传代后的mESC细胞悬液再次接种到新的MEF饲养层培养体系，每天需更换一次胚胎干细胞培养基，直至mESC细胞克隆的密度长到80％左右再次进行细胞传代；
7)传代后的mESC细胞悬液转移到无MEF饲养层培养体系中培养，接种后，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养；
8)每天需更换一次胚胎干细胞培养基，直至mESC细胞克隆的密度长到80％左右，制备mESC单细胞悬液。
本步骤中，mESC细胞即为小鼠胚胎干细胞，可以通过购买或使用本领域中现有的任何方法中的一种获得，本步骤中胚胎干细胞培养基的成分与步骤0中所使用的胚胎干细胞培养基的成分相同。
本步骤中，无MEF饲养层培养体系即：细胞培养板在细胞接种前，预先用0.2％的明胶(Gelatine)处理2小时。由于无MEF饲养层培养体系可使mESC细胞更好地贴壁生长，同时，使混杂在mESC细胞中的MEF细胞在此培养体系中迅速凋亡，因此，本发明中，无MEF饲养层培养体系发挥了纯化mESC细胞的作用。
本步骤中，小鼠胚胎干细胞应先在经丝裂霉素-C处理的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)饲养层培养体系中快速增殖，以获得足量的小鼠胚胎干细胞；在进入诱导分化环节前，小鼠胚胎干细胞应从MEF饲养层培养体系转移到无MEF饲养层培养体系传代培养1次或以上，以纯化小鼠胚胎干细胞，更有利于后续的诱导分化步骤。
步骤2、诱导小鼠胚胎干细胞团簇向视网膜原基分化
本步骤采用透明的96孔U型底细胞培养板进行三维体外培养，有利于胚胎干细胞团簇发育成视网膜类器官，具体操作步骤如下：
1)将步骤1中的mESC单细胞悬液以5000个/孔的密度接种到透明的96孔U型底细胞培养板进行三维体外培养，使用未添加基底膜基质Matrigel(Growth Factor ReducedBasement Membrane Matrix)的干细胞分化培养基，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养；
2)培养1天后可观察到呈球状的细胞团簇，添加完全成分的干细胞分化培养基，诱导细胞团簇向视网膜原基分化；
3)持续培养6天，直至出现视泡结构。
本步骤中，视泡结构为细胞团簇向外凸现而形成的典型的、由呈透亮状的上皮祖细胞分化并堆叠而成的泡状结构(见图1)。
本步骤中，干细胞分化培养基的基础成分为GMEM(Glasgow's Minimum EssentialMedium)培养基，另外需添加终浓度250μg/ml的基底膜基质Matrigel(Growth FactorReduced Basement Membrane Matrix)、占总体积1％的丙酮酸钠(Sodium Pyruvate，100μM)，占总体积1％的非必需氨基酸溶液(Non Essential Amino Acid，NEAA，100×)，占总体积2％的KnockOutTM血清替代物(KnockOut Serum Replacement，KnockOutTMSR)，占总体积1％的N-2Supplement、占总体系2％的B27 Supplement(without vitamin A，50X)、占总体积1‰的的2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol)。
步骤3、诱导视泡结构发育并出现视杯结构
由于小鼠眼组织发育中，Rax可作为视网膜祖细胞的标记物。对类器官视泡结构进行冰冻切片的免疫染色，该结构特异性表达Rax(见图2)标记物，具体操作如下：
1)弃步骤2中的培养基，加入视泡培养基，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养；
2)隔天更换视泡培养基，持续培养3天，直至出现视杯结构。
本步骤中，视泡培养基的基础成分为高糖营养混合培养基DMEM/F-12,GlutaMAXTM，另外需添加占总体积1％的丙酮酸钠(Sodium Pyruvate，100μM)，占总体积1％的非必需氨基酸溶液(Non Essential Amino Acid，NEAA，100×)，占总体积1％的N-2Supplement、占总体积1‰的的2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol)。
步骤4a-1、进一步诱导视杯结构发育
本步骤中，视泡结构发生内陷进而形成杯状结构(见图3)。本步骤的具体操作如下：
1)弃步骤3中的培养基，加入视杯培养基，并置于37℃、5％CO2、40％高氧、饱和湿度的CO2培养箱中培养。
2)隔天更换视杯培养基，持续培养3天。
本步骤中，视杯培养基的基础成分：高糖营养混合培养基DMEM/F-12,GlutaMAXTM，另外需添加占总体积1％的丙酮酸钠(Sodium Pyruvate，100μM)，占总体积1％的非必需氨基酸溶液(Non Essential Amino Acid，NEAA，100×)，占总体积1％的N-2Supplement、占总体系2％的B27 Supplement(without vitamin A，50X)、占总体积1‰的的2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol)。
步骤4a-2、获得成熟的小鼠视网膜类器官及终末分化的细胞系
受内源性细胞信号通路调控和添加外源营养因子的双重影响，视泡结构中的视网膜祖细胞分化为终末分化的视网膜细胞各细胞系，分别有CRX特异性标记的视细胞(见图4)、OTX2特异标记的双极细胞(见图5)、EBF3特异标记的节细胞(见图6)、Calbindin特异标记的水平细胞和无长突细胞(见图7)、以及GFAP特异标记的Muller细胞(见图8)。本步骤的具体操作如下：
