CN115786259A - 一种诱导干细胞分化为巨核细胞和/或血小板的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种诱导干细胞分化为巨核细胞和/或血小板的试剂盒及其应用。该试剂盒可以在避免引入外源细胞和外源基因的情况下诱导干细胞分化为巨核细胞和/或血小板，采用该试剂盒可以高度模拟体内巨核细胞和血小板的生成过程，将干细胞依次诱导成中内胚层细胞、造血内皮细胞，并产生巨核红系祖细胞，巨核红系祖细胞进一步发育为具有多倍体特征的巨核细胞，最终产生具有与天然血小板相似功能性的干细胞源血小板，并且干细胞具有无限增殖的潜能，在体外可以大量扩增，这也为血小板的体外制备提供无限的细胞来源。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诱导干细胞分化为巨核细胞和/或血小板的试剂盒及其应用。
背景技术
血小板是骨髓中成熟的多核巨核细胞经细胞骨架重排和胞浆裂解后脱落下来的小块胞质，在血液循环中能存活5～7天。在人体内，血小板的主要作用是作为止血和血栓形成的调节剂；此外，血小板对破损血管的修复和血管内皮的保护具有重要的功能；同时，也有研究证明血小板在先天性免疫、调节肿瘤生长和血管外渗中有重要的作用。正常人体内每升血液中含有100～300亿个血小板。在临床上许多疾病，如再生障碍性贫血、白血病和系统性红斑狼疮等，会导致血小板数量的减少。当人体内每升血液中血小板的数量低于10～20亿个的时候，止血系统会出现严重的障碍，有导致自发性出血的风险，需要注射血小板进行治疗。目前，用于临床治疗的血小板主要来源于献血者，一个血小板治疗单位至少需要250亿个血小板，需要从1升全血中提取出来，相当于需要5个献血者来完成；而且，由于血小板在体内的存活时间仅有1周左右，因此血小板治疗的药效期是有限的。对于血小板含量长期不足的患者，需要反复注射血小板来维持治疗效果。血小板的来源有限，需求量甚大，这无疑会造成严重的医疗压力。因此，急需寻找除献血来源之外的血小板获得途径。
巨核细胞在体内的发育是一个复杂的过程。首先，位于造血谱系发育顶端的造血干细胞在骨髓中经过不对称分裂形成两个细胞，一个是保持自我更新能力的造血干细胞，另一个是能发育为多种造血谱系但缺乏自我更新能力的造血祖细胞。随后，造血祖细胞经细胞因子的诱导和特定转录因子的调控，向髓系祖细胞或淋巴系祖细胞分化。当髓系祖细胞产生后，其能继续发育并产生具有向红系和巨核系双向分化潜能的巨核红系祖细胞。巨核红系祖细胞在细胞因子EPO和转录因子KLF1等因素的调控下能发生偏向红系谱系的发育；再在细胞因子TPO和转录因子FLI1等因素的调控下能发生偏向巨核谱系的发育，并迁移到骨髓血窦附近的位置。分化早期的巨核细胞首先表达CD61和CD41a两个特异性的免疫标志物。随着巨核细胞发育成熟，表面抗原CD42a、CD42b和CD42d等陆续开始表达，并在成熟阶段表达水平达到最高；CD42b的表达可能会随着血小板的产生而逐渐丢失。通过对体内巨核细胞的转录组学分析，发现人体内至少存在着三种不同功能的成熟巨核细胞，包括对造血干细胞的维持起支持作用的巨核细胞、具有免疫应答作用的巨核细胞以及具有产生血小板能力的巨核细胞。生产血小板巨核细胞的一个特征是，在发育成熟阶段能发生特有的核内有丝分裂，DNA能发生复制形成多倍体，但胞质不能进行分裂，从而导致成熟的产血小板巨核细胞形成多倍体细胞。成熟多倍体巨核细胞具有更高的蛋白质合成能力，为血小板的产生提供充足的物质基础。
目前，多种细胞可用于血小板的生物制造，包括从骨髓、外周血、脐带血中分离的造血干细胞，以及多能干细胞等。与多能干细胞相比，造血干细胞作为血小板的前体细胞，其向巨核细胞和血小板分化的“路程”更加直接快捷。造血干细胞可以从骨髓、外周血、脐带血中分离出来。不同来源的造血干细胞的增殖潜能、偏向巨核谱系的分化能力以及产生血小板的内在能力均有所差异。与脐带血造血干细胞相比，骨髓和外周血来源的造血干细胞分化得到的巨核细胞的多倍体水平更高，其产血小板的潜能更高。但脐带血的来源和储备量均优于前两者，因此脐带血来源的造血干细胞具有更强的竞争力，而且已有多个团队致力于造血干细胞体外分化血小板的研究并建立了相应的培养体系。
人多能干细胞(hPSC)具有多向分化潜能，通过大规模制备人多能干细胞来源的成熟血小板是满足临床上血小板需求的一种潜在替代方案。目前已提出基于hPSC在体外制备血小板的多种途径，包括hESC与基质细胞共培养分化为巨核细胞并产生血小板[1]；通过基因编辑的手段使人诱导多能干细胞(hiPSC)过表达与巨核谱系相关的特异性转录因子，如GATA1、FLI1和TAL1等，来诱导巨核和血小板的产生[2]；以及利用特定的细胞因子组合定向诱导发育过程中各阶段细胞的产生并最终获得巨核细胞产生血小板等[3]。
hPSC在体外诱导为巨核细胞和血小板最初是通过将hESC与OP9基质细胞[3]和小鼠胚胎间充质细胞共培养实现的[1]。随后的研究表明，在无血清和无滋养条件下，可以从多个hESC系中生成巨核细胞和血小板[4]。通过该方法将hESC诱导生成血管母细胞(hemangioblast)作为细胞中间体，从而产生具有血小板超微结构和形态特征的血小板。在体外，这些血小板能被凝血酶所激活，当移植到体内，其能够在激光诱导的血管损伤部位融入血管内形成血栓板[4]。
最近，有研究人员利用hiPSC分化[5,6]和重编程技术[7,8]在体外生成巨核细胞和血小板。Koji Eto实验室的研究人员在hiPSCs衍生的造血祖细胞中利用BMI1和BCL-XL的过表达来抑制细胞衰老和凋亡，并在造血祖细胞向巨核祖细胞分化过程中过表达c-MYC以促进细胞增殖，从而建立了稳定的永生化巨核细胞祖细胞[9]。该永生化的巨核细胞祖细胞在后续的分化过程中当关闭BMI1、BCL-XL和c-MYC的过表达，就能正常地发育为成熟的巨核细胞并产生功能性血小板。此外，Cedric Ghevaert团队的研究人员对hiPSC过表达GATA1、FLI1和TAL1三个巨核特异性转录因子促进其在无滋养细胞的培养体系中分化为巨核细胞和血小板，提高分化效率[2]。此外，有研究人员利用三个转录因子NEF2、MAFG和MAFK将成纤维细胞重编程为巨核细胞，产生的巨核细胞注射到免疫缺陷鼠体内能够产生功能性血小板[7]。同样地，通过导入六种转录因子GATA2、RUNX1、GATA1、TAL1、LMO2和c-MYC能成功地将成纤维细胞转化为巨核祖细胞[10]。
利用天然造血干细胞在体外定向分化为巨核细胞并产生血小板的方法尽管具有一定的优越性，但也存在一些不足之处。例如，造血干细胞主要来源于献血者，献血资源是有限的。其次，无论是脐带血、骨髓还是外周血中能获取的造血干细胞的数量是非常有限的，因此在分化过程中常常需要先对分离收集到的造血干细胞进行体外扩增，提高造血干细胞的数量再进行巨核分化。但造血干细胞在这种依赖于特定细胞因子组合的扩增中常常会发生非定向分化，这将导致造血干细胞分化巨核细胞的效率及产率下降。更重要的是，利用造血干细胞在体外制备血小板并不能真正地满足临床上对血小板的需求。此外，利用与基质细胞共培养的方式诱导hPSC分化为巨核细胞有引入外源细胞的风险，这大大地限制了产生的血小板在临床上的使用。其次，通过引入外源基因的基因编辑手段产生的巨核细胞，尽管在效率上有一定优势，但其获取的产物仍有一定的潜在生物安全风险。因此，该方式产生的血小板在临床上的应用也会受到限制。
[1]Takayama N,Nishikii H,Usui J,et al.Generation of functionalplatelets from human embryonic stem cells in vitro via ES-sacs,VEGF-promotedstructures that concentrate hematopoietic progenitors[J].Blood,2008,111(11):5298-306。
[2]Moreau T,Evans A L,Vasquez L,et al.Large-scale production ofmegakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically definedforward programming[J].Nat Commun,2016,7:11208。
[3]Zhang B,Wu X,Zi G,et al.Large-scale generation of megakaryocytesfrom human embryonic stem cells using transgene-free and stepwise definedsuspension culture conditions[J].Cell Prolif,2021,54(4):e13002。
[4]Lu S J,Li F,Yin H,et al.Platelets generated from human embryonicstem cells are functional in vitro andin the microcirculation of living mice[J].Cell Res,2011,21(3):530-45。
[5]Nakagawa Y,Nakamura S,Nakajima M,et al.Two differential flows in abioreactor promoted plateletgeneration from human pluripotent stem cell-derived megakaryocytes[J].Exp Hematol,2013,41(8):742-8。
[6]Takayama N,Nishimura S,Nakamura S,et al.Transient activation of c-MYC expression is critical forefficient platelet generation from humaninduced pluripotent stem cells[J].J Exp Med,2010,207(13):2817-30。
