CN110177872A - 间充质干细胞和药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供在作为药物使用时安全性高的间充质干细胞。本发明为，以组织因子(TF)的低表达为特征的间充质干细胞。另外，本发明还包含特征在于选自由ITGA11、ITGA1、ITGB5、ITGBL1、ITGB1和ITGAV组成的组中的至少一种整合蛋白基因为低表达的间充质干细胞。进而还包含特征在于选自由ITGA4、ITGA9、ITGA7和ITGA10组成的组中的至少一种整合蛋白基因为高表达的间充质干细胞。上述间充质干细胞优选为异体来源、优选为脂肪组织来源。本发明还包含含有上述间充质干细胞的药物组合物。

Description

间充质干细胞和药物组合物
技术领域
本发明涉及间充质干细胞和药物组合物。
背景技术
间充质干细胞是由Friedenstein(1982)首次从骨髓分离的具有多分化能力的前体细胞(参照非专利文献1)。已经明确了该间充质干细胞存在于骨髓、脐带、脂肪等各种各样的组织中，间充质干细胞移植有望成为针对各种难治性疾病的新型治疗方法(参照专利文献1～2)。最近，已知存在具有与脂肪组织、胎盘、脐带、卵膜等的基质细胞同等功能的细胞。因此，有时也将间充质干细胞称为基质细胞(Mesenchymal Stromal Cell)。
然而，在对小鼠的静脉内给药间充质干细胞的研究中，有报道证实了，由于肺部的循环障碍导致呼吸衰竭而使小鼠死亡的例子(参照非专利文献2～4)，期望开发出安全性高的间充质干细胞。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2012-157263号公报
专利文献2：日本特表2012-508733号公报
非专利文献
非专利文献1：Pittenger F.M.et al.,Science,284,pp.143-147,1999
非专利文献2：Furlani D.et al.,Microvasc.Res.,77,pp.370-376,2009
非专利文献3：Tathumi K.et al.,Biochemical and Biophysical ResearchCommunications,431,pp.203-209,2013
非专利文献4：Shirathuki S.et al.,Hepatology Research,45,pp.1353-1359,2015
发明内容
发明要解决的问题
在上述那样的情况下，本发明的目的在于提供作为药物安全性高的间充质干细胞。
用于解决问题的方案
为了解决上述课题而进行了深入研究，结果本发明人等发现：通过用无血清培养基培养间充质干细胞(mesenchymal stem(stromal)cell；MSC)，能够培养出安全性高的间充质干细胞，从而完成了本发明。根据本发明，能够提供作为药物安全性高的间充质干细胞。即本发明的主旨如下所述。
[1]一种间充质干细胞，其特征在于，组织因子(Tissue Factor；TF)为低表达。
[2]一种间充质干细胞，其特征在于，选自由ITGA11、ITGA1、ITGB5、ITGBL1、ITGB1和ITGAV组成的组中的至少一种整合蛋白基因为低表达。
[3]一种间充质干细胞，其特征在于，选自由ITGA4、ITGA9、ITGA7和ITGA10组成的组中的至少一种整合蛋白基因为高表达。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的间充质干细胞，其为异体来源。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的间充质干细胞，其为脂肪组织来源。
[6]一种药物组合物，其包含[1]～[5]中任一项所述的间充质干细胞。
[7]一种疾病的治疗方法，其特征在于，使用组织因子(Tissue Factor；TF)为低表达的间充质干细胞。
[8]一种疾病的治疗方法，其特征在于，其使用选自由ITGA11、ITGA1、ITGB5、ITGBL1、ITGB1和ITGAV组成的组中的至少一种整合蛋白基因为低表达的间充质干细胞。
[9]一种疾病的治疗方法，其特征在于，其使用选自由ITGA4、ITGA9、ITGA7和ITGA10组成的组中的至少一种整合蛋白基因为高表达的间充质干细胞。
[10]根据[7]～[9]中任一项所述的疾病的治疗方法，其中，上述间充质干细胞为异体来源。
[11]根据[7]～[10]中任一项所述的疾病的治疗方法，其中，上述间充质干细胞为脂肪组织来源。
发明的效果
根据本发明，能够提供在作为药物使用时安全性高的间充质干细胞。
附图说明
图1是示出本发明的间充质干细胞的细胞尺寸(粒径)的图。
图2是示出本发明的间充质干细胞中的TF的mRNA表达的图。
图3是示出本发明的间充质干细胞中的TF的细胞表面蛋白表达(FACS解析)的图。
图4是示出本发明的间充质干细胞中的ITGB5的mRNA表达的图。
图5是示出本发明的间充质干细胞中的ITGB1的mRNA表达的图。
图6是示出本发明的间充质干细胞中的ITGA1的mRNA表达的图。
图7是示出本发明的间充质干细胞中的ITGA11的mRNA表达的图。
图8是示出本发明的间充质干细胞中的ITGAV的mRNA表达的图。
图9是示出本发明的间充质干细胞中的ITGA4的mRNA表达的图。
图10是示出本发明的间充质干细胞中的ITGB1的mRNA表达的图。
图11是示出本发明的间充质干细胞中的ITGA1的mRNA表达的图。
图12是示出本发明的间充质干细胞中的ITGA4的mRNA表达的图。
图13是示出本发明的间充质干细胞中的ITGA11的mRNA表达的图。
图14是示出本发明的间充质干细胞中的ITGAV的mRNA表达的图。
图15是示出本发明的间充质干细胞中的ITGB5的mRNA表达的图。
具体实施方式
以下对本发明的间充质干细胞和包含其的药物组合物进行详细说明。
[间充质干细胞和包含其的药物组合物]
本发明的间充质干细胞的特征在于组织因子(以下也称为“TF”)为低表达。
组织因子(Tissue factor,TF)是由295个氨基酸组成的47kD的糖蛋白，通过肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素1(IL-1)、急性期蛋白、凝血酶、内毒素等传递质，由脑、肺、胎盘等富含TF的组织的损伤(局部因素)，使得在全身的血管内皮细胞、单核细胞的表面被诱导表达。有研究表明，TF与F.VII结合并使F.VII活化，影响到了生理性的外源性凝血的形成。
需要说明的是，TF为低表达包括如下情况：在细胞中，TF的mRNA表达为低表达、或TF蛋白为低表达、或者这两者均为低表达。另外，本发明的间充质干细胞与其它细胞相比，只要TF为低表达即可，具体而言，本发明的间充质干细胞与在现有的培养条件下(例如，利用含有10％FBS的最低必需培养基(Minimum Essential Medium alpha，MEMα)的培养)得到的间充质干细胞相比，只要TF为低表达即可。与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比优选表达90％以下，更优选表达80％以下，进一步优选表达70％以下，特别优选表达60％以下。
另外，本发明的间充质干细胞的特征在于，选自由ITGA11、ITGA1、ITGB5、ITGBL1、ITGB1和ITGAV组成的组中的至少一种整合蛋白基因为低表达。进而，本发明的间充质干细胞的特征在于，选自由ITGA4、ITGA9、ITGA7和ITGA10组成的组中的至少一种整合蛋白基因为高表达。
已知的是，整合蛋白是与细胞外基质相互作用并响应细胞的形状/运动性、细胞周期的进行等细胞外基质的信息来传递细胞内信号的细胞表面蛋白。
