CN115851578A

CN115851578A - 一种3d悬浮诱导持续扩增肝祖细胞类器官和/或肝细胞类器官的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN115851578A
Application number: CN202211668145.XA
Authority: CN
Inventors: 段玉友; 吴海滨; 陈洪林
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2022-12-23
Filing date: 2022-12-23
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2042-12-23
Also published as: CN115851578B

Abstract

本发明公开了一种3D悬浮诱导持续扩增肝祖细胞类器官和/或肝细胞类器官的试剂盒及其应用。试剂盒中减少了细胞因子种类及其用量，使用低浓度的Matrigel分化培养类器官，更高效的支持肝祖细胞类器官和/或肝细胞类器官的长期维持和扩增。在Matrigel存在的条件下，成熟肝细胞类器官中肝细胞呈极化状态，类似于体内肝组织结果，从结构上明显不同于3D悬浮培养条件下非极化的肝细胞球。使用本发明的试剂盒可消耗更少的培养基和细胞因子以及缩短了分化时间，实现体外类器官大规模化扩增培养，从细胞产量、功能及成本等方面可满足临床治疗、药物筛选研发以及药物毒理分析等领域对功能性肝细胞的需求。

Description

一种3D悬浮诱导持续扩增肝祖细胞类器官和/或肝细胞类器官的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种3D悬浮诱导持续扩增肝祖细胞类器官和/或肝细胞类器官的试剂盒及其应用。

背景技术

人多功能干细胞(hPSCs)具有多向分化潜能和无限的自我复制能力，被广泛应用于细胞治疗、药物开发等领域。临床上，对于急性肝衰或末期肝病患者来说，最佳的治疗方法就是肝移植，但由于供体肝的供应缺乏问题，病人往往无法等到合适的供体肝脏进行移植手术，从而丧失最佳治疗时机。因此，人肝细胞移植治疗以及体外生物人工肝脏治疗方案就成了替代的选择。然而，临床上对肝病患者进行肝细胞移植治疗或生物人工肝脏治疗都需要10¹⁰数量级(100亿)的成熟肝细胞，原代肝细胞来源匮乏以及其在体外培养条件下难以扩增培养和功能维持，从而无法满足临床研究与治疗的需求。因此，大规模的获得功能性和可移植的肝细胞，以满足日益增长的治疗和药物研发需求，是现在面临的主要挑战。由于hPSCs具有多向分化潜能以及无限自我复制能力的特性，hPSCs可作为种子细胞源源不断在体外定向分化为肝细胞，为解决肝细胞供应不足提供了可能。

近年来，研究者对于hPSCs的规模化培养进行了深入的探究，开发出了多种hPSCs大规模培养方法，但由于诱导hPSCs分化为肝细胞的时间过长，分化过程中耗费的培养基以及细胞因子过于昂贵，每次分化又存在批次间的差异性，故很难规模化生产10¹⁰数量级及以上的hPSCs后再进行肝细胞分化。肝脏是具有再生能力的，例如小鼠肝脏，在进行肝切除时，即使切掉三分之二的肝脏后，其也能在数周内再生出完整的肝脏，这主要归功于肝脏中的肝祖细胞起到了主要的肝再生作用。于是研究者们通过在体外获得肝祖细胞，诱导肝祖细胞长期培养，以达到规模化生产功能性肝细胞的目的。另一方面，由于供体肝的匮乏，从供体肝获得肝祖细胞或从原代肝细胞诱导为肝祖细胞都将限制其产能，同时肝祖细胞在体外扩增的代数也是有限的；因此，从具有无限增殖能力的hPSCs源源不断地分化可长期扩增的肝祖细胞，再分化为成熟肝细胞将从功能、产量及成本上满足临床和生物制药对肝细胞的需求。

目前，多数研究者对hPSCs在2D贴壁条件下分化为肝祖细胞并进行长期培养的研究，然而，2D分化体系无法模拟人体内肝脏的3D微环境；其次，越来越多的证据表明，3D培养系统可以更好地模拟体内微环境，促进肝脏谱系的产生和肝细胞成熟。另外，类器官的发明更好地模拟了组织器官的结构和功能，然而目前类器官的构建和培养都是基于高浓度Matrigel进行培养，严重限制了类器官的规模化生产和扩增。

有研究人员建立了在2D培养条件下从hPSCs分化可长期扩增的肝祖细胞方法，肝祖细在体外2D培养条件下扩增10代以上，并且能够诱导为具有一定肝功能的肝细胞，最终可获得大量肝细胞，目的想用于生物制药研究以及人工肝治疗等目的[1,2]。也有研究人员建立了在2D培养条件下从hPSCs分化可长期扩增的肝祖细胞类器官方法，肝祖细类器官在体外2D培养条件下扩增20代，并且最终能够诱导成熟肝细胞，目的用于药物筛选以及多种肝脏疾病研究等目的[1,2]。

但是，由于2D培养分化体系无法模拟人体内肝脏的三维微环境，通过此分化体系所获得的肝细胞的成熟度不高以及功能不完全。另外，2D培养条件并不利于肝祖细胞/类器官的规模化生产，这是由于在2D培养条件下，研究者需要通过细胞工厂或细胞贴壁式生长的生物反应器进行规模化生产，然而利用这些方法获得大量细胞需要耗费大量人力物力，成本太高，限制了其转化应用。再者，目前依赖高浓度Matrigel培养条件建立的各种类器官包括肝脏类器官不适宜进行规模化制备，成本更高，无法进行临床转化应用[3,4]。

1.Pan,T.,et al.,Robust expansion and functional maturation of humanhepatoblasts by chemical strategy.Stem Cell Res Ther,2021.12(1):p.151.

2.Chen,S.,et al.,Hepatic spheroids derived from human inducedpluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liverfailure.Cell Res,2020.30(1):p.95-97.

3.Hu,H.,et al.,Long-Term Expansion of Functional Mouse and HumanHepatocytes as 3D Organoids.Cell,2018.175(6):p.1591-1606.e19.

4.Wang,S.,et al.,Human ESC-derived expandable hepatic organoidsenable therapeutic liver repopulation and pathophysiological modeling ofalcoholic liver injury.Cell Res,2019.29(12):p.1009-1026.

综上，现有技术的缺点包括：1、分化时间跨度较长，因此时间成本高：由于2D培养分化体系是模拟人体内肝脏发育过程，无法模拟人体内肝脏的三维微环境，通过此分化体系所获得的相同成熟度肝细胞所需的时间要长，而且也很难获得人体内肝脏的三维微环境下获得的成熟、功能完全的肝细胞；2、分化使用较多昂贵的细胞生长因子，并且使用浓度较高，因此试剂耗材成本高；3、通过人多功能干细胞分化所获的肝细胞的成熟度和功能有待进一步提高；4、使用高浓度Matrigel分化培养类器官，成本高；5、整个分化培养过程步骤多，工艺复杂。

因此，如何减少了细胞因子及其用量，使用低浓度的Matrigel分化培养类器官，更高效的支持肝祖细胞类器官的长期维持和扩增是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供一种培养基组合物。

本发明第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。

本发明第三方面的目的，在于提供上述培养基组合物、试剂盒的应用。

本发明第四方面的目的，在于提供一种肝祖细胞类器官的构建或和持续扩增方法。

本发明第五方面的目的，在于提供一种成熟肝细胞类器官的构建方法。

本发明第六方面的目的，在于提供上述方法构建的肝祖细胞类器官、肝细胞类器官的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一种培养基组合物；包括第五培养基，所述第五培养基包括Matrigel、TGFβ/ALK抑制剂、GSK3β抑制剂和FSK。