[7]Ono Y,Wang Y,Suzuki H,et al.Induction of functional platelets frommouse and human fibroblasts byp45NF-E2/Maf[J].Blood,2012,120(18):3812-21。
[8]Masuda S,Li M,Izpisua Belmonte J C.In vitro generation ofplatelets through direct conversion:firstreport in My Knowledge(iMK)[J].CellRes,2013,23(2):176-8。
[9]Nakamura S,Takayama N,Hirata S,et al.Expandable megakaryocyte celllines enable clinicallyapplicable generation of platelets from human inducedpluripotent stem cells[J].Cell Stem Cell,2014,14(4):535-48。
[10]Pulecio J,Alejo-Valle O,Capellera-Garcia S,et al.Directconversion of fibroblasts to megakaryocyteprogenitors[J].Cell Rep,2016,17(3):671-683。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种诱导干细胞分化为巨核细胞的试剂盒。
本发明第二方面的目的，在于提供一种诱导干细胞分化为血小板的试剂盒。
本发明第三方面的目的，在于提供第一、二方面的试剂盒的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种诱导干细胞分化为巨核细胞和/血小板的方法。
本发明第五方面的目的，在于提供一种巨核细胞。
本发明第六方面的目的，在于提供一种血小板。
本发明第七方面的目的，在于提供本发明第六方面的血小板的应用。
本发明第八方面的目的，在于提供一种药物。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种诱导干细胞分化为巨核细胞的试剂盒，包含：第四培养基；所述第四培养基为包含以下中的至少一种、至少两种或至少三种的基础培养基：生长因子、集落刺激因子、TGFβ/ALK抑制剂。
优选地，所述第四培养基为包含生长因子、集落刺激因子和TGFβ/ALK抑制剂的基础培养基。
优选地，所述第四培养基的生长因子包含表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-1)、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子(LIF)、神经生长因子(NGF)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PDECGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)中的至少一种；进一步优选地，所述第四培养基的生长因子包含成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)中的至少一种；更进一步优选地，所述第四培养基的生长因子包含成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)。
优选地，所述成纤维细胞生长因子包含酸性成纤维细胞因子、碱性成纤维细胞因子中的至少一种；进一步优选地，所述成纤维细胞生长因子包含碱性成纤维细胞因子。
优选地，所述第四培养基的集落刺激因子包含G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、GM-CSF(重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子)、multi-CSF(多重集落刺激因子，又称为IL-3)、EPO(促红细胞生成素)、TPO、SCF、FlT3L中的至少一种；进一步优选地，所述第四培养基的集落刺激因子包含EPO。
优选地，所述第四培养基的TGFβ/ALK抑制剂包含SB431542、SB-505、A-83-01、GW6604、IN-1130、Ki26894、LY2157299、LY364947(HTS-466284)、LY550410、LY573636、LY580276、NPC-30345、SB-505124、SD-093、Sm16、SM305、SX-007、Antp-Sm2A、LY2109761中的至少一种；进一步优选地，所述第四培养基的TGFβ/ALK抑制剂包含SB431542。
优选地，所述生长因子在所述第四培养基中的浓度为20～150ng/mL；进一步为60～90ng/mL；更进一步为70ng/mL。
优选地，所述血管内皮生长因子在所述第四培养基中的浓度为10～100ng/mL；进一步为40～60ng/mL；更进一步为50ng/mL。
优选地，所述碱性成纤维细胞因子在所述第四培养基中的浓度为10～50ng/mL；进一步为20～30ng/mL；更进一步为20ng/mL。
优选地，所述集落刺激因子在所述第四培养基中的浓度为1～10U/mL；进一步为1～5U/mL；更进一步为3U/mL。
优选地，所述TGFβ/ALK抑制剂在所述第四培养基中的浓度为1～20μM；进一步为1～5μM；更进一步为4μM。
优选地，所述第四培养基的基础培养基包含：IMDM(Iscove's ModifiedDulbecco's Medium)培养基、DMEM培养基、Ham's F-12培养基、STEMdiffTMAPELTM2培养基中的至少一种；进一步优选地，所述第四培养基的基础培养基包含STEMdiffTMAPELTM2培养基。
在本发明中，第四培养基用于诱导造血内皮细胞(早期造血细胞)分化为巨核红系祖细胞。
优选地，所述诱导干细胞分化为巨核细胞的试剂盒还包含：第六培养基，所述第六培养基为包含以下中的至少一种或至少两种的基础培养基：集落刺激因子、白细胞介素。
优选地，所述第六培养基为包含集落刺激因子和白细胞介素的基础培养基。
优选地，所述第六培养基的集落刺激因子包含G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、GM-CSF(重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子)、multi-CSF(多重集落刺激因子，又称为IL-3)、EPO(促红细胞生成素)、TPO、SCF、FlT3L中的至少两种；进一步优选地，所述第六培养基的集落刺激因子包含SCF、TPO和IL3。
优选地，所述第六培养基的白细胞介素包含IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-11、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27中的至少两种；进一步优选地，所述第六培养基的白细胞介素包含IL-6和IL-11。
优选地，所述集落刺激因子在所述第六培养基中的浓度为70～450ng/mL；进一步为145～255ng/mL；更进一步为170ng/mL。
优选地，所述SCF在所述第六培养基中的浓度为10～150ng/mL；进一步为50～100ng/mL；更进一步为50ng/mL。
优选地，所述TPO在所述第六培养基中的浓度为50～250ng/mL；进一步为75～125ng/mL；更进一步为100ng/mL。
优选地，所述IL3在所述第六培养基中的浓度为10～50ng/mL；进一步为20～30ng/mL；更进一步为20ng/mL。
优选地，所述白细胞介素在所述第六培养基中的浓度为20～140ng/mL；进一步为60～90ng/mL；更进一步为70ng/mL。
优选地，所述IL6在所述第六培养基中的浓度为10～100ng/mL；进一步为40～60ng/mL；更进一步为50ng/mL。
优选地，所述IL11在所述第六培养基中的浓度为10～40ng/mL；进一步为20～30ng/mL；更进一步为20ng/mL。
优选地，所述第六培养基的基础培养基包含：IMDM(Iscove's ModifiedDulbecco's Medium)培养基、DMEM培养基、Ham's F-12培养基、STEMdiffTMAPELTM2培养基、StemSpanTMSFEM II培养基中的至少一种；进一步优选地，所述第六培养基的基础培养基包含StemSpanTMSFEM II培养基。
在本发明中，所述第六培养基用于诱导巨核红系祖细胞分化为成熟巨核细胞。
优选地，所述诱导干细胞分化为巨核细胞的试剂盒还包含：第二培养基和第三培养基，所述第二培养基和第三培养基为包含生长因子的基础培养基；
所述第二培养基的生长因子包含表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-1)、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子(LIF)、神经生长因子(NGF)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PDECGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)中的任一种；
所述第三培养基的生长因子包含表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-1)、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子(LIF)、神经生长因子(NGF)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PDECGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)中的至少两种。