整合蛋白相关基因为低表达或高表达包括如下情况：在细胞中，整合蛋白相关基因的mRNA表达为低表达或高表达、或整合蛋白相关基因蛋白质为低表达或高表达、或者这两者均为低表达或高表达。另外，本发明的间充质干细胞与其它细胞相比，只要整合蛋白相关基因为低表达或高表达即可，具体而言，本发明的间充质干细胞与在现有的培养条件下(例如，利用含有10％FBS的最低必需培养基(Minimum Essential Medium alpha，MEMα)的培养)得到的间充质干细胞相比，只要整合蛋白相关基因为低表达或高表达即可。
整合蛋白相关基因为低表达是指：与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比优选表达90％以下，更优选表达80％以下，进一步优选表达70％以下，特别优选表达60％以下。具体而言，ITGA1为低表达是指：与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比优选表达50％以下，更优选表达40％以下，进一步优选表达30％以下，特别优选表达20％以下。ITGA11为低表达是指：与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比优选表达10％以下，更优选表达5％以下，进一步优选表达1％以下，特别优选表达0.5％以下。ITGB5表达低表达是指：与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比优选表达70％以下，更优选表达60％以下，进一步优选表达50％以下，特别优选表达40％以下。ITGB1为低表达是指：与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比优选表达90％以下，更优选表达80％以下，进一步优选表达75％以下，特别优选表达70％以下。ITGBL1为低表达是指：与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比优选表达70％以下，更优选表达40％以下，进一步优选表达30％以下，特别优选表达25％以下。ITGAV为低表达是指：与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比优选表达80％以下，更优选表达70％以下，进一步优选表达60％以下，特别优选表达35％以下。另外，本发明的间充质干细胞与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比，ITGAE、ITGAМ、ITGB7或ITGA5可以为低表达。
整合蛋白相关基因为高表达是指：与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比优选表达110％以上，更优选表达120％以上，进一步优选表达130％以上，特别优选表达150％以上。具体而言，ITGA10为高表达是指：与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比优选表达200％以上，更优选表达500％以上，进一步优选表达750％以上，特别优选表达900％以上。ITGA7为高表达是指：与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比优选表达150％以上，更优选表达200％以上，进一步优选表达300％以上，特别优选表达400％以上。ITGA9为高表达是指：与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比优选表达130％以上，更优选表达150％以上，进一步优选表达200％以上，特别优选表达250％以上。ITGA4为高表达是指：与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比优选表达120％以上，更优选表达150％以上，进一步优选表达180％以上，特别优选表达200％以上。另外，本发明的间充质干细胞与在现有的培养条件下得到的间充质干细胞相比，ITGA3或ITGB3可以为高表达。
本发明中间充质干细胞是指：具有分化为属于间充质类的细胞(骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等)、优选为两种以上的细胞、更优选为三种以上的细胞的分化能力，并在维持该能力的状态下能够增殖的细胞。本发明中使用的间充质干细胞的术语是指与基质细胞相同的细胞，不对两者进行特别区分。另外，有时也简记为间充质细胞。作为包含间充质干细胞的组织，例如可列举出：脂肪组织、脐带、骨髓、脐带血、子宫内膜、胎盘、羊膜、绒毛膜、蜕膜、真皮、骨骼肌、骨膜、牙囊、牙周组织、牙髓、牙胚等。例如脂肪组织来源间充质干细胞是指脂肪组织中含有的间充质干细胞，还可称为脂肪组织来源间充质干细胞。这些当中，从对各种疾病的治疗的有效性的观点、获得容易性的观点等出发，优选脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞、胎盘来源间充质干细胞、牙髄来源间充质干细胞，更优选脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、进一步优选脂肪组织来源间充质干细胞。
本发明中的间充质干细胞可以是与被处置的对象(被检体)为同种来源或异种来源。作为本发明中的间充质干细胞的种类，可列举出：人、猴子、马、牛、绵羊、猪、狗、猫、兔子、小鼠、大鼠，优选为与被处置的对象(被检体)为同种来源细胞。本发明中的间充质干细胞可以源自被处置的对象(被检体)、即为自体细胞(同种同系)，或可以源自同种的其它对象、即为异体细胞(同种异体)。优选为异体细胞(同种异体)。
由于间充质干细胞对于同种异体的被检体也不易发生排斥反应，因此可以使用对预先制备的供体的细胞进行扩大培养并冷冻保存后的细胞，作为本发明的药物组合物中的间充质干细胞。因此，从与制备自身的间充质干细胞来使用的情况相比商品化也容易且容易稳定地得到恒定效果这样的观点出发，本发明中的间充质干细胞更优选为同种异体。
本发明中间充质干细胞是指：包含间充质干细胞的任意的细胞群体。该细胞群体的至少20％以上、优选30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％为间充质干细胞。
本发明中脂肪组织是指：含有脂肪细胞和包含微血管细胞等基质细胞的组织，例如，是将哺乳动物的皮下脂肪外科切除或吸取哺乳动物的皮下脂肪而得到的组织。脂肪组织可以由皮下脂肪获得。优选从与后述的脂肪组织来源间充质干细胞的给药对象为同种的动物获得、考虑到对人给药，更优选为人的皮下脂肪。皮下脂肪的供给个体可以是存活或死亡的，但本发明中使用的脂肪组织优选为从存活个体采集的组织。从个体采集时，吸脂例如可示例出：PAL(动力辅助)吸脂、Erchonia激光吸脂或Body-jet吸脂等，从维持细胞的状态这样的观点出发，优选不使用超声波。
本发明中脐带是连接胎儿和胎盘的白色的管状组织，由脐带静脉、脐带动脉、胶状组织(华顿氏胶；Wharton’s Jelly)、脐带基质本身等构成，富含间充质干细胞。脐带优选从与使用本发明的间充质干细胞的被检体(给药对象)为同种的动物获得，考虑到将本发明的间充质干细胞对人给药，更优选为人的脐带。
本发明中骨髓是指填充骨的内腔的实质组织(parenchyma)，为造血器官。骨髓中存在骨髓液，将存在于其中的细胞称为骨髓细胞。骨髓细胞中除了红细胞、粒细胞、巨核细胞、淋巴细胞、脂肪细胞等之外，包含间充质干细胞、造血干细胞、血管内皮祖细胞等。骨髓细胞例如可以由人髂骨、长骨或其它骨采集。
本发明中，所谓脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞的各组织来源间充质干细胞是指：分别包含所谓脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞的各组织来源间充质干细胞的任意的细胞群体。该细胞群体的至少20％以上、优选30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％为所谓脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞的各组织来源间充质干细胞。
