CN107787960A - 视网膜色素上皮细胞的冻存液及其应用 - Google Patents

视网膜色素上皮细胞的冻存液及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107787960A
CN107787960A CN201610809307.5A CN201610809307A CN107787960A CN 107787960 A CN107787960 A CN 107787960A CN 201610809307 A CN201610809307 A CN 201610809307A CN 107787960 A CN107787960 A CN 107787960A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stock solution
frozen stock
serum
retinal pigment
pigment epithelium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610809307.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107787960B (zh
Inventor
袁松涛
范国平
沈涵
方王怡
刘庆淮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eyecure Therapeutics Inc
Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Original Assignee
Eyecure Therapeutics Inc
Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eyecure Therapeutics Inc, Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University filed Critical Eyecure Therapeutics Inc
Priority to CN201610809307.5A priority Critical patent/CN107787960B/zh
Publication of CN107787960A publication Critical patent/CN107787960A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107787960B publication Critical patent/CN107787960B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3813—Epithelial cells, e.g. keratinocytes, urothelial cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/16—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of eye parts, e.g. intraocular lens, cornea

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了视网膜色素上皮细胞的冻存液及其应用。具体地，本发明提供了一种无血清的冻存液，所述冻存液含有二甲基亚砜(DMSO)、血小板裂解液(HPL)，和任选的无血清培养基。本发明还提供了本发明冻存液冻存和复苏的人视网膜色素上皮细胞。实验表明，复苏后视网膜色素上皮细胞的活性高达90％以上，接种培养后形态上具有呈典型的六边形铺路石样，蛋白标记物RPE65呈阳性的细胞(即RPE65+视网膜色素上皮细胞)的比例高达98％。

Description

视网膜色素上皮细胞的冻存液及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养领域。更具体地，本发明涉及视网膜色素上皮细胞的冻存液及其应用。
背景技术
视网膜退行性病变是引起不可逆致盲眼病的主要病因，其中主要包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、Stargardt病。其中年龄相关性黄斑变性患者，全球大约有3千万到5千万，而视网膜色素变性患者约1百万。目前我国的年龄相关性黄斑变性患者大约超过2000万人，并预计将在2050年增加一倍。
由于视网膜退行性病变主要表现为黄斑区视网膜色素上皮(Retinal PigmentEpithelium,RPE)的损伤，因此再生医学RPE细胞的替代移植治疗成为治疗研究的主要方向。迄今已报道了多种来源的RPE细胞移植，主要有患者自体RPE细胞移植、虹膜色素上皮细胞(Iris Pigment Epithelium,IPE)移植，胚胎和成人RPE细胞移植，以及胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)来源的RPE细胞移植。这些细胞移植在动物实验中均显示出明确的治疗作用，但是又均存在各自的缺陷。IPE对某些视网膜变性模型具有治疗作用，但是对IPE和RPE的表达谱研究表明IPE缺乏视紫红质循环中的某些关键酶，并不能完全替代RPE的生理功能。
