CN103555660A - 一种胚胎干细胞无血清培养基及其应用 - Google Patents

一种胚胎干细胞无血清培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种胚胎干细胞无血清培养基及其应用，所述的培养基包含以下组分：小分子抑制剂CHIR99021、XAV939，添加物B27/N2和基础培养基DMEM/F12。本发明使用两个小分子抑制剂CHIR99021、XAV939和成分明确的B27/N2添加物取代了传统胚胎肝细胞培养基中的血清和饲养层细胞，提供了一种没有动物源物质、成份确定的胚胎干细胞培养基，实验证实该培养基不仅可以维持人胚胎干细胞的自我更新，并且能在较长时间内维持胚胎干细胞的未分化状态和全能性，且由于其成分清晰明确，所含蛋白和其他成分皆来自人源重组蛋白或化学合成，不会造成胚胎干细胞污染，故而不会激起相应免疫反应，引发免疫排斥。

Description

一种胚胎干细胞无血清培养基及其应用
技术领域
本发明涉及胚胎干细胞的培养，具体地说，是一种胚胎干细胞无血清培养基及其应用。
背景技术
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ES Cells)是由早期胚胎内细胞团(Inner cell mass，ICM)或原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外分化抑制培养筛选出的一种全能干细胞。胚胎干细胞的形态特征与早期胚胎细胞非常相似，具有稳定的自我更新能力，长时间体外继代培养后仍能保持正常的二倍体染色体结构；同时胚胎干细胞也有非常强的分化能力，在特定的条件培养下，它可以增殖分化为全身200多种细胞类型。因此胚胎干细胞可以提供一种理想的生物学平台，用于科学研究与临床应用，如药物筛选、细胞发育与分化的分子调节机制研究、组织工程种子细胞及基因治疗载体的建立、细胞治疗及再生医学等。
要想充分运用干细胞，首先要建立和维持好干细胞系。ES细胞的培养关键是既要维持细胞的未分化状态和潜能性，又要使其无限增殖。传统建立和维持人胚胎干细胞系的标准方法是：ESC生长在有丝分裂失活的饲养层细胞(FEEDER)上，基本培养基多为DMEM并添加胎牛血清(FCS)及白血病抑制因子(LIF)等。但是，这种培养系统中含有大量的动物源成份，如血清及饲养层细胞等。大量动物源成份的长期使用不仅增加了胚胎干细胞感染外源性病毒、病原体的危险性，还可能造成胚胎干细胞的污染。移植此种来源的胚胎干细胞，潜在的外源性病原体将感染患者，那些被污染的胚胎干细胞也有可能在患者体内诱发激发强烈的免疫反应，发生免疫排斥，这些潜在风险必将极大限制胚胎干细胞的临床应用。已有文献报道，饲养层细胞或血清产品培养的人类胚胎干细胞表达Neu5Gc，一种非人类的唾液酸，这种被污染的人类胚胎干细胞将有很大的可能在患者体内诱发免疫反应。同时，饲养层细胞及血清的使用还对ESC生长、增殖及分化等分子机理研究造成限制，也将给药物筛选带来干扰。另外，传统培养系统中各种复杂未知的营养成份，在长期培养过程中，也有可能会选择或改变胚胎干细胞的某些表型。因此，为了更好的利用胚胎干细胞的这一理想的生物学平台，必须优化培养系统，建立一个没有动物源物质、成份确定的人胚胎干细胞无血清培养基。并且该培养基既能维持胚胎干细胞的未分化状态和潜能性，又能使其无限增殖。
CHIR99021和XAV939均为小分子抑制剂，它们的结构分别如下：
Figure 45872DEST_PATH_IMAGE001
Figure 569258DEST_PATH_IMAGE002
。
小分子抑制剂CHIR99021是目前所知的糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的最选择性抑制剂。XAV939也是小分子选择性抑制剂，作用于TNKS1和TNKS2。GSK-3β、TNKS1和TNKS2都是Wnt信号通路中的重要参与者，Wnt信号通路参与调控干细胞的增殖和自我更新。目前关于含有CHIR99021和XAV939、成分明确的胚胎干细胞无血清培养基还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种胚胎干细胞无血清培养基。
本发明的再一的目的是，提供上述胚胎干细胞无血清培养基的用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种胚胎干细胞无血清培养基，它包含以下组分：小分子抑制剂CHIR99021、XAV939，添加物B27/N2和基础培养基DMEM/F12，所述的添加物B27/N2的组分及各组分重量比为：