优选地，所述第五培养基中的Matrigel的终浓度为3～8v/v％。

优选地，所述第五培养基中的Matrigel的终浓度为4～7v/v％。

优选地，所述第五培养基中的Matrigel的终浓度为5v/v％。

优选地，所述第五培养基中的TGFβ/ALK抑制剂包含SB431542、SB-505、A-83-01、GW6604、IN-1130、Ki26894、LY2157299、LY364947(HTS-466284)、LY550410、LY573636、LY580276、NPC-30345、SB-505124、SD-093、Sm16、SM305、SX-007、Antp-Sm2A、LY2109761中的至少一种。

进一步优选地，所述第五培养基中的TGFβ/ALK抑制剂包含SB431542。

优选地，所述第五培养基中的GSK-3抑制剂包含B216763、TWS119、NP031112、SB216763、CHIR-98014、AZD2858、AZD1080、SB415286、LY2090314、CHIR-99021中的至少一种。

更进一步优选地，所述第五培养基中的GSK-3抑制剂包含CHIR-99021。

优选地，所述第五培养基中还包含生长因子、BMP信号通路激活剂。

优选地，所述第五培养基中的BMP信号通路激活剂包含BMP2、BMP4、SB4、SJ000291942、SJ000063181、SJ000370178、异甘草素、香叶木素、芹菜素和鹰嘴豆芽素中的至少一种。

进一步优选地，所述第五培养基的BMP信号通路激活剂包含BMP4。

优选地，所述第五培养基的生长因子包含表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-1)、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子(LIF)、神经生长因子(NGF)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PDECGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)中的至少一种。

更优选地，所述第五培养基的生长因子包含表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)；所述成纤维细胞生长因子(FGF)优选为成纤维细胞生长因子4(FGF-4)。

优选地，所述第五培养基中还包含FBS、ITS、NEAA、GlutaMAX、烟酰胺。

优选地，所述第五培养基中TGFβ/ALK抑制剂的终浓度为5～20μM。

优选地，所述第五培养基中GSK3β抑制剂的终浓度为3～8μM。

优选地，所述第五培养基中FSK的终浓度5～20μM。

优选地，所述第五培养基中表皮生长因子(EGF)的终浓度为10～30ng/mL。

优选地，所述第五培养基中成纤维细胞生长因子4(FGF-4)的终浓度为10～30ng/mL。

优选地，所述第五培养基中BMP信号通路激活剂的终浓度为10～30ng/mL。

优选地，所述第五培养基中FBS的终浓度为5～15w/w％。

优选地，所述第五培养基中ITS的终浓度为0.5～1.5w/w％。

优选地，所述第五培养基中谷氨酰胺的终浓度为0.5～1.5w/w％。

优选地，所述第五培养基中NEAA的终浓度为0.5～1.5w/w％。

优选地，所述第五培养基中烟酰胺的终浓度为5～15mM。

优选地，所述第五培养基的基础培养基为RPMI1640和IMDM培养基中的至少一种。

优选地，说第五培养基用于将分化后的肝祖细胞诱导培养为肝祖细胞类器官，并可持续培养。

优选地，所述培养基组合物还包含第六培养基，所述第六培养基中包含Matrigel、生长因子。

优选地，所述第六培养基中的Matrigel的终浓度为3～8v/v％。

优选地，所述第六培养基中的Matrigel的终浓度为4～7v/v％。

优选地，所述第六培养基中的Matrigel的终浓度为5v/v％。

优选地，所述第六培养基的生长因子包含表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-1)、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子(LIF)、神经生长因子(NGF)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PDECGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)中的至少一种。

更优选地，所述第六培养基的生长因子包含肝细胞生长因子(HGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)；所述成纤维细胞生长因子(FGF)优选为成纤维细胞生长因子4(FGF-4)。

优选地，所述第六培养基还包含抑瘤素M、二甲基亚砜、地塞米松、第一添加剂；所述第一添加剂包括：抗坏血酸、BSA-FAF、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、基因重组人表皮生长因子和GA-1000。

优选地，所述第六培养基中HGF的终浓度为10～30ng/mL。

优选地，所述第六培养基中FGF-4的终浓度为10～30ng/mL。

优选地，所述第六培养基中抑瘤素M(oncostatin M)的终浓度为30～70ng/mL。

优选地，所述第六培养基中二甲基亚砜的终浓度为0.1～1w/w％。

优选地，所述第六培养基中B27的终浓度为1～3w/w％。

优选地，所述第六培养基中地塞米松的终浓度为80～120nM。

进一步优选地，所述第一添加剂由Single Quots kit内的七种组分组成：0.5mL抗坏血酸、5mL BSA-FAF、0.5mL氢化可的松、0.5mL转铁蛋白、0.5mL胰岛素、0.5mL基因重组人表皮生长因子和0.5mL GA-1000，Single Quots kit购自Lonza，货号为CC-4182。

所述第六培养基的基础培养基包括肝细胞基础培养基。

所述第六培养基用于诱导肝祖细胞类器官分化为成熟的肝细胞类器官。

优选地，所述培养基组合包括第四培养基，所述第四培养基包括生长因子和BMP信号通路激活剂。

优选地，所述第四培养基的生长因子包含表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-1)、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子(LIF)、神经生长因子(NGF)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PDECGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)中的至少一种。

更优选地，所述第四培养基的生长因子包含肝细胞生长因子(HGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)；所述成纤维细胞生长因子(FGF)优选为成纤维细胞生长因子4(FGF-4)。

优选地，所述第四培养基中HGF的终浓度为10～30ng/mL。

优选地，所述第四培养基中FGF-4的终浓度为10～30ng/mL。

优选地，所述第四培养基中的BMP信号通路激活剂包含BMP2、BMP4、SB4、SJ000291942、SJ000063181、SJ000370178、异甘草素、香叶木素、芹菜素和鹰嘴豆芽素中的至少一种。

进一步优选地，所述第四培养基的BMP信号通路激活剂包含BMP4和BMP2。

优选地，所述第四培养基中BMP4的终浓度为5～15ng/mL。

优选地，所述第四培养基中BMP2的终浓度为5～15ng/mL。

优选地，所述第四培养基中还包含FBS、谷氨酰胺(Glutamax)、胰岛素(humaninsulin)、1-硫代甘油(1-thioglycerol)、二甲基亚砜(DMSO)和地塞米松(dexamethasone)。

优选地，所述第四培养基中FBS的终浓度为10～30w/w％。

优选地，所述第四培养基中谷氨酰胺的终浓度为0.5～1.5w/w％。

优选地，所述第四培养基中胰岛素的终浓度为0.05～0.252U/mL。

优选地，所述第四培养基中1-硫代甘油的终浓度为0.2～0.4mM。

优选地，所述第四培养基中二甲基亚砜的终浓度为0.4～0.6w/w％。

优选地，所述第四培养基中地塞米松的终浓度为50～150nM。

优选地，所述第四培养基中的基础培养基为RPMI1640和IMDM培养基中的至少一种。

所述第四培养基用于诱导内胚层分化为肝祖细胞。

优选地，所述培养基组合中包含第一培养基，所述第一培养基包含Activin A和GSK-3抑制剂。

优选地，所述GSK-3抑制剂包含B216763、TWS119、NP031112、SB216763、CHIR-98014、AZD2858、AZD1080、SB415286、LY2090314、CHIR-99021中的至少一种。

