ES2605160T3

ES2605160T3 - Medio de congelación libre de suero que comprende un alto contenido de KSR y el establecimiento de una librería de células madre derivadas de tejido adiposo

Info

Publication number: ES2605160T3
Application number: ES12821828.6T
Authority: ES
Inventors: Helen Zhang; Luyi ZHANG; Wei Cao
Original assignee: Cellular Biomedicine Group Wuxi Ltd; Cellular Biomedicine Group Shanghai Ltd
Current assignee: Cellular Biomedicine Group Wuxi Ltd; Cellular Biomedicine Group Shanghai Ltd
Priority date: 2011-08-09
Filing date: 2012-08-06
Publication date: 2017-03-13
Anticipated expiration: 2032-08-06
Also published as: WO2013020492A1; US20150011429A1; EP2807923A4; CN102550542A; CN102550542B; US9481865B2; EP2807923B1; EP2807923A1

Abstract

Un medio de congelación libre de suero que comprende los siguientes ingredientes: medio de cultivo de libre de suero, dimetilsulfóxido (DMSO) y sustituto de suero Knockout tm Serum Replacement (KSR) y el medio de congelación no contiene suero; y en base al volumen del medio de congelación libre de suero, el contenido del medio de cultivo libre de suero es a y a es del 5 %-15 % (v/v), el contenido de DMSO es b y b es del 8 %- 20 % (v/v), y el contenido de KSR es c y c es del 70 %-85 % (v/v), mientras que a + b + c <= 100 %.

Description

DESCRIPCION

Medio de congelacion libre de suero que comprende un alto contenido de KSR y el establecimiento de una librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo 5

Campo de la invencion

[0001] La presente invencion se refiere al campo de la biotecnologla y, en particular, al medio de congelacion libre de suero para celulas madre derivadas de tejido adiposo y al establecimiento de la librerla de celulas madre

10 derivadas de tejido adiposo.

Antecedentes de la invencion

[0002] Las celulas madre (SC) son un tipo de celulas pluripotentes con capacidad auto-replicante que pueden 15 diferenciarse en varios tipos de celulas funcionales. Hoy en dla, las celulas madre mesenquimales son un tipo de

celulas madre adultas, que tienen capacidad auto-replicante pluripotente y han acaparado mucha atencion. Las celulas madre mesenquimales se pueden cultivar y amplificar in vitr, y se pueden diferenciar en varias celulas de tejidos tales como celulas oseas, celulas de cartllago, celulas de grasa, celulas nerviosas, celulas musculares, etc.

20 [0003] En los ultimos anos, las celulas madre de medula osea, las celulas madre del cordon umbilical y las

celulas madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) se han estudiado exhaustivamente. Las celulas madre derivadas de tejido adiposo son un tipo de celulas madre que tienen capacidad auto-replicante pluripotente y se alslan a partir de tejido adiposo. Las ADSc tienen varias ventajas sobre las celulas madre de la medula osea y las celulas madre de cordon umbilical. Se ha encontrado en la investigacion que las ADSC pueden proliferar in vitro de manera 25 constante con una baja tasa de declive, al tiempo que es facil de obtener fuentes de ADSC y se puede obtener una gran cantidad de ADSC a partir de una pequena cantidad de tejido. Las ADSC son apropiadas para el cultivo a gran escala y crecen de forma homogenea mientras que el dano al cuerpo es pequeno. Por otra parte, las ADSC tienen amplios recursos y gran cantidad de almacenamiento en el cuerpo y las ADSC son apropiadas para el trasplante autoplastico, y muy seguras. El establecimiento de la librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo se ha 30 convertido en un nuevo enfoque en los ultimos anos.

[0004] Puesto que el aislamiento y cultivo de celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano necesita un largo perlodo, se tarda alrededor de dos semanas o mas para que las celulas primarias crezcan hasta confluencia y cerca de tres semanas para alcanzar cierta cantidad de celulas. El cultivo in vitro a largo plazo y

35 el paso de las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano por lo general conduce a una diferenciacion espontanea, lo que resulta en la perdida de multi-diferenciacion potencial. Por lo tanto, con el fin de garantizar la continuidad del experimento, es necesario proporcionar celulas de siembra en grandes cantidades en experimentos o ingenierla de tejidos en cualquier momento. Por lo tanto, es necesario establecer un metodo eficaz de criopreservacion. La fiabilidad de los metodos de criopreservacion se identifica mediante la deteccion del ciclo 40 celular, el fenotipo celular y el potencial de diferenciacion adipogenica de celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano despues de la criopreservacion y la recuperacion.

[0005] En la actualidad, la criopreservacion por lo general adopta suero para la criopreservacion. El suero es el medio natural mas utilizado en el cultivo celular y sus principales ventajas son las siguientes:

45

1) Contiene gran cantidad de nutrientes necesarios para el crecimiento celular con el fin de soportar suficientemente el crecimiento celular.

2) La gran cantidad de protelnas del suero desempenan un papel protector sobre las celulas.

3) Se proporcionan factores de crecimiento y los oligoelementos esenciales para la proliferation celular el cultivo 50 celular in vitro;

4) Proporciona factores de adhesion de celulas dependientes de la adhesion.

[0006] Sin embargo, hay varias desventajas al usar suero animal en medio de congelacion, incluyendo principalmente:

55

1) El suero contiene sustancias que son toxicas para las celulas, tales como poliamina oxidasa que puede reaccionar con poliaminas (por ejemplo, espermina, espermidina) de celulas altamente reproductivas, formando as! poliespermina que es citotoxica. El complemento, los anticuerpos y las toxinas de bacterias afectan al crecimiento celular, e incluso causan la muerte celular;

2) Segun el animal individual, el origen de suero, y el numero de lote del suero, la calidad de cada lote de suero es muy variable y es posible mantener la consistencia de la composition.

3) Durante la recogida de materiales, los micoplasmas y virus pueden contaminar el suero y causar efectos potenciales sobre las celulas, lo que resulta en un fracaso de los experimentos o resultados experimentales poco

5 fiables.

4) El coste del suero es bastante caro, de hasta 3000-4000 RMB por 500 ml de suero.

5) La adquisicion de suero a partir de un cuerpo vivo es perjudicial para animales.

[0007] Ward et al. (Efficient Germline Transmission of Mouse Embryonic Stem Cells Grown in Synthetic

10 Serum in the Absence of a Fibroblast Feeder Layer, Laboratory Investigation) describe un medio de congelation que comprende el 10 % en v/v de DMSO, el 13 % en v/v de KSR y DMeM. Wagner et al. (Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockoutSerum Replacement Feeder-Free Medium, Journal of Visualized Experiments) describe una composicion de criopreservacion que consiste en una mezcla 1:1 de un medio A y un medio B con la composicion final del 65 % de dMeM/F12, el 25 % de KSR y el 10 % de DMSO, vease el 15 ejemplo). Fletcher et al. (Variations in humanized and defined culture conditions supporting derivation of new human embryonic stem cell lines, Cloning and Stem Cells) describe una mezcla de congelacion que comprende el 10 % de DMSO, el 15 % de KSR y el 75 % de KODMEM. Sin embargo, el medio de congelacion usado en estas referencias no puede alcanzar una tasa de recuperation satisfactoria.

20 [0008] Hasta la fecha, no existe un medio de congelacion libre de suero que sea estrictamente adecuado

para celulas madre derivadas de tejido adiposo o para el establecimiento de la librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo. Por lo tanto, es una necesidad urgente en la tecnica desarrollar un medio de congelacion libre de suero nuevo y eficaz adecuado para celulas madre derivadas de tejido adiposo.

25 Sumario de la invencion

[0009] Un objeto de la presente invencion es proporcionar un medio de congelacion libre de suero eficiente para celulas madre derivadas de tejido adiposo y un uso del mismo, evitando as! los posibles riesgos del medio de congelacion que contiene suero en uso cllnico.

30

[0010] Otro objeto de la presente invencion es proporcionar un nuevo tipo de librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo de alta eficiencia y el metodo de establecimiento de la misma.