本发明中的间充质干细胞除了上述TF为低表达之外，例如还可以利用生长特征(例如，从传代至老化为止的群体的倍增能力、倍增时间)、核型分析(例如，正常的核型、母体系统或新生儿系统)、通过流式细胞仪(例如，FACS分析)进行的表面标记物表达、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如，表位检测)、基因表达谱(例如，基因芯片阵列；逆转录PCR、实时PCR、传统型PCR等聚合酶链式反应)、miRNA表达谱、蛋白质阵列、细胞因子等蛋白质分泌(例如，血浆凝血解析、ELISA、细胞因子阵列)、代谢产物(代谢组学解析)、本领域中公知的其它方法等而赋予特征。
(间充质干细胞的制备方法)
TF低表达的间充质干细胞的制备方法没有特别限定，例如可以如下方式进行制备。即，本领域技术人员可以依据公知的方法从脂肪组织、脐带、骨髓等组织中分离间充质干细胞并进行培养，使用与TF特异性结合的抗TF抗体，利用细胞分选仪将TF低表达细胞分离或利用磁珠等去除TF高表达细胞等而获得。另外，通过使用了特定的培养基的培养，诱导TF表达低的间充质干细胞，从而还能够获得TF低表达的间充质干细胞。在通过该诱导而得到的细胞群体中，优选细胞群体的50％以上为TF低表达，更优选70％以上为TF低表达，进一步优选80％以上为TF低表达，特别优选90％以上为TF低表达，最优选实质上为TF低表达的均匀的细胞群体。
各整合蛋白相关基因(蛋白)低表达或高表达的间充质干细胞的制备方法没有特别限定，例如可以如下方式进行制备。即，整合蛋白相关基因(蛋白)低表达细胞可以通过本领域技术人员依据公知的方法从脂肪组织、脐带、骨髓等组织中分离间充质干细胞并进行培养，使用与整合蛋白相关蛋白特异性结合的抗体，利用细胞分选仪进行分离或利用磁珠等去除整合蛋白相关蛋白高表达细胞等而获得。另外，整合蛋白相关基因(蛋白)高表达细胞可以通过本领域技术人员依据公知的方法从脂肪组织、脐带、骨髓等组织中分离间充质干细胞并进行培养，使用与整合蛋白相关蛋白特异性结合的抗体，利用细胞分选仪进行分离而获得。另外，通过使用了特定的培养基的培养来诱导整合蛋白相关基因(蛋白)低表达或高表达的间充质干细胞，由此也能够获得整合蛋白相关基因(蛋白)低表达或高表达的间充质干细胞。在通过该诱导而得到的细胞群体中，优选细胞群体的50％以上为显示出各自的特征(整合蛋白相关基因(蛋白)低表达或高表达)的细胞，更优选70％以上为显示出各自的特征的细胞，进一步优选80％以上，特别优选90％以上，最优选实质上为显示出各自的特征的均匀的细胞群体。以下对TF低表达的间充质干细胞的制备方法进行具体说明。
间充质干细胞可以通过本领域技术人员利用公知的方法来制备。以下作为一个例子对脂肪组织来源间充质干细胞的制备方法进行说明。脂肪组织来源间充质干细胞可以利用例如美国专利第6,777,231号中记载的制造方法得到，例如，可以利用包括以下的工序(i)～(iii)的方法来制造：
(i)通过酶消化脂肪组织而得到细胞悬浮物的工序；
(ii)使细胞沉淀，将细胞再悬浮于适合的培养基的工序；以及
(iii)在固体表面培养细胞，去除不显示出与固体表面结合的细胞的工序。
工序(i)中使用的脂肪组织优选使用经清洗的脂肪组织。清洗可以通过使用生理学允许的生理盐水溶液(例如磷酸缓冲盐水(PBS))，并剧烈地搅拌使其沉淀来进行。其原因在于，从组织中去除脂肪组织中包含的杂质(也称为残骸(debris)，例如损伤组织、血液、红细胞等)。因此，通常重复进行清洗和沉淀直至从上清液中整体上去除了残骸。残留的细胞以各种各样的尺寸的块的形式存在，因此为了将细胞本身的损伤抑制在最小限度并且使其解离，而优选用使细胞间结合变弱或破坏细胞间结合的酶(例如，胶原酶、分散酶或胰蛋白酶等)对清洗后的细胞团块进行处理。这样的酶的量和处理期间依赖于所使用的条件而变化，在本技术领域中是已知的。可以替代这样的酶处理或组合地利用机械的搅拌、超声波能量、热能等其它处理法将细胞团块分解，但为了将细胞的损伤抑制在最小限度而优选仅通过酶处理进行。使用了酶的情况，为了将对细胞的有害作用抑制在最小限度，期望的是在经过适合的期间后使用培养基等使酶失活。
通过工序(i)而得到的细胞悬浮物包含聚集状的细胞的浆料或悬浮物、以及各种夹杂细胞、例如红细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。接着，还可以分离、去除聚集状态的细胞和它们的夹杂细胞，但由于能够通过后述的工序(iii)中的粘附和清洗来去除，因此可以省略该分离、去除。在分离、去除夹杂细胞时，可以通过将细胞强制分成上清液和沉淀的离心分离来实现。将包含得到的夹杂细胞的沉淀悬浮于生理学允许的溶剂中。虽然有悬浮状的细胞中包含红细胞的担心，但由于红细胞会通过后述的由粘附于个体表面进行的选择而被排除，因此未必一定需要溶解的工序。作为选择性地溶解红细胞的方法，可以使用本技术领域中公知的方法例如通过用氯化铵溶解在高渗培养基或低渗培养基中进行孵育等。溶解后，还可以通过例如过滤、离心沉淀或密度分级从期望的细胞分离溶解物。
工序(ii)中，对于悬浮状的细胞，为了提高间充质干细胞的纯度，还可以进行1次或连续多次清洗、离心分离，并再悬浮于培养基中。此外，还可以基于细胞表面标记物图谱或基于细胞的尺寸和颗粒性对细胞进行分离。
再悬浮时使用的培养基只要是能培养间充质干细胞的培养基就没有特别限定，这样的培养基还可以通过如下方式制作：在基础培养基中添加血清、和/或添加白蛋白、运铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、亚硒酸钠、胆固醇、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油等中的1种以上的血清替代物。这些培养基还可以根据需要进一步添加脂质、氨基酸、蛋白质、多糖、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等物质。
作为上述基础培养基，例如可列举出：IMDM、Medium 199、伊格尔最低必需培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium，EMEM)、MEM、MEMα达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s Medium，DMEM)、Ham’s F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、MCDB201培养基以及它们的混合培养基等。
作为上述血清，例如可列举出：人血清、胎牛血清(FBS)、牛血清、仔牛血清、山羊血清、马血清、猪血清、绵羊血清、兔子血清、大鼠血清等，但不限定于这些。使用血清时，可以相对于基础培养基添加5v/v％～15v/v％、优选添加10v/v％。
作为上述脂肪酸，可示例出：亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、棕榈酸(palmitoyl acid)、棕榈酸(palmitic acid)和硬脂酸等，但不限定于这些。脂质可示例出：磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱等，但不限定于这些。氨基酸例如包括：L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸等，但不限定于这些。蛋白质例如可示例出：大肠杆菌素、还原型谷胱甘肽、纤维连接蛋白和β2-微球蛋白等，但不限定于这些。多糖可示例出糖胺聚糖，糖胺聚糖中尤其可示例出透明质酸、硫酸乙酰肝素等，但不限定于这些。生长因子例如可示例出：血小板来源生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等，但不限定于这些。