优选地，所述第二培养基的生长因子包含血管内皮细胞生长因子(VEGF)。
优选地，所述第三培养基的生长因子包含成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)。
优选地，所述成纤维细胞生长因子包含酸性成纤维细胞因子、碱性成纤维细胞因子中的至少一种；进一步优选地，所述成纤维细胞生长因子包含碱性成纤维细胞因子。
优选地，所述生长因子在所述第二培养基中的浓度为10～100ng/mL；进一步为40～60ng/mL；更进一步为40ng/mL。
优选地，所述生长因子在所述第三培养基中的浓度为20～150ng/mL；进一步为50～70ng/mL；更进一步为60ng/mL。
优选地，所述血管内皮生长因子在所述第三培养基中的浓度为10～100ng/mL；进一步为40～50ng/mL；更进一步为40ng/mL。
优选地，所述碱性成纤维细胞因子在所述第三培养基中的浓度为10～50ng/mL；进一步为10～20ng/mL；更进一步为20ng/mL。
优选地，所述第二培养基的基础培养基包含IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)培养基、DMEM培养基、Ham's F-12培养基、STEMdiffTMAPELTM2培养基中的至少一种；进一步优选地，所述第二培养基的基础培养基包含STEMdiffTMAPELTM2培养基。
优选地，所述第三培养基的基础培养基包含IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)培养基、DMEM培养基、Ham's F-12培养基、STEMdiffTMAPELTM2培养基中的至少一种；进一步优选地，所述第三培养基的基础培养基包含STEMdiffTMAPELTM2培养基。
在本发明中，第二培养基和第三培养基用于诱导中内胚层细胞分化为造血内皮细胞(早期造血细胞)。
优选地，所述诱导干细胞分化为巨核细胞的试剂盒还包含：第一培养基，所述第一培养基为包含以下中的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种的基础培养基：ROCK抑制剂、BMP信号通路激活剂、GSK3抑制剂、Activin A。
优选地，所述第一培养基的ROCK抑制剂包含Blebbistatin、HA-100、Y-27632、HA-1077、KD-025、Y-33075、Narciclasine中的至少一种；进一步优选地，所述第一培养基的ROCK抑制剂包含Y-27632。
优选地，所述第一培养基的BMP信号通路激活剂包含BMP2、BMP4、SB4、SJ000291942、SJ000063181、SJ000370178、异甘草素、香叶木素、芹菜素和鹰嘴豆芽素中的至少一种；进一步优选地，所述第一培养基的BMP信号通路激活剂包含BMP4。
优选地，所述第一培养基的GSK-3抑制剂包含GSK-3α抑制剂、GSK-3β抑制剂中的至少一种；进一步优选地，所述第一培养基的GSK-3抑制剂包含B216763、TWS119、NP031112、SB216763、CHIR-98014、AZD2858、AZD1080、SB415286、LY2090314、CHIR-99021中的至少一种；更进一步优选地，所述第一培养基的GSK-3抑制剂包含CHIR-99021。
优选地，所述ROCK抑制剂在所述第一培养基中的浓度为1～20μM；进一步为5～15μM；更进一步为10μM。
优选地，所述BMP信号通路激活剂在所述第一培养基中的浓度为5～50ng/mL；进一步为5～25ng/mL；更进一步为10ng/mL。
优选地，所述GSK3抑制剂在所述第一培养基中的浓度为0.5～5μM；进一步为1～4μM；更进一步为3μM。
优选地，所述Activin A在所述第一培养基中的浓度为1～20ng/mL；进一步为1～5ng/mL；更进一步为2ng/mL。
优选地，所述第一培养基的基础培养基包含IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)培养基、DMEM培养基、Ham's F-12培养基、STEMdiffTMAPELTM2培养基中的至少一种；进一步优选地，所述第一培养基的基础培养基包含STEMdiffTMAPELTM2培养基。
本发明中，所述第一培养基用于诱导干细胞分化为中内胚层细胞。
优选地，所述诱导干细胞分化为巨核细胞的试剂盒还包含：第五培养基，所述第五培养基为包含以下中的至少一种或至少两种的基础培养基：集落刺激因子、白细胞介素。
优选地，所述第五培养基为包含集落刺激因子和白细胞介素的基础培养基。
优选地，所述第五培养基的集落刺激因子包含G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、GM-CSF(重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子)、multi-CSF(多重集落刺激因子，又称为IL-3)、EPO(促红细胞生成素)、TPO、SCF、FlT3L中的至少两种；进一步优选地，所述第五培养基的集落刺激因子包含SCF、TPO和IL3。
优选地，所述第五培养基的白细胞介素包含IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-11、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27中的至少两种；进一步优选地，所述第五培养基的白细胞介素包含IL-6和IL-11。
优选地，所述集落刺激因子在所述第五培养基中的浓度为85～350ng/mL；进一步为85～170ng/mL；更进一步为170ng/mL。
优选地，所述SCF在所述第五培养基中的浓度为25～100ng/mL；进一步为25～50ng/mL；更进一步为50ng/mL。
优选地，所述TPO在所述第五培养基中的浓度为50～200ng/mL；进一步为50～100ng/mL；更进一步为100ng/mL。
优选地，所述IL3在所述第五培养基中的浓度为10～50ng/mL；进一步为XX～XXng/mL；更进一步为20ng/mL。
优选地，所述白细胞介素在所述第五培养基中的浓度为60～200ng/mL；进一步为60～85ng/mL；更进一步为70ng/mL。
优选地，所述IL6在所述第五培养基中的浓度为50～150ng/mL；进一步为50～75ng/mL；更进一步为50ng/mL。
优选地，所述IL11在所述第五培养基中的浓度为10～50ng/mL；进一步为10～20ng/mL；更进一步为20ng/mL。
优选地，所述第五培养基的基础培养基包含：IMDM(Iscove's ModifiedDulbecco's Medium)培养基、DMEM培养基、Ham's F-12培养基、STEMdiffTMAPELTM2培养基、StemSpanTMSFEM II培养基中的至少一种；进一步优选地，所述第五培养基的基础培养基包含StemSpanTMSFEM II培养基。
在本发明中，所述第五培养基用于巨核红系祖细胞的维持培养。
优选地，所述干细胞为具有多向分化潜能的干细胞。
优选地，所述具有多向分化潜能的干细胞包含胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、脐血干细胞中的至少一种；进一步优选地，所述具有多向分化潜能的干细胞包含胚胎干细胞。
优选地，所述干细胞来源于哺乳动物；进一步来源于灵长类，更进一步来源于人。
优选地，所述胚胎干细胞为商业化人胚胎干细胞系。
优选地，所述胚胎干细胞为未经过体内发育的受精14天以内的人类胚胎分离或者获取的干细胞。
优选地，所述巨核细胞为成熟巨核细胞。
本发明的第二个方面，提供一种诱导干细胞分化为血小板的试剂盒，包含：本发明第一个方面的试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包含：第七培养基；所述第七培养基为包含以下中的至少一种或至少两种的基础培养基：集落刺激因子、白细胞介素。
优选地，所述第七培养基为包含集落刺激因子和白细胞介素的基础培养基。
优选地，所述第七培养基的集落刺激因子包含G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、GM-CSF(重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子)、multi-CSF(多重集落刺激因子，又称为IL-3)、EPO(促红细胞生成素)、TPO、SCF、FlT3L中的任一种；进一步优选地，所述第七培养基的集落刺激因子包含TPO。
优选地，所述第七培养基的白细胞介素包含IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-11、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27中的任一种；进一步优选地，所述第七培养基的白细胞介素包含IL-11。
优选地，所述集落刺激因子在所述第七培养基中的浓度为25～100ng/mL；进一步为25～50ng/mL；更进一步为50ng/mL。
优选地，所述白细胞介素在所述第七培养基中的浓度为5～25ng/mL；进一步为5～15ng/mL；更进一步为10ng/mL。
优选地，所述第七培养基的基础培养基包含IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)培养基、DMEM培养基、Ham's F-12培养基、STEMdiffTMAPELTM2培养基、SFM培养基中的至少一种；进一步优选地，所述第七培养基的基础培养基包含SFM培养基。
优选地，所述SFM培养基包含：DMEM/F12、IMDM、BSA、CD lipid concentrate、GlutaMAX添加剂(L-谷氨酰胺的替代品)、ITS、L-Ascorbic acid 2-phosphate(L-抗坏血酸2-磷酸)和1-thioglycreol(1-硫代甘油)。
本发明中，所述第七培养基用于巨核细胞产生血小板。