更进一步优选地，所述第一培养基中的GSK-3抑制剂包含CHIR-99021。

优选地，所述第一培养基中Activin A的终浓度为60～100ng/ml。

优选地，所述第一培养基中Activin A的终浓度为70～90ng/ml。

优选地，所述第一培养基中GSK-3抑制剂的终浓度为1～5μM。

优选地，所述第一培养基的基础培养基为DMEM高糖、DMEM-F12和RPMI1640培养基中的至少一种。

优选地，所述培养基组合中包含第二培养基，所述第二培养基包含Activin A和KnockOut血清替代物。

优选地，所述第二培养基中Activin A的终浓度为60～100ng/ml。

优选地，所述第二培养基中Activin A的终浓度为70～90ng/ml。

优选地，所述第二培养基中KnockOut血清替代物的终浓度为0.5～1.1w/w％。

优选地，所述第二培养基的基础培养基为DMEM高糖、DMEM-F12和RPMI1640培养基中的至少一种。

优选地，所述培养基组合中包含第三培养基，所述第三培养基中包含Activin A和血清替代物。

优选地，所述第三培养基中Activin A的终浓度为60～100ng/ml。

优选地，所述第三培养基中Activin A的终浓度为70～90ng/ml。

优选地，所述第三培养基中血清替代物的终浓度为5～11w/w％。

优选地，所述第三培养基的基础培养基为DMEM高糖、DMEM-F12和RPMI1640培养基中的至少一种。

优选地，所述第一培养基、第二培养基和第三培养基用于诱导干细胞分化为内胚层细胞。

本发明的第二方面，提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含本发明第一方面第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基、第五培养基、第六培养基中的至少一种。

优选地，所述试剂盒包含本发明第一方面第一培养基、第二培养基、第三培养基；用于诱导干细胞分化为内胚层细胞。

优选地，所述试剂盒包含本发明第一方面第四培养基；用于诱导内胚层细胞分化为肝祖细胞。

优选地，所述试剂盒包含本发明第一方面第五培养基；用于诱导肝祖细细胞分化为肝祖细胞类器官，并可持续扩增肝祖细胞类器官。

优选地，所述试剂盒包含本发明第一方面第六培养基；用于诱导肝祖细胞类器官分化为肝细胞类器官。

优选地，所述试剂盒包含本发明第一方面第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基、第五培养基、第六培养基；用于诱导诱导干细胞分化为肝细胞类器官。

本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述的培养基组合物或本发明第二方面所述的试剂盒的应用：

(1)制备内胚层细胞；

(2)制备肝祖细胞；

(3)制备肝细胞；

(4)构建和/或持续扩增肝祖细胞类器官；

(5)构建成熟肝细胞类器官；

(6)制备诱导干细胞分化为内胚层细胞的产品；

(7)制备诱导干细胞分化为肝祖细胞的产品；

(8)制备诱导干细胞分化为肝细胞的产品；

(9)制备构建和/或持续扩增肝祖细胞类器官的产品；

(10)制备构建成熟肝细胞类器官的产品。

优选地，所述扩增包括悬浮扩增。

优选地，所述干细胞为具有多向分化潜能的人源干细胞；

优选地，所述具有多向分化潜能的人源干细胞为人胚胎干细胞、人孤雌生殖干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞或脐血干细胞；

优选地，所述干细胞为干细胞聚集体。

优选地，所述干细胞聚集体的制备方法包括：将干细胞与消化液混合，孵育，弃消化液加入含有Rock抑制剂的mTeSR1培养基重悬，以30～100万/孔的密度接种至含有Rock抑制剂的mTeSR1培养基中，第二天更换为普通的mTeSR1培养基培养2～6天。

优选地，所述Rock抑制剂为Y-27632。

优选地，所述Rock抑制剂在mTeSR1培养基中的终浓度为8～12μM。

本发明使用Rock抑制剂的作用是在细胞传代，细胞接种时维持细胞的活力，存活能力。但研究发现Y-27632对HB类器官扩增过程中可在第0天加入以维持细胞活力，而对后续类器官的增殖其帮助不大，则HB类器官扩增中不包含Y-27632。

本发明的第四方面，提供一种肝祖细胞类器官的构建和/或持续扩增的方法，包括本发明第一方面所述第五培养基进行肝祖细胞类器官扩增培养的步骤。

优选地，为了进一步提高接种效率，可在接种肝祖细胞时另外加入8～12μM Rock抑制剂。

优选地，所述Rock抑制剂为Y-27632。

优选地，所述扩增培养的具体包括利用本发明第一方面所述第五培养基对肝祖细胞进行传代培养获得肝祖细胞类器官，并可持续扩增。

优选地，所述传代的比例为1：(3～5)。

优选地，所述传代周期为4～8天。

优选地，所述肝祖细胞可以为通过本发明第一方面所述的第四培养基诱导内胚层细胞分化的肝祖细胞。

优选地，所述诱导内胚层细胞分化为肝祖细胞的培养时间为100～188h。

优选地，所述诱导内胚层细胞分化为肝祖细胞的培养时间为120～168h。

优选地，所述内胚层细胞可以为通过本发明第一方面所述第一培养基、第二培养基、第三培养基诱导干细胞分化而成的内胚层细胞。

优选地，所述第一培养基的培养时间为18～30h。

优选地，所述第二培养基的培养时间为18～30h。

优选地，所述第三培养基的培养时间为18～30h。

本发明的第五方面，提供一种肝细胞类器官的构建的方法，包括使用本发明第一方面所述第六培养基进行肝祖细胞类器官培养的步骤。

优选地，具体包括使用本发明第一方面所述第六培养基诱导培养肝祖细胞类器官分化为成熟肝细胞类器官。

优选地，所述第六培养基的培养时间为120～240h。

优选地，所述第六培养基的培养时间为120～192h。

优选地，所述第六培养基的培养时间为130～168h。

优选地，所述肝祖细胞类器官以1：(1～4)的密度诱导为肝细胞类器官。

优选地，所述肝祖细胞类器官为本发明第四方面所述的方法构建的肝祖细胞类器官或和持续扩增肝祖细胞类器官。

本发明的第六方面，提供本发明第四方面所述的构建方法构建的肝祖细胞类器官或本发明的第五方面所述的构建方法构建的肝脏类器官在以下任一项所述的应用：

1)肝脏疾病相关的药物筛选、研发和/或毒性分析；

2)作为生物人工肝细胞源；

3)研究肝脏疾病致病机理；

4)制备治疗肝脏疾病的产品；

5)构建肝脏疾病模型；

6)肝脏毒理检测；

7)肝组织工程与再生医学。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种诱导干细胞分化为肝祖细胞类器官和/或肝细胞类器官的试剂盒，试剂盒中减少了细胞因子及其用量，使用低浓度的Matrigel分化培养类器官，更高效的支持肝祖细胞类器官和/或肝细胞类器官的长期维持和扩增。在Matrigel存在的条件下，成熟肝细胞类器官中肝细胞呈极化状态，类似于体内肝组织结果，从结构上明显不同于3D悬浮培养条件下非极化的肝细胞球(hepatic spheroids)。

本发明还提供了一种在3D悬浮培养条件下培养并分化人多功能干细胞为可长期传代扩增的肝祖细胞(HB)类器官以及诱导其为成熟肝细胞类器官的方法；首先建立了一种全程在3D培养条件下培养hPSCs且高效诱导hPSCs分化为肝祖细胞方法，并且进一步优化培养体系能够使肝祖细胞生长为肝祖细胞类器官且可长期稳定的扩增、传代以及冻存，最终再将长期培养后的肝祖细胞类器官诱导分化为功能性成熟肝细胞类器官。全程在3D悬浮培养条件下培养hPSCs且高效诱导hPSCs分化为肝祖细胞、肝祖细胞类器官可持续扩增以及高效分化为功能性肝细胞类器官，从工艺上实现hPSCs培养扩增、肝祖细胞类器官长期扩增培养、功能性肝细胞类器官生产一体化。

而且本发明的培养方法可以更好地模拟体内微环境，与2D条件下得到的肝细胞相比，成熟度更高、功能更强；在整个培养过程中使用了低浓度Matrigel(5％)，即可规模化扩增，成本也大大降低；最终建立了3D悬浮培养条件下可持续扩增、传代及冻存的肝祖细胞类器官(目前已扩增20代，并继续传代培养)，这一技术可实现体外类器官大规模化扩增培养，可望解决行业的瓶颈问题。本发明利用人多功能干细胞来源的肝祖细胞类器官体外长期维持方法，消耗更少的培养基和细胞因子以及缩短了分化时间，一个月内即可从3x10^6细胞数扩增到10^12数量级，从细胞产量、功能及成本等方面可满足临床治疗、药物筛选研发以及药物毒理分析等领域对功能性肝细胞的需求。