从将本发明中得到的脂肪来源间充质干细胞用于细胞移植这样的观点出发，优选使用血清等不包含异种来源成分(无异源，xeno-free)的培养基。另外，为了使间充质干细胞为TF低表达，作为这样的培养基，例如可以使用由PromoCell公司、Lonza公司、Biological Industries公司、Veritas公司、R&DSystems公司、Corning公司和Rohto公司等提供，作为预先制备间充质干细胞(基质细胞)的培养基。
接着，工序(iii)中，对于工序(ii)中得到的细胞悬浮液中的细胞，不使之分化而在固体表面上、在适合的细胞密度和培养条件下使用上述的适合的细胞培养基对其进行培养。本发明中，“固体表面”是指：能够结合/粘附本发明中的脂肪组织来源间充质干细胞的任意材料。在特定的方式中，这样的材料是为了促进哺乳类细胞与该表面的结合/粘附而经处理的塑料材料。具有固体表面的培养容器的形状没有特别限定，可适宜地使用培养皿、烧瓶等。为了去除非结合状态的细胞和细胞的碎片，在孵育后清洗细胞。
本发明中，可以选择最终以与固体表面结合/粘附的状态滞留的细胞作为脂肪组织来源间充质干细胞的细胞群体。
对于所选择的细胞，为了确认为本发明中的脂肪组织来源间充质干细胞，还可以使用流式细胞仪等利用现有的方法对表面抗原进行解析。进而，还可以对分化为各细胞系列的能力进行检测，这样的分化可以利用现有的方法进行。
本发明中的间充质干细胞可以如上所述进行制备，但除了低表达TF；选自由ITGA11、ITGA1、ITGB5、ITGBL1、ITGB1和ITGAV组成的组中的至少一种整合蛋白基因为低表达；进而，选自由ITGA4、ITGA9、ITGA7和ITGA10组成的组中的至少一种整合蛋白基因为高表达以外，还可以定义为具有以下特性的细胞：
(1)在标准培养基中的培养条件下，对塑料显示出粘附性、
(2)表面抗原CD44、CD73、CD90为阳性，CD31、CD45为阴性、
(3)在培养条件下能分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。
从通过上述工序(iii)而得到的间充质干细胞中，利用使用了细胞分选仪、磁珠等的免疫学方法选择性地分离低表达了TF蛋白的细胞，由此能够获得低表达了TF蛋白的间充质干细胞。另外，通过利用能够诱导TF的低表达的特定培养基进行培养，从而还能够诱导间充质干细胞中的TF低表达，有效地获得TF低表达的间充质干细胞。进而，从通过上述工序(iii)而得到的间充质干细胞中，使用与整合蛋白相关蛋白特异性结合的抗体、利用细胞分选仪进行分离或利用磁珠等去除整合蛋白相关蛋白高表达细胞等，由此能够获得整合蛋白相关基因(蛋白)低表达细胞。另外，整合蛋白相关基因(蛋白)高表达细胞可以通过如下方式获得：从通过上述工序(iii)而得到的间充质干细胞中、使用与整合蛋白相关蛋白特异性结合的抗体、利用细胞分选仪进行分离而获得。另外，通过使用了特定的培养基的培养，诱导整合蛋白相关基因(蛋白)低表达或高表达的间充质干细胞，由此也能够获得整合蛋白相关基因(蛋白)低表达或高表达的间充质干细胞。作为一个例子，对基于使用了细胞分选仪的免疫学方法的TF低表达细胞的选择性分离的具体的方法，以下进行说明。
将通过胰蛋白酶·EDTA溶液等对上述制备的间充质干细胞进行处理而得到的细胞悬浮液离心分离(室温、400G、5分钟)并去除上清液。向细胞中加入染色缓冲液(1％BSA-PBS)，制成1×106个细胞/500uL。通过移液使细胞悬浮液浓度均匀后，分注在新的1.5mL微型管中各50uL。在分注的细胞悬浮液中添加抗体(PE鼠抗人CD142克隆HTF-1、BDBiosciences公司制、550312)，在遮光/冷藏下反应30分钟～1小时。用染色缓冲液1mL进行3次清洗后，加入PI缓冲液(在染色缓冲液中以最终浓度为5～20ug/mL的方式添加碘化丙啶溶液(SIGMA公司制、P4864)来制备)300uL并使其充分悬浮。可以在通过带细胞滤网的管后，用荧光激活细胞分选系统(fluorescence activated cell sorting，FACS)进行解析，利用分选来分离TF低表达的间充质干细胞。
(间充质干细胞的冷冻保存)
本发明中的间充质干细胞只要具备疾病治疗效果，就可以适宜于重复进行了冷冻保存和融解的细胞。本发明中，冷冻保存可以通过如下方式进行：本领域技术人员将间充质干细胞悬浮于公知的冷冻保存液中进行冷却。悬浮可以通过如下方式进行：利用胰蛋白酶等剥离剂使细胞剥离，转移至冷冻保存容器中进行适宜处理后，加入冷冻保存液。
冷冻保存液作为冷冻保护剂还可以含有二甲基亚砜(DMSO：Dimethylsulfoxide)，但DMSO除了细胞毒性之外还具有分化诱导间充质干细胞的特性，因此优选减少DMSO含量。作为DMSO的替代物，可示例出：甘油、丙二醇、多糖类和糖醇。使用DMSO时，含有5％～20％的浓度、优选含有5％～10％的浓度、更优选含有10％的浓度。此外还可以包含WO2007/058308中记载的添加剂。作为这样的冷冻保存液，例如还可以使用由BioverdeInc.、NIPPON Genetics Co,Ltd.、REPROCELL Inc.、ZENOAQ公司、Cosmo Bio Co.,Ltd.、Kohjin Bio Co.,Ltd.、Thermo Fisher Scientific Inc.等提供的冷冻保存液。
冷冻保存上述悬浮的细胞时，在-80℃～-100℃之间的温度(例如，-80℃)下保管为宜，可以使用能达到该温度的任意的冷冻仪来进行。没有特别限定，为了避免急剧的温度变化，还可以使用程序冷冻仪来适宜控制冷却速度。冷却速度可以根据冷冻保存液的成分进行适宜选择，可以依据冷冻保存液的制造者指示来进行。
保存期间只要在上述条件下经冷冻保存的细胞融解后保持与冷冻前同等性质，对于上限就没有特别限定，例如可列举出：1周以上、2周以上、3周以上、4周以上、2个月以上、3个月以上、4个月以上、5个月以上、6个月以上、1年以上或更长时间。通过在更低的温度下保存而能够抑制细胞毒性，因此还可以移至液氮上的气相(从-180℃以上至约-150℃以下)中进行保存。在液氮上的气相中保存时，可以使用本领域技术人员公知的保存容器来进行。没有特别限定，例如保存2周以上时，优选在液氮上的气相中进行保存。
融解的间充质干细胞还可以适宜培养至接下来的冷冻保存。间充质干细胞的培养使用能培养上述的间充质干细胞的培养基进行，没有特别限定，还可以在30～40℃、优选为在约37℃的培养温度下、在含有CO2的空气气氛下进行。CO2浓度为约2～5％、优选为约5％。在培养时，在相对于培养容器到达适合的汇合(例如可列举出相对于培养容器，细胞占50％至80％的情况)后，还可以用胰蛋白酶等剥离剂使细胞剥离，以适合的细胞密度接种于另行准备的培养容器中继续进行培养。在接种细胞时，作为典型的细胞密度，可示例出：100细胞/cm2～100000细胞/cm2、500细胞/cm2～50000细胞/cm2、1000～10000细胞/cm2、2000～10000细胞/cm2等。在特定的方式中，细胞密度为2000～10000细胞/cm2。优选为3天～7天到达适合的汇合的方式进行调节。在培养时，还可以根据需要适宜更换培养基。
经冷冻保存的细胞的融解可以通过本领域技术人员利用公知的方法来进行。例如可示例出通过在37℃的恒温槽内或热水浴中静置或振荡来进行的方法。