优选地，所述巨核细胞为成熟巨核细胞。
本发明的第三个方面，在于提供：本发明第一个方面或本发明第二个方面的试剂盒的应用。
本发明第一个方面的试剂盒在(1)～(8)中任一项中的应用；
(1)制备中内胚层细胞；(2)制备造血内皮细胞；(3)制备巨核红系祖细胞；(4)制备巨核细胞；(5)制备诱导干细胞分化为中内胚层细胞的产品；(6)制备诱导干细胞分化为造血内皮细胞的产品；(7)制备诱导干细胞分化为巨核红系祖细胞的产品；(8)制备诱导干细胞分化为巨核细胞的产品。
本发明第二个方面的试剂盒在(1)～(10)中任一项中的应用；
(1)制备中内胚层细胞；(2)制备造血内皮细胞；(3)制备巨核红系祖细胞；(4)制备巨核细胞；(5)制备诱导干细胞分化为中内胚层细胞的产品；(6)制备诱导干细胞分化为造血内皮细胞的产品；(7)制备诱导干细胞分化为巨核红系祖细胞的产品；(8)制备诱导干细胞分化为巨核细胞的产品；(9)制备血小板；(10)制备诱导干细胞分化为血小板的产品。
优选地，所述巨核细胞为成熟巨核细胞。
优选地，所述干细胞为具有多向分化潜能的干细胞。
优选地，所述具有多向分化潜能的干细胞包含胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、脐血干细胞中的至少一种；进一步优选地，所述具有多向分化潜能的干细胞包含诱导多能干细胞。
优选地，所述干细胞来源于哺乳动物；进一步来源于灵长类，更进一步来源于人。
优选地，所述胚胎干细胞为商业化人胚胎干细胞系。
优选地，所述胚胎干细胞为未经过体内发育的受精14天以内的人类胚胎分离或者获取的干细胞。
本发明的第四个方面，提供一种诱导干细胞分化为巨核细胞的方法，包含采用本发明第一个方面或第二个方面的试剂盒的步骤。
优选地，所述方法包含如下步骤：
(1)将干细胞向中内胚层细胞分化培养，得到中内胚层细胞；
(2)将中内胚层细胞向造血内皮分化培养，得到造血内皮细胞；
(3)将造血内皮细胞置于第四培养基中培养，得到巨核红系祖细胞；
(4)将巨核红系祖细胞向巨核细胞分化培养，得到巨核细胞。
优选地，步骤(1)中所述培养在本发明第一个方面或第二个方面的试剂盒中的第一培养基中进行。
优选地，步骤(2)中所述培养在本发明第一个方面或第二个方面的试剂盒中的第二培养基和第三培养基中进行；进一步优选地，优选地，步骤(2)中所述培养依次在本发明第一个方面或第二个方面的试剂盒中的第二培养基和第三培养基中进行。
优选地，步骤(4)中所述培养在本发明第一个方面或第二个方面的试剂盒中的第六培养基中进行。
优选地，步骤(1)中所述培养的时间为24～96小时；进一步为48～72小时；更进一步为48小时。
优选地，步骤(2)中所述培养的时间为48～120小时；进一步为72～120小时；更进一步为96小时。
优选地，步骤(2)中在本发明第一个方面或第二个方面的试剂盒中的第二培养基的培养的时间为24～72小时；进一步为24～48小时；更进一步为24小时。
优选地，步骤(2)中在本发明第一个方面或第二个方面的试剂盒中的第三培养基的培养的时间为48～120小时；进一步为72～96小时；更进一步为72小时。
优选地，在本发明第一个方面或第二个方面的试剂盒中的第三培养基的培养过程中每隔48h更换第三培养基。
优选地，步骤(3)中所述培养的时间为48～120小时；进一步为72～96小时；更进一步为72小时。
优选地，步骤(4)中所述培养的时间为96～192小时；进一步为120～168小时；更进一步为144小时。
优选地，步骤(4)中所述培养过程中每隔48小时更换第六培养基。
优选地，步骤(1)、(2)、(3)中所述培养的条件为32～38℃、4～6％CO2、4～6％O2。
优选地，步骤(4)中所述培养的条件为32～38℃、4～6％CO2、15～25％O2。
优选地，步骤(3)、(4)之间还可以包含：巨核红系祖细胞维持培养的步骤。
优选地，巨核红系祖细胞维持培养在本发明第一个方面或第二个方面的试剂盒中的第五培养基中进行。
优选地，所述培养的条件为32～38℃、4～6％CO2、4～6％O2。
优选地，所述干细胞为具有多向分化潜能的干细胞。
优选地，所述具有多向分化潜能的干细胞包含胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、脐血干细胞中的至少一种；进一步优选地，所述具有多向分化潜能的干细胞包含诱导多能干细胞。
优选地，所述干细胞来源于哺乳动物；进一步来源于灵长类，更进一步来源于人。
优选地，所述胚胎干细胞为商业化人胚胎干细胞系。
优选地，所述胚胎干细胞为未经过体内发育的受精14天以内的人类胚胎分离或者获取的干细胞。
一种诱导干细胞分化为血小板的方法，包含：采用本发明第二个方面的试剂盒的步骤。
优选地，所述方法，包含：诱导干细胞分化为巨核细胞的方法的步骤。
优选地，所述方法还包含：(5)采用本发明第二个方面的试剂盒中的第七培养基培养巨核细胞，得到血小板。
优选地，步骤(5)中所述培养的时间为144～288小时；进一步为192～240小时；更进一步为192小时。
优选地，步骤(5)中所述培养过程中每隔48小时更换第七培养基。
优选地，步骤(5)中所述培养的条件为32～38℃、4～6％CO2、15～25％O2。
本发明的第五个方面，提供一种巨核细胞，通过本发明第三个方面的诱导干细胞分化为巨核细胞的方法制备得到。
优选地，所述巨核细胞中表现出2N的多倍体细胞的含量大于50％；进一步为50～54％。
优选地，所述巨核细胞中表现出4N的多倍体细胞的含量大于30％；进一步为30～32.3％。
优选地，所述巨核细胞中表现出8N的多倍体细胞的含量大于4％；进一步为4～4.9％。
优选地，所述巨核细胞中表现出16N以上的多倍体细胞的含量大于1％；进一步为1～1.39％。
优选地，所述巨核细胞中CD41a+CD42a+细胞的含量大于90％；进一步大于95％；更进一步为95～95.5％。
优选地，所述巨核细胞中CD41a+CD42b+细胞的含量大于85％；进一步大于90％；更进一步为90～90.5％。
本发明的第五个方面，提供一种血小板，通过本发明第三个方面的诱导干细胞分化为血小板的方法制备得到。
优选地，所述血小板中CD61+血小板的含量大于90％；进一步大于95％；更进一步为95～96.2％。
优选地，所述血小板中在ADP和TRAP-6的共同刺激下表达CD62p的血小板的含量大于90％；进一步大于95％；更进一步为95～96.5％。
优选地，所述血小板中在ADP和TRAP-6的共同刺激下与PAC-1结合的血小板的含量大于40％；进一步大于45％；更进一步为45～51％。
本发明的第六个方面，提供一种药物组合物，包含：本发明第五个方面的血小板。
优选地，所述药物还包含药学上可接受的载体。
优选地，所述的药物为液体制剂。
优选地，所述的药物为静脉注射试剂。
优选地，所述药学上可接受的载体包括但并不限于：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、DMSO、及其组合。
本发明的第七个方面，提供本发明第五个方面的血小板和/或本发明第六个方面的药物组合物在制备药物中的应用。
优选地，所述药物具有治疗和/或预防如下疾病中的至少一种：贫血、血小板减少症、急性白血病。
优选地，一种治疗疾病的方法，包括如下步骤：向受试对象施用本发明第五个方面的血小板和/或本发明第六个方面的药物组合物。
优选的，所述的对象为哺乳动物，更优选为灵长类，更进一步优先为人。
优选的，施用部位为所述对象的静脉。
优选地，所述疾病包含贫血、血小板减少症、急性白血病中的至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种诱导干细胞分化为巨核细胞和/或血小板的试剂盒，该试剂盒可以在避免引入外源细胞和外源基因的情况下诱导干细胞分化为巨核细胞和/或血小板，采用该试剂盒可以高度模拟体内巨核细胞和血小板的生成过程，将干细胞依次诱导成中内胚层细胞、造血内皮细胞，并产生巨核红系祖细胞，巨核红系祖细胞进一步发育为具有多倍体特征的巨核细胞，最终产生具有与天然血小板相似功能性的干细胞源血小板，并且干细胞具有无限增殖的潜能，在体外可以大量扩增，这也为血小板的体外制备提供无限的细胞来源。
附图说明
图1是诱导人胚胎干细胞分化为血小板的示意图。
图2是诱导人胚胎干细胞分化为早期造血细胞(造血内皮细胞)的示意图及细胞检测结果图：其中，A是诱导人胚胎干细胞分化为造血内皮细胞的示意图；B是诱导人胚胎干细胞分化为造血内皮细胞的细胞形态变化图(比例尺＝100μm)；C是诱导人胚胎干细胞分化为造血内皮细胞过程中Brachyury、KDR、ERG和TIE1的RT-qPCR检测结果图；D是诱导人胚胎干细胞分化为造血内皮细胞过程中CD31+CD34+造血内皮标记的细胞流式检测结果图；E是诱导人胚胎干细胞分化为造血内皮细胞的第六天细胞球CD43的免疫荧光染色结果图(比例尺＝100μm)：*表示：与第0天相比，p＜0.05；***表示：与第0天相比，p＜0.001；****表示：与第0天相比，p＜0.0001；ns表示：与第0天相比，p＞0.05。
图3是诱导早期造血细胞(造血内皮细胞)分化为巨核红系祖细胞的示意图及细胞检测结果图：其中，A是诱导造血内皮细胞分化为巨核红系祖细胞的示意图；B是诱导造血内皮细胞分化为巨核红系祖细胞的细胞形态变化图(比例尺＝100μm)；C是诱导造血内皮细胞分化为巨核红系祖细胞过程中CD43的细胞流式检测结果图；D是诱导造血内皮细胞分化为巨核红系祖细胞过程中CD41a和CD235a的细胞流式检测结果图。
图4是巨核红系祖细胞球维持培养的示意图及细胞球检测结果图：其中，A是巨核红系祖细胞球维持培养的示意图；B是巨核红系祖细胞球维持培养过程中细胞形态变化图(比例尺＝100μm)；C是巨核红系祖细胞球维持培养过程中持续产生的悬浮细胞的数量比较结果图；D是巨核红系祖细胞球维持培养过程中细胞球CD31和CD34、CD43以及CD41a和CD235a的细胞流式检测结果图。
图5是巨核红系祖细胞球维持培养中悬浮细胞检测结果图：其中，A是巨核红系祖细胞球维持培养过程产生的悬浮细胞CD43、CD41a和CD235a的细胞流式检测结果图；B是巨核红系祖细胞球维持培养过程中产生的CD41a+悬浮细胞比例统计结果图。