1)弃步骤4a-1的培养基，加入视网膜类器官维持培养基，并置于37℃、5％CO2、40％高氧、饱和湿度的CO2培养箱中培养。
2)隔天更换视网膜类器官维持培养基，持续培养6-8天。
本步骤中，视网膜类器官培养基的基础成分：高糖营养混合培养基DMEM/F-12,GlutaMAXTM，另外需添加占总体积1％的丙酮酸钠(Sodium Pyruvate，100μM)，占总体积1％的非必需氨基酸溶液(Non Essential Amino Acid，NEAA，100×)，占总体系2％的B27Supplement(without vitamin A，50X)、占总体积1‰的的2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol)。
所述步骤中，将视杯培养基更换为视网膜类器官培养基，培养6天后可获得成熟的视网膜类器官，该类器官具有与原生器官相似的细胞组成和组织结构，并检测到视细胞标记物CRX、双极细胞标记物OTX2、节细胞标记物EBF3、水平细胞和无长突细胞标记物Calbindin、和Muller细胞标记物GFAP，这些细胞迁移至成熟位置，视网膜类器官片层化结构不断发育。
步骤4b、视网膜祖细胞建库与储存
本步骤的视网膜祖细胞由步骤3中的视杯结构获得。本步骤的具体操作如下：
1)在15ml离心管中加入TrypLETMExpress酶5ml，放入40个视泡结构(40个视泡结构取自步骤3)，置于37℃恒温水浴箱中作用10分钟；
2)轻轻吹打细胞，直至吹打成单细胞悬液后离心，将视泡结构进行组织消化，获得视网膜祖细胞悬液；
3)弃上清后，加入视网膜祖细胞培养基吹打，并将视网膜祖细胞悬液置于20μm细胞过滤装置；
4)收集过滤后的视网膜祖细胞悬液，加入视网膜祖细胞培养基，置于37℃、5％CO2、40％高氧、饱和湿度的CO2培养箱中进行贴壁培养；
5)直至细胞克隆的密度长到约70％左右可进行细胞传代；
6)稳定连续传代三次后，完成视网膜祖细胞建系工作，使用视网膜祖细胞冻存液储存该细胞系。
本步骤中，细胞免疫组化实验表明，连续传代三代后的细胞，仍表达视网膜祖细胞标记物Rax(见图9)，提示视网膜祖细胞建库成功。
本步骤中，视网膜祖细胞培养基的基础成分是视泡培养基，另外需添加终浓度为3.5μM CHIR-99021，150ng/ml Sonic Hedgehog重组蛋白，15ng/ml成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor，FGF)，15ng/ml表皮细胞生长因子(Epidermal GrowthFactor，EGF)。
本步骤中，视网膜祖细胞冻存液的基础成分是视网膜祖细胞培养基，另外需添加10％的二甲基亚砜(DMSO)。
为了更好地构建视网膜祖细胞系，本步骤使用TrypLETMExpress酶将视泡结构解离成单细胞。免疫荧光染色实验提示，视泡结构含有大量Rax+的视网膜祖细胞。添加视网膜祖细胞培养基连续传代，即可制备足量的、可传代、扩增及冻存的视网膜祖细胞系。
本发明中，依次通过步骤0、步骤1、步骤2、步骤3、步骤4a-1和步骤4a-2便可获得成熟的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，而依次通过步骤0、步骤1、步骤2、步骤3和步骤4b可将视网膜祖细胞建库并储存起来。
本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法中，整个制备方法可形成标准化流程和质量控制体系，在产业化方面具备很强的自主研发的能力。与人视网膜类器官相比，实验成本大大压缩了90％以上。
本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，更能模拟体内视网膜发育的过程。而视网膜细胞发育和成熟是一个复杂的过程，包括细胞增殖、分化和迁移等多个阶段。这个过程中，尽管外源性的信号通路起到了一定调控作用，但主要还是由细胞内源性关键基因表达来驱动。区别于传统的二维培养体系，小鼠视网膜类器官在诱导分化过程中突破了细胞间单纯的信号通路调控，而是通过更加紧密的细胞内部、细胞间以及细胞与基质间高度相互作用分化而成，其起源的视网膜祖细胞、视网膜终末分化的各细胞系高度保留了体内视网膜细胞的遗传特征。
一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，所述小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系由上述小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法构建而成。
本发明的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，由小鼠胚胎干细胞经体外诱导并培养18天，即可获得成熟的小鼠视网膜类器官。与人视网膜类器官相比，小鼠视网膜类器官同样具备与体内视网膜相似的细胞和形态特征，但培养周期大大压缩了90％以上，
本发明的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，相对于人视网膜类器官，该小鼠视网膜类器官的优势在于周期更短、成本更低，更加标准化和规模化，具有与原生器官相似的细胞组成和组织结构；类器官内终末分化的视细胞、双极细胞、节细胞、水平细胞、无长突细胞和Muller细胞，高度保留了体内视网膜细胞的遗传特征；类器官起源非终末分化的视网膜祖细胞，通过细胞建库和储存，能够保持未分化或低分化特征。该发明将在功能组织诱导、疾病模型建立、药物筛选、临床端研究等基础研究和转化应用中具有广大的应用前景。
视网膜色素变性是一种遗传性视网膜退行性病变，有超过70个基因、超过3000个突变位点与视网膜色素变性明确有关，而本发明的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，为构建视网膜色素变性(retinitispigmentosa,RP)模型提供新的工具。该发明具备周期短、低成本等优势，将在功能组织诱导、疾病模型建立等基础研究中具有广大的应用前景。
一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的应用，其特征在于，所述小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系作为制备治疗视网膜相关疾病药物的应用。
本发明小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，可用于视网膜相关疾病治疗等转化应用中。整个制备方法可形成标准化流程和质量控制体系，将在药物筛选、临床端应用等方面具有广大的应用前景。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例，不能以此来限定本发明的权利保护范围，因此依本发明申请专利范围上所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (10)
1.一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、扩增小鼠胚胎干细胞：将mESC依次在MEF饲养层培养体系、无MEF饲养层培养体系条件下短期连续传代，制备mESC单细胞悬液；
步骤2、诱导小鼠胚胎干细胞团簇向视网膜原基分化：将mESC单细胞悬液以5000个/孔的密度接种到U型底细胞培养板进行三维体外培养，胚胎干细胞不断扩增、细胞团簇进一步堆叠向视网膜原基分化，直至出现视泡结构；
步骤3、诱导视泡结构发育并出现视杯结构：将培养基更换为视泡培养基，促使视泡结构进一步发育，直至出现视杯结构；
步骤4a-1、进一步诱导视杯结构发育：将培养基更换为视杯培养基，促使视杯结构进一步发育；
步骤4a-2、获得成熟的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系：将培养基更换为视网膜类器官培养基，获得成熟的视网膜类器官及其终末分化的细胞系；
步骤4b、视网膜祖细胞建库与储存：将步骤3获得的视泡结构进行组织消化，获得视网膜祖细胞悬液，添加视网膜祖细胞培养基传代培养3次，获得视网膜祖细胞系并使用视网膜祖细胞冻存液储存。
2.根据权利要求1所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，其特征在于，所述MEF饲养层培养体系的构建方法为：将MEF细胞接种到细胞培养板，更换MEF培养基，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，加入含10-20μg/ml丝裂霉素-C的MEF培养基作用2小时后，利用磷酸缓冲盐溶液冲洗丝裂霉素-C，加入胚胎干细胞培养基，构建成MEF饲养层培养体系。
3.根据权利要求1所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，其特征在于，所述无MEF饲养层培养体系的构建方法为：细胞培养板在细胞接种前，预先用0.2％的明胶(Gelatine)处理2小时。
4.根据权利要求1所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，其特征在于，所述终末分化的细胞系包括视细胞、双极细胞、节细胞、水平细胞、无长突细胞和Muller细胞。
5.根据权利要求4所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，其特征在于，所述视细胞由CRX特异性标记，所述双极细胞由OTX2特异标记的、所述节细胞由EBF3特异标记、所述水平细胞和无长突细胞均由Calbindin特异标记、所述Muller细胞由GFAP特异标记。
6.根据权利要求1所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤1中，所述mESC细胞悬液接种到MEF饲养层培养体系后，需不断更换胚胎干细胞培养基进行培养，直至mESC细胞克隆的密度长到80％，传代形成mESC细胞悬液。
7.根据权利要求6所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，其特征在于，所述mESC细胞悬液转移到无MEF饲养层培养体系中培养后，需不断更换胚胎干细胞培养基，直至mESC细胞克隆的密度长到80％，制备mESC单细胞悬液。
8.根据权利要求1所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤4b中，所述视网膜祖细胞由RAX特异性标记。
9.一种小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系，其特征在于，所述小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系由权利要求1-8任一项所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的构建方法构建而成。
10.一种如权利要求9所述的小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系的应用，其特征在于，所述小鼠视网膜类器官及其终末分化的细胞系作为制备治疗视网膜相关疾病药物的应用。
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