本发明的间充质干细胞可以是任意状态的细胞，例如可以是将培养中的细胞剥离并回收的细胞，还可以是在冷冻保存液中被冷冻的状态的细胞。使用将扩大培养而得到的相同批次的细胞分成小部分进行冷冻保存后的细胞时，在稳定地得到同样的作用效果方面、操作性优异方面等是优选的。冷冻保存状态的间充质干细胞可以在即将使用之前进行融解并悬浮于冷冻保存液的状态下直接混合于输液或培养基等的溶液中。另外，可以利用离心分离等方法去除冷冻保存液后悬浮于输液或培养基等的溶液中。此处，本发明中的“输液”是指：对人进行治疗时所使用的溶液，没有特别限定，溶液例如可列举出：生理盐水、日本药典生理盐水、5％葡萄糖液、日本药典葡萄糖注射液、林格氏液、日本药典林格溶液、乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、1号液(初始溶液)、2号液(脱水补充剂)、3号液(维持液)、4号液(术后恢复液)等。
将本发明的间充质干细胞用于药物组合物时，只要在不损害本发明的效果的范围内，除了上述间充质干细胞以外还可以根据其用途、形态，按照常规方法含有药学上可接受的载体、添加物。作为这样的载体、添加物，例如可列举出：等渗剂、增稠剂、糖类、糖醇类、防腐剂(保存剂)、杀菌剂或抗菌剂、pH调节剂、稳定化剂、螯合剂、油性基质、凝胶基质、表面活性剂、悬浮化剂、粘结剂、赋形剂、润滑剂、崩解剂、发泡剂、流动化剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧化剂、甜味剂、酸味剂、着色剂、呈味剂、香料或清凉化剂等，但不限定于这些。作为代表性的成分，例如可列举出以下的载体、添加物等。
作为载体，例如可列举出：水、含水乙醇等的水性载体；作为等渗剂(无机盐)，例如可列举出：氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等；作为多元醇，例如可列举出：甘油、丙二醇、聚乙二醇等；作为增稠剂，例如可列举出：羧乙烯基聚合物、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、藻酸、聚乙烯醇(完全、或部分皂化物)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇等；作为糖类，例如可列举出：环糊精、葡萄糖等；作为糖醇类，例如可列举出：木糖醇、山梨醇、甘露糖醇等(它们可以是d构型、l构型或dl构型中的任意者)；作为防腐剂、杀菌剂或抗菌剂，例如可列举出：二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、烷基二氨基乙基甘氨酸盐酸盐、苯甲酸钠、乙醇、苯扎氯铵、苄索氯铵、葡萄糖酸洗必泰、氯丁醇、山梨酸、山梨酸钾、氨丁三醇、脱氢醋酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、羟基喹啉硫酸盐、苯乙醇、苄醇、双胍化合物(具体而言，聚己缩胍盐酸盐(聚六亚甲基双胍盐酸盐)等)、Glokill(Rhodia公司制商品名)等；作为pH调节剂，例如可列举出：盐酸、硼酸、氨基乙基磺酸、ε-氨基己酸、柠檬酸、乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、碳酸氢钠、碳酸钠、硼砂、三乙醇胺、单乙醇胺、二异丙醇胺、硫酸、硫酸镁、磷酸、多聚磷酸、丙酸、草酸、葡萄糖酸、富马酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、葡萄糖酸内酯、乙酸铵等；作为稳定化剂，例如可列举出：二丁基羟基甲苯、氨丁三醇、甲醛次硫酸氢钠(RONGALIT)、生育酚、焦亚硫酸钠、单乙醇胺、单硬脂酸铝、单硬脂酸甘油酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；作为油性基质，例如可列举出：橄榄油、玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油等植物油、中链脂肪酸甘油三酯等；作为水性基质，例如可列举出：聚乙二醇400等；作为凝胶基质，例如可列举出：羧乙烯基聚合物、胶质等；作为表面活性剂，例如可列举出：聚山梨醇酯80、氢化蓖麻油、脂肪酸甘油酯、山梨坦倍半油酸酯等；作为悬浮化剂，例如可列举出：白蜂蜡、各种表面活性剂、阿拉伯胶、阿拉伯胶粉末、黄原胶、大豆磷脂等；作为粘结剂，例如可列举出：羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇等；作为赋形剂，例如可列举出：蔗糖、乳糖、淀粉、玉米淀粉、结晶纤维素、轻质硅酸酐等；作为润滑剂，例如可列举出：蔗糖脂肪酸酯、硬脂酸镁、滑石等；作为崩解剂，例如可列举出：低取代度羟丙基纤维素、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠等；作为发泡剂，例如可列举出：碳酸氢钠等；作为流动化剂，例如可列举出：偏硅酸铝钠、轻质硅酸酐等。
本发明的间充质干细胞根据目的可以以各种形态、例如固体制剂、半固体制剂、液体制剂等各种各样的剂型来提供。例如可以以固体制剂(片剂、粉末、散剂、颗粒剂、胶囊剂等)、半固体制剂[软膏剂(硬软膏剂、软软膏剂等)、霜剂等]、液体制剂[洗剂、萃取剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂、注射剂(包括输液剂、嵌入式注射剂、缓释型注射剂、使用时制备型的注射剂)、透析用剂、气雾剂、软胶囊剂、营养剂等]、贴剂、巴布剂等的形态加以利用。另外，本发明的间充质干细胞还可以以油性或水性的赋形剂中的溶液或乳液等的形式加以利用。进而，本发明的间充质干细胞还可以通过喷雾来用于患部，本发明的间充质干细胞还可以以喷雾后在患部被凝胶化或片化的形态加以利用。本发明的间充质干细胞还可以在将上述间充质干细胞制成片状或立体结构体后用于患部。
本发明的间充质干细胞可以使用生理盐水、日本药典生理盐水、5％葡萄糖液、日本药典葡萄糖注射液、林格氏液、日本药典林格氏液、乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、碳酸氢盐林格氏液、1号液(初始溶液)、2号液(脱水补给液)、3号液(维持液)、4号液(术后恢复液)等输液、或DMEM等细胞培养培养基进行悬浮或稀释来使用，优选用生理盐水、5％葡萄糖液、1号液(初始溶液)、更优选用5％葡萄糖液、1号液(初始溶液)进行悬浮或稀释来使用。
将本发明的间充质干细胞用于液体制剂时，液体制剂的pH只要在药物上、药理学上(制药上)或生理学上可接受的范围内就没有特别限定，作为一个例子，可列举出为2.5～9.0、优选为3.0～8.5、更优选为3.5～8.0的范围。
将发明的间充质干细胞用于液体制剂时，对于液体制剂的渗透压，只要在生物体可接受的范围内就没有特别限制。作为液体制剂的渗透压比的一个例子，可列举出优选为0.7～5.0、更优选为0.8～3.0、进一步优选为0.9～1.4的范围。渗透压的调节可以使用无机盐、多元醇、糖醇、糖类等，利用该技术领域中已知的方法进行。渗透压比是基于第十五次修订日本药典、试样的渗透压相对于286mOsm(0.9w/v％氯化钠水溶液)的渗透压之比，渗透压参考日本药典中记载的渗透压测定法(冰点下降法)进行测定。需要说明的是，对于渗透压比测定用标准液(0.9w/v％氯化钠水溶液)，可以如下制备：将氯化钠(日本药典标准试剂)在500～650℃下干燥40～50分钟后，在干燥器(硅胶)中进行自然冷却，准确称量其0.900g，溶解于纯化水中准确地制成100mL，或使用市售的渗透压比测定用标准液(0.9w/v％氯化钠水溶液)。
本发明的间充质干细胞向对象的给药途径可列举出：口服给药、皮下给药、肌肉给药、静脉内给药、动脉内给药、髄腔内给药、腹腔内给药、舌下给药、直肠给药、阴道给药、眼内给药、经鼻给药、吸入、经皮给药、植入物、向肝表面的喷雾及通过片等的粘贴进行的直接给药等，由于将本发明的间充质干细胞进行静脉内给药时高的安全性也得到认可，因此优选静脉内给药、动脉内给药等血管内给药，最优选静脉内给药。