图6是诱导巨核红系祖细胞分化为成熟巨核细胞的示意图及细胞检测结果图：其中，A是诱导巨核红系祖细胞分化为成熟巨核细胞的示意图；B是诱导巨核红系祖细胞分化为成熟巨核细胞的细胞形态图(比例尺＝100μm)；C是诱导巨核红系祖细胞分化为成熟巨核细胞过程中CD41a和CD235a的细胞流式检测结果图；D是诱导巨核红系祖细胞分化为成熟巨核细胞过程中CD41a和CD42a的细胞流式检测结果图；E是诱导巨核红系祖细胞分化为成熟巨核细胞过程中CD41a和CD42b的细胞流式检测结果图。
图7是分化第15天的巨核细胞的细胞检测结果图：其中，A是分化第15天的巨核细胞的多倍体检测结果图；B是分化第15天的巨核细胞的瑞氏-吉姆萨染色结果图(比例尺＝100μm)；C是分化第15天的巨核细胞的CD62p的免疫荧光染色结果图(比例尺＝100μm)。
图8是成熟巨核细胞产生血小板阶段的示意图及细胞检测结果图：其中，A是成熟巨核细胞产生血小板阶段的示意图；B是成熟巨核细胞产生血小板阶段CD61的细胞流式检测结果图；C是产生的血小板受刺激前后CD42b和CD62p以及CD42b和PAC-1的细胞流式检测结果图。
图9是血小板减少症模型小鼠的体重变化、凝血功能和止血功能的结果图：其中，A是血小板减少症模型小鼠的体重变化结果图；B是血小板减少症模型小鼠的凝血功能结果图；C是血小板减少症模型小鼠的止血功能结果图；**表示：p＜0.01；****表示：p＜0.0001；ns表示：p＞0.05。
图10是血小板减少症模型小鼠输注血小板治疗后凝血功能、止血功能和外周血中人CD61+细胞的比例变化的结果图：其中，A是血小板减少症模型小鼠输注血小板治疗后凝血功能的检测结果图；B是血小板减少症模型小鼠输注血小板治疗后止血功能的检测结果图；C是血小板减少症模型小鼠输注血小板治疗后外周血中人CD61+细胞的比例变化的结果图；*表示：p＜0.05；**表示：p＜0.01；***表示：p＜0.001；ns表示：p＞0.05。
图11是培养基对早期造血细胞(造血内皮细胞)向巨核红系祖细胞分化效率的影响图：其中，A是早期造血细胞(造血内皮细胞)向巨核红系祖细胞分化的示意图；B是早期造血细胞(造血内皮细胞)向巨核红系祖细胞分化过程中细胞球的CD43、CD41a和CD235a标记物的细胞流式检测结果图；C是早期造血细胞(造血内皮细胞)向巨核红系祖细胞分化过程中产生的悬浮细胞的CD43、CD41a和CD235a标记物的细胞流式检测结果图。
图12是培养基对巨核红系祖细胞维持的影响图：其中，A是巨核红系祖细胞维持培养的示意图；B是巨核红系祖细胞维持培养过程中细胞球的CD43、CD41a和CD235a标记物的细胞流式检测结果图；C是巨核红系祖细胞维持培养过程中产生的悬浮细胞的CD43、CD41a和CD235a标记物的细胞流式检测结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
定义
术语“干细胞”是指能够自我复制并且具有多能性或多潜能性的细胞。通常来说，干细胞可以使受伤组织再生。本文中的干细胞可以是但不限于胚胎干(ES)细胞、诱导多能干细胞或组织干细胞(也称为组织特异性干细胞或体干细胞)。
“胚胎干(ES)细胞”是来源于早期胚胎的多能干细胞。ES细胞最初于1981年建立，其自1989年以来也应用于敲除小鼠的产生。在1998年，建立了人ES细胞，其目前正变得可用于再生医学。
与ES细胞不同，组织干细胞具有有限的分化潜能。组织干细胞存在于组织中的特定位置并且具有未分化的细胞内结构。因此，组织干细胞的多能性通常较低。组织干细胞具有较高的核/质比并具有较少的细胞内细胞器。大多数组织干细胞具有低多能性、长细胞周期和超过个体寿命的增殖能力。基于细胞来源于的部位例如皮肤系统、消化系统、骨髓系统、神经系统等，将组织干细胞分成几类。皮肤系统中的组织干细胞包括表皮干细胞、毛囊干细胞等。消化系统中的组织干细胞包括胰腺(常见)干细胞、肝干细胞等。骨髓系统中的组织干细胞包括造血干细胞、间充质干细胞等。神经系统中的组织干细胞包括神经干细胞、视网膜干细胞等。
“诱导多能干细胞”(通常缩写为iPS细胞或iPSC)是指通过引入某些称为重编程因子的因子由非多能细胞(通常体细胞)或终末分化细胞(例如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等)人工制备的多能干细胞类型。
术语“分化”是一种过程，通过该过程，较不特化的细胞形成至少一种更特化的新细胞类型的后代。
术语“基础培养基”属于化学成分确定的培养基，包括但不限于如IMDM(Iscove'sModified Dulbecco's Medium)培养基、DMEM培养基、Ham's F-12培养基、STEMdiffTMAPELTM2培养基、StemSpanTMSFEM II培养基等基础细胞培养基。
术语“多重集落刺激因子”又称白细胞介素-3。主要由活化Z细胞或T细胞克隆产生。含13个氨基酸残基，可作为免疫调节剂，可刺激多能干细胞和多种祖细胞的增殖和分化。
术语“SB431542”还包括SB431542及其盐，尤其是药学上可接受的盐。
术语“CHIR99021”包括CHIR99021及其盐，尤其是药学上可接受的盐。
术语“Y-27632”还包括Y-27632及其盐，尤其是药学上可接受的盐。优选的药学上可接受的盐是Y-27632 2HCL。
术语“成纤维细胞生长因子”由垂体和下丘脑分泌的多肽，能促进成纤维细胞有丝分裂、中胚层细胞的生长，还可刺激血管形成，在创伤愈合及肢体再生中发挥作用，有酸性(pI 5.6)和碱性(pI 9.6)两种，即aFGF和bFGF。
术语“骨形态发生蛋白4”即bone morphogenetic protein-4，BMP4，在胚胎发育时期对多种细胞的增殖分化具有调控作用。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1一种诱导干细胞分化为血小板的试剂盒
一种诱导干细胞分化为血小板的试剂盒，包含：第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基、第五培养基、第六培养基和第七培养基；
其中，第一培养基为含10μM的Y27632、10ng/mL BMP4(骨形态发生蛋白4)、2ng/mLActivin A和3μM CHIR99021的STEMdiffTMAPELTM2培养基；
第二培养基为含40ng/mL VEGF(血管内皮生长因子)的STEMdiffTMAPELTM2培养基；
第三培养基为含40ng/mL VEGF和20ng/mL bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的STEMdiffTMAPELTM2培养基；
第四培养基为含50ng/mL VEGF、20ng/mL bFGF、3U/mL EPO(促红细胞生成素)和4μM SB431542的STEMdiffTMAPELTM2培养基；
第五培养基为含50ng/mL SCF(干细胞生长因子)、100ng/mL TPO(促血小板生成素)、20ng/mLIL3(多重集落刺激因子)、50ng/mL IL6(白细胞介素6)和20ng/mL IL11(白细胞介素11)的STEMdiffTMAPELTM2培养基；
第六培养基为含50ng/mL SCF、100ng/mL TPO、20ng/mL IL3、50ng/mL IL6和20ng/mL IL11的StemSpanTMSFEM II培养基；
第七培养基为含50ng/mL TPO和10ng/mL IL11的SFM培养基，SFM培养基由48v/v％DMEM/F12、48v/v％IMDM、0.5v/v％BSA、1v/v％CD lipid concentrate、2mM GlutaMAXTM添加剂(L-谷氨酰胺的替代品)、1％ITS、50μg/mL L-Ascorbic acid 2-phosphate(L-抗坏血酸2-磷酸)和437μM 1-thioglycreol(1-硫代甘油)组成。
实施例2一种诱导干细胞分化为血小板的试剂盒
一种诱导干细胞分化为血小板的试剂盒，包含：第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基、第五培养基、第六培养基和第七培养基；
其中，第一培养基为含1μM的Y27632、5ng/mL BMP4(骨形态发生蛋白4)、1ng/mLActivin A和0.5μM CHIR99021的STEMdiffTMAPELTM2培养基；
第二培养基为含10ng/mL VEGF(血管内皮生长因子)的STEMdiffTMAPELTM2培养基；
第三培养基为含10ng/mL VEGF和10ng/mL bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的STEMdiffTMAPELTM2培养基；
第四培养基为含10ng/mL VEGF、10ng/mL bFGF、1U/mL EPO(促红细胞生成素)和1μM SB431542的STEMdiffTMAPELTM2培养基；
第五培养基为含25ng/mL SCF(干细胞生长因子)、50ng/mL TPO(促血小板生成素)、10ng/mL IL3(多重集落刺激因子)、50ng/mL IL6和10ng/mL IL11的STEMdiffTMAPELTM2培养基；
第六培养基为含10ng/mL SCF、50ng/mL TPO、10ng/mL IL3、10ng/mL IL6和10ng/mL IL11的StemSpanTMSFEM II培养基；
第七培养基为含25ng/mL TPO和5ng/mL IL11的SFM培养基，SFM培养基由48％DMEM/F12、48％IMDM、0.5％BSA、1％CD lipid concentrate、2mM GlutaMAX、1％ITS、50μg/mL L-ascorbic phosphate和437μM 1-thioglycreol(1-硫代甘油)组成。
实施例3一种诱导干细胞分化为血小板的试剂盒
一种诱导干细胞分化为血小板的试剂盒，包含：第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基、第五培养基、第六培养基和第七培养基；
