CN108184819A - 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人脐带华通氏胶组织冻存保护液及其制备与应用，通过渗透性保护剂和非渗透性保护剂分别平衡细胞内外的电解质浓度，同时降低自由水的含量、减少冰晶形成，一方面避免外部高渗环境导致细胞过度脱水、造成细胞损伤，另一方面可降低冰晶对细胞的物理性损伤；添加蛋白组合物可以为细胞提供所需的养分，从而提高细胞的存活率；亲水性胶体可以在水中形成触变胶，使渗透性保护剂中的各成分分布均匀，并可使细胞在其中均匀分散、不易出现沉淀，并且易于取用和存放。通过上述成分组合使用，可以有效提高华通氏胶组织的活性和抗逆性，从而提高细胞冻存时和复苏后的存活率、减少冻存造成的细胞活性损失。
Description
技术领域
本发明属于人体组织冻存技术领域，特别涉及一种人脐带华通氏胶组织冻存保护液及其制备与应用。
背景技术
脐带是哺乳类动物连接胎儿和胎盘的管状结构，用于为胎儿提供营养物质、输送代谢产物。脐带血中含有丰富的间充质干细胞，间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称为“万用细胞”，适用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复的种子细胞。华通氏胶是脐带羊膜和血管间的凝胶状填充物，富含黏多糖、成纤维细胞和巨噬细胞，其中部分细胞具有干细胞的特质和分化潜能，因此成为用来分离间充质干细胞的理想材料。因此，对华通氏胶进行存储，可以提供重要的医学材料。传统的程序化冻存由于容易使液体产生结晶，往往会对细胞造成机械性损伤；新式的玻璃化冻存可以完全避免结晶问题，从而大大提高冻存细胞的复苏率。但是，玻璃化冻需要使用具有细胞毒性的二甲基亚砜，容易对细胞造成化学性伤害；而简单地对现有冻存液的成分进行增减或调整用量，对冻存效果的提升有限。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种人脐带华通氏胶组织冻存保护液及其制备与应用。
本发明具体技术方案如下：
本发明一方面提供了一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，包括如下重量份数的成分：
15～20份渗透性保护剂、10～15份非渗透性保护剂、4～8份蛋白组合物以及0.8～1.5份亲水性胶体；
所述渗透性保护剂包括二甲基亚砜、甘油、肌醇、甘露醇以及脯氨酸中的至少一种；
所述非渗透性保护剂包括海藻糖、聚蔗糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮以及羟乙基淀粉中的至少一种；
所述蛋白组合物包括牛血清白蛋白、植物源重组人血清白蛋白、酪蛋白、乳清蛋白、γ-球蛋白以及抗冻蛋白中的至少一种；
所述亲水性胶体包括角叉菜胶、明胶、黄芪胶、罗望子胶以及桃胶中的至少一种。
渗透性保护剂可以渗透到细胞内，平衡细胞内外未结冰的水溶液中电解质的浓度，从而避免外部的高渗环境导致细胞过度脱水、造成细胞损伤；非渗透性保护剂分子量较大、不能渗透到细胞内，一方面通过优先与细胞外溶液中的水分子结合，降低自由水的含量、使冰点降低、从而减少冰晶的形成，另一方面可以降低溶液中电解质的浓度，从而减轻溶质损伤；蛋白组合物可以为细胞提供所需的养分，从而提高细胞的存活率。亲水性胶体可以在水中形成触变胶，不需加热、只靠震荡等机械力就可使凝胶变为溶胶，方便使用；静置一段时间即可从溶胶变回凝胶状态，使渗透性保护剂中的各成分分布均匀，并可使细胞在其中均匀分散、不易出现沉淀，有效保持细胞的活力和遗传稳定性，并且易于取用和存放。
进一步地，所述渗透性保护剂包括重量份数比为1:1～2:1～3的二甲基亚砜、脯氨酸以及肌醇。
二甲基亚砜是最常用的冷冻保护剂，效果优异但毒性较大，因此本发明中采用上述组合，以便减少二甲基亚砜的用量、降低细胞毒性，同时不影响冷冻保护剂的效果。
进一步地，所述非渗透性保护剂包括重量份数比为1:1～2的海藻糖以及羟乙基淀粉。
进一步地，所述蛋白组合物包括重量份数比为1～2:1～3:2～3的乳清蛋白、抗冻蛋白以及植物源重组人血清白蛋白。