胚胎干细胞的临床应用存在伦理争议，因潜在致瘤性其安全性也始终令人诟病；iPSCs在构建过程中被导入了潜在的原癌基因，逆转录病毒整合进入宿主基因组也会增加致瘤的风险，最近的研究也证实了iPSCs比胚胎干细胞有更高的畸胎瘤形成倾向。虽然有研究报道减少或完全去除外源性转录因子，或者通过小分子化合物，或者通过导入后再去除的办法来解决问题。但是无论那一种方法对iPSCs进入临床前的安全性还有待进一步验证。
研究表明，人RPE细胞具有免疫原性小，不引起T细胞显著的特异性免疫反应，还可以抑制T细胞激活，避免了免疫抑制剂的使用；具有极大的体外增殖能力，一个人眼球可以用于治疗数百名AMD患者，减轻了对人RPE细胞临床应用的取材限制、经济负担和伦理争论；人RPE细胞在体内可以分泌营养因子，与宿主视网膜形成突触连接；在致肿瘤性风险上明显优于干细胞来源的RPE细胞；能够表达多种RPE特有的功能性标志物等优点，是视网膜色素上皮细胞移植替代治疗最有希望的细胞来源之一。
人视网膜色素上皮细胞的增殖能力巨大，临床应用前景巨大，因此对细胞制剂有长期保存和便于临床注射使用的要求。以往视网膜色素上皮细胞的冻存都是在添加动物血清(主要为FBS)的培养体系下进行的。一方面，由于动物血清具有异种蛋白免疫排斥的风险，且动物血清中的成分不明确，可能含有动物来源的病原体，易被病毒、支原体、疯牛病病毒感染，在生产临床级别的人用细胞制剂时，理论上会导致一些病原体的传播，因此在临床应用中具有潜在的危险。另一方面，血清间具有批次差异，造成不同批次冻存的细胞表型、增殖能力、长期培养后的细胞功能等存在较大差异，直接影响了视网膜色素上皮细胞的临床应用。因此，如果想让人视网膜色素上皮细胞进行大规模生产并广泛应用于临床，必须有无动物源性成分的体外培养方法。而目前市场上的临床级别冻存液(不含动物源性成分)成分复杂，成本昂贵，而且复苏效率较低，并不适合临床上大规模生产。
综上所述，本领域迫切需要开发一种适用于视网膜色素上皮细胞的无动物血清(如胎牛血清)且复苏效率高的冻存液。
发明内容
本发明的目的就是提供一种适用于视网膜色素上皮细胞的无动物血清、复苏效率高的冻存液及其制法和用途。
本发明第一方面提供了一种用于冻存视网膜色素上皮细胞的无血清冻存液，所述冻存液含有(i)二甲基亚砜(DMSO)；(ii)血小板裂解液(HPL)；和(iii)任选的无血清培养基，并且，所述冻存液不添加动物血清。
在另一优选例中，按无血清冻存液的体积计，DMSO含量为a,a选自1％-20％(v/v)；HPL含量为b,b选自20％-99％(v/v)；无血清培养基含量为c,c选自0％-90％(v/v)，且a+b+c≤100％。
在另一优选例中，a+b+c≥80％，较佳地≥90％，更佳地≥95％。
在另一优选例中，按体积计，b选自50-97％，较佳地60-95％，更佳地70-94％，最佳地80-92％。
在另一优选例中，按体积计，a选自2.5％-18％，较佳地4-16％，更佳地6-14％，最佳地8-12％。
在另一优选例中，按体积计，c选自0％-80％，较佳地0-60％，更佳地0-40％，最佳地0-20％。
在另一优选例中，所述无血清培养基选自下组：DMEM培养基、MEM培养基、或其组合。
在另一优选例中，所述无血清培养基包括基础培养基。
在另一优选例中，所述的无血清冻存液由二甲基亚砜(DMSO)、血小板裂解液(HPL)、和任选的无血清培养基构成。
在另一优选例中，所述的无血清冻存液由二甲基亚砜(DMSO)和血小板裂解液(HPL)构成。
本发明第二方面提供了一种本发明第一方面所述无血清冻存液的用途，用于保存视网膜色素上皮细胞和/或建立视网膜色素上皮细胞库。
本发明第三方面提供了一种视网膜色素上皮细胞混合物，包括以下组分：
视网膜色素上皮细胞；和
本发明第一方面所述的无血清冻存液。
在另一优选例中，所述的混合物为液态或固态。
在另一优选例中，所述的混合物中，视网膜色素上皮细胞的浓度为1×104-1×108个/ml或g，较佳地，1×105-1×107个/ml或g。
在另一优选例中，所述的视网膜色素上皮细胞包括哺乳动物(如人)的视网膜色素上皮细胞。
本发明第四方面提供了一种视网膜色素上皮细胞库，所述细胞库含有本发明第三方面所述的视网膜色素上皮细胞混合物。
在另一优选例中，所述视网膜色素上皮细胞和无血清冻存液的混合物，用程序梯度降温后，液氮保存。
在另一优选例中，所述细胞库中视网膜色素上皮具有以下特性：复苏后的具有蛋白标记物RPE65呈阳性的视网膜色素上皮细胞的比例≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％(如98-99％)。
在另一优选例中，所述细胞库中视网膜色素上皮具有以下特性：复苏后的视网膜色素上皮细胞的存活率≥90％。
本发明第五方面提供了本发明第四方面所述视网膜色素上皮细胞库的用途，用于保存视网膜色素上皮细胞。
本发明第六方面提供了一种制备视网膜色素上皮细胞库的方法，包括步骤：
(a)将本发明第一方面所述的无血清冻存液与视网膜色素上皮细胞进行混合，获得一混合物；和
(b)将所述混合物在低温下保存，从而形成所述的视网膜色素上皮细胞库。
在另一优选例中，所述的视网膜色素上皮细胞包括原代视网膜色素上皮细胞、经传代的视网膜色素上皮细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述的经传代的视网膜色素上皮细胞的传代次数n为2-20，较佳地3-10。