其中，第一培养基为含20μM的Y27632、50ng/mL BMP4(骨形态发生蛋白4)、20ng/mLActivin A和5μM CHIR99021的STEMdiffTMAPELTM2培养基；
第二培养基为含100ng/mL VEGF(血管内皮生长因子)的STEMdiffTMAPELTM2培养基；
第三培养基为含100ng/mL VEGF和50ng/mL bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的STEMdiffTMAPELTM2培养基；
第四培养基为含100ng/mL VEGF、50ng/mL bFGF、10U/mL EPO(促红细胞生成素)和20μM SB431542的STEMdiffTMAPELTM2培养基；
第五培养基为含100ng/mL SCF(干细胞生长因子)、200ng/mL TPO(促血小板生成素)、50ng/mL IL3(多重集落刺激因子)、150ng/mL IL6和50ng/mL IL11的STEMdiffTMAPELTM2培养基；
第六培养基为含150ng/mL SCF、250ng/mL TPO、50ng/mL IL3、100ng/mL IL6和40ng/mL IL11的StemSpanTMSFEM II培养基；
第七培养基为含100ng/mL TPO和25ng/mL IL11的SFM培养基，SFM培养基由48％DMEM/F12、48％IMDM、0.5％BSA、1％CD lipid concentrate、2mM GlutaMAX、1％ITS、50μg/mL L-ascorbic phosphate和437μM 1-thioglycreol(1-硫代甘油)组成。
效果实施例
效果实施例1
一种诱导人胚胎干细胞分化为巨核细胞和血小板的方法，示意图如图1所示，包含如下步骤：
(1)人胚胎干细胞向造血内皮细胞分化，示意图如图2中A所示：
1)hESC培养、传代和维持：本实施例所用的hESC使用有小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为滋养层细胞的培养方式进行培养；在传代的前一天，用1×PBS缓冲液稀释的终浓度为0.1wt％的明胶铺被六孔板(明胶的储存浓度为2％，保存于4℃冰箱，使用前需在37℃水浴中复温至液态)；铺被明胶的六孔板放置在生物安全柜中两小时后接种MEF，六孔板的每个孔接种2-3×105个MEF，每孔加入2mL MEF完全培养基(包含10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素-庆大霉素溶液(三抗)的DMEM高糖培养基)在37℃、5％CO2饱和湿度的环境下培养一天待用；选取一孔生长状态良好的hESC(从美国WiCell研究所购买；状态良好：在hESC传代5～6天后，细胞覆盖率达70％～80％，细胞克隆紧密且边缘清晰，没有明显分化的hESC)，吸弃培养基后用1×PBS洗一遍，加入1mL 1mg/mL IV型胶原酶溶液并在37℃下孵育35～40分钟，显微镜下观察克隆形态以确定合适的消化时间。当hESC克隆边缘高亮或出现折叠时即可。吸弃胶原酶溶液，轻柔地加入1mL DMEM/F12培养基洗涤一遍，吸弃DMEM/F12培养基。每孔加入2mL hESC完全培养基(包含20％血清替代物(KSR)、1mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、1％非必需氨基酸和10ng/mL bFGF的DMEM/F12培养基)轻柔地将细胞吹打下来并转移至离心管内，将细胞团轻轻地吹打成细胞数量约为15的团块。将细胞团块按1：6(六孔板一孔传六孔)的比例接种到种有MEF的六孔板中，细胞维持在37℃、5％CO2饱和湿度的环境下培养，每天更换新鲜的hESC完全培养基。
2)中内胚层阶段诱导：hESC细胞克隆生长至80％左右，吸弃培养基后用1×PBS洗一遍，加入1mLGCDR并在37℃下孵育5分钟，吸弃GCDR，加入1mL实施例1中的第一培养基，轻轻吹打成单细胞悬液；将单细胞悬液接种在低粘附六孔板中，每孔100万个细胞，添加实施例1中的第一培养基至3mL每孔。在37℃、5％CO2和5％O2的环境下静置培养2天，诱导并产生中内胚层细胞球。
3)造血内皮阶段诱导：将中内胚层细胞球的培养基更换为实施例1中的第二培养基，在37℃、5％CO2和5％O2的条件下处理一天，然后更换为实施例1中的第三培养基培养一天；随后更换新的实施例1中的第三培养基，在37℃、5％CO2和5％O2的条件下培养2天，得到造血内皮细胞。
(2)早期造血细胞(造血内皮细胞)向巨核红系祖细胞诱导阶段，示意图如图3中A所示：将步骤(1)得到的早期造血细胞(造血内皮细胞)的培养基更换为实施例1中的第四培养基，在37℃、5％CO2和5％O2的环境下继续培养3天，诱导早期造血细胞(造血内皮细胞)进一步分化为巨核红系祖细胞。
(3)巨核红系祖细胞维持培养阶段：取部分步骤(2)得到的巨核红系祖细胞进行维持培养，示意图如图4中A所示，具体如下：将分化第9天产生的悬浮细胞与细胞球分离出来，用实施例1中的第五培养基对细胞球继续进行培养，每隔3天分离出新产生的悬浮细胞，并更换实施例1中的第五培养基继续进行培养。
(4)巨核红系祖细胞向成熟巨核细胞诱导阶段：取部分步骤(2)得到的巨核红系祖细胞向成熟巨核细胞诱导，示意图如图6中A所示，具体如下：将分化第9天产生的悬浮细胞收集起来，采用实施例1中的第六培养基在37℃、5％CO2和20％O2环境下进行巨核谱系诱导6天，每隔两天更换一次培养基。
(5)成熟巨核细胞产生血小板阶段，示意图如图8中A所示：将分化至第9+6天的成熟巨核细胞收集起来，采用实施例1中的第七培养基在37℃、5％CO2和20％O2环境下培养8天，每两天更换一次培养基，诱导成熟巨核细胞产生血小板。
步骤(1)中的细胞的检测：
1)细胞形态变化：分化前6天，每天对细胞球进行拍照，记录细胞的形态变化；结果如图2中B所示：hESC消化成单个细胞或小细胞团后接种到低粘附六孔板中静置培养1天，可以形成规则的、较为均一的中内胚层细胞球，细胞球的直径为70～150μm；随着分化的进行，细胞球的体积越来越大，当分化到第6天时，细胞球的直径可达300～400μm；从形态上，可以看到，分化到第4天时，随着细胞因子bFGF的添加，细胞球内部变得透亮，开始出现空心的“囊状”结构，在第6天时，这种“囊状”结构更加明显。
2)细胞RT-qPCR检测：分化前6天，每隔两天收集一次细胞球，检测中胚层特异性基因(Brachyury)、造血中胚层及造血内皮特异性基因(KDR)和早期造血特异性基因(ERG和TIE1)的表达水平，结果如图2中C所示：在分化前6天内，中胚层特异性基因Brachyury的表达显著提高，并在分化第2天达到峰值；随着分化的进行，造血中胚层和造血内皮相关基因KDR的表达逐渐升高，早期造血相关基因ERG和TIE1的表达也逐渐升高，且在分化第6天达到最大值(图C中第8、10天的数据为巨核红系祖细胞的数据)。
3)细胞流式检测：分化前6天，每隔两天收集一次细胞球，检测CD31+CD34+造血内皮特异性标志物的表达水平，结果如图2中D所示：CD31+内皮细胞的比例从分化第2天开始逐渐增加；CD34+造血细胞在分化的第6天开始产生，此时CD31+CD34+造血内皮细胞首次出现，比例约为44％。
4)细胞免疫荧光染色：分化第6天，收集细胞球检测CD43早期髓系特异性标志物的表达；结果如图2中E所示：分化第6天细胞球中出现了CD43+早期髓系造血细胞。以上结果表明，经过以上培养基联合低氧条件，在分化第6天，可以将hESC定向诱导为早期造血细胞(造血内皮细胞)。
步骤(2)中的细胞的检测：
1)细胞形态变化：对细胞球进行拍照，记录细胞的形态变化。结果如图3中B所示：分化第8天开始可以观察到原本光滑的细胞球表面开始出现明亮的圆形单个细胞或细胞簇；在分化第9天时，培养基中出现大量单个独立存在或多个松散地聚集在一起的悬浮细胞。
2)细胞流式检测：分别收集分化第6天和第9天的细胞球和产生的悬浮细胞，检测CD43、CD41a和CD235a的表达水平，结果如图3中C、D所示：随着分化的进行，细胞球中CD43+早期髓系造血细胞的比例有所增加(从3.56％到11.1％)，CD235a+CD41a+巨核红系祖细胞的比例也有所增加(从0.095％到4.14％)；与细胞球相比，分化第9天收集的悬浮细胞表达高比例的CD43+早期髓系造血标志物(高达97.7％)，CD235a+CD41a+巨核红系祖细胞的达76.7％，另外，约有10.6％的细胞表达CD235a-CD41a+巨核谱系标志物。以上结果表明，在该分化体系下，能将早期造血细胞(造血内皮细胞)球诱导分化为巨核红系祖细胞。
步骤(3)中的细胞的检测：
1)细胞形态变化和细胞数量统计：对细胞球进行拍照，记录细胞的形态变化，每隔3天收集一次悬浮细胞并对细胞数量进行统计分析，结果如图4中B、C所示：在分化第9～21天内，细胞球仍能持续产生悬浮细胞。随着悬浮细胞不断地从细胞球表面脱落下来，细胞球的体积逐渐变小；在形态上，分化前18天内，细胞球仍维持较为规则的球型，当分化到第21天时，细胞球表面开始出现一些类似空泡的结构(图4中B)；在分化的第9～21天内每隔3天收集一次悬浮细胞并进行统计分析，结果如图4中C所示：在分化的前18天内产生悬浮细胞的数量不断增加，在第18天时达到最大值；随着培养的进行，悬浮细胞的数量开始逐渐下降；在分化第21天，悬浮细胞的数量尽管比第18天的更少，相比于第9天，数量还是相对较多的。以上结果表明，巨核红系祖细胞球在该培养体系下仍能维持培养并持续产生悬浮细胞。
2)细胞流式检测：每隔3天分别收集细胞球和悬浮细胞，检测细胞球中CD31和CD34、CD43以及CD41a和CD235a的表达水平，检测悬浮细胞中CD43、CD235a和CD41a的表达水平，结果如图4、5所示：在培养过程中细胞球CD31+CD34+造血内皮细胞的比例能持续维持在30％以上；在第12、15和18天时，检测到较低比例的CD43+细胞(分别为2.46％、6.36％和8.33％)；第21天时，该比例升高至50％以上；另外，检测到CD235a+CD41a+细胞的比例也维持在较低的水平(图4中D)，这与上一阶段的结果(图3中D)相似；在分化过程中，产生的悬浮细胞中CD43+细胞的比例高达95％以上；尽管CD235a+CD41a+细胞的比例却逐渐下降，CD41a+细胞的比例仍能维持在60％～80％范围内(图5)。综上所述，在第五培养基的诱导下，巨核红系祖细胞球能维持培养，并维持含有30％以上的CD31+CD34+造血内皮细胞；同时能持续产生CD41a+偏向巨核谱系分化的悬浮细胞。