目前常规的细胞保存液主要使用胎牛血清或人血清白蛋白，细胞珍贵程度越高、对营养的要求就越高，上述成分的用量也越高；植物源重组人血清白蛋白基于植物生产制造，能够提供与血清相当的营养成分，可以替代胎牛血清，从而可降低成本；乳清蛋白含有人体细胞必需的所有种类氨基酸，同时包含多种球蛋白，可以为华通氏胶组织提供必需的养分和接近人体内的环境，以提高细胞的活力；抗冻蛋白能抑制冷冻过程中冰晶的生长、降低冰晶对细胞的伤害，从而提高细胞的存活率。
进一步地，所述亲水性胶体包括重量份数比为1:1～1.5的罗望子胶和桃胶。
罗望子胶和桃胶均为植物来源，不会对细胞产生毒害作用，并且其主要成分都为多糖，也可以为细胞提供一定的养分。采用上述组合，可以有效保持细胞的活性和遗传稳定性，从而提高复苏率和分化的成功率。
本发明另一方面提供了一种制备上述的人脐带华通氏胶组织的冻存保护液的方法，包括如下步骤：
S1：将所述渗透性保护剂和所述非渗透性保护剂添加到质量份数为50～60份的去离子水中溶解；
S2：向步骤S1得到的水溶液中加入所述蛋白组合物，振荡混匀；
S3：向步骤S2得到的水溶液中加入所述亲水性胶体，搅拌均匀使所述亲水性胶体充分溶解，在37～42℃下磁力搅拌5～10min，得到触变胶体系；
S4：将步骤S3得到的触变胶体系加入步骤S2得到的混合体系中，在室温下磁力搅拌5～10min，用细菌过滤器进行过滤，置于4℃下保存。
通过上述方法，可以制得均质、稳定的冻存保护液，最大限度地保留冻存保护液中的有效成分，以便为华通氏胶组织提供良好的保存环境。
本发明还提供了上述冻存保护液在人脐带华通氏胶组织冻存中的应用，包括如下步骤：
S1：用生理盐水对新鲜脐带进行清洗，剥取华通氏胶并剪碎成小块，贴壁培养48h，并对得到的细胞进行传代培养7d；
将细胞克隆成细胞团后再进行保存，可显著降低单个细胞受损凋亡的概率，从而显著提高细胞的存活率和复苏的成功率；
S2：将步骤S1得到的传代细胞置于DMEM培养基中，于2～5℃下加入预先经超声处理过的所述冻存保护液，低速离心并轻轻振荡混匀；
由于团块结构会显著影响单个细胞与冻存保护液的接触，因此首先通过超声处理、使冻存保护液内部分散成小液滴，从而提高冷冻保护液在细胞团块内的渗透性；
S3：将步骤S2得到的细胞混合液置于液氮中，降温至-196℃下保存。
进一步地，所述步骤S2包括如下步骤：
S2.1：将所述冻存保护液在20～25℃、40Hz条件下超声振荡3～5min；
S2.2：将步骤S1得到的传代细胞置于8～10％的DMEM培养基中浸泡，超声结束后立即将所述冻存保护液加入所述传代细胞中；
由于超声处理只是暂时改变了液体的物理形态，因此在超声结束后应立即将冻存保护液加入细胞中，以保证冻存保护液的渗透性；
S2.3：将上述混合体系在1000～1500rpm/min条件下离心5min，离心结束后轻轻振荡混匀1～3分钟，得到细胞混合液。
进一步地，每g所述传代细胞中加入0.5mL所述DMEM培养基以及1.5mL所述冻存保护液。
进一步地，步骤S2中，所述冻存保护液在超声处理之前预先在37℃水浴中放置5～15min。
由于凝胶在较高温度下比在较低温度下更易转变为溶胶，因此在将低温保存的冻存保护液取出后，先通过温水浴进行升温，再进行超声振荡时即可降低处理的时间和超声功率，同时通过超声振荡使冻存保护液分子运动剧烈、从而进一步升高温度，以便为待保存的细胞提供适宜的条件。
本发明的有益效果如下：本发明提供了一种人脐带华通氏胶组织冻存保护液及其制备与应用，通过渗透性保护剂和非渗透性保护剂分别平衡细胞内外的电解质浓度，同时降低自由水的含量、减少冰晶形成，一方面避免外部高渗环境导致细胞过度脱水、造成细胞损伤，另一方面可降低冰晶对细胞的物理性损伤；添加蛋白组合物可以为细胞提供所需的养分，从而提高细胞的存活率；亲水性胶体可以在水中形成触变胶，使渗透性保护剂中的各成分分布均匀，并可使细胞在其中均匀分散、不易出现沉淀，并且易于取用和存放。通过上述成分组合使用，可以有效提高华通氏胶组织的活性和抗逆性，从而提高细胞冻存时和复苏后的存活率、减少冻存造成的细胞活性损失。
具体实施方式
主要试剂及培养基的配制
A.DMEM培养基：具体成分如下：
| 序号 | 化合物名称 | 含量(mg/L) | 序号 | 化合物名称 | 含量(mg/L) |
| 1 | 无水氯化钙 | 265.00 | 18 | L-丝氨酸 | 42.00 |
| 2 | 硝酸铁 | 0.10 | 19 | L-苏氨酸 | 95.00 |
| 3 | 氯化钾 | 400.00 | 20 | L-色氨酸 | 16.00 |
| 4 | 无水硫酸镁 | 97.67 | 21 | L-酪氨酸 | 72.00 |
| 5 | 氯化钠 | 6400.00 | 22 | L-缬氨酸 | 94.00 |
| 6 | 无水磷酸二氢钠 | 109.00 | 23 | D-泛酸钙 | 4.00 |
| 7 | 丁二酸 | 75.00 | 24 | 酒石酸胆碱 | 7.20 |
| 8 | 丁二酸钠 | 100.00 | 25 | 叶酸 | 4.00 |
| 9 | L-盐酸精氨酸 | 84.00 | 26 | 肌醇 | 7.20 |
| 10 | L-盐酸胱氨酸 | 63.00 | 27 | 烟酰胺 | 4.00 |
| 11 | 甘氨酸 | 30.00 | 28 | 核黄素 | 0.40 |
| 12 | L-盐酸组氨酸 | 42.00 | 29 | 盐酸硫胺 | 4.00 |
| 13 | L-异亮氨酸 | 105.00 | 30 | 盐酸吡哆辛 | 4.00 |
| 14 | L-亮氨酸 | 105.00 | 31 | 葡萄糖 | 1000.00 |
| 15 | L-盐酸赖氨酸 | 146.00 | 32 | 丙酮酸钠 | 110.00 |
| 16 | L-甲硫氨酸 | 30.00 | 33 | 酚红 | 9.30.00 |
| 17 | L-苯丙氨酸 | 66.00 |
B.生理盐水：
称取0.9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升。
实施例1
一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，包括如下重量份数的成分：
15份渗透性保护剂、10份非渗透性保护剂、8份蛋白组合物以及1份亲水性胶体；
所述渗透性保护剂包括10份二甲基亚砜以及5份甘油；
所述非渗透性保护剂为聚乙二醇；
所述蛋白组合物包括5份牛血清白蛋白以及3份酪蛋白；
所述亲水性胶体为明胶。
实施例2
一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，包括如下重量份数的成分：
20份渗透性保护剂、15份非渗透性保护剂、4份蛋白组合物以及0.8份亲水性胶体；
所述渗透性保护剂包括12份脯氨酸以及8份甘露醇；
所述非渗透性保护剂包括10份聚蔗糖以及5份聚乙烯吡咯烷酮；
所述蛋白组合物包括3份酪蛋白以及1份γ-球蛋白；
所述亲水性胶体包括0.5份明胶以及0.3份黄芪胶。
实施例3
一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，包括如下重量份数的成分：
15份渗透性保护剂、15份非渗透性保护剂、4份蛋白组合物以及0.8份亲水性胶体；
所述渗透性保护剂包括3份二甲基亚砜、3份脯氨酸以及9份肌醇；
所述非渗透性保护剂包括5份海藻糖以及10份羟乙基淀粉；
所述蛋白组合物包括1份乳清蛋白、1份抗冻蛋白以及2份植物源重组人血清白蛋白；
所述亲水性胶体包括0.4份罗望子胶以及0.4份桃胶。
实施例4
一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，包括如下重量份数的成分：
20份渗透性保护剂、10份非渗透性保护剂、8份蛋白组合物以及1.5份亲水性胶体；
所述渗透性保护剂包括5份二甲基亚砜、10份脯氨酸以及5份肌醇；
所述非渗透性保护剂包括5份海藻糖以及5份羟乙基淀粉；
所述蛋白组合物包括2份乳清蛋白、3份抗冻蛋白以及3份植物源重组人血清白蛋白；
所述亲水性胶体包括0.6份罗望子胶以及0.9份桃胶。
实施例5
一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，包括实施例1所述的成分，其制备方法包括如下步骤：
S1：将渗透性保护剂和非渗透性保护剂添加到50份的去离子水中溶解；
S2：向步骤S1得到的水溶液中加入蛋白组合物，振荡混匀；
S3：向步骤S2得到的水溶液中加入所述亲水性胶体，搅拌均匀使所述亲水性胶体充分溶解，在37℃下磁力搅拌10min，得到触变胶体系；
S4：将步骤S3制得的触变胶体系用细菌过滤器进行过滤，置于4℃下保存。
实施例6
一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，包括实施例2所述的成分，其制备方法包括如下步骤：
S1：将渗透性保护剂和非渗透性保护剂添加到60份的去离子水中溶解；
S2：向步骤S1得到的水溶液中加入蛋白组合物，振荡混匀；
S3：向步骤S2得到的水溶液中加入所述亲水性胶体，搅拌均匀使所述亲水性胶体充分溶解，在42℃下磁力搅拌5min，得到触变胶体系；
S4：将步骤S3制得的触变胶体系用细菌过滤器进行过滤，置于4℃下保存。
实施例7
实施例3所述的冻存保护液在人脐带华通氏胶组织冻存中的应用，包括如下步骤：
S1：用生理盐水对新鲜脐带进行清洗，剥取华通氏胶并剪碎成小块，贴壁培养48h，并对得到的细胞进行传代培养7d；
S2：将步骤S1得到的传代细胞置于DMEM培养基中，于2～5℃下加入预先经超声处理过的所述冻存保护液，低速离心并轻轻振荡混匀；
S3：将步骤S2得到的细胞混合液置于液氮中，降温至-196℃下保存。
实施例8
实施例4所述的冻存保护液在人脐带华通氏胶组织冻存中的应用，包括实施例7所述的步骤，其中步骤S2包括如下步骤：
S2.1：将所述冻存保护液在20℃、40Hz条件下超声振荡10min；
S2.2：将步骤S1得到的传代细胞置于8％的DMEM培养基中浸泡，每g传代细胞中加入0.5mL培养基，超声结束后立即向每g传代细胞中加入1.5mL冻存保护液；
S2.3：将上述混合体系在1000rpm/min条件下离心5min，离心结束后轻轻振荡混匀1分钟，得到细胞混合液。
实施例9
实施例4所述的冻存保护液在人脐带华通氏胶组织冻存中的应用，包括实施例7所述的步骤，其中步骤S2包括如下步骤：
S2.1：将所述冻存保护液在37℃水浴中放置5～15min，取出后在25℃、40Hz条件下超声振荡5min；
S2.2：将步骤S1得到的传代细胞置于10％的DMEM培养基中浸泡，每g传代细胞中加入0.5mL培养基，超声结束后立即向每g传代细胞中加入1.5mL冻存保护液；
S2.3：将上述混合体系在1500rpm/min条件下离心5min，离心结束后轻轻振荡混匀3分钟，得到细胞混合液。
对照例1
一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，包括如下重量份数的成分：
15份渗透性保护剂、15份非渗透性保护剂以及4份蛋白组合物；
所述渗透性保护剂包括3份二甲基亚砜、3份脯氨酸以及9份肌醇；
所述非渗透性保护剂包括5份海藻糖以及10份羟乙基淀粉；
所述蛋白组合物包括1份乳清蛋白、1份抗冻蛋白以及2份植物源重组人血清白蛋白。
对照例2
一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，包括如下重量份数的成分：
20份渗透性保护剂、10份非渗透性保护剂、8份蛋白组合物以及0.5份亲水性胶体；
所述渗透性保护剂包括5份二甲基亚砜、10份甜菜碱以及5份肌醇；
所述非渗透性保护剂包括5份海藻糖以及5份羟乙基淀粉；
所述蛋白组合物包括2份乳清蛋白、3份抗冻蛋白以及3份植物源重组人血清白蛋白；
所述亲水性胶体包括0.2份明胶以及0.3份黄芪胶。
对照例3
一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，包括如下重量份数的成分：
20份渗透性保护剂、10份非渗透性保护剂、8份蛋白组合物以及2份亲水性胶体；
所述渗透性保护剂包括14份甘油以及6份棉子糖；
所述非渗透性保护剂包括5份海藻糖以及5份羟乙基淀粉；
所述蛋白组合物包括2份乳清蛋白、3份抗冻蛋白以及3份植物源重组人血清白蛋白；
所述亲水性胶体包括1.2份罗望子胶以及0.8份桃胶
实验例1
复苏率实验
分别以实施例1、3、5提供的保护液作为实验组1～3，分别以常规冻存保护液、玻璃化冻存保护液、对照例1～3提供的保护液分别作为对照组1～5，对同一来源的华通氏胶组织分别进行冻存，复苏后按3*105的接种量分别接种到5mL常规传代培养基中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养5d，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据增值率＝培养后细胞总数/(3*105)计算增值率，即为复苏率。结果如表1所示。