附图说明

图1为人多功能干细胞向肝祖细胞分化、肝祖细胞类器官维持以及诱导肝细胞成熟分化路线图；图1A为分化路线图；图1B为分化过程中各个阶段细胞球图像，比例尺＝100μm。

图2为hPSC聚集体扩增阶段检测；图2A为第五天hPSC聚集体图像，比例尺＝100μm；图2B为免疫荧光检测hPSC多能性标志物OCT4,NANOG,TRA-1-60以及SSEA4表达水平，比例尺＝100μm。

图3为DE分化阶段检测；图3A为第3天DE细胞球图像，比例尺＝100μm；图3B为qPCR检测内胚层相关基因表达水平；图3C为流式细胞术检测内胚层标志物CXCR4,SOX17表达水平；图3D为免疫荧光检测内胚层标志物FOXA2表达水平，比例尺＝100μm。

图4为肝祖细胞分化阶段检测；图4A为第6天肝祖细胞球图像，比例尺＝100μm；图4B为qPCR检测肝祖细胞相关基因表达水平；图4C为流式细胞术检测肝祖细胞标志物AFP,EPCAM表达水平；图4D为免疫荧光检测肝祖细胞标志物EPCAM,HNF4A以及AFP表达水平，比例尺＝100μm。

图5为HB类器官长期培养后检测；图5A为HB类器官第十代图像，比例尺＝100μm；图5B为HB类器官第十代HE染色切片图像，比例尺＝100μm；图5C为HB类器官第5/15代倍增时间计算；图5D为HB类器官长期培养扩增曲线；图5E为qPCR检测HB类器官相关基因表达水平；图5F为流式细胞术检测HB类器官相关标志物AFP,ALB,EPCAM,Ki67以及TBX3表达水平；图5G为HB类器官长期培养十五代后核型分析；图5H为免疫荧光检测HB类器官标志物AFP,ALB,EPCAM,SOX9,Ki67,E-cad,CK19以及HNF4A表达水平，比例尺＝100μm。

图6为第十代HB类器官冻存复苏后检测；图6A为HB类器官第十代复苏后培养第3、6天图像，比例尺＝100μm；图6B为流式细胞术检测HB类器官第十代复苏后相关标志物AFP,ALB,EPCAM,Ki67以及TBX3表达水平。

图7为搅拌式反应器规模化扩增HB类器官；图7A为规模化培养HB类器官示意图；图7B为反应器中规模化培养HB类器官细胞图像，比例尺＝100μm；图7C为静态培养与动态培养HB类器官个数对比；图7D为静态培养与动态培养HB类器官扩增能力对比；图7E为静态培养与动态培养HB类器官代时对比；图7F为动态培养过程中监测类器官直径统计图；图7G为不同细胞系来源的HB类器官扩增能力对比；图7H为反应器中长期扩增HB类器官一个月总细胞数统计。

图8为长期培养的HB类器官诱导成熟后检测；图8A为HB类器官诱导为成熟肝细胞球图像，比例尺＝100μm；图8B为qPCR检测成熟肝细胞相关基因表达水平；图8C为流式细胞术检测成熟肝细胞相关标志物ALB,A1AT以及ASGPR表达水平；图8D为免疫荧光检测成熟肝细胞标志物ALB,E-cad,ZO1,CK18,ASGPR,A1AT以及HNF4A表达水平，比例尺＝100μm。

图9为长期培养的HB类器官诱导成熟后检测；图9A为ELISA检测ALB分泌水平；图9B为PAS染色图像，比例尺＝100μm；图9C为ICG染色图像，比例尺＝100μm；图9D为qPCR检测尿素循环相关基因表达水平；图9E为尿素合成能力检测；图9F为qPCR检测一级代谢酶相关基因表达水平；图9G为试剂盒检测一级代谢酶表达水平检测；图9H为免疫荧光检测肝细胞极化标志物；图9I为CDFDA检测成熟肝细胞类器官胆小管。

图10为非酒精性脂肪肝疾病模型的构建；图10A为油红检测OA诱导后的脂滴形成，比例尺＝100μm；图10B为OA诱导后甘油三酯水平检测；图10C为OA诱导后细胞内氧化应激水平检测；图10D为氧化应激水平定量统计图；图10E为qPCR检测OA诱导后脂质蓄积相关基因表达水平；图10F为OA+亚精胺处理肝细胞类器官后油红检测脂滴水平，比例尺＝100μm；图10G为细胞内脂滴水平定量统计图；图10H为细胞内甘油三酯水平检测；图10I为qPCR检测OA+亚精胺处理肝细胞类器官后脂质蓄积相关基因表达水平。

图11为药物筛选/毒性分析模型的构建；图11A为药物筛选IC50曲线统计图；图11B为IC50统计图；图11C为IC50结果汇总表格。

图12为CDFDA检测胆汁淤积表型的发生，比例尺＝50μm。

图13为极化肝细胞类器官治疗急性肝衰小鼠；图13A为小鼠急性肝衰模型构建以及治疗方案示意图；图13B为小鼠存活率统计图；图13C为肝损伤指标ALT，AST，TBIL，ALP以及血氨检测统计图；图13D为人源白蛋白分泌水平检测定量图；图13E为小鼠肝脏组织对比图；图13F为小鼠肝脏组织HE染色对比图；图13G为小鼠肝损伤区域统计图。

图14为HB类器官扩增体系中不同Matrigel浓度的影响；图14A为去除Matrigel后肝祖细胞球培养形态图，比例尺＝100μm；图14B为去除Matrigel后肝祖细胞扩增能力统计；图14C为流式细胞术检测去除Matrigel后肝祖细胞相关标志物表达水平；图14D为不同浓度Matrigel在传代后扩增第5天的细胞图像，比例尺＝100μm。

图15为HB类器官扩增培养基成分筛选；图15A为实施逐减法后各组细胞球形态，比例尺＝100μm；图15B为实施逐减法后各组细胞成克隆率统计；图15C为流式细胞术检测实施逐减法后各组细胞对于增殖标志物Ki67表达水平；图15D为实施逐减法后各组细胞对于增殖标志物Ki67表达水平统计。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

定义

术语“干细胞”是指能够自我复制并且具有多能性或多潜能性的细胞。通常来说，干细胞可以使受伤组织再生。本文中的干细胞可以是但不限于胚胎干(ES)细胞、诱导多能干细胞或组织干细胞(也称为组织特异性干细胞或体干细胞)。

“胚胎干(ES)细胞”是来源于早期胚胎的多能干细胞。ES细胞最初于1981年建立，其自1989年以来也应用于敲除小鼠的产生。在1998年，建立了人ES细胞，其目前正变得可用于再生医学。

与ES细胞不同，组织干细胞具有有限的分化潜能。组织干细胞存在于组织中的特定位置并且具有未分化的细胞内结构。因此，组织干细胞的多能性通常较低。组织干细胞具有较高的核/质比并具有较少的细胞内细胞器。大多数组织干细胞具有低多能性、长细胞周期和超过个体寿命的增殖能力。基于细胞来源于的部位例如皮肤系统、消化系统、骨髓系统、神经系统等，将组织干细胞分成几类。皮肤系统中的组织干细胞包括表皮干细胞、毛囊干细胞等。消化系统中的组织干细胞包括胰腺(常见)干细胞、肝干细胞等。骨髓系统中的组织干细胞包括造血干细胞、间充质干细胞等。神经系统中的组织干细胞包括神经干细胞、视网膜干细胞等。

“诱导多能干细胞”(通常缩写为iPS细胞或iPSC)是指通过引入某些称为重编程因子的因子由非多能细胞(通常体细胞)或终末分化细胞(例如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等)人工制备的多能干细胞类型。