在另一优选例中，所述无血清冻存液与视网膜上皮细胞的比例为1×104个细胞/ml－1×108个细胞/ml，较佳地，1×105个细胞/ml－1×107个细胞/ml。
在另一优选例中，在步骤(a)之前，还包括如下步骤：
(a1)对获得的视网膜色素上皮细胞进行消化，得到经消化的视网膜色素上皮细胞；
(a2)对上一步骤获得的经消化的视网膜色素上皮细胞进行离心，得到的沉淀的视网膜色素上皮细胞。
在另一优选例中，在步骤(a)中，所述混合包括如下步骤：
(i)将本发明第一方面所述的无血清冻存液加入到人视网膜色素上皮细胞中，并重悬细胞，获得所述视网膜色素上皮细胞混合物，其中视网膜色素上皮细胞浓度为1×105-1×107个/ml。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述低温保存指在液氮下保存。
在另一优选例中，步骤(i)中，视网膜色素上皮细胞混合物中，所述视网膜色素上皮细胞的浓度为5×105-2×106个/ml。
在另一优选例中，步骤(b)中使用程序降温法梯度降温，较佳地降温速率为-1至-2℃/min。
在另一优选例中，步骤(b)中当温度到达-25℃以下时，降温速率调至-5至-10℃/min。
在另一优选例中，步骤(b)中当温度达到-100℃时，将视网膜色素上皮细胞直接保存于液氮中。
本发明第七方面提供了一种无血清冻存试剂盒，包括以下组分：
(i)一容器以及位于所述容器中的本发明第一方面所述的用于冻存视网膜色素上皮细胞的无血清冻存液；
(ii)使用说明书。
在另一优选例中，所述试剂盒用于冻存视网膜色素上皮细胞。
本发明第八方面提供了本发明第七方面所述试剂盒的用途，用于冻存视网膜色素上皮细胞。
本发明第九方面提供了一种如本发明第一方面所述的无血清冻存液的制备方法，包括步骤：
将二甲基亚砜(DMSO)、血小板裂解液(HPL)、和任选的无血清培养基进行混合，从而形成本发明第一方面所述的无血清冻存液。
本发明第十方面提供了一种移植物，所述移植物包括：安全有效量的用本发明第一方面所述的无血清冻存液保存后并复苏的视网膜色素上皮细胞，和药学上可接受的载体或稀释剂。
在另一优选例中，所述的移植物包括自体或异体移植物。
在另一优选例中，所述的移植物为注射剂，尤其是适合眼内注射的注射剂。
在另一优选例中，所述的移植物为液态。
在另一优选例中，所述的移植物中，视网膜色素上皮细胞的浓度为1×104-1×108个/ml，较佳地1×105-1×107个/ml。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明中P3代人视网膜色素上皮细胞用4种不同冻存液(100％DMSO为阴性对照)冻存复苏后细胞活性(1A)和凋亡的流式检测结果(1B)。
图2显示了本发明的P3代人视网膜色素上皮细胞冻存前细胞培养1周的图片。
图3显示了P3代人视网膜色素上皮细胞在4种不同冻存液(100％DMSO为阴性对照)冻存复苏后作为P4代细胞培养1周的图片，以及流式检测表达蛋白标志物RPE65含量的比较结果。
图4显示了P2代人视网膜色素上皮细胞在5种不同浓度血小板裂解液(HPL)所混合形成冻存液下，复苏后细胞活性的流式检测的比较结果。
图5显示了P2代人视网膜色素上皮细胞(5A)在5种不同浓度血小板裂解液(HPL)所混合形成冻存液下，复苏后作为P3代细胞培养1周的图片(5B)。
图6显示了P2代人视网膜色素上皮细胞在3种不同无血清冻存液冻存下，复苏后细胞活性的流式检测的比较结果。从左边起分别为本发明(血小板裂解液+二甲基亚砜)、商品化的Cryo-SFM、白蛋白(人血白蛋白+二甲基亚砜)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量筛选和测试，首次意外发现，在无血清条件下，将一定量的血小板裂解液和二甲基亚砜混合，加入或不加入基础培养基MEM，所制备的冻存液可以非常有效地对人的视网膜色素上皮细胞进行冻存，不仅复苏后的视网膜色素上皮细胞活性可达到并超过90％，显著高于目前市场上的临床级别和非临床级别冻存液，而且具有视网膜色素上皮细胞特有的形态和蛋白标记物RPE65。此外，配置方便成本低廉，适合临床大批量生产。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“本发明的无血清冻存液”、“本发明冻存液”可互换使用，指二甲基亚砜(DMSO)、血小板裂解液(HPL)、任选无血清培养基的混合物，其中，血清组分的含量≤0.1％，较佳地≤0.01％，更佳地≤0.005％(如0％)，按冻存液的总重量计。
如本文所用，术语“以上”和“以下”包括本数，例如“95％以上“指≥95％，“0.2％以下”指≤0.2％。
如本文所用，术语“包括”、“含有”可以是开放式、或封闭式的，因此所述术语包括“由……构成”、“基本上由……构成”或类似表述。
视网膜色素上皮细胞
视网膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium,RPE)细胞在视网膜十层结构中扮演着极其重要和多重的角色，包括营养和支持光感受器细胞，参与血视网膜屏障的建立等等。RPE细胞的退化是许多不可逆致盲眼病的主要诱因和主要病理变化，其中主要包括年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration,AMD)、视网膜色素上皮细胞变性(Retinitis Pigmentosa,RP)、Startgardt's症等视网膜退行性病变。