[0011] En el primer aspecto de la presente invencion, se proporciona un medio de congelacion libre de suero, 35 que comprende siguientes ingredientes: medio de cultivo libre de suero, dimetilsulfoxido (DMSO) y sustituto de suero

Knockout™ Serum Replacement (KSR), y el medio de congelacion no contiene nada de suero; y, en base al volumen de medio de congelacion libre de suero, el contenido del medio de cultivo libre de suero es a y a es del 5 %-15 % (v/v), el contenido de DMSO es b y b es del 8 %-20 % (v/v), y el contenido de KSR es c y c es del 70 %-85 % (v/v), mientras que a + b + c <100 %.

40

[0012] En una realization preferida, a es del 8 %-12 % (v/v), b es del 10 %-14 % (v/v), y c es del 75 %-80 % (v/v), en volumen.

[0013] En una realizacion preferida, a es el 10 % (v/v), b es el 12 % (v/v), y c es el 78 % (v/v), en volumen.

45

[0014] En una realizacion preferida, el medio de cultivo libre de suero se selecciona del grupo que consiste en medio de cultivo DEME y medio de cultivo UltraMEM.

[0015] En una realizacion preferida, el medio de cultivo libre de suero es medio de cultivo DEME disponible 50 en el mercado, que comprende la cantidad adecuada de insulina, transferrina, penicilina y estreptomicina.

[0016] En el segundo aspecto de la presente invencion, se proporciona un uso del medio de congelacion libre de suero del primer aspecto de la presente invencion para el almacenamiento a largo plazo de las celulas madre derivadas de tejido adiposo y/o el establecimiento de una librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo.

55

[0017] En el tercer aspecto de la presente invencion, se proporciona una mezcla de celulas madre derivadas de tejido adiposo, en la que la mezcla comprende:

celulas madre derivadas de tejido adiposo, y

el medio de congelacion libre de suero del primer aspecto de la presente invencion.

[0018] En el cuarto aspecto de la presente invencion, se proporciona una librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo, en la que la librerla comprende la mezcla de celulas madre derivadas de tejido adiposo del cuarto

5 aspecto de la presente invencion.

[0019] En una realizacion preferida, la mezcla de celulas madre derivadas de tejido adiposo y el medio de congelacion libre de suero se conservan en nitrogeno llquido despues de que se enfrle en un gradiente de enfriamiento programado.

10

[0020] En una realizacion preferida, despues de la recuperacion, las celulas madre derivadas de tejido adiposo recuperadas de la librerla tienen capacidad de induccion adipogenica.

[0021] En una realizacion preferida, la tasa de supervivencia de las celulas madre derivadas de tejido adiposo 15 recuperadas de la librerla es del > 90 %.

[0022] En una realizacion preferida, la tasa de supervivencia de las celulas madre derivadas de tejido adiposo recuperadas de la librerla es del > 95 %.

20 [0023] En el quinto aspecto de la presente invencion, se proporciona un uso de la librerla de celulas madre

derivadas de tejido adiposo del cuarto aspecto de la presente invencion para la preservacion a largo plazo de las celulas madre derivadas de tejido adiposo.

[0024] En el sexto aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo para establecer una librerla 25 de celulas madre derivadas de tejido adiposo, que comprende:

i) el lavado de un material de tejido adiposo que contiene celulas madre derivadas de tejido adiposo, obteniendo as! una mezcla tejido de la que se eliminan las celulas sangulneas;

ii) la digestion de la mezcla de tejido obtenida en la etapa (i), obteniendo as! una mezcla de tejido adiposo digerido;

30 iii) la filtracion de la mezcla de tejido adiposo digerido obtenido en la etapa anterior para eliminar los restos de tejido

no digerido, obteniendo de esta manera un filtrado que comprende celulas madre derivadas de tejido adiposo;

iv) la centrifugacion del filtrado obtenido en la etapa anterior, y el descarte de la grasa en la capa superior, obteniendo de este modo un precipitado que contiene celulas madre derivadas de tejido adiposo;

v) la inoculacion y el paso de las celulas madre derivadas de tejido adiposo obtenidas en la etapa (iv), obteniendo de 35 este modo celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo;

vi) la digestion de las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo, obteniendo de este modo celulas madre derivadas de tejido adiposo dispersas;

vii) la mezcla de las celulas madre derivadas de tejido adiposo obtenidas en la etapa (vi) con el medio de congelacion libre de suero del primer aspecto de la presente invencion, y la preservacion de la mezcla a baja

40 temperatura, obteniendo de esta manera la librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo.

[0025] En una realizacion preferida, la digestion de la etapa (ii) comprende la digestion con colagenasa, preferentemente digestion con colagenasa I.

45 [0026] En una realizacion preferida, la digestion de la etapa (vi) comprende la digestion con tripsina.

[0027] En una realizacion preferida, la etapa (vii) comprende: mezclar el medio de congelacion libre de suero con las celulas madre derivadas de tejido adiposo obtenidas en la etapa (vi) con el fin de formar una mezcla de celulas madre derivadas de tejido adiposo, y enfriar y conservar la mezcla en nitrogeno llquido, obteniendo de esta

50 manera la librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo.

[0028] En una realizacion preferida, el enfriamiento de la etapa (vii) comprende el uso de un metodo de congelacion programado por gradiente de enfriamiento; preferentemente la velocidad de enfriamiento es de - 1 °C/min a -2 °C/min.

55

[0029] En una realizacion preferida, cuando la temperatura alcanza por debajo de -25 °C en la etapa (vii), la velocidad de enfriamiento se ajusta de -5 °C/min a -10 °C/min.

[0030] En una realizacion preferida, cuando la temperatura alcanza -100 °C en la etapa (vii), las celulas

madre derivadas de tejido adiposo se conservan directamente en nitrogeno llquido.

[0031] En el septimo aspecto de la presente invencion, se proporciona una composition de autoinjerto, que comprende:

5

una cantidad eficaz de celulas madre derivadas de tejido adiposo que se recuperan despues de preservarlas con el medio de congelation libre de suero del primer aspecto de la presente invencion, o las celulas madre derivadas de tejido adiposo que se recuperan de la librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo del cuarto aspecto de la presente invencion, y

10 al menos un vehlculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.

[0032] Se debe entender que, en la presente invencion, las caracterlsticas tecnicas descritas especlficamente mas arriba y a continuation (como en los ejemplos) se pueden combinar entre si, constituyendo de este modo una o mas soluciones tecnicas nuevas o preferidas que no se describen especlficamente una por una debido a la

15 limitation del contexto.

Descripcion de las figuras de la invencion

[0033]

20

La Fig. 1 muestra los resultados de la recuperation de celulas madre derivadas de tejido adiposo tratadas con un medio de congelacion normal que contenla suero y medio de congelacion libre de suero de la presente invencion; en la que la Fig. 1A muestra los resultados de la recuperacion de celulas madre derivadas de tejido adiposo en el grupo que se trato con un medio de congelacion normal que contenla suero; y la Fig. 1B muestra el resultado de la 25 recuperacion de celulas madre derivadas de tejido adiposo en el grupo que se trato con el medio de congelacion libre de suero de la presente invencion.

La Fig. 2 muestra los resultados de la identification de marcadores de superficie de protelna de antlgeno identificados por citometrla de flujo en celulas del estroma derivadas de tejido adiposo que se recuperaron despues de criopreservarse en el medio de congelacion libre de suero de la presente invencion (la formulation se muestra en 30 el Ejemplo 3). Los resultados indicaban que la pureza de las celulas madre derivadas de tejido adiposo era bastante alta. La Fig. 2A muestra que la tasa de celulas madre derivadas de tejido adiposo recuperadas que contienen CD34 era del 0 %. La Fig. 2B muestra que la tasa de celulas madre derivadas de tejido adiposo recuperadas que contienen CD45 era del 0 %. La Fig. 2C muestra que la tasa de celulas madre derivadas de tejido adiposo recuperadas que contienen CD29 era del 98,9 %. La Fig. 2D muestra que la tasa de celulas madre derivadas de 35 tejido adiposo recuperadas que contienen CD73 es del 93,5 %. La Fig. 2E muestra que la tasa de celulas madre derivadas de tejido adiposo recuperadas que contienen CD90 es del 96,3 %. La Fig. 2F muestra que la tasa de celulas madre derivadas de tejido adiposo recuperadas que contienen CD105 es del 73,3 %.