术语“分化”是一种过程，通过该过程，较不特化的细胞形成至少一种更特化的新细胞类型的后代。

术语“SB431542”还包括SB431542及其盐，尤其是药学上可接受的盐。

术语“CHIR99021”包括CHIR99021及其盐，尤其是药学上可接受的盐。

术语“Y-27632”还包括Y-27632及其盐，尤其是药学上可接受的盐。优选的药学上可接受的盐是Y-27632 2HCL。

术语“成纤维细胞生长因子”由垂体和下丘脑分泌的多肽，能促进成纤维细胞有丝分裂、中胚层细胞的生长，还可刺激血管形成，在创伤愈合及肢体再生中发挥作用，有酸性(pI 5.6)和碱性(pI 9.6)两种，即aFGF和bFGF。

术语“骨形态发生蛋白4”即bone morphogenetic protein-4，BMP4，在胚胎发育时期对多种细胞的增殖分化具有调控作用。

实施例1

一种试剂盒，包含第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基、第五培养基和第六培养基。

第一培养基为：1640培养基(Gibco，61870036)+80ng/ml Activin A(Peprotech，120-14)+3μM CHIR99021(Selleck，CT99021)；

第二培养基为：1640培养基+80ng/ml Activin A+0.8％ KSR(Thermo,10828028)；

第三培养基为：1640培养基+80ng/ml Activin A+8％ KSR。

第四培养基(HB培养基)为：IMDM media(Gibco，31980030)+20％ FBS(胎牛血清，VISTECH，SE100-B7953)+1％w/w GlutaMAX(Gibco，35050061)+0.126U/mL human insulin(重组人胰岛素，Sigma，91077C-1)+0.3mM 1-thioglycerol(1-硫代甘油，Sigma，M6145)+20ng/mL FGF-4(Peprotech，100-18B)+20ng/mL HGF(Peprotech，100-39)+10ng/mL BMP2(Peprotech，120-02)+10ng/mL BMP4(Peprotech，120-05)+0.5％ DMSO(二甲基亚砜，MPBiomedical，196055)+100nM dexamethasone(地塞米松，Sigma，D4902)。

第五培养基为：肝祖细胞(HB)类器官扩增培养基+5％Matrigel(Corning,354230)。

其中肝祖细胞(HB)类器官扩增培养基为：IMDM+10％w/w FBS+1％w/w ITS(biogems,00-101)+1％w/w NEAA(Gibco,11140050)+1％w/wGlutaMAX(Gibco，35050061)+10mM烟酰胺(Sigma,N0636)+5μM CHIR99021+10μM SB431542(Selleckchem,S1067)+10μMFSK(MCE,HY-15371)+20ng/mL FGF-4+20ng/mL BMP4+20ng/mL EGF(Peprotech,AF-100-15)。

第六培养基为：肝细胞类器官成熟培养基+5％Matrigel(Corning,354230)。

其中肝细胞类器官成熟培养基为：Hepatocyte basal medium(Lonza，CC-3911)+Single Quots kit(Lonza，CC-4182)+20ng/mL HGF+50ng/mL oncostatin M(Peprotech，300-10)+0.5％ DMSO+100nM dexamethasone(Sigma，D4902)+20ng/mL FGF-4+2％w/w B27(Gibco,17504044)。

实施例2

一种高效的人多功功能干细胞(hPSCs)3D悬浮定向诱导分化肝祖细胞的方法，路线图如图1所示，具体包括以下步骤：

1、3D悬浮培养条件下，人多功能干细胞以聚集体形式进行扩增：细胞皆培养于37℃，5％ CO2条件的细胞培养箱中。选取贴壁2D培养的状态良好的hPSC细胞(状态良好：在hPSC传代后4-5天时，细胞覆盖率达70％-80％左右，克隆边缘规整且无分化细胞的hPSC)，吸弃培养基后加入1mL PBS清洗孔中细胞，吸弃后加入1mL GCDR(消化酶)，放回CO₂培养箱中孵育4-6分钟，之后吸弃孔中的GCDR，加入1mL含有10μM的Y-27632的mTeSR1培养基，用移液枪轻柔吹打至单细胞状态，获得单细胞悬液，将单细胞悬液接种至低粘附6孔板中，接种密度为50万细胞/mL，每孔3mL，补充培养基中的Y-27632至10μM，放入培养箱中培养，第二天更换培养基为普通的mTeSR1培养基，之后每日换液，培养至第五天即完成人多能干细胞在3D悬浮培养条件下的扩增。

取一部分细胞球进行质量检测，结果如图2所示，图2A为光学显微镜下hPSC聚集体形态，另外通过免疫荧光检测hPSC此条件下扩增5天后的多能性marker表达，结果显示其依然高表达OCT4，NANOG，TRA-1-60以及SSEA4(图2B)，表明此培养条件能够维持hPSC的多能性，适合用于后续分化。

2、收集hPSC聚集体后，用PBS清洗聚集体一次，之后开始为期3天的DE分化过程：

3D悬浮培养条件下，人多功能干细胞聚集体向内胚层(DE)分化：DE分化过程每天需更换不同的培养基，首先配制DE分化培养基，第一天使用第一培养基；第二天使用第二培养基；第三天使用第三培养基。经过3天的诱导分化后，取一部分细胞球进行检测，结果如图3所示，相比于未分化状态下的多能干细胞，DE分化后高表达SOX17，FOXA2以及GATA4这三个内胚层相关基因，并且，通过流式细胞术以及免疫荧光检测，同样发现在诱导分化后其对于CXCR4，SOX17以及FOXA2这三个内胚层标志物表达水平很高，说明此时获得了较高纯度的DE细胞，适用于后续的肝细胞分化。

3、收集DE细胞球后，用PBS清洗一次，之后开始使用第四培养基进行为期6天的肝祖细胞分化，每日换液，3D悬浮培养条件下，DE细胞球向肝祖细胞球分化。

6天后取一部分细胞进行检测，结果如图4所示，在经过6天的分化后，细胞球结构由分化前实心的DE细胞球变为了相对空心的肝祖细胞球状态，其高表达甲胎蛋白(AFP)以及EPCAM，表明大多细胞都为肝祖细胞状态；通过qPCR分析其基因表达水平，也表明此状态下高表达肝祖细胞的相关基因，说明其具有肝祖细胞基因表达特征；最后也通过免疫荧光验证了其高表达肝祖细胞标志物EPCAM，HNF4A以及AFP，说明通过本实施例的分化方法，最终能够高效的获得高纯度的肝祖细胞，用于后续实验。

实施例3

一种高效的在3D悬浮培养条件下长期扩增和维持肝祖细胞(HB)类器官方法，使用第五培养基进行诱导培养，具体包括以下步骤：

1、将诱导分化6天后的HB细胞球利用TrypLE消化为单细胞，具体步骤为收集HB细胞球后，PBS清洗一遍，之后吸弃PBS，加入1mL TrypLE后，放入培养箱中消化5-7分钟，之后轻柔吹打为单细胞悬液，加入500μL HB培养基终止消化，1,500rpm离心5分钟，吸弃上清液后，用HB培养基重悬单细胞悬液，之后将单细胞悬液以20万/mL的密度接种入新的低粘附6孔板中，每孔接种2.5mL肝祖细胞(HB)类器官扩增培养基，另外在接种时需另外加入10μMY-27632。

2、接种后第1天，不需要更换培养基，直接加入5％体积的Growth factor reducedMatrigel，Matrigel富含细胞外基质，能够在3D悬浮培养条件下提供给肝祖细胞细胞外基质的支持，在此体系中至关重要。通过加入了5％的Matrigel，肝祖细胞会形成肝细胞类器官样的空泡细胞球结构，而不加入Matrigel的对照组中肝祖细胞则逐渐死亡，无法长期维持扩增。