在临床上，除了湿性AMD可以利用Avastin、Lucentis等抗VEGF药物控制疾病的进展，干性AMD、RP和Startgardt's症均无任何有效治疗方法。因此再生医学RPE细胞的移植替代治疗已成为治疗研究的主要方向，而大规模生产符合GMP标准的功能稳定的人RPE细胞，需要无血清、无动物源性的冻存液。
血小板裂解液
人血小板裂解液(HPL)是含有高浓度生长因子和细胞因子的细胞培养添加剂。
在本发明中，原料来自于美国的血液中心提供的经过全面检测合格的血小板，可追本溯源，在GMP条件下生产，安全性极高，批次间稳定。依据美国FDA公布的细胞培养安全等级标准，符合二级，可用于人体临床。
通常，血小板裂解液可用常规方法制得。目前血小板裂解液已商品化，可从Helios公司购得。
在本发明中，血小板裂解液的浓度没有特别限制，只要能够实现本发明技术效果的血小板裂解液的浓度均在本发明的保护范围之内。
在本发明中，血小板裂解液可来自于人，也可来自于动物，可来自于自体，也可来自于异体。
二甲基亚砜(DMSO)
二甲基亚砜是一种含硫有机化合物，常温下为无色无臭的透明液体，具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物。在细胞培养中，DMSO可以作为渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。
无血清培养基
如本文所用，术语“无血清培养基”指可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的基本上不含血清的培养基。适用于非本发明的无血清培养基没有特别限制，可以是任何适用于培养或保存干细胞(尤其是脂肪干细胞)的无血清培养基。
一般，无血清培养基的基本成分包括(但不局限于)：
无机盐：无机盐可以调节细胞渗透压、调节酶的活性以及溶液酸碱度，一般包括：CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4等。
氨基酸：氨基酸是细胞合成蛋白质的必须原料，一般包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、酪氨酸。精氨酸和半胱氨酸等。
维生素：维生素是维持细胞生命的一种生物活性物质，形成辅基或辅酶。脂溶性维生素一般包括：VA、VD、VE和VK等，水溶性维生素一般包括叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素和硫胺素等。
碳水化合物：碳水化合物是细胞的能量来源，也是蛋白质和核酸的组分，葡萄糖是最主要的碳水化合物组分。
微量元素：微量元素具有促进细胞生长，活化酶蛋白功能的重要组分，硒是最常见的微量元素。
生长因子及激素：不同的细胞可以添加不同的生长因子和激素，如胰岛素等。
促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，促贴壁物质一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。
无血清培养基还可以包括抗生素，常用抗生素包括但不局限于青霉素、链霉素，其终浓度一般为20-100mg/ml，较佳地50mg/ml。
本领域技术人员可以通过常用方法配制无血清培养基，也可以购买市售的各种无血清培养基，其中包括(但并不限于)：DEME无血清培养基、UltraMEM无血清培养基等。
冻存液
通常，培养视网膜色素上皮细胞的冻存液都含有动物血清(如胎牛血清)。在本发明中，将血小板裂解液和二甲基亚砜混合，加入或不加入基础培养基MEM，对人的视网膜色素上皮细胞进行冻存。
在本发明中，还可以将血小板裂解液和二甲基亚砜混合作为冻存液，加入或不加入基础培养基MEM，冻存人的视网膜色素上皮细胞。
在本发明中，血小板裂解液的浓度不受特别的限制，一种优选的血小板裂解液的浓度(v/v)为20％-99％，较佳地，85-97.5％，更佳地，90-95％；
所述的二甲基桠枫(DMSO)的浓度(v/v)为1％-20％，较佳地2.5％-15％，更佳地，5％-10％；
所述的冻存液中可加入基础培养基MEM，浓度(v/v)为0％-90％,较佳地，0％-70％,更佳为不添加(即0％)。
在另一优选例中，本发明提供了一种有效的可用于视网膜色素上皮细胞的无血清冻存液，具体包括组分：二甲基亚砜(DMSO)和血小板裂解液(HPL)，任选无血清培养基，且所述冻存液不含血清。通常，按体积计，DMSO含量为1％-20％，HPL含量为20％-99％，无血清培养基的含量为0％-90％。在另一优选例中，按体积计，DMSO含量为2.5％-15％，HPL含量为85-97.5％，无血清培养基的含量为0％-70％，更佳地DMSO含量为5％-10％，HPL含量为90-95％，无血清培养基的含量为0％，更佳地DMSO含量为10％，HPL含量为90，无血清培养基的含量为0％。
用本发明的冻存液冻存的视网膜色素上皮细胞，不仅复苏后活性能达到90％以上，而且再培养后细胞形态无明显改变，能够大量表达视网膜色素上皮细胞特有的蛋白标记物，是优于胎牛血清和现有市场上临床级别冻存液的，可以用于培养符合临床应用标准的视网膜色素上皮细胞的体外冻存液。
冻存液试剂盒
在本发明中，还提供了一种用于培养视网膜色素上皮细胞的冻存液试剂盒，包括以下组分：
(i)人血小板裂解液(HPL)；和
(ii)二甲基亚砜(DMSO)；和
