ITUB20152804A1 - Mezzo di coltura cellulare privo di siero. - Google Patents
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Description
“MEZZO DI COLTURA CELLULARE PRIVO DI SIERO”
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione riguarda un mezzo per coltura cellulare in particolare di fibroblasti autoioghi umani destinati a trapianti di pelle nel campo della medicina estetica o rigenerativa.
STATO DELLA TECNICA
Nella medicina estetica e rigenerativa l’uso di trapianto di fibroblasti autoioghi definito in gergo “autotrapianto” è una tecnica utilizzata da tempo.
Con l’età il numero di fibroblasti attivi nella pelle tende a diminuire, cosi come le relative capacità metaboliche. L’aumento di cellule dovuto al trapianto di fibroblasti autoioghi in grado di sintetizzare la matrice extracellulare, consente di contrastare gli effetti delTinvecchiamento della pelle.
Infatti è stato clinicamente dimostrato che nei pazienti nei quali sono stati iniettate colture di fibroblasti autoioghi provenienti da espianti dello stesso paziente e coltivati in vitro, hanno migliorato le proprietà biomeccaniche della pelle del suddetto paziente, come dimostrato con diversi tipi di prove cliniche quali ad esempio la profilometria ottica, la cutometria a vuoto, Tanalisi fotometrica VI SIA<®>.
Infatti i fibroblasti iniettati sono stati in grado di sintetizzare la matrice extracellulare per almeno 12 mesi.
Nelle aree della pelle dei pazienti che hanno subito il trattamento si nota infatti un aumento del collagene ed un generale ispessimento del derma (fino al 60% in 12 mesi), un aumento dell’ elasticità della cute (25% nell’area periorbitale ) ed una generale riduzione delle rughe pari al 50% (V.Zorin et al “Clinical-instrumental and morphological evaluation of thè effect of autologous derma! fibroblasts administration” Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medi cine Arti eie firstpublished online: 19 DEC 2014b DOI: 10.1002/tenn.l976).
Nonostante i buoni esiti ottenuti con questa tecnica, essa stenta a prendere piede per una serie di criticità, prima fia tutte il mezzo di coltura cellulare.
Infatti è ben noto che i mezzi di coltura nelle quali crescono cellule quali i fibroblasti non sempre sono adatti ad essere iniettati nell’uomo.
Infatti è noto che le cellule presentano un’ottima vitalità cellulare e proliferazione in presenza di siero ed il siero generalmente impiegato è il siero fetale bovino (PBS). Questo tipo di sostanze può essere immunogeno e quindi provocare in alcuni soggetti reazioni allergiche. Altri tipi di mezzi di colture cellulari quali il DMEM hanno elevatissime quantità di glucosio che può rivelarsi pericoloso in soggetti con diabete conclamato oppure con tendenze al diabete.
E’ sentita l’esigenza di disporre di mezzi di coltura cellulare che non presentino i suddetti inconvenienti, in altre parole che siano privi di siero e nel contempo contengano un più basso contenuto di glucosio, rispetto ai mezzi di coltura cellulare quali il DMEM.
E’ d’altronde nota una soluzione salina fisiologica detta formulazione di Tyrode che consente di conservare a basse temperature gli organi da trapiantare per 10-12 ore.
Questa soluzione acquosa è costituita dai seguenti componenti nelle rispettive concentrazioni
Formulazione di Tyrode standard
NaCl 137 mM
KC1 2,7 mM
D-glucosio 5,5 mM
NaHC0312 mM
NaH2P040,2 mM
MgCl21 mM
CaCl21,8 mM
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
La richiedente ha ora trovato una soluzione salina, la quale, quando adoperata come mezzo di coltura cellulare, in particolare per fibroblasti, mantiene le cellule vitali fino al 30% per un periodo di 24 ore di incubazione in detto liquido. Inoltre questo tipo di soluzione salina consente una crescita cellulare decisamente superiore a quella di un mezzo di coltura contenente solo PBS.
Oggetto della presente invenzione è quindi una soluzione acquosa salina contenente
a) una miscela di sali minerali costituita da cloruro di sodio, cloruro di potassio, bicarbonato di sodio, di -idrogeno fosfato di sodio, cloruro di magnesio e cloruro di calcio,
b) D-glucosio e
c) almeno una vitamina idrosolubile,
in cui la concentrazione di b) D-glucosio è < di 6 mM.