本发明的间充质干细胞的用量(给予量)可以根据患者的状态(体重、年龄、症状、身体状况等)及本发明的药物组合物的剂型等而不同，从发挥充分的治疗效果的观点出发，有优选大量的倾向，另一方面，从抑制副作用的表现的观点出发，有优选小量的倾向。通常，在对成人给药时，作为细胞数，为1×103～1×1012个/次、优选为1×104～1×1011个/次、更优选为1×105～1×1010个/次、进一步优选为5×106～1×109个/次。另外，作为患者的单位体重的给药量，为1×10～5×1010个/kg、优选为1×102～5×109个/kg、更优选为1×103～5×108个/kg、进一步优选为1×104～5×107个/kg。需要说明的是，可以将本用量作为1次量来进行多次给药，还可以将本用量分成多次进行给药。
本发明的间充质干细胞可以与1种或2种以上的其它药剂一起给药。作为其它药剂，可列举出可以作为肝脏的治疗药、心脏病的治疗药、炎症性肠病治疗药、呼吸系统用药、神经系统用药、循环系统用药、脑循环改善药、免疫抑制药使用的任意药剂。
作为肝脏的治疗药，例如可列举出：乙型肝炎治疗药(拉米夫定(Lamivudine)、阿德福韦(Adefovir)、恩替卡韦(Entecavir)、替诺福韦(Tenofovir)等)、干扰素制剂(干扰素α、干扰素α-2b、干扰素β、PEG干扰素α-2a、PEG干扰素α-2b等)、丙型肝炎治疗药(利巴韦林(Ribavirin)、特拉匹韦(Telaprevir)、司美匹韦(simeprevir)、伐尼瑞韦(Vaniprevir)、达卡他韦(Daclatasvir)、阿那匹韦(Asunaprevir)、索非布韦(Sofosbuvir)等)、糖皮质激素(泼尼松龙(Prednisolone)、甲基泼尼松龙琥珀酸钠等)、抗凝固剂(干燥浓缩人抗凝血酶III、甲磺酸加贝酯(Gabexate Mesilate)、血栓调节蛋白α等)、解毒剂(依地酸钙二钠水合物、谷胱甘肽(Glutathione)、2,3-二巯基-1-丙醇、硫代硫酸钠水合物、舒更葡糖钠(Sugamadex sodium)等)、人血清白蛋白、肝脏提取物、熊去氧胆酸、甘草酸、硫唑嘌呤、苯扎贝特(Bezafibrate)、氨基酸(甘氨酸、L-半胱氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸和它们的盐等)、维生素(生育酚、黄素腺嘌呤二核苷酸、硫胺素二硫化物磷酸盐(Thiamine disulfide phosphate)、吡哆醇(Pyridoxine)、维生素B12(Cyanocobalamin)和它们的盐等)、抗生素(舒巴坦钠(Sulbactam sodium)、头孢哌酮钠(Cefoperazonesodium)、美洛培南(Meropenem)水合物、盐酸万古霉素(Vancomycin hydrochloride)等)等。
作为心脏病的治疗药，例如可列举出：ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、β阻滞剂、抗血小板药物、华法林、钙拮抗剂、硝酸药、利尿剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、盐酸胺碘酮等。
作为炎症性肠病治疗药，例如可列举出：柳氮磺吡啶(Salazosulfapyridine)、美沙拉嗪(Mesalazine)等。
作为呼吸系统用药，例如可列举出：双吗啉胺(Dimorpholamine)、多沙普仑(Doxapram)盐酸盐水合物、西维来司钠(Sivelestat sodium)水合物、甲苯吡啶酮(Pirfenidone)、肺表面活性物质(Lung surfactant)、阿法链道酶(Dornase alfa)等。
作为神经系统用药，例如可列举出：依达拉奉(Edaravone)、干扰素β-1a、干扰素β-1b、盐酸芬戈莫德、利鲁唑(Riluzole)、他替瑞林(Taltirelin)水合物等。
作为循环系统用药，例如可列举出：癸烟酯(Hepronicate)、盐酸米多君(Midodrine hydrochloride)、甲磺酸氨苯哒嗪(Amezinium Metilsulfate)、盐酸乙苯福林(Etilefrine hydrochloride)、盐酸去氧肾上腺素(Phenylephrine hydrochloride)等。
作为脑循环改善药，例如可列举出：酒石酸艾芬地尔(Ifenprodil tartrate)、尼麦角林(Nicergoline)、异丁地特(Ibudilast)、甲磺酸二氢麦角碱(Dihydroergotoxinmesylate)、富马酸尼唑苯酮(Nizofenone Fumarate)、盐酸法舒地尔(Fasudilhydrochloride)水合物等。
作为免疫抑制药，例如可列举出：环孢菌素、硫唑嘌呤、咪唑立宾(Mizoribine)、巴利昔单抗(Basiliximab)、他克莫司(Tacrolimus)水合物、盐酸胍立莫、霉酚酸酯、依维莫司(Everolimus)等。
将上述其它药剂与本发明的间充质干细胞一起给药的情况，在保存时，可以将间充质干细胞与其它药剂保存在相同的容器内，还可以保存在不同的容器中。根据疾病的种类、治疗方法、患者的状态等还可以将其它药剂和间充质干细胞同时给药，还可以隔开一定的间隔给药。
本发明的间充质干细胞可以适宜地用于各种疾病的治疗。例如优选对于内脏疾病来使用，具体而言是指：心脏病、胃/十二指肠疾病、小肠/大肠疾病、肝疾病、胆道疾病、胰脏疾病、肾疾病、肺部疾病、纵隔胸膜疾病、横隔胸膜疾病、胸膜疾病、腹膜疾病、神经疾病、中枢神经系统(CNS)障碍、外周动脉疾病、外周静脉疾病。
具体的疾病，例如可列举出：自身免疫性肝炎、重型肝炎、慢性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝疾病(nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD))、非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis(NASH))、非酒精性脂肪肝(nonalcoholicfatty liver(NAFL))、肝纤维化、肝硬化、肝癌、脂肪肝、药剂过敏性肝损伤、血色沉着病、含铁血黄素沉着症、血铜蓝蛋白缺乏症、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、胆道闭锁、肝脓疡溃、慢性活动性肝炎、慢性持续性肝炎等肝疾病；心肌梗塞、心力衰竭、心律不齐、心悸、心肌病、缺血性心肌病、心绞痛、先天性心脏病、心脏瓣膜病、心肌炎、家族性肥厚型心肌病、舒张型心肌症、急性冠脉综合征、动脉粥样硬化血栓形成、再狭窄等心脏病；急性胃炎、慢性胃炎、胃/十二指肠溃疡、胃癌、十二指肠癌等胃/十二指肠疾病；缺血性肠炎、炎症性肠病、溃疡性大肠炎、Crohn病(克罗恩病)、单纯性溃疡、肠白塞病、小肠癌、大肠癌等小肠/大肠疾病；急性胆嚢炎、急性胆管炎、慢性胆嚢炎、胆管癌、胆嚢癌等胆道疾病；急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌等胰脏疾病；急性肾炎、慢性肾炎、急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭等肾疾病；肺炎、肺气肿、肺纤维化、间质性肺炎、特发性间质性肺炎、剥离性间质性肺炎、急性间质性肺炎、非特异的间质性肺炎、药物导致的肺部疾病、嗜酸性粒细胞性肺部疾病、肺动脉高压、肺结核、肺结核后遗症、急性呼吸窘迫综合征、囊肿性纤维化、肺慢性阻塞性疾病、肺塞栓症、肺痈、尘肺、吞咽性肺炎肺纤维化、急性上呼吸道感染、慢性下呼吸道感染、气胸、肺胞上皮细胞中发现损伤的疾病、淋巴管平滑肌瘤、淋巴性间质性肺炎、肺泡蛋白沉积症、肺朗格汉斯细胞性肉芽肿等肺部疾病；纵隔肿瘤、纵隔囊性疾病、纵隔炎等纵隔胸膜疾病；膈疝等横隔胸膜疾病；胸膜炎、脓胸、胸膜肿瘤、癌性胸膜炎、胸膜间皮瘤等胸膜疾病；腹膜炎、腹膜肿瘤等腹膜疾病；包括小儿脑性瘫痪在内的脑瘫综合征、无菌性脑膜炎、格林-巴利综合征、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、重症肌无力、单神经病变、多发性神经病、脊髓性肌萎缩症、脊椎障碍、急性横贯性脊髓炎、脊髓梗死(脊髓缺血性损伤)、颅内肿瘤、脊柱肿瘤等神经疾病；阿尔茨海默病、认知障碍、中风、多发性硬化症、帕金森病等CNS障碍；肌纤维发育不良、外周动脉疾病(PAD)、闭塞性血栓血管炎(伯格病)、川崎病(KD)等外周动脉疾病；深静脉血栓形成、慢性静脉功能不全、静脉炎后综合征、浅静脉血栓形成等外周静脉疾病；移植物抗宿主疾病(Graft-versus-host disease：GVHD)、继发性免疫缺陷病、原发性免疫缺陷病、B细胞的缺损、T细胞衰竭、B和T细胞复合缺损、吞噬细胞缺陷、经典途径补体缺乏、MBL途径补体缺乏、替代途径补体缺乏、补体调节蛋白缺陷、补体受体缺陷等免疫缺陷疾病。