表1各组细胞复苏情况对比
由表1可知，实验组各组的复苏率均达到90％以上，显著高于对照组各组，并且以实验组3的复苏率最高。表明本发明提供的冻存保护液可以有效降低传统方法对华通氏胶组织造成的物理或化学的伤害，并可以有效保存组织细胞的生理活性，从而有利于后续使用；并且根据实验组和对照例4、5可知，在冻存保护液中添加罗望子胶和桃胶得到的触变胶体系，对华通氏胶组织的保存效果显著好于添加其他亲水性胶体时的效果。
实验例2
细胞表面免疫表型遗传实验
分别以实施例2、4、6提供的保护液作为实验组1～3，分别以常规冻存保护液、玻璃化冻存保护液、对照例1～3提供的保护液分别作为对照组1～5，对同一来源的华通氏胶组织分别进行冻存，复苏后按3*105的接种量分别接种到5mL常规传代培养基中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养48h，并对获得的细胞的表面抗原进行流式检测，同时以母细胞作为阳性对照。结果如表2所示。
表2各组细胞表面抗原检测结果
实验结果表明，实验组各组中CD14、CD31、CD34、CD45、CD54、CD80、CD86以及HLA-DR等不表达造血细胞表面标志均表现为阴性，而CD29和CD44、CD73、CD105、CD166、HLA-ABC和UEA-1等在间充质干细胞表达的表面抗原均表现为阳性，与对照组相同；而对照组各组均有部分抗原的表达情况与阳性对照不符。由此可知经过原代培养的细胞与原间充质干细胞细胞具有相同的表面抗原，说明采用本发明提供的冻存保护液对间充质干细胞进行保存，可以很好地再现母细胞的遗传表型；并且添加罗望子胶和桃胶得到的触变胶体系可以有效地使华通氏胶细胞保持良好的遗传稳定性，不会对原间充质干细胞的活性和遗传稳定性造成影响。
实验例3
成骨分化性能实验
分别以实施例7～9提供的方法为实验组1～3，以常规程序化冻存法以及常规玻璃化冻存法分别作为对照组1～2，对同一来源的华通氏胶组织分别进行冻存，复苏后分别接种到常规传代培养基中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养，待复苏后细胞融合度达到80～90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，用成骨诱导培养基继续培养2～4周，每2～3天换液，培养结束后用碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞形成，Von Kossa染色鉴定骨结节形成。
培养1周后，细胞形态发生明显的改变，由纺锤形变为多角形，细胞周边出现凸起，并可向周围延伸。培养2周以上后，细胞基质中出现钙化斑，并且开始形成多层小结结构，碱性磷酸酶染色呈强阳性反应，并且阳性程度由低到高排序情况为对照组1＜对照组2＜实验组1＜实验组2＜实验组3；培养4周后，Von Kossa染色可见明显黑色钙化结节，并且钙化结节面积由小到大排序为对照组1＜对照组2＜实验组1＜实验组2＜实验组3。由此表明，采用本发明提供的方法对华通氏胶组织进行冻存，比常规冻存方法更能保持华通氏胶的成骨分化潜能。
实验例4
成脂肪分化性能实验
分别以实施例7～9提供的方法为实验组1～3，以常规程序化冻存法以及常规玻璃化冻存法分别作为对照组1～2，对同一来源的华通氏胶组织分别进行冻存，复苏后分别接种到常规传代培养基中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养，待复苏后细胞融合度达到80～90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，用成脂肪诱导培养基继续培养2～4周，每2～3天换液，培养结束后用油红染色鉴定脂肪滴。