Ulteriore oggetto della presente invenzione è un mezzo per coltura cellulare privo di siero costituito dalla suddetta soluzione fisiologica.
Infine ulteriore oggetto della presente invenzione è una coltura cellulare di fibroblasti autoioghi umani nel mezzo di coltura secondo la presente invenzione per uso in trapianti della pelle in medicina estetica o rigenerativa.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
La figura 1 rappresenta in forma di grafico i risultati del saggio MTT sulla vitalità cellulare % di fibroblasti dopo 24 ore di incubazione rispettivamente in DMEM, DMEM PBS, PBS da solo, soluzione di Tyrode convenzionale, soluzione secondo la presente invenzione in presenza di Vitamina C (0,lmM) e vitamina B6 (lOmM) e soluzione secondo la presente invenzione in presenza di Vitamina C (ImM), e vitamina B6 (lOmM).
La figura 2 rappresenta la proliferazione di fibroblasti umani (conta cellulare) dopo 24 ore di incubazione nei seguenti mezzi di coltura: DMEM da solo, DMEM PBS, PBS da solo, soluzione di Tyrode convenzionale, soluzione secondo la presente invenzione in presenza di Vitamina C (0,lmM), vitamina B6 (lOmM) e soluzione secondo la presente invenzione in presenza di Vitamina C (ImM), vitamina B6 (lOmM).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Preferibilmente la soluzione salina delTinvenzione ha una concentrazione del componente b) ovvero il D-glucosio di 5,5mM.
Preferibilmente le vitamine idrosolubili secondo la presente invenzione sono scelte tra almeno una delle seguenti: vitamina C, vitamina B12, vitamina B6, vitamina B5 o acido pantotenico, biotina, nicotinammide ovvero la fonna ammidica della vitamina B3, acido α-lipoico o vitamina N in forma salificata.
Preferibilmente la soluzione salina dell’ invenzione contiene almeno l’associazione di vitamina C e vitamina B6.
Preferibilmente per gli scopi della presente invenzione per vitamina B6 si intende piridossina, piridossamina cloridrato, piiidossale o piridossal fosfato.
Preferibilmente la vitamina C è presente in concentrazione compresa tra 0,05 mM e 2 mM ed una concentrazione di vitamina B6 compresa tra 5mM e 20 mM.
Secondo una forma particolarmente preferita dell’ invenzione la soluzione salina secondo la presente invenzione è costituita da i seguenti componenti nelle rispettive concentrazioni millimolari:
NaCl 130 mM,
KC1 2,68 mM,
D-glucosio 5.5 mM,
NaHCOs 11,9 mM,
NaH2P040,46 mM,
MgCl21.05 mM,
CaCl21,8 mM,
Vitamina C 0,1 -1 mM,
Vitamina B6 10 mM.
Si riportano qui di seguito a scopo illustrativo le prove sperimentali di vitalità cellulare e proliferazione di cellule di fibroblasti condotte su colture cellulari rispettivamente in DMEM, DMEM PBS, PBS da solo, soluzione di Tyrode convenzionale, soluzione secondo la presente invenzione in presenza di Vitamina C (Ο,ΙΜιη) e vitamina B6 (lOmM) e soluzione secondo la presente invenzione in presenza di Vitamina C (IMm), e vitamina B6 (lOmM).
ESEMPIO
Metodo
Le cellule (fibroblasti dermici umani primari) sono state coltivate in condizioni standard per amplificazione (37° C, 5% C02, in incubatore 95% umidità) nei seguenti liquidi di coltura
• DMEM
• DMEM addizionato di antibiotici e 10% di siero, nel liquido di coltura contenente siero PBS (10%)
• Tyrode Standard
• Due liquidi di Tyrode modificati secondo Tinvenzione e contenenti ciascuno vitamina B6 in concentrazione 1 OmM e vitamina C rispettivamente in concentrazione 0,1 e ImM.
Si riportano qui di seguito nella seguente tabella la formulazioni Tyrode convenzionale o standard e le formulazioni Tyrode modificate secondo la presente invenzione e testate nel presente esempio.