这些当中，优选确认了利用间充质干细胞充分地得到了治疗效果的肝疾病、心脏病、肺部疾病、神经疾病、外周动脉疾病、免疫缺陷疾病，其中，可以更适宜地用于肝纤维化、肝硬化、心肌梗塞、心力衰竭、肺纤维化、间质性肺炎、小儿脑性瘫痪、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、外周动脉疾病(PAD)、移植物抗宿主疾病(Graft-versus-host disease：GVHD)的治疗，可以进一步适宜地用于肝纤维化、肝硬化、心肌梗塞、心力衰竭、肺纤维化、间质性肺炎。
[疾病的治疗方法]
根据本发明的另一方案，本发明还包括使用如下间充质干细胞的疾病的治疗方法，所述间充质干细胞为：组织因子(TF)为低表达的间充质干细胞；特征在于选自由ITGA11、ITGA1、ITGB5、ITGBL1、ITGB1和ITGAV组成的组中的至少一种整合蛋白基因为低表达的间充质干细胞，或者特征在于选自由ITGA4、ITGA9、ITGA7和ITGA10组成的组中的至少一种整合蛋白基因为高表达的间充质干细胞。即，根据本发明，通过对各种疾病的患者给予上述本发明的间充质干细胞，从而能够安全性高地发挥各种疾病的治疗效果。需要说明的是，对于本发明的治疗方法中所使用的间充质干细胞，可以适用上述的[间充质干细胞和包含其的药物组合物]项目中的说明。
[治疗用间充质干细胞的判定方法]
根据本发明的另一方案，本发明还包括判定间充质干细胞是否适于疾病治疗的方法。即，本发明的判定方法包括如下工序：测定间充质干细胞的组织因子(TF)的表达的工序；测定选自由ITGA11、ITGA1、ITGB5、ITGBL1、ITGB1和ITGAV组成的组中的至少一种整合蛋白基因的表达的工序；测定选自由ITGA4、ITGA9、ITGA7和ITGA10组成的组中的至少一种整合蛋白基因的表达的工序。在上述工序中，确认了如下情况的细胞可以判定在疾病治疗中安全性高，所述情况为：间充质干细胞的组织因子(TF)的表达为低表达；选自由ITGA11、ITGA1、ITGB5、ITGBL1、ITGB1和ITGAV组成的组中的至少一种整合蛋白基因的表达为低表达；选自由ITGA4、ITGA9、ITGA7和ITGA10组成的组中的至少一种整合蛋白基因的表达为高表达。需要说明的是，对于上述组织因子(TF)、各种整合蛋白的表达的详情可以适用上述的[间充质干细胞和包含其的药物组合物]项目中的说明。
实施例
以下列举实施例和试验例对本发明进行详细地说明，但本发明不受这些实施例等限定。
[脂肪来源间充质干细胞的传代培养]
从P2至P4使用间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司)来培养脂肪组织来源间充质干细胞(以下“ADSC”)(Lonza公司制、产品编号PT-5006)。在P4至P5中，使用间充质干细胞用无血清培养基、或10％FBS血清培养基(最低必需培养基(Minimum Essential Mediumalpha(MEMα))培养了3天。使用胰蛋白酶将附着于烧瓶上的ADSC剥离并移至离心管中，以400×g进行5分钟离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后加入适量细胞冷冻保存液(STEM-CELLBANKER(ZENOAQ公司))使其悬浮。将该细胞悬浮溶液分注于内旋盖冷冻管中后，在冷冻仪内以-80℃保存，然后转移至液氮上的气相中继续进行保存作为冷冻储存物。
[使用了自身免疫性肝炎模型小鼠的治疗效果的确认](实施例1)
通过对小鼠(C57BL/6、CLEA Japan,Inc.、7周龄、雄)单次给药20mg/kg的伴刀豆球蛋白A(sigma-aldrich公司制)来诱发肝炎。对诱发了该肝炎的小鼠将上述冷冻储存物的细胞(用间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司)培养的脂肪来源间充质干细胞、或用10％FBS血清培养基(MEM)培养的脂肪来源间充质干细胞)以5×107个细胞/kg进行单次静脉内给药。细胞融解后，用MEMα(无血清添加)进行清洗，然后悬浮于HBSS中用于给药。无细胞给药组仅给予了HBSS。无细胞给药组和间充质干细胞用无血清培养基组(用间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司)培养的脂肪来源间充质干细胞给药组)全部存活；与此相对，10％FBS血清培养基组(用10％FBS血清培养基(MEMα)培养的脂肪来源间充质干细胞)全部死亡(表1)。
[表1]
给药量(细胞/Kg) 总数(只) 20小时后存活数(只)
无细胞给药组 - 6 6
间充质干细胞用无血清培养基组 5×10<sup>7</sup> 6 6
10％FBS血清培养基组 5×10<sup>7</sup> 6 0
根据以上的结果，示出了10％FBS血清培养基组(用10％FBS血清培养基(MEMα)培养的脂肪来源间充质干细胞)在安全性上存在问题，而间充质干细胞用无血清培养基组(用间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司)培养而得到的本发明的间充质干细胞)的安全性高。
[脂肪组织来源间充质干细胞的细胞尺寸的测定](实施例2)
使用CellInsigh CX5高内涵筛选(HCS)平台(Thermo fisher scientific公司制)测定了与上述同样进行了制备的脂肪来源间充质干细胞的细胞尺寸。用间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司)进行了培养的细胞的平均粒径为11.99μm，而用10％FBS血清培养基(MEMα)进行了培养的细胞的平均粒径为13.03μm。可知用间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司)进行了培养的细胞的平均粒径比用10％FBS血清培养基进行了培养的细胞的平均粒径小10％左右(图1)。
[给予10％FBS血清培养基培养细胞对小鼠生存率的影响](试验例1)
从P2至P4使用间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司)来培养ADSC(Lonza公司制、产品编号PT-5006)。从P4至P5使用10％FBS血清培养基(MEMα)培养3天，与上述同样地制作了冷冻储存物。对正常小鼠(C57BL/6、CLEAJapan，Inc.、9周龄、雄)单次静脉内给药(5×107个细胞/kg)该细胞时，确认了6例中全部在给予后20小时以内死亡。需要说明的是，细胞融解后，用MEMα(无血清添加)清洗后悬浮于HBSS中用于给药。由此，启示出并非由于与伴刀豆球蛋白A诱发肝炎的相互作用，而是由于用10％FBS血清培养基(MEMα)培养的细胞致使小鼠死亡的可能性。
[脂肪来源间充质干细胞的TF表达](实施例3)
从P2至P4使用间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司)来培养ADSC(Lonza公司、产品编号PT-5006)。从P4至P5中，使用间充质干细胞用无血清培养基(无血清培养基组)或10％FBS血清培养基(MEMα、血清培养基组)培养3天，与上述同样地制作了冷冻储存物。使各P5细胞复苏，回收了总RNA。通过实时PCR测定了TF的mRNA表达量(图2)。另外，利用流式细胞仪检测了在蛋白质水平上的表达(图3)。
可知与血清培养基组相比，无血清培养基组中，TF的mRNA和TF蛋白的表达量低。
[脂肪来源间充质干细胞的整合蛋白相关基因的表达1](实施例4)
从P2至P4分别使用间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司、无血清培养基组)或10％FBS血清培养基(血清培养基组)培养ADSC(Lonza公司制、产品编号PT-5006)，与上述同样地制作了冷冻储存物。使各P4细胞复苏，以5000细胞/cm2接种在6孔板中，分别用2种培养基培养3天后，通过微列阵解析(microarray assay)解析了基因表达。将结果示于表2。
可知：与血清培养基组相比，无血清培养基组中，ITGA11、ITGA1、ITGB5、ITGBL1、ITGB1和ITGAV的表达量显著地低，ITGA4、ITGA9、ITGA7和ITGA10的表达量显著地高(表2)。表2中的数值是以底数2的对数来表示各基因(mRNA)的相对表达强度。另外，倍性变化(foldchange)为血清培养基组/无血清培养基组的值。
[表2]
[脂肪来源间充质干细胞的整合蛋白相关基因的表达2](实施例5)
从P2至P4分别用间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司、无血清培养基组)或10％FBS血清培养基(血清培养基组)培养ADSC(Lonza公司制、产品编号PT-5006)，与上述同样地制作了冷冻储存物。使各P4细胞复苏，以5000细胞/cm2接种在6孔板中，分别使用2种培养基培养3天，然后回收ADSC的总RNA，利用定量PCR测定了作为整合蛋白相关基因的ITGB5和ITGB1的mRNA表达量。将结果示于图4和图5。
如图4和图5所示，可知：与血清培养基组相比，无血清培养基组中ITGB5和ITGB1的表达量低。
[脂肪来源间充质干细胞的整合蛋白相关基因的表达3](实施例6)
从P2至P4分别用间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司、Rohto培养基组)、间充质干细胞用无血清培养基(Lonza公司、Lonza培养基组)或10％FBS血清培养基(血清培养基组)培养ADSC(Lonza公司制、产品编号PT-5006)，制作了冷冻储存物。使各P4细胞复苏，以5000个细胞/cm2接种在6孔板中，分别用3种培养基培养3天，然后回收ADSC的总RNA，利用定量PCR测定了作为整合蛋白相关基因的ITGA1、ITGA11、ITGAV和ITGA4的mRNA表达量。将结果示于图6～图9。
如图6～图9所示，可知：与血清培养基组相比，无血清培养基组中ITGA1、ITGA11和ITGAV的表达量低，与Lonza公司培养基组相比，Rohto公司培养基组中ITGA1、ITGA11和ITGAV的表达量进一步低。另外，可知：与血清培养基组相比，无血清培养基组中ITGA4的表达量高，与Lonza公司培养基组相比，Rohto公司培养基组中ITGA14的表达量进一步高。
[脂肪来源间充质干细胞和脐带来源间充质干细胞的整合蛋白相关基因的表达](实施例7)
从P2至P4分别用间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司、无血清培养基组)或10％FBS血清培养基(血清培养基组)培养脂肪来源间充质干细胞(ADSC、Lonza公司制、产品编号PT-5006)和脐带来源间充质干细胞的各细胞，与上述同样地制作了冷冻储存物。使各P4细胞复苏，以5000细胞/cm2接种在6孔板中，分别使用3种培养基培养3天，然后回收脂肪来源间充质干细胞和脐带来源间充质干细胞的总RNA，利用定量PCR测定了作为整合蛋白相关基因的ITGB1的mRNA表达量。将结果示于图10。
如图10所示，可知与脂肪来源间充质干细胞同样，对于脐带来源间充质干细胞而言，与血清培养基组相比，无血清培养基组中ITGB1的表达量低。
[脂肪来源间充质干细胞和骨髓来源间充质干细胞的整合蛋白相关基因的表达](实施例8)
从P2至P4分别用间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司、无血清培养基组)或10％FBS血清培养基(血清培养基组)培养脂肪来源间充质干细胞(ADSC、Lonza公司制、产品编号PT-5006)和骨髓来源间充质干细胞(Lonza公司制、型号：PT-2501)的各细胞，与上述同样地制作了冷冻储存物。使P4细胞复苏，以5000细胞/cm2接种在6孔板中，分别用3种培养基培养3天，然后回收脂肪来源间充质干细胞和骨髓来源间充质干细胞的总RNA，利用定量PCR测定了作为整合蛋白相关基因的ITGA1和ITGA4的mRNA表达量。将结果示于图11和图12。
如图11和图12所示，可知：与脂肪来源间充质干细胞同样，对于骨髓来源间充质干细胞，与血清培养基组相比，无血清培养基组中ITGA1的表达量也低、ITGA4的表达量也高。
[脂肪来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞和骨髓来源间充质干细胞的整合蛋白相关基因的表达](实施例9)
从P2至P4分别用间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司、无血清培养基组)或10％FBS血清培养基(血清培养基组)培养脂肪来源间充质干细胞(ADSC、Lonza公司制、产品编号PT-5006)、脐带来源间充质干细胞和骨髓来源间充质干细胞(Lonza公司制、型号：PT-2501)的各细胞，与上述同样地制作了冷冻储存物。使各P4细胞复苏，以5000细胞/cm2接种在6孔板中，分别用3种培养基培养3天，然后回收各间充质干细胞的总RNA，利用定量PCR测定了作为整合蛋白相关基因的ITGA11、ITGAV和ITGB5的mRNA表达量。将结果示于图13～图15。
如图13～图15所示，可知：与脂肪来源间充质干细胞同样，对于脐带来源间充质干细胞和骨髓来源间充质干细胞，与血清培养基组相比，无血清培养基组中ITGA11、ITGAV和ITGB5的表达量也低。
产业上的可利用性
根据本发明，可提供间充质干细胞和含有其的药物组合物。另外，根据本发明，能够提供在作为药物使用时安全性高的间充质干细胞。

Claims (6)

1.一种间充质干细胞，其特征在于，组织因子(TF)为低表达。
2.一种间充质干细胞，其特征在于，选自由ITGA11、ITGA1、ITGB5、ITGBL1、ITGB1和ITGAV组成的组中的至少一种整合蛋白基因为低表达。
3.一种间充质干细胞，其特征在于，选自由ITGA4、ITGA9、ITGA7和ITGA10组成的组中的至少一种整合蛋白基因为高表达。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的间充质干细胞，其为异体来源。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的间充质干细胞，其为脂肪组织来源。
6.一种药物组合物，其含有权利要求1～5中任一项所述的间充质干细胞。
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