La Fig. 3 muestra los resultados de induction adipogenica de las celulas madre derivadas de tejido adiposo que se recuperaron despues de la criopreservacion en el medio de congelacion libre de suero de la presente invencion (la 40 formulacion se muestra en el ejemplo 3). La Fig. 3A muestra los resultados de induccion de las celulas madre derivadas de tejido adiposo recuperadas en un medio de induccion adipogenico. Los resultados muestran que las celulas madre derivadas de tejido adiposo tratadas con el medio de congelacion libre de suero de la presente invencion (la formulacion se muestra en el Ejemplo 3) tienen una fuerte capacidad adipogenica despues de la recuperacion. La Fig. 3B muestra que las celulas madre derivadas de tejido adiposo recuperadas no poseen 45 capacidad adipogenica cuando las ADSC se cultivan en medio de cultivo normal.

Descripcion detallada de la invencion

[0034] A traves de una investigation amplia e intensiva, el inventor ha descubierto inesperadamente que 50 aunque la mayorla sustituto de suero no se puede utilizar para sustituir suero en medio de congelacion, una

congelacion especlfica libre de suero preparado medio por KSR puede proporcionar efecto criopreservacion dramaticamente superior a la de congelacion medio que contiene suero, por lo tanto proporcionar un nuevo medio de congelacion libre de suero adecuado para la preservacion a largo plazo de las celulas madre derivadas de tejido adiposo por primera vez. El medio de congelacion de la presente invencion ha superado las desventajas del medio 55 de congelacion tradicional. Las celulas madre derivadas de tejido adiposo a partir de una librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo establecida con el medio de congelacion de la presente invencion se conservan bien y con una fuerte potencia de diferenciacion. La presente invencion se realiza en base a este descubrimiento.

Condiciones

[0035] Tal como se usa en el presente documento, los terminos "mas" y "menos", incluyen el numero en si,

por ejemplo, "mas del 95 %" significa > 95 %, "menos del 0,2 %" significa < 0,2 %.

5 [0036] Los terminos "libre de suero" o "sustancialmente libre de suero" se pueden utilizar indistintamente, lo

que significa que el componente de suero es < 0,1 %, preferentemente < 0,01 %, mas preferentemente < 0,005 % (por ejemplo, 0 %), en base al total peso del medio de congelacion.

Celulas madre derivadas de tejido adiposo (ADSC)

10

[0037] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "celulas madre derivadas de tejido adiposo" se refiere a celulas madre que se separan del tejido adiposo. Especlficamente, las celulas madre derivadas de tejido adiposo son las celulas madre separadas de tejido adiposo y poseen multiples diferenciaciones potenciales. No hay limitacion particular en cuanto a los tejidos adiposos o los materiales de tejido adiposo en la presente invencion, que

15 puede ser de cualquier tejido adiposo de cualquier posicion del animal o del ser humano, preferentemente tejidos adiposos humanos. Preferentemente, los tejidos adiposos son tejidos de posiciones tales como la cintura, las caderas, el abdomen, los muslos, la parte superior de los brazos, etc. Las ADSC pueden proliferar in vitro de manera constante con baja tasa de declive. Las ADSC son materias primas faciles de obtener, en una gran cantidad de almacenamiento en el cuerpo, convenientes para el cultivo en gran escala y con un mlnimo dano corporal. Ademas, 20 las ADSC tienen amplias fuentes y son adecuadas para el autotrasplante.

Medio libre de suero

[0038] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "medio libre de suero" se refiere a un medio 25 que esta sustancialmente libre de suero y que puede mantener el crecimiento in vitro y la proliferacion de las celulas

durante un largo periodo de tiempo. No hay limitacion particular en cuanto al medio libre de suero de la presente invencion, que puede ser cualquier medio de cultivo libre de suero adecuado para el cultivo o la preservacion de las celulas madre (en particular ADSC).

30 [0039] En general, los componentes basicos del medio libre de suero incluyen, pero no se limitan a:

[0040] Sales inorganicas. Las sales inorganicas pueden regular la presion osmotica intracelular, ajustar la actividad enzimatica y el valor pH de la solucion; en general, las sales inorganicas incluyen CaCl2, KCl, MgSO4, NaCl, NaHCO3, NaH2PO4, etc.

35

[0041] Aminoacidos. Los aminoacidos son los materiales indispensables para la slntesis de protelnas de las celulas. En general, los aminoacidos incluyen valina, leucina, isoleucina, treonina, lisina, triptofano, fenilalanina, metionina, histidina, tirosina, arginina y cistelna, etc.

40 [0042] Vitaminas. Las vitaminas son sustancias biologicamente activas que mantienen las celulas mediante la

formacion de un cofactor o coenzima. Por lo general, las vitaminas solubles en grasa incluyen VA, VD, VE y VK, etc. En general, las vitaminas solubles en agua incluyen el acido folico, la nicotinamida, el acido pantotenico, la piridoxina, la riboflavina y la tiamina, etc.

45 [0043] Hidratos de carbono. Los hidratos de carbono son la fuente de energla de las celulas, y tambien los

componentes de los acidos nucleicos y las protelnas. La glucosa es el componente mas importante de los hidratos de carbono.

[0044] Oligoelementos. Los oligoelementos son componentes importantes que promueven el crecimiento 50 celular y activan la funcion de las zimoprotelnas. El selenio es el oligoelemento mas comun.

[0045] Factores de crecimiento y hormonas. Se pueden anadir diferentes factores de crecimiento y hormonas como la insulina en las diferentes celulas.

55 [0046] Materiales que promueven la adhesion. Muchas celulas deben crecer en condiciones de adhesion, y

los materiales que promueven la adhesion generalmente son materiales de la matriz extracelular, tales como fibronectina, laminina, y similares.

[0047] El medio libre de suero tambien puede comprender antibioticos. Los antibioticos comunes incluyen,

pero no se limitan a la penicilina, la estreptomicina y la concentracion final de los antibioticos generalmente es de 20100 mg/ml, y preferentemente 50 mg/ml.

[0048] El experto en la tecnica puede formular el medio de cultivo libre de suero usando metodos

5 convencionales, o se pueden adquirir diversos medios libres de suero disponible en el mercado, incluyendo (pero no limitados a): medio de cultivo libre de suero DEME, medio de cultivo libre de suero UltraMEM, etc.

Dimetilsulfoxido (DMSO)

10 [0049] El dimetilsulfoxido es un compuesto organico que contiene azufre, que es incoloro e inodoro y un

llquido transparente a temperatura ambiente. Tiene caracterlsticas tales como una alta polaridad, alto punto de ebullicion, buena estabilidad termica, no protonico, miscible con agua, y se puede disolver en etanol, propanol, benceno y cloroformo y en la mayorla de las sustancias organicas. En cultivo celular, el DMSO puede actuar como agente protector de la permeabilidad, y puede reducir el punto de congelacion de las celulas, reducir la formation de 15 cristales de hielo, reducir el dano por radicales libres a las celulas, y cambiar la permeabilidad de la biopellcula a electrolito, farmacos, toxinas y metabolitos.

Medio de congelacion libre de suero

20 [0050] La presente invention proporciona un medio de congelacion libre de suero eficaz adecuado para

celulas madre derivadas de tejido adiposo, que comprende:

medio libre de suero, dimetilsulfoxido (DMSO) y el sustituto de suero Knockout™ Serum Replacement (KSR), y el medio de congelacion no contiene nada de suero.