Componente Tyrode modificata Tyrode standard secondo la presente
invenzione
NaCl 130 mM 137 mM
KC1 2,68 mM 2,7 mM
D-glucosio 5,5 mM 5,5 mM
NaHC03 11,9 mM 12 mM
NaH2P04 0,46 mM 0,2 mM
MgC12 1,05 mM I mM
CaC12 1,8 mM 1,8 mM
VitC 0,1 mM o 1 mM Assente
Vit B6 10 mM Assente
Al momento deH'esperimento le cellule staccate mediante trattamento con tripsina e dopo centrifugazione e lavaggi in tampone sterile (PBS), sono state sospese nelle diverse soluzioni preparate e quindi contate con un conta cellule automatico. Durante Tincubazione per 24 h le cellule sono state mantenute nell'incubatore come per la fase in amplificazione.
Le colture cellulari sono state quindi valutate per la vitalità (saggio MTT) e per la proliferazione (conta cellulare).
I risultati delle suddette prove sono riportati rispettivamente nelle Figure 1 e 2. Come si può vedere dopo 24 ore di incubazione nei terreni privi di siero (PBS e Tyrode standard) le cellule di fatto hanno totalmente perso la loro vitalità. Nel caso del mezzo di coltura DMEM col siero le cellule hanno più del 90% di sopravvivenza che cala a poco più del 60% in DMEM senza siero ma in presenza di alte dosi di aminoacidi, vitamine e 25 mM glucosio, che è il quintuplo della concentrazione standard. Le formulazioni del Tyrode modificate secondo la presente invenzione invece mantengono vitali le cellule fino al 30% dopo 24 ore, un risultato nettamente migliore rispetto alla soluzione Tyrode standrad, ma anche rispetto al liquido di coltura contenente solo PBS.
Le due formulazioni di Tyrode modificato oggetto della presente invenzione e testate mostrano una proliferazione decisamente migliore rispetto alla fonnulazioni standard contenente solo PBS e la Tyrode standard, anche se ovviamente inferiori alle fonnulazioni DMEM che sono decisamente molto più ricche di aminoacidi, micronutrienti.
Claims (9)
- RIVENDICAZIONI 1. Soluzione acquosa salina comprendente: a) una miscela di sali minerali biologicamente accettabili costituita da cloruro di sodio, cloruro di potassio, bicarbonato di sodio, di-idrogeno fosfato di sodio, cloruro di magnesio e cloruro di calcio, b) D-glucosio e c) almeno una vitamina idrosolubile, in cui la concentrazione di b) glucosio e < di 6 mM.
- 2. Soluzione fisiologica salina secondo la rivendicazione 1, in cui la concentrazione di b) glucosio è 5,5mM.
- 3. Soluzione acquosa salina secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui dette vitamine idrosolubili sono scelte tra almeno una delle seguenti: vitamina C, vitamina B12, vitamina B6, vitamina B5, biotina, nicotinammide, acido α-lipoico in forma salificata.
- 4. Soluzione acquosa salina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, contenenti almeno la vitamina C e la vitamina B 12.
- 5. Soluzione acquosa salina secondo la rivendicazione 4 in cui detta vitamina C è presente in concentrazione compresa tra 0,05 mM e 2 mM ed una concentrazione di vitamina B6 compresa tra 5 mM e 20 mM.
- 6. Soluzione salina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 4 o 5, caratterizzata dal fatto che detta soluzione è una soluzione di tyrode modificata ed è costituita da i seguenti componenti nelle rispettive concentrazioni millimolari: NaCl 130 mM, KC1 2,68 mM, D-glucosio 5.5 mM, NaHCOs 11,9 mM, NaH2P040,46 mM, MgCl21.05 mM, CaCh 1,8 mM, Vitamina C 0,1 -1 mM, Vitamina B6 10 mM.
- 7. Mezzo di coltura cellulare, privo di siero, costituito dalla soluzione acquosa salina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 -6
- 8. Coltura cellulare di fibroblasti espansi nel mezzo di coltura cellulare privo di siero secondo la rivendicazione 7.
- 9. Coltura cellulare secondo la rivendicazione 8, in cui detti fibroblasti sono umani autoioghi, per uso in trapianti della pelle in medicina estetica.
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