培养3天后，细胞形态由纺锤形逐渐收缩变短，大部分细胞变成多边形；培养1周后，镜下可见细胞内有微小脂肪滴出现；培养2周后，可见细胞中出现融合成团的脂肪滴。油红染色可见细胞内产生的脂肪被特异性染成红色。并且染色程度由浅到深排序为对照组1＜对照组2＜实验组1＜实验组2＜实验组3。由此表明，采用本发明提供的方法对华通氏胶组织进行冻存，比常规冻存方法更能保持华通氏胶的成脂肪分化潜能。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，其特征在于，包括如下重量份数的成分：
15～20份渗透性保护剂、10～15份非渗透性保护剂、4～8份蛋白组合物以及0.8～1.5份亲水性胶体；
所述渗透性保护剂包括二甲基亚砜、甘油、肌醇、甘露醇以及脯氨酸中的至少一种；
所述非渗透性保护剂包括海藻糖、聚蔗糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮以及羟乙基淀粉中的至少一种；
所述蛋白组合物包括牛血清白蛋白、植物源重组人血清白蛋白、酪蛋白、乳清蛋白、γ-球蛋白以及抗冻蛋白中的至少一种；
所述亲水性胶体包括角叉菜胶、明胶、黄芪胶、罗望子胶以及桃胶中的至少一种。
2.如权利要求1所述的人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，其特征在于，所述渗透性保护剂包括重量份数比为1:1～2:1～3的二甲基亚砜、脯氨酸以及肌醇。
3.如权利要求2所述的人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，其特征在于，所述非渗透性保护剂包括重量份数比为1:1～2的海藻糖以及羟乙基淀粉。
4.如权利要求3所述的人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，其特征在于，所述蛋白组合物包括重量份数比为1～2:1～3:2～3的乳清蛋白、抗冻蛋白以及植物源重组人血清白蛋白。
5.如权利要求4所述的人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，其特征在于，所述亲水性胶体包括重量份数比为1:1～1.5的罗望子胶和桃胶。
6.一种制备如权利要求1～5中任一项所述的人脐带华通氏胶组织的冻存保护液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将所述渗透性保护剂和所述非渗透性保护剂添加到质量份数为50～60份的去离子水中溶解；
S2：向步骤S1得到的水溶液中加入所述蛋白组合物，振荡混匀；
S3：向步骤S2得到的水溶液中加入所述亲水性胶体，搅拌均匀使所述亲水性胶体充分溶解，在37～42℃下磁力搅拌5～10min，得到触变胶体系；
S4：将步骤S3得到的触变胶体系用细菌过滤器进行过滤，置于4℃下保存。
7.权利要求1～5中任一项所述的冻存保护液在人脐带华通氏胶组织冻存中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
S1：用生理盐水对新鲜脐带进行清洗，剥取华通氏胶并剪碎成小块，贴壁培养48h，并对得到的细胞进行传代培养7d；
S2：将步骤S1得到的传代细胞置于DMEM培养基中，于2～5℃下加入预先经超声处理过的所述冻存保护液，低速离心并轻轻振荡混匀；
S3：将步骤S2得到的细胞混合液置于液氮中，降温至-196℃下保存。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤S2包括如下步骤：
S2.1：将所述冻存保护液在20～25℃、40Hz条件下超声振荡3～5min；
S2.2：将步骤S1得到的传代细胞置于8～10％的DMEM培养基中浸泡，超声结束后立即将所述冻存保护液加入所述传代细胞中；
S2.3：将上述混合体系在1000～1500rpm/min条件下离心5min，离心结束后轻轻振荡混匀1～3分钟，得到细胞混合液。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，每g所述传代细胞中加入0.5mL所述DMEM培养基以及1.5mL所述冻存保护液。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤S2中，所述冻存保护液在超声处理之前预先在37℃水浴中放置5～15min。
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