25

[0051] El contenido del medio de cultivo libre de suero es del 5 %-15 %, el contenido de DMSO es del 8 %- 20 %, y el contenido de KSR es del 70 %-85 %, en volumen. Preferentemente, el contenido de medio de cultivo libre de suero es del 8 %-12 %, el contenido de DMSO es del 10 %-14 %, y el contenido de KSR es del 75 %-80 %. Mas preferentemente, el contenido de medio de cultivo libre de suero es del 10 %, el contenido de DMSO es del 12 %, y

30 el contenido de KSR es del 78 %.

Criopreservacion de celulas

[0052] La tecnica de criopreservacion de celulas es un metodo importante para la preservation de especies 35 en ciencias biologicas. Si la criopreservacion se lleva a cabo sin ningun tipo de condiciones adicionales, el agua del

entorno intracelular y extracelular forma cristales de hielo, que dan lugar a danos mecanicos, aumento del nivel de electrolitos, cambios en la presion osmotica, deshidratacion, cambios de pH, y desnaturalizacion de las protelnas en las celulas, e incluso puede conducir a la muerte celular. El punto de congelacion se reducira por lo que se anade un agente de protection al medio de cultivo. Esto hace que el agua intracelular se difunda fuera de las celulas antes de 40 congelar en condiciones de congelacion lenta. La formacion de cristales de hielo se reduce si se almacena a baja temperatura por debajo de -130 °C.

[0053] El medio de congelacion es la parte mas importante para la criopreservacion. El medio de congelacion traditional contiene suero animal, principalmente suero de ternera fetal y/o suero de ternero bovino. El suero es una

45 especie de mezcla extremadamente compleja que se produce por la elimination de fibrina del plasma. Algunos de los constituyentes del suero todavla no estan claros. Por otra parte, los constituyentes y el contenido del suero pueden variar, dependiendo del sexo, la edad, el estado fisiologico y las condiciones nutricionales de los donantes animales. El suero comprende varias protelnas plasmaticas, peptidos, grasas, carbohidratos, hormonas y sustancias inorganicas, etc.

50

[0054] La presente invencion utiliza un medio de congelacion libre de suero que comprende un medio libre de suero y un sustituto de suero para la criopreservacion de celulas a fin de reducir los defectos presentados por el suero de las celulas animales, as! como para asegurar los efectos de criopreservacion y recuperation de celulas.

55 [0055] La criopreservacion de las celulas se puede llevar a cabo con equipos y metodos convencionales. En

una realization preferida, se usa un enfriamiento programado. La caja de enfriamiento normalmente esta fabricada en policarbonato, polietileno de alta densidad o espuma. Ademas, se requiere isopropanol y un sistema de refrigeration mecanica. La velocidad de enfriamiento es ajustable y repetible con el fin de cumplir con los requisitos para la criopreservacion y recuperacion de celulas. Un procedimiento de enfriamiento tlpico comprende: enfriar con

una velocidad de enfriamiento de -1 a -2 °C/min; cuando la temperatura alcanza por debajo de -25 °C, se ajusta la velocidad de enfriamiento de -5 a -10 °C/min; y rapidamente se sumerge en nitrogeno llquido cuando la temperatura alcanza por debajo de -100 °C. Las celulas se pueden conservar en nitrogeno llquido durante un largo periodo, que puede ser de decadas de anos o mas.

5

Librerfa de celulas

[0056] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "librerfa de celulas" se refiere a una poblacion de celulas que se enfrlan mediante un determinado programa y que se conservan a largo plazo en un

10 medio de congelacion especlfico. Las celulas de la librerfa de celulas pueden ser de origen humano o de mamlferos (no humanos) tales como ratas, ratones, monos, gatos, ovejas, etc.; y de fuentes de aves de corral, tales como pollos. Las celulas pueden ser de diferentes organos o tejidos, tales como: cavidad oral, rinon, hlgado, linfa, musculo, ovario. Las celulas de la librerfa de celulas se pueden conservar durante decadas de anos o mas.

15 Recuperacion de celulas

[0057] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "recuperacion de celulas" se refiere al proceso en el que las celulas se vuelven a activar desde estado latente. Generalmente, en la recuperacion de celulas se usa la recuperacion rapida, un procedimiento conocido por el experto en la tecnica, que comprende el

20 paso rapido del tubo de congelacion en nitrogeno llquido a un bano de agua caliente cuya temperatura preferentemente es de 37 °C-40 °C; se agita a un intervalo variable para acelerar la descongelacion; el tubo de congelacion se esteriliza despues de que las celulas se hayan descongelado completamente; se lavan y las celulas descongeladas se vuelven a suspender, las celulas se transfieren a un matraz de cultivo de celulas y se cultivan en una incubadora de CO2; y se determina la tasa de supervivencia y viabilidad de las celulas.

25

Adhesion celular

[0058] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "adhesion celular" se refiere al hecho de que haya una superficie de soporte para la fijacion durante el crecimiento de las celulas normales, mientras las celulas

30 crecen y proliferan sobre la superficie por los factores adherentes excretados por ellas mismas o suministrados en el medio. Las celulas se desarrollan en dos formas despues de crecer sobre la superficie, que son celulas similares a fibroblastos o celulas epitelioides. Hay un fenomeno de inhibition por contacto durante el crecimiento de adhesion. Se lleva a cabo el tratamiento con tripsina durante el cultivo de celulas animales para hacer que las celulas adherentes se desprendan. Por otra parte, las celulas tumorales no tienen estas caracterlsticas y se pueden cultivar 35 en el cultivo de suspension.

Deteccion del antfgeno de celulas madre

[0059] Las celulas madre derivadas de tejido adiposo criopreservadas por el metodo de la presente invention 40 tienen una alta pureza despues de la recuperacion, que se ha demostrado mediante la deteccion de antlgenos de

superficie celular.

[0060] Hay varios antlgenos y receptores especificos de las celulas madre derivadas de tejido adiposo, principalmente CD3, CD13, D29, CD34, CD45, CD49e, CD59, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC, etc.

45

[0061] El antfgeno CD34 es una protefna transmembrana altamente glicosilada de tipo I que se expresa selectivamente sobre la superficie de las celulas madre hematopoyeticas humanas (HSC), celulas progenitoras (PC) y celulas endoteliales vasculares (EC). La relation de celulas madre derivadas de tejido adiposo con CD34 en las celulas madre preferentemente es del < 0,2 %, mas preferentemente del < 0,2 %.

50

[0062] CD45 existe sobre la superficie de todas las celulas madre hematopoyeticas, incluyendo celulas madre hematopoyeticas y osteoclastos, la relacion de celulas madre derivadas de tejido adiposo con CD45 en las celulas madre preferentemente es del < 0,1 %.

55 [0063] CD29, CD73, CD90, CD105 y etc. existen principalmente sobre la superficie de las celulas del estroma

derivadas de tejido adiposo.

[0064] La relacion de celulas madre derivadas de tejido adiposo con CD29 en las celulas madre

preferentemente es del > 95 %, mas preferentemente del > 97 %, lo mas preferentemente del > 98 %.

[0065] La relacion de celulas madre derivadas de tejido adiposo con CD73 en las celulas madre

preferentemente es del > 80 %, mas preferentemente del > 90 %, lo mas preferentemente del > 93 %.

5 [0066] La relacion de celulas madre derivadas de tejido adiposo con CD90 en las celulas madre

preferentemente es del > 80 %, mas preferentemente del > 90 %, lo mas preferentemente del > 95 %.

[0067] La relacion de celulas madre derivadas de tejido adiposo con CD105 en las celulas madre

preferentemente es del > 70 %, mas preferentemente del > 72 %, lo mas preferentemente del > 75 %.