(iii)任选的基础培养基(MEM)。
在一优选实施方式中，所述试剂盒包括以下组分：
(i)第一混合物，所述第一混合物由人血小板裂解液(HPL)和二甲基亚砜(DMSO)混合而成；和
(ii)任选的，在第一混合物中加入基础培养基(MEM)。
视网膜色素上皮细胞的冻存制剂
用本发明的冻存方法冻存的视网膜色素上皮细胞，复苏后不仅细胞活性能达到90％及以上，而且形态无明显改变，能够大量表达视网膜色素上皮细胞特有的蛋白标记物。
用本发明的所冻存和复苏的视网膜色素上皮细胞，可以经过玻璃体腔灌注液或生理盐水清洗后，作为生物制剂或细胞制剂，直接用于临床眼部注射治疗。通常，所述制剂中，冻存的视网膜色素上皮细胞的浓度为1×105-1×107个/ml，较佳地5×105-2×106个/ml。
优选地，所述的生物制剂或细胞制剂为注射剂，尤其是适合眼内注射的注射剂。
细胞冻存
细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。如果在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，严重时引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞，贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞冻存中最重要的部分是细胞冻存液。传统的细胞冻存液含有动物血清，主要为胎牛血清和/或小牛血清。血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种极其复杂的混合物，其一部分组成成份尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件的不同而不同。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、无机物等。
本发明采用含有无血清培养基和血清替代品的冻存液进行细胞冻存，既排除了动物细胞血清带来的缺陷，又能保证细胞冻存和复苏的效果。
细胞冻存时可采用常规的设备和方法进行。在优选例中，可采用程序降温法，降温盒材质通常为聚碳酸脂、高密度聚乙烯和泡沫，并需要异丙醇和机械冷冻装置。冷却速率可调，并且可以重复进行，从而满足了细胞冻存和复原的需要。一种典型的降温程序为：降温速率-1至-2℃/min；当温度到达-25℃以下时，可调至-5至-10℃/min；当温度达到-100℃时，可以迅速浸入液氮中。细胞在液氮中可以长期保存达数十年或更久。
细胞库
如本发明所用，所述“细胞库”指经一定程序降温后、长期保存在特定冻存液中的一类细胞群。细胞库中的细胞可以来源于人；也可以来源于(非人)哺乳动物，如大鼠、小鼠、猴、猫、羊等；也可以来源于禽类，如鸡。细胞可以来源于不同的器官和组织，如：口腔、肾、肝脏、淋巴、肌肉、卵巢等。细胞库中的细胞保存时间可以长达数十年或更久。
细胞复苏
如本发明所用，所述“细胞复苏”指休眠的细胞重新活化的过程。一般采用本领域技术人员所熟知的程序即快速复苏法，将冷冻管迅速由液氮转入到温水浴中，较佳地37℃-40℃，不定时搅拌加速解冻；细胞完全解冻后，对冷冻管进行消毒；将解冻后清洗细胞并重悬，转移到细胞培养瓶，CO2孵箱中培养；检查细胞存活率及活力。
细胞贴壁
如本发明所用，所述“细胞贴壁”指正常细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面,细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子，可以在该表面上生长，繁殖。当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态，即成纤维样细胞性或上皮样细胞。贴壁生长有接触抑制的现象，在动物细胞培养中，要用胰蛋白酶处理，使贴壁细胞脱落。而肿瘤细胞就没有这些特性，可以悬浮培养。
移植组合物和施用方式
本发明还提供了一种自体或异体移植组合物，可用于修复视网膜等多种用途。自体移植组合物包括有效量的、经本发明无血清冻存液保存后并复苏的脂肪干细胞，在一个优选例中还可以包括至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，对于含脂肪干细胞的组合物，优选形式为液态剂型
配制好的移植组合物可以通过常规途径进行给药或施用，其中包括(但并不限于)：眼内、或局部给药。
使用本发明的移植组合物时，是将安全有效量的脂肪干细胞施用于人，其中该安全有效量通常为105-108细胞/人/次，更佳地为106-107细胞/人/次。当然，具体剂量还应考虑施用途径、施用对象的健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
1.本发明冻存液和方法可高效冻存视网膜色素上皮细胞，在相同条件下复苏所获得的视网膜色素上皮细胞活性显著优于采用胎牛血清的冻存液(P＝0.002,n＝3)和目前市场上所用的冻存液Cryo-SFM(P＝0.0049,n＝3)。
2.用本发明冻存液和方法所复苏的视网膜色素上皮细胞的形态好且质量稳定，其中，蛋白标记物RPE65呈阳性的细胞(即RPE65+视网膜色素上皮细胞)的比例高达98％。
3.本发明的冻存液中所用材料均为非动物源性、无血清成分的，极大提高了细胞在临床应用中的安全性。