3、第2天后，补充1mL肝祖细胞(HB)类器官扩增培养基，之后每日更换2mL培养基。更换培养基时，倾斜孔板，时细胞球沉降至孔底，吸弃上面的培养基后再加入新鲜培养基。

4、培养至6-7天时进行细胞传代，此时细胞球呈肝细胞类器官样的空心细胞球形态，如图5A所示。传代步骤：收集所有细胞球，1,000rpm离心2分钟，吸弃上清后用PBS清洗一次，之后离心吸弃PBS，加入1mL TrypLE，放入培养箱中消化5-7分钟，之后轻柔吹打为单细胞悬液，加入500μL HB培养基终止消化，1,500rpm离心5分钟，吸弃上清液后，若按照1:4的比例传代，则用400μL HB培养基重悬单细胞悬液，同时加入400μL的Matrigel，轻柔混合均匀后置于冰上待用；向6孔板中每孔加入1.8mL HB扩增培养基，之后每孔加入200μL细胞悬液与Matrigel的混合液，加入后再用1mL枪头轻柔吹打混匀体系，放回培养箱中进行培养。传代后第一天即可观察到形成了薄层的Matrigel，以及包裹在Matrigel中的小细胞球，3-4天后细胞球会进入指数生长期，由实心细胞球变为肝细胞类器官样的空心细胞球形态，迅速进行扩增，6-7天后再次进行传代。

5、可冻存复苏性能：长期培养过程中，HB细胞球能够冻存，复苏，可在液氮中长期保存，一般原代肝细胞冻存后复苏细胞存活率非常低，且复苏后肝功能丧失严重，而HB细胞的冻存复苏性能很好，复苏后依然能够形成空心细胞球，并且维持高效的扩增能力。冻存复苏步骤：收集所有细胞球，1,000rpm离心2分钟，吸弃上清后用PBS清洗一次，之后离心吸弃PBS，加入1mL TrypLE，放入培养箱中消化5-7分钟，之后轻柔吹打为小细胞团，加入500μLHB培养基终止消化，1,500rpm离心5分钟，吸弃上清液后，加入1mL mFreSR，轻柔吹打起小细胞团后，转移如冻存管中进行冻存。

对长期培养后吸取一部分HB类器官进行检测，结果如图5，图6所示。首先可见细胞球形态明显与之前不同，此阶段的细胞球十分接近肝细胞类器官的空心细胞球样结构，HE染色切片结果同样显示其仅由一层细胞组成空心球状结构。在此培养体系下，HB细胞倍增时间在45小时左右，平均6天传代一次，每代细胞能够稳定扩增6-8倍，若起始为10万细胞数，则通过7代的培养则可收获10^11次方肝祖细胞。通过qPCR检测发现其依然高表达肝祖细胞相关基因，另外，通过流式细胞术以及免疫荧光分析蛋白表达水平，也验证了其高表达AFP、ALB、HNF4A、EPCAM、SOX9、TBX3、TBX3、CK19以及TBX3这些肝祖细胞标志物，另外Ki67检测也证明了其呈现Ki67高阳性率，表明细胞处于活跃的增殖状态。另外，在长期培养HB类器官十五代后对其进行核型分析，结果表明染色体皆正常，并未发生染色体突变，表明本发明的培养体系很稳定。

对第十代的HB类器官进行冻存，发现其在复苏之后，依然能够自发形成细胞球，具有较高的复苏效率以及复苏后成球效率，并且同样能够形成肝细胞类器官样结构。进行流式细胞术检测后发现，其在复苏后也依然维持了肝祖细胞特征标志物的表达，高表达AFP、ALB、EPCAM、TBX3以及Ki67，表明经过长时间冻存后，细胞依然具有维持肝祖细胞特性的复苏能力。

实施例4

生物反应器(转瓶)中高效的规模化扩增HB类器官方法，具体步骤如下。

收集长期培养的HB类器官，1,000rpm离心1分钟后，PBS清洗一次，吸弃上清后加入1mL TeypLE置于37度下进行细胞消化，消化5分钟后，加入含血清培养基中和，将其吹打为单细胞悬液，之后1,500rpm离心5分钟后，吸弃上清，用HB类器官扩增培养基重悬后进行细胞计数，将300万单细胞接种至低粘附10厘米培养皿中静态培养24小时，于低粘附10厘米培养皿中，培养基用10毫升，加入5％ Matrigel即500微升进行培养；24小时后，将低粘附10厘米培养皿中的小HB类器官轻柔的转移入转瓶中，补充培养基至30毫升，并补充1毫升Matrigel至总体系的5％，转瓶转速设为60转，持续搅拌。在转瓶中培养过程中，每天半换液，换液过程中先静置5分钟使类器官沉降至瓶底，再吸弃上部分的培养基，补充新培养基。7天后对细胞进行收获。

结果表明，反应器中HB类器官依然呈典型的空泡状，相比于静态培养，动态培养下能够收获比静态培养多两杯的类器官数量，并且不同细胞系在反应器中的扩增效率相近，表明此扩增体系的稳定性。最后，用H9分化的HB类器官在反应器中进行了为期一个月的长期培养，与静态培养板/皿培养下长期培养一致，其在反应器中进行长期培养同样能够稳定的持续扩增，平均每代扩增24倍左右，扩增4代能够获得10^12次方数量级以上的HB类器官，能够满足临床上肝细胞移植所需的治疗量(图7)。

实施例5

一种高效的诱导长期培养HB类器官分化为成熟肝细胞类器官方法以及应用。

1、收集长期培养的HB类器官，1000rpm离心1分钟后，PBS清洗一次，吸弃上清后加入配制好的第六培养基轻柔将细胞球重悬起来后，转入新的低粘附6孔板中进行培养,在转移时需要加入5％的Matrigel到孔中，以支持成熟肝细胞类器官的生长。例如将HB类器官转移到六孔板中的一个孔里时，首先用1.9mL第六培养基轻柔重悬HB类器官后，再加入0.1mL于冰上预冷的Matrigel，轻柔混匀后再将2mL的悬液转移到孔中进行培养。每两天更换一次培养基，此时仅需更换肝细胞类器官成熟培养基，不需要再额外加入Matrigel。1孔HB类器官应至少以1:2的密度进行成熟诱导。

在6天后取一部分肝细胞类器官进行检测，检测肝功能成熟度，结果如图8所示。通过qPCR检测，发现其在此阶段下成熟肝细胞类器官高表达ALB、A1AT、HFN4A、ASGPR、FXR、UGT1A1等肝功能特征基因，大多基因的表达水平接近，甚至高于体外培养24小时的新鲜原代人肝细胞(PHH)的表达水平，另外，对于增殖基因Ki67，其也从高表达状态在成熟后转为了低表达状态，这点与PHH也是类似的。通过流式细胞术以及免疫荧光分析成熟肝细胞特异性高表达的蛋白标志物，也验证了在诱导成熟后，高表达ALB、A1AT、ASGPR、ZO1、CK18、HNF4A以及E-cad，表明此阶段细胞确实为成熟肝细胞。

之后进行了一系列的体外肝功能性检测，如图9所示。ALB分泌水平能够达到5μg/mL；利用PAS进行糖原染色，结果表明肝细胞球具有糖原贮存能力；另外利用吲哚花青绿(ICG)进行染色，染色1小时后细胞球变绿，洗去染液1小时后细胞球又排出绿色的ICG，表明肝细胞球具有转运能力；检测其尿素代谢能力，发现CPS1,NAGS,ASS1以及ASL等氨代谢相关基因都呈高表达状态，表达水平与PHH接近，进行尿素合成能力检测同样发现其尿素产量与PHH相差无几；最后，进行药物代谢能力检测，通过加入利福平(rifampicin)和奥美拉磋(omeprazole)诱导一级代谢酶的表达，发现在诱导后，肝细胞球对CYP3A4、CYP2C9、CYP1A1以及CYP1B1的表达水平接近甚至超过了PHH，利用试剂盒检测药物代谢水平也同样证实了其表达水平在诱导后有显著的提高。