10

[0068] El experto en la tecnica puede utilizar los metodos comunes para detectar la pureza y el grado de

diferenciacion de celulas madre derivadas de tejido adiposo, tales como el metodo de citometrla de flujo. Se anaden

anticuerpos dirigidos especlficos diferentes durante la deteccion, en donde los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales intactos, o los anticuerpos pueden ser un fragmento de anticuerpo de un fragmento

15 inmunorreactivo, tal como Fab' o (Fab)2; la cadena pesada del anticuerpo; la cadena ligera del anticuerpo; la molecula Fv de cadena sencilla, que esta disenado geneticamente (Ladner et al., patente de EE. UU. n.° 4.946.778); o anticuerpos quimericos tales como anticuerpos que tienen especificidad de union con anticuerpos murinos al tiempo que aun conservan parte del anticuerpo humano. Las celulas son analizadas y clasificadas automaticamente por citometrla de flujo despues de que se anadan anticuerpos y se unan a antlgenos sobre la superficie celular 20 durante un cierto perlodo de tiempo.

Adipogenesis y ensayos

[0069] Dado que las celulas madre derivadas de tejido adiposo tienen una capacidad de diferenciacion multi- 25 direccional, ciertas celulas diferenciadas que tienen una funcion particular se pueden obtener por diferenciacion

induciendo celulas madre derivadas de tejido adiposo bajo ciertas condiciones.

[0070] La induccion adipogenica de celulas madre derivadas de tejido adiposo se puede llevar a cabo por expertos en la tecnica con cualquiera de los metodos comunes. Un metodo de induccion preferido es anadir

30 dexametasona al medio de cultivo. Principalmente hay 3 tipos de medios de induccion que contienen dexametasona: 1. dexametasona + 1-metil-3-isobutilxantina (IBMX), 2. dexametasona + insulina, 3. dexametasona + indometacina, 1-metil-3-isobutilxantina e insulina. La sustancia mas importante del medio de induccion es la dexametasona. La baja concentration de dexametasona es uno de los componentes esenciales del cultivo de celulas madre mesenquimales con cultivo en bajo contenido de suero o libre de suero, que pueden promover la rapida proliferation 35 in vitro de las celulas madre mesenquimales; mientras que una mayor concentracion de dexametasona puede inducir a que las celulas madre mesenquimales se diferencien hacia adipocitos.

[0071] El experto en la tecnica puede utilizar los metodos y tinciones comunes (por ejemplo, Oil Red, Sudan Red 5B, y Solvent Red 27, etc.) para detectar la induccion adipogenica de las celulas madre. Una tincion preferida

40 es Oil Red (O), es decir, Oil Red O. La estructura del Oil Red O es 1-2,5-dimetil-4-(2,5-dimetilfenilazo)fenilazo-2- naftol, que es un polvo de color rojo. Se trata de un colorante azoico soluble en aceite, facilmente soluble en benceno, etanol y acetona. Durante la induccion adipogenica, las gotitas de aceite se acumulan constantemente en el citoplasma de las celulas, y aumentan continuamente de volumen, y, finalmente, las gotitas de aceite ocupan el citoplasma. Como tincion biologica, el Oil Red O es facil de combinar con aceite, pero con baja fuerza de tincion a la 45 estructura de las propias celulas. La observation de la tincion adipogenica se puede llevar a cabo claramente usando un microscopio.

Composicion de autotrasplante y su administracion

50 [0072] La presente invention proporciona ademas una composicion de autotrasplante que es util para

multiples fines tales como composicion anti-envejecimiento. La composicion de autotrasplante comprende una dosis eficaz de celulas madre derivadas de tejido adiposo que se recuperan despues de conservadas con el medio de congelation libre de suero de la presente invencion. En una realization preferida, ademas puede comprender un vehlculo o diluyente, al menos un vehlculo farmaceuticamente aceptable. El ingrediente activo normalmente se 55 mezcla con un excipiente o se diluye con un excipiente en la preparation de la composicion. Para las composiciones que contienen celulas madre derivadas de tejido adiposo, la formulation preferida es una formulation llquida.

[0073] La composicion de autotrasplante preparada se puede administrar o aplicar por una via de

administracion comun, que comprende (pero no esta limitada a): via intramuscular, intraperitoneal, intravenosa,

subcutanea, intradermica, o topica.

[0074] Cuando se utiliza la composition de autotrasplante de la presente invention se administra una dosis segura y eficaz al ser humano, en la que la dosis segura y eficaz generalmente es de 105-108 celulas/persona/una

5 vez, preferentemente 106-107 celulas/persona/una vez. Por supuesto, la dosis especlfica puede variar de acuerdo con factores tales como la forma de administration y el estado de salud del sujeto, que esta dentro de la capacidad del medico experto.

[0075] Las principales ventajas del medio de congelation libre de suero de la presente invencion incluyen:

10

1) El medio tiene ingredientes claros y no contiene ingredientes nocivos para las celulas.

2) El medio tiene una calidad estable y el contenido de los ingredientes de nutrition no varla con los lotes.

3) Las celulas se pueden recuperar bien despues de la criopreservacion con una alta tasa de supervivencia;

4) Las celulas, despues de la criopreservacion, tienen unas caracterlsticas antigenicas estables y una alta pureza.

15 5) Las celulas madre derivadas de tejido adiposo recuperadas tienen una fuerte capacidad de diferenciacion

despues de la preservacion.

[0076] La presente invencion se ilustrara adicionalmente a continuation con referencia a los ejemplos especlficos. Los metodos experimentales sin condiciones especlficas descritos en los siguientes ejemplos

20 generalmente se realizan en las condiciones convencionales, por ejemplo, en las condiciones descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), o de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A menos que se indique lo contrario, las partes y porcentajes se calculan en peso.

25 Ejemplo 1

Separacion de las celulas madre derivadas de tejido adiposo

1. Reactivos y consumibles

30 [0077]

forceps esteril filtro esteril

tubos de centrlfuga de 50 ml 35 frascos de cultivo

medio libre de suero DMEM (adquirido en Hyclone Company) solution de tripsina al 0,125 %-EDTA al 0,01 %

[0078] El metodo de preparation del 0,1 % de colagenasa I (recien preparado): 0,1 g pesados de colagenasa 40 I en polvo se disolvio en 100 ml de medio sin ningun factor, y se pre-calienta hasta 37 °C antes de su uso.

2. Separacion de las celulas madre derivadas de tejido adiposo

[0079]

45

2.1. Lavado del tejido adiposo (con el fin de eliminar las celulas sangulneas): se anadio una cantidad igual de solucion salina a un tubo de centrlfuga que contiene tejido adiposo. La tapa del tubo de centrlfuga se apreto, se agito durante 3 minutos para lavar a fondo el tejido adiposo, y a continuacion se dejo reposar 3-5 minutos para separar las diferentes fases. Se retiro la fase acuosa inferior. El protocolo antes mencionado se repitio tres veces hasta que el

50 llquido de la capa inferior se volvio relativamente mas claro.

2.2. Digestion de la colagenasa: Despues de retirar la solucion salina, DMEM precalentado que contiene el 0,1 % de colagenasa I con un volumen igual a tejido adiposo se anadio en el tubo de centrlfuga y se puso en el agitador a una temperatura constante de 37 °C, 200 rpm, y se digirio durante 1 h. El tubo de centrlfuga se agito durante 5-10 segundos cada 15 minutos (para hacer que la colagenasa I y el tejido adiposo entrasen completamente en contacto);

55 2.3. Recogida del sedimento: despues de la digestion, el tubo se centrifugo durante 10 min a 2000 rpm. El tejido adiposo digerido en la capa superior se retiro y el sedimento en la capa inferior de los dos tubos se recogio en un nuevo tubo de centrlfuga, a continuacion se anadio 50 ml de DMEM, se centrifugo a 1000 rpm durante 8 minutos, y se lavo una vez.

2.4. Filtration y recuento: se anadio DMEM hasta 50 ml, se mezcla y se filtra con un filtro de 100 pm para extraer los

tejidos no digeridos. Se anadio DMEM hasta 50 ml, y se extrajo 1 ml de la mezcla del tubo de hacer un recuento de la cantidad y la viabilidad de las celulas.