4.由于不采用任何血清，因此提高了本发明制备的视网膜色素上皮细胞的质量稳定性(包括各批次间的稳定性)，有助于大规模制备符合临床应用标准的视网膜色素上皮细胞。
5、本发明配置方法简便、成本低廉，人血小板裂解液(human platelet lysates)及冻存液中的其他成分均为价格低廉的培养试剂，没有使用昂贵的细胞因子，避免了患者接受移植手术需要支付高昂的治疗费用，有利于大规模临床应用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
在本发明中，实施例中所用到的材料和试剂，如无特别说明，均为市售产品。
材料
实施例1冻存液NO.1
于2ml血小板裂解液内依次加入7ml的MEM和1ml二甲基亚砜，得到本发明的人视网膜色素上皮细胞的冻存液10ml，于4℃可保存1个月，其中，二甲基亚砜浓度(v/v)为10％，血小板裂解液的浓度(v/v)为20％。
实施例2冻存液No.2
于9ml血小板裂解液内加入1ml二甲基亚砜，得到本发明的人视网膜色素上皮细胞的冻存液10ml，于4℃可保存1个月，其中，二甲基亚砜浓度(v/v)为10％，血小板裂解液的浓度(v/v)为90％。
实施例3冻存液No.3
于9.75ml血小板裂解液内加入0.25ml二甲基亚砜，得到本发明的人视网膜色素上皮细胞的冻存液10ml，于4℃可保存1个月，其中，二甲基亚砜浓度(v/v)为2.5％，血小板裂解液的浓度(v/v)为97.5％。
实施例4冻存液No.4
于9.5ml血小板裂解液内加入0.5ml二甲基亚砜，得到本发明的人视网膜色素上皮细胞的冻存液10ml，于4℃可保存1个月，其中，二甲基亚砜浓度(v/v)为5％，血小板裂解液的浓度(v/v)为95％。
实施例5冻存液No.5
于8.5ml血小板裂解液内加入1.5ml二甲基亚砜，得到本发明的人视网膜色素上皮细胞的冻存液10ml，于4℃可保存1个月，其中，二甲基亚砜浓度(v/v)为15％，血小板裂解液的浓度(v/v)为85％。
对比例1冻存液C1
于9ml胎牛血清内加入1ml二甲基亚砜，得到人视网膜色素上皮细胞的冻存液10ml，于4℃可保存1个月，其中，二甲基亚砜浓度(v/v)为10％，胎牛血清的浓度(v/v)为90％。该冻存液为传统的冻存方式，其缺点为含有动物血清，有潜在的朊病毒感染风险，易导致免疫排斥。
对比例2冻存液C5
以10ml二甲基亚砜作为人视网膜色素上皮细胞的冻存液，于常温可保存1年，其中，二甲基亚砜浓度(v/v)为100％，血小板裂解液的浓度(v/v)为0％。该冻存液为阴性对照，100％的二甲基亚砜对细胞有较强的杀伤作用，不能直接用于细胞冻存。
对比例3冻存液C2(Cryo-SFM)
为购买的商品化的无动物源性无血清成分的冻存液10ml。于4℃可保存1年，其中成分不明。(购自HELIOS公司，货号：HPCFDCRL50。该冻存液的缺点为成份复杂保密，复苏效率较低。
对比例4冻存液C6
以10ml血小板裂解液作为人视网膜色素上皮细胞的冻存液，于-20度可保存1年，其中，二甲基亚砜浓度(v/v)为0％，血小板裂解液的浓度(v/v)为100％。该冻存液的为阴性对照，100％的血小板裂解液不能在冻存过程中保护细胞，不能直接用于细胞冻存。
对比例5冻存液C3
于9ml血清替代物(Knock-out Serum Replacement,KSR)内加入1ml二甲基亚砜，得到本发明的人视网膜色素上皮细胞的冻存液10ml，于4℃可保存1个月，其中，二甲基亚砜浓度(v/v)为10％，血清替代物KSR的浓度(v/v)为90％。该冻存液同样无动物源性无血清成分，但其缺点为复苏效率较低。
对比例6冻存液C4
于9ml人血白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)内加入1ml二甲基亚砜，得到本发明的人视网膜色素上皮细胞的冻存液10ml，于4℃可保存1个月，其中，二甲基亚砜浓度(v/v)为10％，人血白蛋白的浓度(v/v)为90％。该冻存液同样无动物源性无血清成分，但其缺点为复苏效率较低。
实施例6冻存和建库
在本实施例中，采用实施例1-2(冻存液No.1和No.2)、对比例1-3(冻存液C1、C5、C2)冻存的人的视网膜色素上皮细胞(RPE)。
将培养1周获得的P3代人视网膜色素上皮细胞在六孔板中每孔加入1ml0.25％胰蛋白酶消化，放入37度培养箱中消化1分钟。观察到细胞变圆并悬浮后，立刻加入10ml培养基稀释并中止消化。反复吹打培养板，帮助细胞悬浮，并将细胞吸入15ml离心管中，1000转/分钟离心5分钟。离心后弃去上清，加入冻存液No.1-5重悬细胞，并计数。以1×106个/ml的浓度，将细胞在提前配置好的冻存液中重悬。
然后立刻放入程序降温盒中放入-80度冰箱冻存，24小时后取出放入液氮罐中长期保存。
实施例7复苏和表征
将实施例6冻存的人视网膜色素上皮细胞冻存管从液氮中取出后立刻放在37度水浴锅中快速溶解。待冻存液融化后，将含细胞的冻存液放入10ml玻璃体腔灌注液中，1000转/分钟离心5分钟。离心后弃去上清，并加入10ml玻璃体腔灌注液中重悬，1000转/分钟离心5分钟，计数。离心后弃去上清，再次加入玻璃体腔灌注液，以1×106/ml重悬做成细胞制剂。用流式细胞仪对细胞活性和凋亡进行检测。
结果如图1A所示。结果显示，冻存液No.2冻存的人RPE细胞复苏后活性(Viability)最高，超过对比例C1的含有胎牛血清FBS的冻存液(P＝0.002,n＝3)，以及冻存液C2的市面上可购买的临床级别冻存液Cryo-SFM 0.0049,n＝3)。