步骤(4)中的细胞的检测：
1)细胞形态变化：经过6天的诱导，巨核红系祖细胞出现直径较大的细胞，同时产生丝状的前血小板结构(图6中B)。
2)细胞流式检测：在分化的6天内，每隔两天收集一次细胞，检测CD41a+CD235a+巨核红系祖细胞、CD41a+CD42a+以及CD41a+CD42b+成熟巨核细胞特异性标志物的表达水平，结果如图6中C～E所示：在分化的第9+0天到第9+2天，CD235a+CD41a+细胞的比例从76.7％增加到81.6％，该细胞主要由CD235a-CD41a-细胞和CD235a+细胞分化而来；在分化的第9+2天到第9+6天，CD235a+CD41a+细胞的比例逐渐减少，CD235a-CD41a+细胞的比例则逐渐增加，CD235a+CD41a-细胞的比例和CD235a-CD41a-细胞的比例没有显著变化，表明CD235a+CD41a+细胞逐步分化为CD41a+细胞(图6中C)。随着巨核诱导分化的进行，分化细胞中特异性标志物CD41a和CD42a的表达逐渐升高(图6中D)。在前两天(第9+0天至第9+2天)，CD41a+CD42a+细胞生成迅速，比例相对增加了3.92倍；随后处于稳定的水平缓慢增加，到分化第15天比例达到95％以上。另外，检测到细胞特异性标志物CD41a和CD42b的表达随着巨核诱导分化的进行逐渐升高(图6中E)。在前两天(第9+0天至第9+2天)，CD41a+CD42b+细胞的比例上调最快，增加了4.79倍；随后缓慢增加，到分化第9+6天时比例达到90％以上。以上结果也表明，在巨核细胞发育过程中，CD42a和CD42b的表达处于同步上调的状态，且在分化第9+6天可以获得95％以上的CD41a+CD42a+以及90％以上CD41a+CD42b+成熟巨核细胞。
3)细胞多倍体检测：成熟巨核细胞的一个重要标志是细胞通过发生核内有丝分裂，形成多倍体细胞；碘化丙啶是一种可以通过破损的细胞膜进入细胞内，嵌入细胞核内双链脱氧核苷酸链并在特定激光的激发下发出红色荧光的化学物质；在分化的第9+6天检测细胞多倍体比例，结果如图7中A所示：在巨核细胞分化至第9+6天时，分别有54.0％、32.3％、4.92％以及1.39％的细胞表现出2N、4N和8N及16N以上的多倍体水平。该实验结果表明，采用第六培养基处理后产生了具有多倍体特征的成熟巨核细胞。
4)瑞氏-吉姆萨染色：Wright-Giemsa染色工作液是由瑞士色素和吉姆萨染料两种复合染料组合而成的细胞染料，能使细胞涂片中的细胞质呈橘色或红色，细胞核呈蓝色到紫色；对分化第9+6天的细胞进行瑞氏-吉姆萨染色，鉴定分化细胞的形态，结果如图7中B所示：hESC来源的成熟巨核细胞的细胞质被染成了橘色，细胞核被染成了蓝紫色，通过观察，可以看出细胞的体积较大，直径约为70～100μm，细胞核的数量多，体积大，并且细胞呈不规则的分叶状；细胞质内填充了大量大小不一的紫红色微小颗粒，细胞膜的边缘不规整，呈伪足状。以上特征与成熟巨核细胞的特征相符。
5)细胞免疫荧光染色：P-选择素(CD62p)是血小板内α-颗粒膜表面的糖蛋白，当血小板被活化后，CD62p会被暴露在血小板表面，通过介导细胞间的黏附参加体内凝血过程。此外，表达CD62p也是巨核细胞产生血小板的一个重要标志。在分化第9+6天，收集细胞检测CD62p血小板特异性标志物的表达。结果如图7中C所示，大部分分化的巨核细胞表达CD62p，说明其具有产血小板的能力。
步骤(5)中的血小板及功能的检测：
1)流式检测：在分化第9+6和第9+14天分别收集培养基上清中的血小板(1000rpm离心5分钟后沉降细胞，收集培养基上清，3000g离心10分钟沉降血小板)，检测CD61的表达水平，结果如图8中B所示：在分化第9+6天培养基上清中有72.1％CD61+血小板产生，当分化到第9+14天时，CD61+血小板的比例达到96.2％。该结果表明，在分化第9+6天，成熟巨核细胞已经开始产生血小板，在第七培养基诱导8天后，产生的血小板纯度更高。
2)血小板体外功能检测：血小板在刺激剂的作用下被活化是血小板具有凝血功能的一个重要标志。在受到激活前，血小板处于静息状态，不发生聚集反应；当受到诸如胶原、ADP和凝血酶等物质的刺激后，活化的血小板会暴露出P-选择素(CD62p)，并同时具有与PAC-1结合的能力。因此，可以利用ADP等刺激剂激活体外分化的血小板，通过检测其表面CD62p的表达以及与PAC-1的结合能力来分析其体外功能。在分化第9+14天收集细胞培养基上清中的血小板，在室温条件下用ADP(终浓度为100μΜ)和TRAP-6(终浓度为40μM)刺激血小板1小时后，检测血小板表面CD62p、CD42b的表达，以及与PAC-1的结合能力。结果如图8中C所示，在ADP和TRAP-6的共同刺激下，分化第9+14天的血小板中有96.5％的血小板表达CD62p，且有51％的血小板表现出与PAC-1的结合能力。
3)血小板的体内功能分析，具体包括以下步骤：
S1血小板减少症模型小鼠构建
S11将健康的6～8周龄小鼠(购自广东省医学实验动物中心)分为3组：对照组4只，不注射任何溶剂或药物；阴性对照组4只，注射与建模组等量的生理盐水(溶剂)；建模组4只，注射环磷酰胺溶液；在注射药物的前一天(第0天)对所有小鼠进行称重并记录；
S12对建模组小鼠连续三天按150mg/kg的剂量皮下注射环磷酰胺溶液(生理盐水配制，浓度为10mg/mL)；对阴性对照组小鼠连续三天皮下注射与建模组等量的生理盐水。连续七天对各组小鼠进行称重并记录；
S13在建模的第四天对各组小鼠的凝血能力(凝血时间和止血时间)进行检测；
S14小鼠凝血时间检测方法：小鼠眼眶静脉丛采血法采集小鼠血液，将毛细管置于内侧眼角处，与鼻翼平面成45度角斜刺入2～3mm，轻轻旋转毛细管的同时施加压力，血浆通过毛细管流出并滴在盖玻片上，此时开始记录血液凝集时间；
(A)盖玻片法：从30秒开始，每隔15秒用针尖轻轻挑动盖玻片上的血液，当挑起的血液中出现丝状凝血物时，记录时间；
(B)毛细管法：从30秒开始，每隔30秒折断毛细管一次，直至毛细管折断后出现丝状凝血物，记录从血液滴落到玻片上至出现丝状凝血物的时长；
S15小鼠止血时间检测方法：用23G针刺穿小鼠尾尖端2cm血管致使尾部出血，立即将尾部伤口放进装满生理盐水的透明试管中直至血液停止流出，记录从刺穿血管出血到止血的时长。
连续8天记录小鼠的体重变化，结果如图9中A所示：正常小鼠与注射生理盐水组小鼠的体重随着饲养天数的增加而增加；相比之下，注射环磷酰胺的小鼠在注射3天内体重逐渐下降，并在第4天体重达到最低，当停止注射环磷酰胺后，小鼠的体重开始恢复。
在建模第4天，对小鼠的凝血和止血功能进行检测，结果如图9中B、C所示：与正常小鼠相比，模型小鼠的血液凝固时间明显延长且凝血效率显著下降，注射生理盐水组小鼠与正常小鼠的血液凝固时间没有显著性差异；与正常小鼠相比，模型小鼠尾部血管被扎穿后，止血时间明显更长，注射生理盐水组小鼠的止血效率则与正常小鼠没有显著性差异。
以上结果表明，连续3天对小鼠注射150mg/kg剂量的环磷酰胺能有效地消耗小鼠体内的血小板，并导致模型小鼠的凝血和止血功能显著下降。因此，该方法能够有效地构建血小板减少症模型。
S2血小板体内功能检测及分析
S21按照S1中血小板减少症模型小鼠构建的方法，构建对照组小鼠4只(不注射任何溶剂或药物)和建模组小鼠18只(连续三天注射环磷酰胺溶液)；
S22在建模的第四天，将建模组小鼠随机分为三组，分别设为安慰剂治疗组(注射等量生理盐水)、人血小板样品(捐献者来源的天然血小板)治疗组以及hESC分化血小板治疗组；人血小板样品治疗组和hESC分化血小板治疗组的血小板注射剂量保持一致，为1×108个/只，血小板经尾静脉注射进入小鼠体内；
S23分别在注射血小板的0.5、1、2、4、6、24和48小时后采集各组小鼠的尾静脉血20μL以检测小鼠体内人血小板的比例；将20μL血液与1mL 1×PBS缓冲液混合稀释，用AlexaFlour anti-humanCD61流式抗体进行标记，并使用BD FACS Celesta十二色高端流式分析细胞仪进行检测；
S24在注射血小板的4小时后，对小鼠的凝血能力(凝血时间和止血时间)进行检测(方法同S1)。
实验结果如图10所示，在血小板减少症模型小鼠建模的第4天对小鼠分别注射相同剂量的hESC分化的血小板和捐献者来源的天然血小板进行治疗，并在注射血小板后的第0.5、1、2、4、6、24和48小时分别采集小鼠的微静脉血检测小鼠体内外源血小板的含量变化。结果如图10中C所示，两种来源的血小板注射到小鼠体内后的前1个小时内，血小板的含量均显著下降，但在2个小时之后，血小板的含量趋于稳定。
在血小板减少症模型小鼠建模的第4天对小鼠分别注射相同剂量的hESC分化的血小板和捐献者来源的天然血小板进行治疗。在注射4个小时后对血小板减少症模型小鼠的凝血和止血功能进行检测。如图10中A、B所示：与安慰剂组(注射生理盐水治疗)相比，注射hESC分化的血小板和捐献者来源的天然血小板的小鼠血液凝固时间均明显缩短，且两种来源的血小板对小鼠血液凝固效率的作用没有显著性差异，但稍低于正常小鼠；经两种外源的血小板治疗后，小鼠的止血效率明显提高，并且两种血小板的止血效果也相似，与正常小鼠相比没有显著差异。以上结果表明，hESC分化的血小板能有效恢复血小板减少症模型小鼠的凝血和止血功能，且其效果与天然血小板相似。
效果实施例2培养基对造血内皮细胞向巨核红系祖细胞分化效率的影响
S1一种诱导人胚胎干细胞分化为巨核红系祖细胞的方法，示意图如图11中A所示，与效果实施例1的步骤(1)、(2)一致。
S2一种诱导人胚胎干细胞分化为巨核红系祖细胞的方法，示意图如图11中A所示，与效果实施例1的步骤(1)、(2)一致，区别仅在于步骤(2)中的培养基更换为第五培养基。
比较S1、S2方法分化为巨核红系祖细胞的效率，结果如图11所示：图11中B为分化阶段细胞球的表面标记物(CD43、CD41a和CD235a)的细胞流式检测结果，可以看到，在第四培养基或第五培养基诱导3天后，造血内皮细胞球分别产生了11.1％或15.5％的CD43+细胞，同时，分别有4.14％或5.95％的CD41a+CD235a+细胞产生；图11中C为分化阶段产生的悬浮细胞的表面标记物(CD43、CD41a和CD235a)的细胞流式检测结果，可以看到在四培养基或第五培养基中培养3天后，产生的悬浮细胞均高表达CD43(95％以上)；在第四培养基的诱导下，产生的悬浮细胞中CD235a+CD41a+细胞和CD235a-CD41a-细胞的比例分别为76.7％和6.76％；而在第五培养基的诱导下，产生的悬浮细胞中CD235a+CD41a+细胞和CD235a-CD41a-细胞的比例分别为62.7％(比第四培养基低1.2倍)和25.2％(比第四培养基高3.5倍)。由于巨核细胞主要以单个独立细胞的形式存在，因此，更加关注悬浮细胞的检测结果并以此作为判断标准。从细胞流式分析结果来看，S1的方法，即采用第四培养基更利于巨核红系祖细胞的产生。
效果实施例3培养基对巨核红系祖细胞维持的影响
S1一种诱导人胚胎干细胞分化为巨核红系祖细胞的方法，示意图如图12中A所示，与效果实施例1的步骤(1)、(2)、(3)一致。
S2一种诱导人胚胎干细胞分化为巨核红系祖细胞的方法，示意图如图12中A所示，与效果实施例1的步骤(1)、(2)、(3)一致，区别仅在于步骤(3)中的培养基更换为第四培养基。
比较S1、S2方法对巨核红系祖细胞维持的影响，结果如图12所示：图12中B为培养阶段细胞球的表面标志(CD43、CD41a和CD235a)的细胞流式检测结果，可以看到，在第四培养基或第五培养基的作用下，细胞球内CD43+细胞和CD235a+CD41a+巨核红系祖细胞比例均维持在较低水平；在这3天培养过程中，细胞球均能持续产生悬浮细胞，图12中C为该培养阶段产生的悬浮细胞的表面标志(CD43、CD41a和CD235a)的细胞流式检测结果，可以看到第四培养基或第五培养基诱导产生的悬浮细胞均高表达早期髓系特异性标志物CD43；其中第四培养基培养基诱导产生CD43+悬浮细胞的比例约为82.4％，明显低于第五培养基诱导产生的比例(约95％，比第四培养基高1.15倍)；在第四培养基的诱导下，产生的悬浮细胞中CD41a+细胞的比例仅为57％左右，比上一阶段(第四培养基诱导的第9天悬浮细胞)的CD41a+细胞比例率低1.54倍；其中，CD235a+CD41a+细胞和CD235a-CD41a-细胞的比例分别为32.6％和24.9％，这表明，在第四培养基继续诱导3天后，产生巨核红系祖细胞悬浮细胞的效率明显比上一阶段更差；而在第五培养基诱导下产生的悬浮细胞含有80.5％CD41a+细胞，比本阶段第四培养基诱导产生的比例更高，且与上一阶段第四培养基诱导的第9天悬浮细胞中CD41a+细胞比例接近；并且，此时CD235a+CD41a+细胞和CD235a-CD41a-细胞的比例分别为66.7％(比第四培养基高2.04倍)和10.2％(比第四培养基低2.44倍)。从细胞流式分析结果来看，S1的方法，即采用第五培养基更利于巨核红系祖细胞的维持。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种试剂盒，包含：第四培养基；所述第四培养基为包含生长因子、集落刺激因子和TGFβ/ALK抑制剂的基础培养基。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包含：第六培养基，所述第六培养基为包含以下中的至少一种或至少两种的基础培养基：集落刺激因子、白细胞介素；
优选地，所述试剂盒还包含：第二培养基和第三培养基，所述第二培养基和第三培养基为包含生长因子的基础培养基；
所述第二培养基的生长因子包含表皮生长因子、血小板衍生的生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-I、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子、神经生长因子、抑瘤素M、血小板衍生的内皮细胞生长因子、转化生长因子-α、血管内皮细胞生长因子中的任一种；
所述第三培养基的生长因子包含表皮生长因子、血小板衍生的生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-I、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子、神经生长因子、抑瘤素M、血小板衍生的内皮细胞生长因子、转化生长因子-α、血管内皮细胞生长因子中的至少两种；
优选地，所述试剂盒还包含：第一培养基，所述第一培养基为包含以下中的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种的基础培养基：ROCK抑制剂、BMP信号通路激活剂、GSK3抑制剂、Activin A；
优选地，所述试剂盒还包含：第五培养基，所述第五培养基为包含以下中的至少一种或至少两种的基础培养基：集落刺激因子、白细胞介素；
优选地，所述第五培养基和所述第六培养基的集落刺激因子包含G-CSF、M-CSF、GM-CSF、IL-3、EPO、TPO、SCF、FlT3L中的至少两种；
优选地，所述第五培养基和所述第六培养基的的白细胞介素包含IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-11、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27中的至少两种。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包含：第七培养基；所述第七培养基为包含以下中的至少一种或至少两种的基础培养基：集落刺激因子、白细胞介素；
优选地，所述第七培养基的集落刺激因子包含G-CSF、M-CSF、GM-CSF、IL-3、EPO、TPO、SCF、FlT3L中的任一种；
优选地，所述第七培养基的白细胞介素包含IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-11、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27中的任一种。
4.权利要求3所述的试剂盒在(1)～(10)中任一项中的应用；
(1)制备中内胚层细胞；(2)制备造血内皮细胞；(3)制备巨核红系祖细胞；(4)制备巨核细胞；(5)制备诱导干细胞分化为中内胚层细胞的产品；(6)制备诱导干细胞分化为造血内皮细胞的产品；(7)制备诱导干细胞分化为巨核红系祖细胞的产品；
(8)制备诱导干细胞分化为巨核细胞的产品；(9)制备血小板；(10)制备诱导干细胞分化为血小板的产品。
5.如下S1～S2中任一种方法：
S1：一种诱导干细胞分化为巨核细胞的方法，包含采用权利要求1～3中任一项所述的试剂盒的步骤；
S2：一种诱导干细胞分化为血小板的方法，包含采用权利要求3所述的试剂盒的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
S1中所述诱导干细胞分化为巨核细胞的方法包含如下步骤：
(1)将干细胞向中内胚层细胞分化培养，得到中内胚层细胞；
(2)将中内胚层细胞向造血内皮分化培养，得到造血内皮细胞；
(3)将造血内皮细胞置于权利要求1～3中任一项所述的第四培养基中培养，得到巨核红系祖细胞；
(4)将巨核红系祖细胞向巨核细胞分化培养，得到巨核细胞；
优选地，S2中所述诱导干细胞分化为血小板的方法包含如下步骤：
(1)将干细胞向中内胚层细胞分化培养，得到中内胚层细胞；
(2)将中内胚层细胞向造血内皮分化培养，得到造血内皮细胞；
(3)将造血内皮细胞置于权利要求3所述的第四培养基中培养，得到巨核红系祖细胞；
(4)将巨核红系祖细胞向巨核细胞分化培养，得到巨核细胞；
(5)采用权利要求3所述的试剂盒中的第七培养基培养巨核细胞，得到血小板。
7.一种巨核细胞，通过权利要求5或6所述的诱导干细胞分化为巨核细胞的方法制备得到。
8.一种血小板，通过权利要求5或6所述的诱导干细胞分化为血小板的方法制备得到。
9.一种药物组合物，包含：权利要求8所述的血小板；
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
10.权利要求8所述的血小板和/或权利要求9所述的药物组合物在制备药物中的应用；
优选地，所述药物具有治疗和/或预防如下疾病中的至少一种：贫血、血小板减少症、急性白血病。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114438036A (zh) * | 2021-12-03 | 2022-05-06 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种促进干细胞向红系细胞定向分化与成熟的方法与应用 |
-
2022
- 2022-12-02 CN CN202211537146.0A patent/CN115786259A/zh active Pending
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN114438036A (zh) * | 2021-12-03 | 2022-05-06 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种促进干细胞向红系细胞定向分化与成熟的方法与应用 |
| CN114438036B (zh) * | 2021-12-03 | 2023-08-18 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种促进干细胞向红系细胞定向分化与成熟的方法与应用 |
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