Ejemplo 2

5 Cultivo de celulas madre derivadas de tejido adiposo

[0080]

1. Inoculacion: las celulas madre derivadas de tejido adiposo separadas descritas en el Ejemplo 1 se centrifugaron 10 durante 8 minutos a 1000 rpm, se lavaron una vez, y se inocularon en una botella de cultivo T75, en la que la densidad del inoculo se ajusto de acuerdo con la cantidad de celulas contadas (densidad de inoculo: normalmente se inocularon 12 ml de liposuccion adiposa en cada botella de cultivo T75, es decir, las celulas separadas de los 50 ml de liposuccion adiposa se inocularon en cuatro frascos de cultivo T75), y a continuacion se cultivo a 37 °C con el 5 % de CO2.

15 2. Paso de las celulas: las celulas se volvieron adherentes durante aproximadamente 1-2 dlas despues de inoculadas, entre las que despues de tres dlas aparecio una pequena cantidad de celulas madre mesenquimales adherentes. Despues de cultivadas durante 5-7 dlas, las celulas adherentes se convirtieron en una colonia. La digestion y el paso de las celulas se llevaron a cabo con una solucion del 0,125 % de tripsina - 0,01 % de EDTA. Se anadieron 2 ml de la digestion a cada botella de cultivo T75, y el tiempo de digestion fue de 1,5-2,5 min. Las celulas 20 se recogieron y se contaron, y a continuacion se digirieron y se pasaron por 5 x 103/cm2 (es decir, 1:1-2 en base a la situacion de adhesion primaria). Las celulas se hicieron crecer mas rapido despues de los pasos, por lo general les llevo tres dlas para el paso de nuevo. Las celulas se pasan de acuerdo con la relacion de 1:2-3 en base a las condiciones de crecimiento de las celulas. Por lo general, el numero de celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo P2 es superior a 2 x 107.

25

Ejemplo 3

Criopreservacion de las celulas

1. Reactivos y consumibles 30

[0081]

tubo de congelacion de 2 ml pipeta de 52 ml 35 pipeta de 102 ml

tubo de centrlfuga de 50 ml pajita de plastico de 3 ml filtro celular de 40 pm

caja de congelacion programada Nalgene (Artlculo n.° 5100-0001c disponible en el mercado) 0,25 % de pancreatina- 40 EDTA DMSO

medio libre de suero (adquirido en Sciencell, el Artlculo n.° 7511 es): el medio libre de suero disponible en el mercado es medio de cultivo DMEM, que contiene la cantidad adecuada de insulina, transferrina, penicilina y estreptomicina.

45 Alternativas de suero: Knockout™ Serum Replacement (KSR), (adquirido en Invitrogen, Artlculo n.° 10828028)

Medio de congelacion libre de suero: 10 % de medio libre de suero + 12 % de DMSO + 78 % de alternativa de suero KSR en volumen;

medio de congelacion ordinario: 10 % de suero de ternera fetal + 10 % de DMSO + 80 % de DMEM en volumen.

50 2. Criopreservacion

[0082]

2.1 Se observo la morfologla de las celulas a criopreservar, y las celulas se digieren cuando su confluencia alcanza 55 el 85 %-90 %.

2.2 Se anadio la cantidad apropiada de medio libre de suero (2-3 ml/75 cm2) a cada vaso de cultivo despues de la digestion celular. Los vasos se pipetearon o agitaron en varias ocasiones hasta que la mayorla de las celulas se hubo desprendido, y a continuacion, se trasladaron a un tubo de centrlfuga de 50 ml. Se anadio 4-5 ml de PBS a los vasos de cultivo originales para lavar la pared de los vasos, y la solucion de lavado se combino y se anadio al tubo

de centrlfuga, y se centrifugo durante 10 min.

2.3 Lavado de las celulas: El sobrenadante en el tubo de centrlfuga se retiro y se anadio 2-4 ml de PBS en cada tubo de centrlfuga, y se pipetea suavemente para homogeneizarlo. La suspension de celulas de los 15-20 tubos de centrlfuga se combinaron en un tubo de centrlfuga y se centrifugo a 210 g durante 10 min para lavar.

5 2.4 El medio de congelacion de celulas libre de suero se anadio poco a poco a la suspension de celulas a lo largo de la pared interior del tubo, y se pipeteo para homogeneizarlo (el intervalo de la densidad de criopreservacion fue de

0. 5.a 2 x 107/ml), mientras se anadla el medio de congelacion ordinario que contenla suero en el otro grupo. Hay cinco muestras para cada grupo.

2.5 Las celulas a criopreservar se pusieron en la caja de enfriamiento programado que contiene alcohol isopropllico. 10 La cantidad y los tiempos de uso del isopropanol se deben considerar antes de utilizarse con el fin de anadir o sustituir el isopropanol a tiempo de acuerdo con protocolos. Las celulas se mantuvieron a -80 °C durante toda la noche en el congelador con la velocidad de enfriamiento de la caja de enfriamiento mantenida a -1 °C/min, se movio al tanque de nitrogeno llquido al dla siguiente, por lo que se establecio el banco de celulas madre adiposas.

15 Ejemplo 4

Recuperacion de las celulas

1. Reactivos y consumibles

20 [0083]

pipeta de 5 ml pipeta de 102 ml pajita de plastico de 3 ml 25 tubo de centrlfuga de 50 ml

solucion de PBS pre-enfriada a 4 °C 75 % de etanol

2. Recuperacion 30

[0084]

2.1 La temperatura del bano de agua termostatico se ajusto a 40 °C. El tubo de congelacion de celulas se saco del nitrogeno llquido, y a continuacion, se puso inmediatamente en agua caliente a 40 °C y se agito suavemente hasta

35 que el medio de congelacion se hubo descongelado completamente;

2.2 La tapa del tubo de congelacion se limpio con etanol al 75 % y se quemo con una llama. La tapa del tubo de congelacion se abrio y la suspension celular se transfirio a un tubo de centrlfuga de 50 ml (cabe senalar que el movimiento debe ser suave). A continuacion se anadio 1 ml de PBS pre-enfriado a 4 °C al tubo de congelacion, y se pipeteo para lavar. Las celulas residuales en el tubo se transfirieron a un tubo de centrlfuga de 50 ml tanto como sea

40 posible, y a continuacion se mezclaron pipeteando suavemente;

2.3 Se repitieron los protocolos mencionados anteriormente. La suspension de celulas y el llquido de lavado de los 2-3 tubos de congelacion se combinaron en un tubo de centrlfuga de 50 ml. Se anadio PBS pre-enfriado a 4 °C en el tubo de centrlfuga (en el que la relacion de adicion era de 10-15 ml por tubo de congelacion). El tubo se centrifugo a 210 g durante 8 minutos. Se retiro el sobrenadante; y las celulas de 2-3 tubos de centrlfuga se podlan combinar en

45 un tubo de centrlfuga de 50 ml, seguido de dilucion de las celulas a traves de la adicion gradual de PBS pre-enfriado a 4 °C hasta 45 ml (o diluido en una relacion de 15-20 ml por tubo de centrlfuga), y a continuacion se pipeteo suavemente para homogeneizarlo. Se tomaron 10 pl de la muestra para contar el numero y la viabilidad de las celulas, y despues se centrifugo a 210 g durante 10 min. La poblacion de celulas recuperadas se obtuvo a partir del sedimento resultante.

50

Ejemplo 5

Determinacion de la viabilidad de las celulas recuperadas de celulas madre derivadas de tejido adiposo

[0085] La tercera generacion de celulas madre derivadas de tejido adiposo se criopreservaron utilizando el 55 medio de congelacion libre de suero que se describe en el Ejemplo 3. El proceso de recuperacion de celulas se

realizo un mes mas tarde. Se dividieron cinco grupos y se prepararon en una unica suspension celular cuya concentracion era de 1 x 105/ml, de la que se tomaron 9 gotas y se movieron al tubo de EP. Se anadio en cada tubo una gota de solucion de azul de tripan cuya concentracion es del 0,4 %. Se utiliza la camara de recuento sangulnea para contar el numero y la viabilidad de las celulas en 2 min. El grupo de control era las celulas recuperadas

criopreservadas con medio de congelacion ordinario y tratado por el mismo metodo mencionado anteriormente.

[0086] Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Viabilidad celular des: pues de la recuperacion

Grupos: Medio de congelacion ordinario que contiene suero medio de congelacion libre de suero de la presente invencion

1: 89,0 % 95,5 %

2: 90,5 % 93,5 %

3: 91,0 % 94,5 %

4: 93,5 % 95,5 %

5: 96 % 95,0 %

Promedio: 92 % 94,8 %

[0087] En la Tabla 1 se puede ver que la viabilidad celular promedio de las celulas recuperadas despues de criopreservarlas con medio de congelacion libre de suero de la presente invencion es del 94,8 %, mientras que la viabilidad celular promedio de las celulas recuperadas despues de criopreservarlas con medio de congelacion

10 ordinario que contiene suero es del 92 %. Esto indica que el efecto del medio de congelacion libre de suero de la presente invencion es mejor que el del grupo control.

Ejemplo 6

Determinacion del tiempo de criopreservacion de la disolucion de criopreservacion libre de suero de la 15 presente invencion

[0088] Con el fin de determinar el efecto de criopreservacion del banco de celulas preparadas con el medio de congelacion libre de suero de la presente invencion (cuya formula se muestra en el Ejemplo 3), el inventor recupero las celulas madre derivadas de tejido adiposo que hablan sido criopreservadas durante 1 mes, 3 meses y 6

20 meses, respectivamente. Cinco muestras de cada grupo se tineron para su recuento por el metodo descrito en el Ejemplo 4. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2

Grupos: Recuperadas despues de 1 mes de criopreservacion Recuperadas despues de 3 meses de criopreservacion Recuperadas despues de 6 meses de criopreservacion

1: 94,5 % 95,5 % 91,0 %

2: 93,5 % 93,0 % 96,5 %

3: 95,0 % 92,5 % 95,0 %

4: 94,5 % 94,5 % 93,5 %

5: 95,0 % 96,5 % 95,5 %

Promedio: 94,5 % 94,4 % 94,3 %

25 [0089] El resultado mostraba que la viabilidad de las celulas promedio de celulas crioconservadas durante 1

mes, 3 meses y 6 meses fue del: 94,5 %, 94,4 % y 94,3 %, respectivamente, y las condiciones de recuperacion de celulas eran correctas, lo que significa que las propiedades del banco de celulas era estable.

Ejemplo 7

30 Determinacion de la tasa de adhesion celular

[0090] Las celulas tratadas con el medio de congelacion libre de suero de la presente invencion (cuya formula se muestra en el Ejemplo 3) y las celulas tratadas con el medio de congelacion de control se inocularon por separado en placas de 24 pocillos con 5 x 104 celulas por pocillo. Cada grupo se inoculo con celulas en 3 pocillos y

35 se cultivaron durante un dla. Entonces se observo la situacion de adhesion celular.

[0091] El resultado se muestra en la Fig 1. La Fig 1A muestra la situacion de adhesion del grupo tratado con medio de congelacion libre de suero de la presente invencion despues de la recuperacion, y la Fig 1B es la del grupo de control. El resultado muestra que las celulas recuperadas despues de criopreservarlas con el medio de

40 congelacion libre de suero de la presente invencion tienen una mayor viabilidad celular y un mejor efecto de adhesion.

Ejemplo 8

Identificacion de los marcadores de superficie de las celulas madre

[0092] Las celulas tratadas con el medio de congelacion de la presente invencion (cuya formula se describe

5 en el Ejemplo 3) y las celulas del grupo de control se recuperaron respectivamente. Se centrifugaron las celulas madre, se resuspendieron, y se contaron. El concentrado de las celulas se ajusto a 1 * 108/l y se centrifugo durante 5 min. El sobrenadante se retiro y las celulas se lavaron con D-Hanks frlo a 4 °C y se resuspendieron. La suspension celular se centrifugo a 800 r/min durante 5 min mas. El sobrenadante se retiro, se resuspendio con 1 ml de D-Hanks, entonces se anadio 5-10 pl de anticuerpo y se mantuvo fuera de la luz en hielo durante 30 min. Despues se lavo con 10 D-Hanks y se retiro el sobrenadante. El mismo protocolo de lavado se repitio 2-3 veces para asegurarse de que los anticuerpos no combinados se eliminaban completamente con el lavado seguido de la adicion de aproximadamente 200 a 300 pl de D-Hanks para formar una suspension para la clasificacion por el citometro de flujo. Los anticuerpos anadidos eran anticuerpos contra CD34, CD45, CD29, CD73, CD90 y CD105 humanos, respectivamente.

15 [0093] Los resultados se muestran en la Fig 2. La Fig 2A es el mapa de citometrla de flujo de anticuerpo

monoclonal CD34, en el que el contenido de CD34 es del 0 %; la Fig 2B es el mapa de citometrla de flujo de anticuerpo monoclonal CD45, en el que el contenido de CD45 es del 0 %; la Fig 2C es el mapa de citometrla de flujo de anticuerpo monoclonal CD29, en el que el contenido de CD29 es del 98,9 %; la Fig 2D es el mapa de citometrla de flujo de anticuerpo monoclonal CD73, en el que el contenido de CD73 es del 93,5 %; la Fig. 2E es el mapa de 20 citometrla de flujo de anticuerpo monoclonal CD90, en el que el contenido de CD90 es del 96,3 %; la Fig. 2F es el mapa de citometrla de flujo de anticuerpo monoclonal CD105, en el que el contenido de CD34 es del 73,3 %.

[0094] El resultado del analisis antigenico se muestra en la Tabla 3.

25 Tabla 3

Antlgeno de superficie: CD34 CD45 CD29 CD73 CD90 Cod105

Resultado: 0 % 0 % 98,9 % 93,5 % 96,3 % 73,3 %

[0095] Conclusion: El analisis del marcador de antlgeno de superficie celular se llevo a cabo despues de que las celulas madre derivadas de tejido adiposo se recuperasen despues de criopreservarlas con el medio de congelacion libre de suero de la presente invencion. El resultado mostraba que las celulas madre procesadas a partir

30 de los metodos mencionados anteriormente tenlan una mayor pureza, las cuales eran principalmente celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo. Por ejemplo, el 98,9 % de las celulas tienen el antlgeno de superficie CD29 (que era un antlgeno especlfico de celulas madre adiposas bien reconocido), pero no el antlgeno cD34 (un antlgeno de superficie tlpico de celulas madre hematopoyeticas), ninguna celula tiene (0 %) antlgeno CD45 (que era un antlgeno tlpico conocido situado sobre la superficie de leucocitos).

35

Ejemplo 9

Adipogenesis y ensayo de celulas madre derivadas de tejido adiposo

[0096] Se utilizo el medio de congelacion de la presente invencion (Ejemplo 3) para establecer el banco de 40 celulas de las celulas madre derivadas de tejido adiposo humano. Las celulas madre se inocularon en placas de 6

pocillos con 2 x 105 celulas por pocillo despues de la recuperacion. Las celulas madre en medio de cultivo normal sirvieron como control negativo.

[0097] Metodos de cultivo e induccion: se anadieron una concentracion final de 1 pmol/l de dexametasona, 10 45 pmol/l de insulina, 200 pmol/l de indometacina y 0,5 mmol/l de metilxantina de isobutilo al medio basico (DMEM +

10 % de suero fetal de ternero), tales como se ha preparado en el medio adipogenico. El medio de cultivo se cambio dos veces a la semana hasta que se realizo la tincion adipogenica. Tambien se realizaron experimentos en paralelo para cada grupo (n = 3).

50 Metodos de tincion con Oil Red O:

[0098] Tincion: la solucion nutritiva se elimino suave y gradualmente, seguido de lavado suave con D-Hanks. Se anadio el 10 % de formalina neutra y se fijo a la citomembrana durante 30 min. Se anadio el 0,5 % de Oil Red O (1,5 ml en placas de 6 pocillos) para la tincion durante 10 min-1 h.

55

[0099] Blanqueamiento: 75 % de etanol/60 % de isopropanol usado para enjuagar la tincion residual, re- tincion con hematoxilina palida durante 1 minuto seguido de un enjuague con PBS, montaje con gelatina de glicerol,

y se observa con el microscopio.

[0100] 5-10 vistas se seleccionaron al azar en cada grupo de muestras para su observacion fotografiando para evaluar el efecto de diferenciacion adipogenica del metodo de co-cultivo. El tejido adiposo es de color rojo

5 brillante, el nucleo de la celula azul, y el mesenquima es incoloro.

[0101] El resultado muestra que las celulas madre derivadas de tejido adiposo cultivadas con el medio de congelacion libre de suero de la presente invencion todavla tienen la capacidad de diferenciarse en celulas de grasa cuando se tratan con un inductor de la adipogenesis (Figura 3). Se puede ver en la Figura 3A que hay un gran

10 numero de pequenos grupos de gotitas de llpidos (rojo) en las celulas adipogenicas diferenciadas. La Figura 3B es el control negativo, que son las celulas madre sin el tratamiento con el inductor de diferenciacion.

Ejemplo 10

Comparacion del efecto de criopreservacion de diferentes tipos de medio de congelacion libre de suero 15 (sustituto de suero)

[0102] Con el fin de evaluar el efecto del medio de congelacion libre de suero de la presente invencion, el inventor utilizo otro medio de congelacion libre de suero (sustituto de suero) para la comparacion: FetalClone III (SH30109.01) disponible en el mercado en HyClone Company.

20

[0103] Medio de congelacion libre de suero de la presente invencion: 10 % de medio libre de suero + 12 % de DMSO + 78 % de KSR (en volumen)

Medio de congelacion libre de suero del grupo de control: 10 % de medio libre de suero + 12 % de DMSO + 78 % de FetalClone III (en volumen).

25 Se tomaron celulas criopreservadas de tercera generation durante un mes, y se cuenta el numero de celulas viables de acuerdo con el metodo descrito en el Ejemplo 5 despues de la recuperation.

[0104] El resultado se muestra en la Tabla 4.

30 Tabla 4

Grupos: Medio de congelacion libre de suero de la presente invencion Medio de congelacion libre de suero del grupo de control Medio de congelacion que contiene suero del grupo de control

1: 95,5 % 90,5 % 91,5 %

2: 93,0 % 91,0 % 92,9 %

3: 94,5 % 89,2 % 90,0 %

4: 95,0 % 89,5 % 91,5 %

5: 95,5 % 88,0 % 91,8 %

Promedio: 94,7 % 89,6 % 91,5 %

[0105] Los resultados del ensayo inesperadamente muestran que el efecto de recuperacion de las celulas tratadas con el medio de congelacion libre de suero de la presente invencion que no contiene nada de suero es el mejor, superior al de los grupos de control tratados con otro medio de congelacion libre de suero o medio de

35 congelacion que contiene suero.

[0106] Esto demostro que, aunque la mayorla de las sustituciones de suero no eran adecuadas como alternativas al suero en el medio de congelacion, el medio de congelacion libre de suero que contiene KSR de la presente invencion tiene un mejor efecto de criopreservacion que el medio de congelacion que contiene suero. Asl,

40 el medio de congelacion libre de suero de la presente invencion es ideal para la criopreservacion de celulas madre derivadas de tejido adiposo.

Ejemplo 11

Comparacion del efecto de la criopreservacion de celulas utilizando un medio de congelacion libre de suero 45 con una formula diferente

[0107] En este ejemplo se sometieron a ensayo medios de congelacion libres de suero de la presente invencion de cuatro formulas diferentes, en el que las formulas se muestran en la Tabla 5.

50 [0108] El banco de celulas se preparo de acuerdo con el metodo descrito en el Ejemplo 3. Despues de 3

meses de criopreservacion, las celulas madre derivadas de tejido adiposo del banco se recuperaron segun el metodo descrito en el Ejemplo 4. La viabilidad celular se determino por el metodo descrito en el Ejemplo 5.

Tabla 5

Grupos: Formula (en volumen)

1: 7 % de medio libre de suero + 8 % de DMSO + 85 % de KSR

2: 10 % de medio libre de suero + 12 % de DMSO + 78 % de KSR

3: 15 % de medio libre de suero + 15 % de DMSO + 70 % de KSR

4: 5 % de medio libre de suero + 15 % de DMSO + 80 % de KSR

5

[0109] El resultado muestra que las celulas madre derivadas de tejido adiposo de bancos establecidos con

las cuatro formulas diferentes de la presente invencion tienen todas tasas de supervivencia altas (alrededor del 9395 %) despues de la recuperacion.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un medio de congelacion libre de suero que comprende los siguientes ingredientes: medio de cultivo

de libre de suero, dimetilsulfoxido (DMSO) y sustituto de suero Knockout™ Serum Replacement (KSR) y el medio de 5 congelacion no contiene suero; y

en base al volumen del medio de congelacion libre de suero, el contenido del medio de cultivo libre de suero es a y a es del 5 %-15 % (v/v), el contenido de DMSO es b y b es del 8 %- 20 % (v/v), y el contenido de KSR es c y c es del 70 %-85 % (v/v), mientras que a + b + c < 100 %.

10 2. El medio de congelacion libre de suero de la reivindicacion 1, en el que, a es del 8 %-12 % (v/v), b es

del 10 %-14 % (v/v), y c es del 75 %-80 % (v/v), en volumen.
3. Un uso del medio de congelacion libre de suero de la reivindicacion 1 para el almacenamiento a largo plazo de celulas madre derivadas de tejido adiposo y/o el establecimiento de una librerla de celulas madre derivadas

15 de tejido adiposo.
4. Una mezcla de celulas madre derivadas de tejido adiposo, en la que la mezcla comprende:

celulas madre derivadas de tejido adiposo, y 20 el medio de congelacion libre de suero de la reivindicacion 1.
5. Una librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo, en la que la librerla comprende la mezcla de celulas madre derivadas de tejido adiposo de la reivindicacion 4.

25 6. La librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo de la reivindicacion 5, en la que la mezcla de

celulas madre derivadas de tejido adiposo y el medio de congelacion libre de suero se conserva en nitrogeno llquido

despues de que se enfrla en un enfriamiento de gradiente programado.
7. La librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo de la reivindicacion 5, en la que las celulas 30 madre derivadas de tejido adiposo recuperadas de la librerla tienen capacidad de induccion adipogenica.
8. La librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo de la reivindicacion 5, en la que la tasa de

supervivencia de las celulas madre derivadas de tejido adiposo recuperadas de la librerla es del > 90 %.

35 9. Un uso de la librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo de la reivindicacion 5 para la

preservacion a largo plazo de las celulas madre derivadas de tejido adiposo.
10. Un metodo para establecer una librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo, que comprende:

40 i) el lavado de un material de tejido adiposo que contiene celulas madre derivadas de tejido adiposo, obteniendo as! una mezcla tejido de la que se eliminan las celulas sangulneas;

ii) la digestion de la mezcla de tejido obtenido en la etapa (i), obteniendo as! una mezcla de tejido adiposo digerido;

iii) la filtracion de la mezcla de tejido adiposo digerido obtenido en la etapa anterior para eliminar los restos de tejido no digerido, obteniendo de esta manera un filtrado que comprende celulas madre derivadas de tejido adiposo;

45 iv) la centrifugacion del filtrado obtenido en la etapa anterior y el descarte de la grasa en la capa superior, obteniendo de este modo un precipitado que contiene las celulas madre derivadas de tejido adiposo;

v) la inoculacion y el paso de las celulas madre derivadas de tejido adiposo obtenidas en la etapa (iv), obteniendo de este modo celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo;

vi) la digestion de las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo, obteniendo de este modo celulas 50 madre derivadas de tejido adiposo dispersas; y

vii) la mezcla de las celulas madre derivadas de tejido adiposo obtenidas en la etapa (vi) con el medio de congelacion libre de suero de la reivindicacion 1 y la preservacion de la mezcla a baja temperatura, obteniendo de esta manera la librerla de celulas madre derivadas de tejido adiposo.