冻存液No.1为在冻存液No.2的基础上用基础培养基MEM替代部分血小板裂解液，结果显示，冻存液No.1冻存的细胞复苏后的活性不如冻存液No.2，但是远远高于冻存液C1、C2和C5。
结果如图1B所示。对细胞凋亡进行分析后发现，冻存液No.2冻存后复苏获得的非凋亡活细胞(Viable Cell)最多。冻存液C5的完全二甲基亚砜所构成的阴性对照，冻存复苏后的细胞几乎全部为死细胞。
细胞活性检测和凋亡检测结果表明，本发明的冻存液对人视网膜色素上皮细胞的冻存复苏效率明显优于传统的含有动物源性血清成份的冻存液C1和市面上可购买的临床级别冻存液C2。
实施例8复苏和表征
采用与实施例6相同方法和相同的冻存液进行冻存，不同点在于，如图2所示所用的人的视网膜色素上皮细胞(RPE)为P3代细胞，并对所述冻存的人的视网膜色素上皮细胞进行复苏。
将冻存的人视网膜色素上皮细胞冻存管从液氮中取出后立刻放在37度水浴锅中快速溶解。待冻存液融化后，将含细胞的冻存液放入10ml玻璃体腔灌注液中，1000转/分钟离心5分钟。离心后弃去上清，并计数。以3×105个/孔(即1.5×105个/ml)的浓度接种在六孔板中。第二天换液，此后每三天换液，培养2周后，进行观察和鉴定。
结果如图3所示。结果显示，冻存液No.1-2、C1－C2复苏的细胞复苏接种为P4代细胞，增殖能力良好。接种后第3天可以明显看出冻存液No.2的活细胞最多。培养7天后可以看出4种冻存液冻存复苏的视网膜色素上皮细胞与冻存前P3代视网膜色素上皮细胞培养1周(图2)时的形态无明显差别。冻存液C2所构成的阴性对照，复苏后的细胞几乎全部为死细胞，接种培养1周未见存活细胞。
培养1周后，对冻存液No.1-2、C1－C2复苏的细胞进行鉴定，流式检测结果显示冻存液No.1-2、C1－C2复苏的细胞能够表达视网膜色素上皮细胞特有的蛋白标记RPE65，但是冻存液C1-C2冻存的人RPE细胞复苏培养后RPE65表达量较低，而用本发明的冻存液No.2冻存的人RPE细胞复苏培养后RPE65表达量达到98％以上，冻存液No.1冻存的人RPE细胞复苏培养后RPE65表达量为97.3％，冻存液No.3冻存的人RPE细胞复苏培养后RPE65表达量为97.9％。
此外，用本发明的冻存液No.2冻存的胎儿RPE细胞可存活率达到90％以上，且无动物源性成分，复苏后经过生理盐水或玻璃体腔灌主液清洗后可以直接用于移植注射人体，解决了细胞制品做成制剂后长期保存、方便运输和随时注射的问题，可以应用于临床。
实施例9冻存和建库
在本实施例中，分别采用实施例2－5、对比例4的冻存液No.2－5、C4来冻存人的视网膜色素上皮细胞(RPE)。方法如下：
将培养2周获得的P2代人视网膜色素上皮细胞在六孔板中每孔加入1ml0.25％胰蛋白酶消化，放入37度培养箱中消化3分钟。观察到细胞变圆并悬浮后，立刻加入10ml培养基稀释中止消化。反复吹打培养板，帮助细胞悬浮，并将细胞吸入15ml离心管中，1000转/分钟离心5分钟。离心后弃去上清，加入冻存液重悬细胞，并计数。以1×106个/ml的浓度，将细胞在提前配置好的冻存液中重悬。
然后立刻放入程序降温盒中放入-80度冰箱冻存，24小时后取出放入液氮罐中长期保存。
实施例10冻存和复苏
本实施例的实验方法同实施例7，采用实施例9采用的冻存液冻存人的视网膜色素上皮细胞。
结果如图4显示，用流式细胞仪对冻存复苏后的视网膜色素上皮细胞活性检测结果显示，采用冻存液No.2和No.4的冻存液，复苏后细胞活性较高且超过90％，高于采用冻存液No.3和冻存液No.5的复苏后细胞活性。(P<0.001,n＝3)。
然而，由100％血小板裂解液组成的冻存液C6为阴性对照，冻存复苏后的视网膜色素上皮细胞几乎全部死亡。
实施例11冻存和复苏
实验方法同实施例6，不同之处在于采用对比例4的冻存液C6、实施例2-5的冻存液No.2-5。
结果如图5A和5B所示，结果显示，冻存液No.2及No.4复苏的细胞复苏接种为P4代细胞，接种后第1天存活的细胞最多，增殖能力良好，培养7天后细胞形态与冻存前P3代视网膜色素上皮细胞培养1周(图5)时的形态无明显差别。
冻存液No.3和No.5的细胞经冻存后复苏接种，存活的细胞比冻存液No.2及No.4存活的细胞少。而由100％血小板裂解液组成的冻存液C6为阴性对照，冻存复苏接种后几乎全部为死细胞，接种培养1周未见存活细胞。
实施例12冻存和建库
在本实施例中，采用冻存液No.2、C3－C4，来冻存人的视网膜色素上皮细胞(RPE)。方法如下：
将培养2周获得的P3代人视网膜色素上皮细胞在六孔板中每孔加入1ml0.25％胰蛋白酶消化，放入37度培养箱中消化3分钟。观察到细胞变圆并悬浮后，立刻加入10ml培养基稀释中止消化。反复吹打培养板，帮助细胞悬浮，并将细胞吸入15ml离心管中，1000转/分钟离心5分钟。离心后弃去上清，加入冻存液重悬细胞，并计数。以1×106个/ml的浓度，将细胞在提前配置好的冻存液中重悬。
然后立刻放入程序降温盒中放入-80度冰箱冻存，24小时后取出放入液氮罐中长期保存。
实施例13冻存和复苏
本实施例的实验方法同实施例7，不同之处在于采用冻存液No.2和C3-C4。
结果如图6显示，用流式细胞仪对冻存复苏后的视网膜色素上皮细胞活性检测结果显示，采用冻存液C3冻存复苏后的视网膜色素上皮细胞活性约60％，远低于采用冻存液No.2冻存复苏的细胞活性(P＝0.0036,n＝3)。冻存液C4复苏后的细胞活性约55％，远低于采用冻存液No.2冻存复苏的细胞活性(P<0.0001,n＝3).