另外，人体内肝脏在正常的生理状态下是具有极性的，即具有顶膜和基底膜，实现对营养物质和肝细胞合成物质的方向性吸收以及释放。类器官除了具有特定的功能，具有结构特点或特征是与细胞球的主要区别。在此条件下成熟的肝细胞类器官同样是具有极性的，通过免疫荧光的分析，发现肝细胞类器官的内部定位有ZO1，MDR1以及Factin这些顶膜标志物，而NTCP这一基底膜标志物则表达于肝细胞类器官的外侧即基底膜侧，表明本发明诱导成熟的肝细胞类器官具有显著的极化特征，与体内结果类似；另外，通过CDFDA分析，发现此条件下诱导成熟的肝细胞类器官具有显著的胆小管分布，这对于肝细胞类器官后续的应用，如药物筛选以及病毒性肝炎模型的构建尤为重要，是不同于非极化状态的肝细胞球。

以上结果表明，HB类器官在经过长期培养后，依然具有诱导为成熟的具有极性的功能性肝细胞类器官的能力，具有媲美PHH的肝功能等级。此技术为规模化生产功能性肝细胞提供了保障。

2、成熟肝细胞类器官的疾病模型(肝细胞脂质蓄积模型)构建具体步骤如下。

在诱导长期培养的HB类器官为成熟肝细胞类器官(诱导6天即可进行脂质蓄积模型构建)后，分别利用200，800μM的油酸(oleic acid，OA)诱导脂质蓄积模型的构建。在经过2天的OA处理后，通过油红染色结果即可发现，随着OA浓度升高，细胞球中脂滴的含量逐渐升高，表明细胞球发生了脂肪变性。之后利用流式细胞仪检测细胞内氧化应激ROS的水平，同样发现加入OA后细胞内ROS随之升高，表明细胞球中产生了氧化应激；之后，利用试剂盒对细胞内甘油三酯水平，结果也表明随着培养基中OA浓度升高，细胞内甘油三酯的水平也随之升高，代表着肝细胞脂质蓄积的发生。通过qPCR对造模后细胞球的基因表达进行检测，结果同样发现脂质蓄积特征基因如FASN，PLIN2等基因的表达水平显著上升，表明脂质蓄积模型构建的成功。之后利用了亚精胺(spermidine,SPD)，一种缓解肝细胞脂质蓄积的药物，来进行挽救实验。在OA处理的同时加入了200μM的SPD进行处理，结果表明在2天后，SPD加入组中脂滴的相对数量显著降低，同时脂质蓄积相关基因表达水平也有所下降(图10)，表明本实施例制备的极化肝细胞类器官作为脂质蓄积模型是能够成功诱导出疾病对应症状，并且能够接受药物的治疗。以上结果为之后将极化肝细胞类器官应用于肝细胞脂质蓄积模型相关药物的开发以及脂质蓄积的治疗方面建立了基础。

实施例6药物筛选、药物研发和毒理分析

将成熟的极化肝细胞类器官应用于肝细胞药物筛选/药物毒理分析的构建方法。

收集诱导成熟后的极化肝细胞类器官(诱导成熟后6天即可应用于药物筛选模型中)，用移液枪将其分至低粘附96孔板中，每孔约10-20个类器官，之后即可对不同药物进行毒理分析。本实施例中分别对8种药物(Mannitol、Troglitazone、Chlorpromazine、Diclofenac、Cyclosporine A、Nefazodone、Tolcapone、Bosentan)进行了毒理分析，检测极化肝细胞类器官进行药物筛选/毒理分析的能力；在进行毒理分析时，每种药物选择至少7个不同的浓度，每个浓度实施三个重复孔，在药物处理48小时后，利用细胞活力检测试剂盒对细胞活力进行检测，绘制IC50曲线，最终计算出每个药物对每种细胞的IC50值。在实验中，同时还用非极化的肝细胞球以及HepG2(肝癌细胞系，常用于肝细胞药物筛选)细胞球同时进行药物毒理分析。

最终结果表明，对于8种不同药物，除了对肝细胞无毒性的Mannitol外，极化肝细胞类器官对其余药物的敏感性都是最强的，其有最低的IC50数值，而HepG2，经常被用作药物筛选的肝癌细胞系对大多药物都表现出了较强的抗药性，其具有最高的IC50数值，这就表明如果用HepG2进行前期药物开发的细胞实验，获得的IC50数值将无法应用于后续的动物实验以及临床研究中，而极化肝细胞类器官对药物表现出的敏感性则能更快的体现出药物诱导肝损伤的发生，为后续的药物开发打下基础。另外对这些药物进行了CDFDA检测，通过利用每种药物的IC25数值处理细胞48小时，之后检测在药物处理后胆汁淤积表型的发生。结果表明，如报道一致，Mannitol，Tolcapone以及Dicofenac并不会诱导胆汁淤积，而其他药物则导致了不同程度的胆汁淤积，导致CDFDA无法进入肝细胞类器官的内部，表明制备的极化肝细胞类器官能够正确的反应药物对肝细胞带来的损失影响(图11，图12)。

实施例7：肝细胞类器官用于救治急性肝衰动物

将成熟的极化肝细胞类器官应用于救治急性肝衰小鼠的方法。

利用FRG品系的免疫缺陷小鼠构建急性肝衰模型：在细胞移植的前两天时，根据每只小鼠体重，通过腹腔注射600mg/ml的硫代乙酰胺(thiacetamide，TAA)；细胞移植的前一天时，同样根据每只小鼠体重，腹腔注射1200mg/ml的TAA。此时小鼠若无法即使治疗，一般会在3-4天内由于肝衰竭而死亡。在注射了TAA后，实验组小鼠在注射18小时后进行极化肝细胞类器官肾包膜移植，而对照组小鼠同样进行手术，但其向肾包膜中注射PBS。手术后每日观察小鼠状态，计算小鼠存活率，并在7天后对存活小鼠进行检测。

结果表明，在手术移植了极化肝细胞类器官后，7天后小鼠存活率为71％，而对照组仅为22％，两组间存在显著性差异，表明极化的肝细胞类器官能够挽救急性肝衰小鼠的生命，同时也表明极化肝细胞类器官在体内同样能够发挥肝细胞功能。在检测肝损伤指标ALT，AST，TBIL，ALP以及血氨后也发现，相比于对照组，实验组能够使小鼠肝损伤更快的恢复。7天后对各组小鼠肝脏进行取样拍照，同样也能够看到在移植了极化肝细胞类器官后，小鼠的肝脏表现的更加接近正常小鼠肝脏的模样，而对照组小鼠肝脏则存在明显的肝坏死区域(图13)。

以上结果表明极化肝细胞类器官不仅在体外具有成熟肝细胞相关功能，其在小鼠体内同样能够发挥肝细胞的功能，挽救急性肝衰小鼠的生命，这表明肝细胞类器官将来可以用于肝细胞细胞移植和生物人工肝的细胞源。

对比例1

HB类器官扩增阶段培养体系所用培养基为：IMDM培养基+10％ FBS+1x ITS+1xNEAA+1x GlutaMAX+10mM烟酰胺+5μM CHIR99021+10μM SB431542+10μM FSK+20ng/mL FGF-4+20ng/mL BMP4+20ng/mL EGF+5％ Matrigel。其中，Matrigel对于本体系至关重要，它能够在3D悬浮培养条件下为HB类器官提供细胞外基质，以支持其长期培养。若在体系中去除Matrigel，则会导致细胞无法长期培养，无法高效扩增；细胞球形态不再像肝细胞类器官的空心样单层结构，反而是实心肝细胞球中间出现许多空泡，如图14A所示。此条件下细胞扩增能力逐渐下降，培养至第5代后就基本无法再继续扩增，虽然通过流式细胞术检测结果表明，仅去除Matrigel依然能维持肝祖细胞的特征标志物表达，但由于其无法继续支持细胞正常扩增，故无法达到规模化肝细胞的目的。同时，5％的Matrigel浓度也是十分关键的，如图14D所示，同样是传代后第5天，在5％Matrigel条件下，HB类器官大多呈单个，饱满的空心状类器官形态，而2.5％Matrigel组中，HB类器官则呈多泡状细胞球样，十分不规则，也难以后续直接进行成熟诱导；而在10％Matrigel组中，HB类器官则的体积则明显更小，表明此条件下其细胞增殖相对5％Matrigel组更慢。相比于其他文献发表的肝细胞类器官培养方法，由于目前大家普遍使用“悬滴法”形成Matrigel+细胞悬液的微滴，这需要50％至100％的Matrigel来支持类器官生长，后续难以真正应用于规模化生产中[5,6]。由此可见，5％Matrigel对于本发明所建立的肝祖细胞规模化扩增体系是必不可少的。

5.Wang,S.,et al.,Human ESC-derived expandable hepatic organoidsenable therapeuticliver repopulation and pathophysiological modeling ofalcoholic liver injury.Cell Res,

2019.29(12):p.1009-1026.

6.Mun,S.J.,et al.,Generation of expandable human pluripotent stemcell-derivedhepatocyte-like liver organoids.J Hepatol,2019.71(5):p.970-985.

对比例2

HB类器官扩增培养基配方的研制起初是根据在体内外影响肝祖细胞再生/增殖/扩增的相关信号通路，选择对应通路的小分子或者细胞因子来模拟肝祖细胞再生的过程，最终建立的小分子+细胞因子组合。通过大量文献调研，发现了Wnt，TGFβ，cAMP，Activin，EGF以及HGF相关通路与肝祖细胞的再生相关，所以起初肝祖细胞扩增培养基所选用的小分子+细胞因子组合为CHIR99021+SB431542+FSK+Y27632+FGF-4+BMP4+HGF+EGF，发现此组合能够支持肝祖细胞在3D条件下的长期培养。之后，通过逐减法，即逐一减去小分子/细胞因子，来验证哪些小分子/细胞因子对于肝祖细胞的长期培养是必不可少的。实验结果如图15所示，首先从细胞球形态分析，去掉CHIR99021以及FSK后，细胞球无法形成空心的类器官样结构，与完全培养基组差异显著；其次，从接种细胞后的成克隆效率分析，去掉CHIR99021，SB431542以及FSK后，成克隆效率显著降低，这就说明这三个小分子对于本扩增体系必不可少，而去掉任何一个细胞因子则对于细胞球形态和成克隆率影响不大。最后，通过流式细胞术检测细胞增殖标志物——Ki67的表达水平，除去之前已经证实了必不可少的CHIR99021以及SB431542外，结果发现，相比于完全培养基组的Ki67表达水平，去掉Y27632以及HGF后，其Ki67表达水平有表达水平更高的峰存在，表明去掉这两个小分子/细胞因子后，细胞增殖能力更显著。所以最终确定的HB类器官扩增培养基即为本实施例1中第五培养基：IMDM培养基+10％w/w FBS+1％w/wITS+1％w/w NEAA+1％w/wGlutaMAX+10mM烟酰胺+5μM CHIR99021+10μM SB431542+10μM FSK+20ng/mL FGF-4+20ng/mL BMP4+20ng/mL EGF+5％ Matrigel。

本发明全程都在3D悬浮培养条件下进行人多功能干细胞培养扩增、肝祖细胞类器官的分化和可持续培养及规模化扩增、规模化分化肝细胞类器官一体化。相比于2D培养条件，3D悬浮培养条件下才能真正进行细胞的规模化生产，而之前所报道的肝祖细胞/类器官长期培养都仅在2D培养条件下开展实验，并不能应用于实际生产中，而3D悬浮培养条件下，结合3D规模化反应器的应用，才能最终高效的实现细胞生产的规模化扩增和分化一体化。这归功于本发明建立3D悬浮人多功能干细胞培养技术、3D悬浮多阶段分化技术、3D悬浮扩增技术等的组合，并联合使用低浓度Matrigel等方法实现的。

本发明也可以模拟体内肝脏细胞发育过程和环境，对于肝细胞来说，3D悬浮培养条件下形成的肝细胞类器官，由于其能更好的模拟体内肝脏的3D结构，同时Matrigel诱导肝细胞极化，相比于2D单层培养的肝细胞，结果更类似于体内肝组织结构特点，其肝功能更强，最终规模化获得的肝细胞类器官也更适合于各种应用。这个优点基于本发明建立的各种3D悬浮培养、扩增技术。

本发明采用扩增使用低浓度和研发的培养基体系组合。仅以5％的Matrigel作为细胞外基质支持肝祖细胞类器官的规模化扩增。前文已经表明了对于肝祖细胞类器官在3D悬浮培养条件下长期培养，加入细胞外基质——Matrigel的重要性。这点和类器官的3D培养很相似，但是肝细胞类器官的3D培养，都是利用高浓度的Matrigel形成悬滴，再接种细胞进去进行培养，这种方法产生的肝细胞类器官同样具有长期培养能力，但其扩增能力和成克隆效率十分低，所以要花费两周才能传代一次，并且利用如此高浓度的Matrigel，无法与3D规模化生物反应器结合，无法真正应用于肝细胞规模化实际生产中，终归只能与实验室进行研究。而本发明通过仅以5％的Matrigel作为细胞外基质，能够使肝祖细胞类器官在3D条件下更高效的增殖，并且足以支持其长期培养至20代，这为将来与3D规模化生物反应器结合，真正的获得规模化后的肝细胞提供了技术的保障。这个优点在于经过大量的尝试，本发明成功地发现5％的低浓度Matrigel能够支持肝祖细胞类器官在3D悬浮培养条件下进行可持续性扩增，这是规模化扩增肝祖细胞类器官及规模化生产功能性肝细胞类器官的关键。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.一种培养基组合物；包括第五培养基，所述第五培养基包括Matrigel、TGFβ/ALK抑制剂、GSK3β抑制剂和FSK；优选地，所述Matrigel的终浓度为3～8v/v％。

2.根据权利要求所述培养基组合物，其特征在于，所述培养基组合物还包含第六培养基，所述第六培养基中包含Matrigel、生长因子；所述Matrigel的终浓度为3～8v/v％；优选地，所述第六培养基的生长因子包含表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-1)、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子(LIF)、神经生长因子(NGF)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PDECGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述培养基包含第四培养基，所述第四培养基包括生长因子和BMP信号通路激活剂；所述第四培养基的生长因子包含EGF、PDGF、FGF、HGF、IGF-1、IGF-Ⅱ、LIF、NGF、抑瘤素M、PDECGF、TGF-α、VEGF中的至少一种；所述第四培养基中的BMP信号通路激活剂包含BMP2、BMP4、SB4、SJ000291942、SJ000063181、SJ000370178、异甘草素、香叶木素、芹菜素和鹰嘴豆芽素中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述培养基组合还包括第一培养基、第二培养基、第三培养基，所述第一培养基中包含Activin A和GSK-3抑制剂；所述第二培养基中包含Activin A、knockout血清替代物；所述第三培养基中包含Activin A、血清替代物；优选地，所述第一培养基中GSK-3抑制剂包含B216763、TWS119、NP031112、SB216763、CHIR-98014、AZD2858、AZD1080、SB415286、LY2090314、CHIR-99021中的至少一种。

5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～4任一项所述的第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基、第五培养基、第六培养基中的至少一种。

6.权利要求1～4任一项所述的培养基组合物或权利要求5所述的试剂盒的应用：