Figure 999102DEST_PATH_IMAGE003
Figure 37465DEST_PATH_IMAGE004
。所述的B27/N2添加物其成分明确，所含蛋白、维生素和其他成分皆来自人源重组蛋白、人源化产品或化学合成。
该培养基中，所述的小分子抑制剂CHIR99021和XAV939的摩尔比为0.8-0.95：0.95-1.08。
该培养基中，所述的基础培养基DMEM/F12的组分及各组分重量比优选为：
Figure 578168DEST_PATH_IMAGE005
Figure 34688DEST_PATH_IMAGE006
Figure 369855DEST_PATH_IMAGE007
。但是基础培养基DMEM/F12不仅限于此，也可以直接从试剂公司购买。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：如上任一所述的胚胎干细胞无血清培养基在培养胚胎干细胞中的应用。
本发明优点在于：
本发明使用两个小分子抑制剂CHIR99021、XAV939和成分明确的B27/N2添加物取代了传统胚胎肝细胞培养基中的血清和饲养层细胞，提供了一种没有动物源物质、成份确定的胚胎干细胞培养基，实验证实该培养基不仅可以维持人胚胎干细胞的自我更新，并且能在较长时间内维持胚胎干细胞的未分化状态和全能性，且由于其成分清晰明确，所含蛋白和其他成分皆来自人源重组蛋白或化学合成，不会造成胚胎干细胞污染，故而不会激起相应免疫反应，引发免疫排斥。
附图说明
附图1是用实施例1培养基培养的人胚胎干细胞系H9碱性磷酸酶（ALP）染色图片。其中未分化胚胎干细胞表面标志物TRA-1-60和 SSEA-4；核标记为Nanog和OCT-4。
附图2是用实施例1培养基培养的人胚胎干细胞系H9 ES细胞注入小鼠，获取脐胎瘤切片，进行HE染色的图片。
附图3是用实施例1培养基培养的人胚胎干细胞系H9 ES细胞注入小鼠，获取脐胎瘤切片，进行免疫荧光染色的图片。
附图4是用实施例1培养基培养的人胚胎干细胞H9 ES的Neu5Gc检测质谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1  本发明的胚胎干细胞无血清培养基（一）
所述的培养基由以下成分组成：CHIR99021，XAV939，B27/N2和DMEM/F12。各成分的具体物质组成及其工作浓度为：
（1）CHIR99021   0.85μmol/L，
（2）XAV939      1.02μmol/L，
（3）添加物N2：
（4）添加物B27：
Figure 239908DEST_PATH_IMAGE009
（5）DMEM/F12：
Figure 737885DEST_PATH_IMAGE005
Figure 57002DEST_PATH_IMAGE006
Figure 273220DEST_PATH_IMAGE007
按照上述组分，常规方法配制培养基。
实施例2  本发明的胚胎干细胞无血清培养基（二）
所述的培养基由以下成分组成：CHIR99021，XAV939，B27/N2和DMEM/F12。各成分的具体物质组成及其工作浓度为：
（1）CHIR99021   0.80μmol/L，
（2）XAV939      1.08μmol/L，
（3）添加物N2：
（4）添加物B27：
Figure 570526DEST_PATH_IMAGE011
（5）DMEM/F12：
Figure 326123DEST_PATH_IMAGE005
Figure 764058DEST_PATH_IMAGE006
Figure 246992DEST_PATH_IMAGE007
    按照上述组分，常规方法配制培养基。
实施例3  本发明的胚胎干细胞无血清培养基（三）
所述的培养基由以下成分组成：CHIR99021，XAV939，B27/N2和DMEM/F12。各成分的具体物质组成及其工作浓度为：
（1）CHIR99021   0.95μmol/L，
（2）XAV939      0.95μmol/L，
（3）添加物N2：
Figure 719562DEST_PATH_IMAGE012
（4）添加物B27：
Figure 567432DEST_PATH_IMAGE013
（5）DMEM/F12：
Figure 305712DEST_PATH_IMAGE005
Figure 530020DEST_PATH_IMAGE006
Figure 919413DEST_PATH_IMAGE007
    按照上述组分，常规方法配制培养基。
实施例4  本发明的胚胎干细胞无血清培养基（四）
所述的培养基由以下成分组成：CHIR99021，XAV939，B27/N2和DMEM/F12。各成分的具体物质组成及其工作浓度为：
（1）CHIR99021   0.85μmol/L，
（2）XAV939      1.02μmol/L，
（3）添加物N2：
Figure 203764DEST_PATH_IMAGE008
（4）添加物B27：
Figure 616290DEST_PATH_IMAGE009
（5）DMEM/F12：购于sigma公司。
按照上述组分，常规方法配制培养基。
实施例5  本发明的胚胎干细胞无血清培养基（五）
所述的培养基由以下成分组成：CHIR99021，XAV939，B27/N2和DMEM/F12。各成分的具体物质组成及其工作浓度为：
（1）CHIR99021   0.80μmol/L，
（2）XAV939      1.08μmol/L，
（3）添加物N2：
Figure 191759DEST_PATH_IMAGE010
（4）添加物B27：
Figure 373342DEST_PATH_IMAGE011
（5）DMEM/F12：购于invitrogen公司。
按照上述组分，常规方法配制培养基。
实施例6  本发明胚胎干细胞无血清培养基的效果验证
一、实验方法
1、细胞培养
人胚胎干细胞系H9用于下述所有实验。
人胚胎干细胞系H9，接种于细胞培养皿，实验所用细胞培养皿皆经预处理，包含下列人源粘附分子：10μg/cm2 人源胶原蛋白IV（collagen IV）、0.2μg/cm2 人源玻璃粘连蛋白（vitronectin ）、 5μg/cm2 人源纤维连接蛋白（fibronectin）、5μg/cm2 人源层粘连蛋白（laminin）。添加胚胎肝细胞培养基进行连续培养，每两天更换一次培养基，大约6天继代培养一次。继代培养采用拉细的玻璃吸管将hES细胞集落切割成大小合适、均匀的小块，然后按1:3的比例继代培养。每隔五代，收集冻存一次人胚胎干细胞，并同时检测人胚胎干细胞的分化状态及其全能性。
实验设置6组，分别为采用实施例1、2、3、4、5的胚胎肝细胞无血清培养基培养组及对照组（使用人胚胎干细胞完全培养基进行培养，货号：HUXES-90011），每组设50个培养板，实验重复3次。
各实验组使用的细胞冻存液为：对应的培养基分别加10%DMSO、0.1mol/L蔗糖。
2、检测人胚胎干细胞的分化状态及其全能性
未分化的胚胎干细胞具有以下特征：
①呈集落样生长，单个细胞体积小而圆，核质比大；
②胞内的碱性磷酸酶活性较高；
③蛋白Oct 4 和Nanog阳性表达于细胞核内；
④蛋白SSEA-4和Tra-1-60阳性表达于细胞膜表面。
观察细胞的生长，通过碱性磷酸酶染色检测ES胞内碱性磷酸酶活性，通过免疫荧光染色检测ES胞内外蛋白。
碱性磷酸酶染色（ALP）方法：冷的100%酒精固定ES细胞，室温下用PBT溶液（PBS + 0.1% Tween-20）润洗两次，每次5分钟；然后室温下，用NTMT溶液（100mM  Tris-HCl  pH 9.5，100mM NaCl，50mmMgCl2，0.1% Tween-20）润洗细胞三次，每次5分钟。ES细胞浸泡于底物溶液开始显色反应（每1毫升NTMT中含168mg硝基蓝四氮唑（4-Nitroblue tetrazolium：NBT）和84.5毫克5-溴-4-氯-8-吲哚磷酸（5-bromo-4-chloro-8-indolilphosphate：BCIP）；40-120分钟后，用PBT洗涤3次停止显色。显微镜下观察分析结果。
免疫荧光染色方法：细胞在2%多聚甲醛中固定15分钟，然后PBS洗3次，每次5分钟，然后用10%正常山羊血清（NGS）室温孵育30分钟封闭非特异性结合位点。转移至一抗缓冲液中室温过夜（5%NGS和0.1% Triton X-100）。第二天，PBS洗涤细胞3次，每次5分钟，然后与Cy2或Cy3偶联的羊抗鼠IgG室温孵育60分钟。PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。最后，DAPI（1:1000稀释）染色1分钟，PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。荧光显微镜下分析结果。所用一抗分别是：anti-TRA-1-60 (MAB4360, Millipore), anti-human Nanog-NL493 (R&DSystems), anti-Oct-4 (SC5279, Santa Cruz), anti-SSEA-4 (MC-813-70, DSHB), anti-SMA (MAB1259, R&D systems), anti-TUJ-1 (MMS-435P, Covance) and anti-GFAP (556327, BD biosciences).
小鼠畸胎瘤检查方法：107个H9 ES细胞注入八周龄裸鼠背部皮下，一个月后杀死小鼠，取下脐胎瘤，切片通过免疫荧光染色和HE染色分析H9细胞系的全能性。外胚层（Ectoderm）标志：TUJ-1；中胚层（Mesoderm）标志：SMA；内胚层（Endoderm）标志：AFP。
检测Neu5Gc方法：107个H9 ES细胞经超声破碎后，密度梯度离心，HPLC纯化Neu5Gc，过质谱检测。
二、实验结果
1、碱性磷酸酶（ALP）染色证实胚胎干细胞系处于未分化状态
图1是用实施例1培养基培养的人胚胎干细胞系H9碱性磷酸酶（ALP）染色图片，其中未分化胚胎干细胞表面标志物TRA-1-60和 SSEA-4；核标记为Nanog和OCT-4。结果证实人胚胎干细胞系H9处于未分化状态。
2、HE染色证实胚胎干细胞的全能性
图2是用实施例1培养基培养的人胚胎干细胞系H9 ES细胞注入小鼠，获取脐胎瘤切片，进行HE染色的图片。结果显示该胚胎干细胞具备全能性。
3、免疫荧光染色证实胚胎干细胞全能性
图3是用实施例1培养基培养的人胚胎干细胞系H9 ES细胞注入小鼠，获取脐胎瘤切片，进行免疫荧光染色的图片。结果同样显示该胚胎干细胞具备全能性。
4、Neu5Gc检测证实无污染
图4是用实施例1培养基培养的人胚胎干细胞H9 ES的Neu5Gc检测质谱图。结果显示胚胎干细胞无非人类唾液酸Neu5Gc表达，表明本发明的胚胎肝细胞无血清培养基不会造成胚胎干细胞污染。
实验结果显示用实施例2-5的胚胎干细胞无血清培养基进行培养的人胚胎干细胞H9同样具备全能性。实施例1-5的培养基培养人胚胎干细胞H9未出现污染，对照组的培养基培养人胚胎干细胞H9在3次实验中分别出现5例、7例、8例污染。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种胚胎干细胞无血清培养基，其特征在于，它包含以下组分：小分子抑制剂CHIR99021、XAV939，添加物B27/N2和基础培养基DMEM/F12，所述的添加物B27/N2的组分及各组分重量比为：
Figure 335478DEST_PATH_IMAGE001
Figure 596695DEST_PATH_IMAGE002
。
2.根据权利要求1所述的胚胎干细胞无血清培养基，其特征在于，所述的小分子抑制剂CHIR99021和XAV939的摩尔比为0.8-0.95：0.95-1.08。
3.根据权利要求1所述的胚胎干细胞无血清培养基，其特征在于，所述的基础培养基DMEM/F12的组分及各组分重量比为：
 
Figure 999995DEST_PATH_IMAGE003
。
4.权利要求1-3任一所述的胚胎干细胞无血清培养基在培养胚胎干细胞中的应用。
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