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于冻存视网膜色素上皮细胞的无血清冻存液，其特征在于，所述冻存液含有(i)二甲基亚砜(DMSO)；(ii)血小板裂解液(HPL)；和(iii)任选的无血清培养基，并且，所述冻存液不添加动物血清。
2.如权利要求1所述的无血清冻存液，其特征在于，按无血清冻存液的体积计，DMSO含量为a,a选自1％-20％(v/v)；HPL含量为b,b选自20％-99％(v/v)；无血清培养基含量为c,c选自0％-90％(v/v)，且a+b+c≤100％。
3.一种权利要求1所述无血清冻存液的用途，其特征在于，用于保存视网膜色素上皮细胞和/或建立视网膜色素上皮细胞库。
4.一种视网膜色素上皮细胞混合物，其特征在于，包括以下组分：
视网膜色素上皮细胞；和
权利要求1所述的无血清冻存液。
5.一种视网膜色素上皮细胞库，其特征在于，所述细胞库含有权利要求4所述的视网膜色素上皮细胞混合物。
6.一种权利要求5所述视网膜色素上皮细胞库的用途，其特征在于，用于保存视网膜色素上皮细胞。
7.一种制备视网膜色素上皮细胞库的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将权利要求1所述的无血清冻存液与视网膜色素上皮细胞进行混合，获得一混合物；和
(b)将所述混合物在低温下保存，从而形成所述的视网膜色素上皮细胞库。
8.一种无血清冻存试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
(i)一容器以及位于所述容器中的权利要求1所述的用于冻存视网膜色素上皮细胞的无血清冻存液；
(ii)使用说明书。
9.一种如权利要求1所述的无血清冻存液的制备方法，其特征在于，包括步骤：
将二甲基亚砜(DMSO)、血小板裂解液(HPL)、和任选的无血清培养基进行混合，从而形成权利要求1所述的无血清冻存液。
10.一种移植物，其特征在于，所述移植物包括：安全有效量的用权利要求1所述的无血清冻存液保存后并复苏的视网膜色素上皮细胞，和药学上可接受的载体或稀释剂。
CN201610809307.5A 2016-09-07 2016-09-07 视网膜色素上皮细胞的冻存液及其应用 Active CN107787960B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610809307.5A CN107787960B (zh) 2016-09-07 2016-09-07 视网膜色素上皮细胞的冻存液及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610809307.5A CN107787960B (zh) 2016-09-07 2016-09-07 视网膜色素上皮细胞的冻存液及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107787960A true CN107787960A (zh) 2018-03-13
CN107787960B CN107787960B (zh) 2021-04-02

Family

ID=61530925

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610809307.5A Active CN107787960B (zh) 2016-09-07 2016-09-07 视网膜色素上皮细胞的冻存液及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107787960B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108715833A (zh) * 2018-06-01 2018-10-30 天晴干细胞股份有限公司 一种负载血小板裂解液的微球制备方法
CN114586769A (zh) * 2020-12-07 2022-06-07 精准生技股份有限公司 用于细胞冷冻保存的无血清细胞冷冻保存液及其冷冻保存方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104178452A (zh) * 2014-08-26 2014-12-03 同济大学 一种视网膜色素上皮细胞培养基及其应用
CN104673747A (zh) * 2015-02-27 2015-06-03 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 一种血小板裂解液的制备方法及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104178452A (zh) * 2014-08-26 2014-12-03 同济大学 一种视网膜色素上皮细胞培养基及其应用
CN104673747A (zh) * 2015-02-27 2015-06-03 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 一种血小板裂解液的制备方法及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CG TAYLOR等: "Freezing and recovery of mesenchymal stem cells in human platelet lysate", 《CYTOTHERAPY》 *
林少芬等: "人视网膜色素上皮细胞原代培养冻存和复苏方法改进", 《实用医技杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108715833A (zh) * 2018-06-01 2018-10-30 天晴干细胞股份有限公司 一种负载血小板裂解液的微球制备方法
CN114586769A (zh) * 2020-12-07 2022-06-07 精准生技股份有限公司 用于细胞冷冻保存的无血清细胞冷冻保存液及其冷冻保存方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107787960B (zh) 2021-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7157050B2 (ja) 細胞生存率を維持するための組成物および方法
US20240141298A1 (en) Method of isolating mesenchymal stem cells from the amniotic membrane of the umbilical cord, a mesenchymal stem cell population isolated from the amniotic membrane of the umbilical cord and a cell culture medium for isolating mesenchymal stem cells from the amniotic membrane of the umbilical cord
RU2558778C2 (ru) Лечение инсульта с использованием изолированных плацентарных клеток
ES2605160T3 (es) Medio de congelación libre de suero que comprende un alto contenido de KSR y el establecimiento de una librería de células madre derivadas de tejido adiposo
CN110050782A (zh) 一种干细胞冻存液及其制备方法和冻存方法
CN102511471B (zh) 一种间充质干细胞冻存液及其制备方法
JP6561173B2 (ja) 哺乳動物細胞投与用液
US10104881B2 (en) Composition comprising plant-derived recombinant human serum albumin, lipids, and plant protein hydrolysates as active ingredients for cryopreservation of stem cells or primary cells
TW201534722A (zh) 含有海藻糖及聚葡糖之哺乳動物細胞移植用溶液
WO2020186870A1 (zh) 冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用
CN102807967A (zh) 乳牙牙髓在制备间充质干细胞中的应用和乳牙牙髓间充质干细胞的培养方法
CN106434557A (zh) 由脐带间充质干细胞制备cd34阳性细胞的方法
CN108184819A (zh) 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用
WO2007032224A1 (ja) 培養細胞シート及びその作製方法
CN113973805B (zh) 细胞冻存试剂盒及其使用方法
CN107787960A (zh) 视网膜色素上皮细胞的冻存液及其应用
CN107304412A (zh) 视网膜色素上皮细胞的培养基及其应用
CN107058225A (zh) 一种复合诱导培养基以及采用该培养基诱导脐带间充质干细胞成神经元样细胞的方法
RU2303631C1 (ru) Среда для криоконсервирования мезенхимальных стволовых клеток и биотрансплантат с ее использованием
CN108378019A (zh) 一种人精原干细胞的冻存液
JP2009065854A (ja) 細胞増殖方法ならびに組織の修復および再生のための医薬
WO2012034352A1 (zh) 使人的体细胞逆向分化产生自体生殖干细胞的方法、试剂盒及其应用
WO2020067442A1 (ja) 細胞の凍結保存方法
CN110106147A (zh) 一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant