WO2018235899A1 - 筋サテライト細胞の培養方法 - Google Patents
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
Definitions
- the present invention relates to a method for culturing muscle stem cells. More specifically, the present invention relates to a method for culturing muscle stem cells while maintaining their undifferentiated state. The present invention also relates to a method for producing muscle stem cells usable for cell transplantation and the like, and a composition used therefor.
- Skeletal muscle is not only necessary for exercise and posture maintenance, but also important for metabolic regulation as the largest energy-using organ.
- skeletal muscle is characterized by high regenerative ability. Skeletal muscle is regenerated by activating skeletal muscle stem cells (muscle satellite cells) and differentiating and fusing them (Non-patent Document 1).
- Muscular dystrophy is a hereditary disease in which muscle atrophy progresses with repeated necrosis and regeneration of muscle fibers, and an effective treatment has not been established yet.
- an exon skipping therapy using a nucleic acid drug there is, for example, an exon skipping therapy using a nucleic acid drug (Non-patent Document 2).
- Non-patent Document 2 the application of cell transplantation therapy is also expected, but it is known that the culture of muscle stem cells in vitro loses the undifferentiated nature as stem cells and stops the growth (non Patent Document 3).
- An object of the present invention is to provide a method for culturing muscle stem cells while maintaining their undifferentiated properties.
- another object of the present invention is to provide a composition used in a method of culturing while maintaining the undifferentiated property of muscle stem cells.
- the present inventors have found that by culturing cells in a medium containing retinoid and laminin, it is possible to grow cells while maintaining the undifferentiated nature of muscle stem cells. Since this technology is simple and safe, and can maintain the undifferentiated nature of muscle stem cells with high efficiency, it is expected to be applied to cell transplantation treatment for muscle diseases including muscular dystrophy, compound screening system, and regenerative medicine. .
- the present invention is based on such findings and includes the following aspects: [Aspect 1] A method for culturing muscle satellite cells, comprising culturing cells using a medium containing (i) retinoid and (ii) laminin.
- the retinoid is selected from the group consisting of atRA, AM80, AM580, Am555S, Es80, Es580, Re80, Fv80, Ch55, Az80, fenretinide, CD437, BMS453, Tazarotene, docosahexaenoic acid, A1120, Ch55, EC23, A740003, and mixtures thereof
- the medium is selected from the group consisting of G-CSF, bFGF, IL-1 ⁇ , IL-13, IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , GSK3 inhibitor, sal003, p38 inhibitor, (R) -PFI-2 and mixtures thereof 7.
- the muscle satellite cells are human cells.
- a method of culturing human muscle satellite cells comprising culturing cells using a liquid medium containing (i) retinoid and (ii) laminin, The retinoid is atRA or AM80 and the concentration of retinoid is at least 10 -8 M, A culture method, wherein the laminin is human laminin 511 E8 fragment, the laminin is contained in a liquid medium, the concentration of laminin is at least 1.5 ⁇ g / ml, and the undifferentiated human muscle satellite cells are maintained.
- a composition for suppressing muscle differentiation of muscle satellite cells which comprises (i) retinoid and (ii) laminin.
- the retinoid is selected from the group consisting of atRA, AM80, AM580, Am555S, Es80, Es580, Re80, Fv80, Ch55, Az80, fenretinide, CD437, BMS453, Tazarotene, docosahexaenoic acid, A1120, Ch55, EC23, A740003, and mixtures thereof
- Aspect 13 Aspect 13
- the retinoid is selected from the group consisting of atRA, AM80, AM580, Am555S, Es80, Es580, Re80, Fv80, Ch55, Az80, fenretinide, CD437, BMS453, Tazarotene, docosahexaenoic acid, A1120, Ch55, EC23, A740003, and mixtures thereof
- 20 The cell culture medium according to aspect 18 or 19, wherein the concentration of retinoid is at least 10 -8 M.
- Aspect 21 21.
- laminin is selected from the group consisting of laminin 511, laminin 521, laminin 522, laminin 523, and mixtures thereof.
- the medium is selected from the group consisting of G-CSF, bFGF, IL-1 ⁇ , IL-13, IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , GSK3 inhibitor, sal003, p38 inhibitor, (R) -PFI-2 and mixtures thereof 23.
- Aspect 24 24.
- Cell culture medium supplements comprising (i) retinoid and (ii) laminin.
- the retinoid is selected from the group consisting of atRA, AM80, AM580, Am555S, Es80, Es580, Re80, Fv80, Ch55, Az80, fenretinide, CD437, BMS453, Tazarotene, docosahexaenoic acid, A1120, Ch55, EC23, A740003, and mixtures thereof
- Aspect 27 The cell culture medium supplement according to aspect 27.
- Aspect 29] 30 The cell culture medium supplement according to aspect 27 or 28, wherein the concentration of retinoid when added to the cell culture medium is at least 10-8 M.
- the concentration of retinoid when added to the cell culture medium is at least 10-8 M.
- Aspect 31 41. The cell culture medium supplement of any of aspects 27-30, wherein the concentration of laminin when added to the cell culture medium is at least 1.5 ⁇ g / ml.
- Aspect 34 34.
- Aspect 35 35.
- a method for producing cells for use in cell transplantation comprising the step of culturing muscle satellite cells using a medium containing (i) retinoid and (ii) laminin.
- the retinoid is selected from the group consisting of atRA, AM80, AM580, Am555S, Es80, Es580, Re80, Fv80, Ch55, Az80, fenretinide, CD437, BMS453, Tazarotene, docosahexaenoic acid, A1120, Ch55, EC23, A740003, and mixtures thereof
- Aspect 36 the production method according to aspect 36.
- Aspect 38 Aspect 34. A method according to aspect 36 or 37, wherein the concentration of retinoid is at least 10 ⁇ 8 M.
- laminin is selected from the group consisting of laminin 511, laminin 521, laminin 522, laminin 523 and mixtures thereof.
- laminin is selected from the group consisting of laminin 511, laminin 521, laminin 522, laminin 523 and mixtures thereof.
- the medium is selected from the group consisting of G-CSF, bFGF, IL-1 ⁇ , IL-13, IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , GSK3 inhibitor, sal003, p38 inhibitor, (R) -PFI-2 and mixtures thereof 41.
- a method according to any of aspects 36 to 40 further comprising at least one factor.
- the method according to any of the aspects 36-41, wherein the muscle satellite cells are human cells.
- the method according to any one of aspects 36 to 42, wherein the muscle satellite cells are cells derived from iPS cells.
- the muscle satellite cells are cells derived from muscular dystrophy patients.
- the production method according to any one of aspects 36 to 44, wherein the muscle satellite cells are genetically modified cells.
- the method according to any one of aspects 36 to 45, wherein the cell is a cell for use in the treatment of diabetes.
- a method for treating a disease or injury in a patient comprising the steps of culturing muscle satellite cells using a medium comprising (i) retinoid and (ii) laminin, and culturing the muscle satellite cells or cells derived therefrom into the patient A method comprising the step of transplanting.
- the retinoid is selected from the group consisting of atRA, AM80, AM580, Am555S, Es80, Es580, Re80, Fv80, Ch55, Az80, fenretinide, CD437, BMS453, Tazarotene, docosahexaenoic acid, A1120, Ch55, EC23, A740003, and mixtures thereof 46.
- Aspect 51 A method of treatment according to aspect 47 or 48, wherein the concentration of retinoid is at least 10 ⁇ 8 M.
- Aspect 50] 50 A method of treatment according to any of aspects 47 to 49, wherein laminin is selected from the group consisting of laminin 511, laminin 521, laminin 522, laminin 523 and mixtures thereof.
- Aspect 41 A method of treatment according to any of aspects 47 to 50, wherein the concentration of laminin is at least 1.5 ⁇ g / ml.
- the medium is selected from the group consisting of G-CSF, bFGF, IL-1 ⁇ , IL-13, IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , GSK3 inhibitor, sal003, p38 inhibitor, (R) -PFI-2 and mixtures thereof 52.
- Aspect 53 Aspect 47.
- Aspect 54 Diseases include muscular dystrophy, congenital myopathy, distal myopathy, myotonic disease, inflammatory myopathy, periodic quadriplegia, metabolic myopathy, myasthenia gravis, congenital myasthenic syndrome, mitochondrial disease, sarcopenia and diabetes 54.
- the method of treatment according to any of aspects 47-54, wherein the muscle satellite cells are cells derived from iPS cells.
- the muscle satellite cells are genetically modified cells.
- a cellular composition comprising at least 5 ⁇ 10 5 muscle satellite cells.
- Aspect 58 60.
- the cell composition of aspect 57 further comprising (i) a retinoid and (ii) laminin.
- the retinoid is selected from the group consisting of atRA, AM80, AM580, Am555S, Es80, Es580, Re80, Fv80, Ch55, Az80, fenretinide, CD437, BMS453, Tazarotene, docosahexaenoic acid, A1120, Ch55, EC23, A740003, and mixtures thereof 60.
- [Aspect 60] 60 60.
- Aspect 61 71 The cell composition of any of aspects 57-60, wherein the laminin is selected from the group consisting of laminin 511, laminin 521, laminin 522, laminin 523, and mixtures thereof.
- Aspect 62 72 A cell composition according to any of aspects 57-61, wherein the concentration of laminin is at least 1.5 ⁇ g / ml.
- Aspect 63] 73 The cell composition of any of aspects 57-62, wherein the purity of muscle satellite cells is at least 85%.
- Aspect 64 64 The cell composition of any of aspects 57-63, wherein the muscle satellite cells are human cells.
- Aspect 65 65 The cell composition of any of aspects 57-60, wherein the laminin is selected from the group consisting of laminin 511, laminin 521, laminin 522, laminin 523, and mixtures thereof.
- Aspect 62 72 A cell composition according to any of aspects 57-61, wherein the concentration of laminin is at
- Aspect 69 Aspect 69.
- a method of screening for a substance that affects differentiation, proliferation or survival of muscle satellite cells or cells derived therefrom Culturing muscle satellite cells in the presence of (i) retinoid and (ii) laminin, Contacting a test substance with the cultured muscle satellite cells or cells derived therefrom, Evaluating whether a test substance affects differentiation, proliferation or survival of muscle satellite cells or cells derived therefrom.
- Aspect 71 The retinoid is selected from the group consisting of atRA, AM80, AM580, Am555S, Es80, Es580, Re80, Fv80, Ch55, Az80, fenretinide, CD437, BMS453, Tazarotene, docosahexaenoic acid, A1120, Ch55, EC23, A740003, and mixtures thereof
- Aspect 70 the screening method according to aspect 70.
- Aspect 72 Aspect 69.
- Aspect 73 71.
- Aspect 74 74. The screening method of any of embodiments 70-73, wherein the concentration of laminin is at least 1.5 ⁇ g / ml.
- Aspect 75 70. The screening method according to any one of aspects 70 to 74, wherein the muscle satellite cells are human cells.
- the muscle satellite cells are cells derived from iPS cells.
- the screening method according to any one of aspects 70 to 76, wherein the muscle satellite cells are cells derived from muscular dystrophy patients.
- Aspect 78 The screening method according to any one of aspects 70 to 77, wherein the muscle satellite cells are genetically modified cells.
- 10-7 M of all-trans-Retinoic Acid (atRA) is added to the growth medium, and after 17 passages, the skeletal muscle stem cell culture system is cultured for 3 days in differentiation medium, and the differentiation ability is evaluated with anti-MyoD antibody and anti-myosin It is a microscope image analyzed by heavy chain antibody.
- 10 -8 to 10 -6 M retinoid compound is added to differentiation medium and cultured for 96 hours.
- Myocytes containing control (Non-treated) and RXR agonist form myotubes, but addition of RAR agonist suppresses the formation of myotubes.
- Skeletal muscle stem cells were pre-coated with Matrigel, culture dishes (Matrigel-Precoated), culture dishes pre-coated with iMatrix-511 (iMatrix 511-Precoated) and iMatrix-511 at passage 0 were used.
- Myog a graph of the analysis of the expression of MCK. It is a graph showing Pax7 positive cells and Myog positive cells in skeletal muscle stem cells cultured on Matrigel or in a medium containing iMatrix 511 (atRA treated +/-) for 48 hours.
- FIG. 11 is a graph showing the results of evaluation of skeletal muscle stem cell proliferation by WST-8 assay after culturing for 3 days by adding atRA or Am80 to the growth medium in a human skeletal muscle stem cell culture system.
- the ordinate is the absorbance at 450 nm.
- the control (cont) is one in which DMSO is added instead of atRA or Am80.
- the graph shows that addition of 10 -6 M Am80 suppresses the proliferation of human skeletal muscle stem cells.
- FIG. 12 is a microscopic image showing the results of analysis of the action of retinoid compounds on the differentiation ability in inducing differentiation of human skeletal muscle stem cells. Immunostaining with anti-myosin heavy chain antibody was performed to visualize the myotubes in which myocytes were fused. Both atRA and Am80 inhibit myotube formation at concentrations of 10 -7 M and 10 -6 M.
- FIG. 13 is a graph showing the results of analysis of the effect of atRA on the expression of a muscle differentiation regulator. The gene expression of MYOD1 and MYOG was relatively quantitatively analyzed by real-time PCR. The vertical axis is relative amount to the control (cont).
- FIG. 14 is a graph showing the results of relative quantitative analysis of gene expression of MYOD1 and MYOG by real-time PCR method after culturing for 3 days by adding atRA and / or iMatrix-511 to the growth medium of human skeletal muscle stem cell culture system is there. NDUFA13 was used as an internal control gene. The vertical axis is relative amount to the control (cont). The graph shows that the gene expression of MYOD1 and MYOG was most suppressed when 10 -6 M of atRA and 0.1 ⁇ g / cm 2 of iMatrix-511 were added.
- FIG. 14 is a graph showing the results of relative quantitative analysis of gene expression of MYOD1 and MYOG by real-time PCR method after culturing for 3 days by adding atRA and / or iMatrix-511 to the growth medium of human skeletal muscle stem cell culture system is there. NDUFA13 was used as an internal control gene. The vertical axis is relative amount to the control (cont). The
- FIG. 15 is a graph showing the results of culture of human skeletal muscle stem cells for 3 days in the presence of atRA and iMatrix-511, and quantification of cell proliferation by absorbance. Vertical axis is relative OD to control. The graph shows that the addition of atRA and iMatrix-511 promoted the proliferation of human skeletal muscle stem cells.
- FIG. 16a is a micrograph showing the results of culturing human skeletal muscle stem cells in the presence of atRA and iMatrix-511, and transplanting the cultured cells ( 4 ⁇ 10 5 cells) into the tibialis anterior muscle of NOG-mdx mice. It is.
- FIG. 16b is a graph showing the transplantation efficiency of human skeletal muscle stem cells cultured by adding atRA and iMatrix-511.
- the vertical axis is the ratio of human spectrin-positive muscle fibers to total muscle fibers in the cross-section of the tibialis anterior muscle.
- the horizontal axis is control (cont), atRA (RA), atRA + iMatrix-511 (RA + iM).
- Human skeletal muscle stem cells cultured with the addition of 10 -6 M atRA and 0.1 ⁇ g / cm 2 iMatrix-511 exhibited the highest transplantation efficiency, and the value exceeded 10% at which the therapeutic effect of cell transplantation can be expected .
- Muscle stem cells Tissue stem cells of skeletal muscle are small pluripotent cells called muscle stem cells or muscle satellite cells, and exist between the basement membrane and the muscle sheath. Muscle satellite cells usually stay in the stationary phase of the cell cycle and maintain an undifferentiated state, but when skeletal muscle is damaged in any way, they are activated to divide, differentiate into myoblasts, and form myotubes To regenerate muscle fibers.
- Stationary undifferentiated muscle satellite cells can be identified using Pax7 expression as an index. As myoblasts differentiate by activation of muscle satellite cells, the expression of Pax 7 decreases and the expression of MyoD increases. Furthermore, as myoblasts form myotubes, myogenin expression is elevated. In addition, myotubes in which myocytes are fused can be visualized by immunostaining with anti-myosin heavy chain antibody.
- undifferentiated muscle satellite cells can be identified because undifferentiated muscle satellite cells exhibit a round shape, whereas differentiated cells exhibit a flat and huge shape.
- the muscle satellite cells used in the present invention are preferably animal muscle satellite cells, more preferably mammalian muscle satellite cells, and mouse, rat, pig, rabbit, monkey or human muscle satellite cells More preferably, it is a human or mouse muscle satellite cell, more preferably a human muscle satellite cell.
- Muscle satellite cells used in the present invention can be isolated from animal tissues.
- DMEM medium containing 0.14% protease Sigma-Aldrich
- Enzyme The method of isolation with a flow cytometer (BD, Aria II) after digestion (Exp Cell Res. 10, 245-255, 2004; Nat Med. 20, 255-264, 2014), etc. may be mentioned, but the limitation is not limited I will not.
- Methods for separating muscle satellite cells from tissues are known to those skilled in the art, and may be referred to, for example, Fukada et al. Exp Cell Res 2004; 296: 245-255.
- the muscle satellite cells used in the present invention may be produced from animal ES cells, iPS cells, and other stem cells. Although cells derived from iPS cells and the like may be "satellite cell-like" muscle stem cells, in the present application, these are also considered to be included in muscle satellite cells.
- Retinoid refers to vitamin A or a group of compounds chemically related to it.
- Vitamin A is a generic term for retinol, retinal, retinoic acid (these are called vitamin A1) and their 3-dehydro forms (called vitamin A2) and their derivatives, and they are classified as fat-soluble vitamins in vitamins Ru.
- Retinoids are used as medicaments to regulate the proliferation of epithelial cells. Retinoids have many important functions throughout the body, including roles in vision, regulation of cell proliferation and differentiation, proliferation of bone tissue, immune function, and activation of tumor suppressor genes.
- Retinoids that can be used in the present invention include, but are not limited to, tretinoin, tamibarotene and the like.
- Tretinoin also referred to as all-trans retinoic acid (atRA)
- Tamivarotene is a synthetic retinoid and is an oral agent used as a chemotherapeutic agent for tretinoin (ATRA) resistant acute promyelocytic leukemia (APL).
- ATRA chemotherapeutic agent for tretinoin
- APL acute promyelocytic leukemia
- Retinoids that can be used in the present invention include RAR agonists, and also include other RAR agonists such as AM580, Am555S, Es80, Es580, Re80, Fv80, Ch55, Az80.
- Other retinoids that can be used in the present invention include fenretinide, CD 437, BMS 453, Tazarotene, docosahexaenoic acid, A1120, Ch55, EC23, A740003, and the like.
- Laminin is a high molecular weight protein (approximately 400-900 kDa) of the extracellular matrix and is a major component of basement membrane. Laminin is an important component of basement membrane and affects cell differentiation, migration and adhesion. Laminin is a heterotrimeric protein containing ⁇ , ⁇ and ⁇ chains, and it is specified 5 kinds of ⁇ chains, 3 kinds of ⁇ chains and 3 kinds of ⁇ chains which can form 15 isoforms. It is done.
- Laminin molecules are named according to the composition of each chain.
- laminin composed of ⁇ 5 chain, ⁇ 1 chain and ⁇ 1 chain is described as “laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1” or “laminin 511”.
- the other 14 isoforms are laminin 111, laminin 211, laminin 121, laminin 221, laminin 332, laminin 311, laminin 321, laminin 421, laminin 521, laminin 213, laminin 423, laminin 522, laminin 523 It is described as Laminin may be full length or a part thereof.
- each of ⁇ 5 chain, ⁇ 1 chain and ⁇ 1 chain may be full length independently of each other It may be a part.
- Laminin is preferably an E8 fragment because it is easy to produce and purify a recombinant protein, and from the viewpoint of practical use, it is more preferably an E8 fragment of human laminin.
- laminin E8 the E8 fragment of laminin
- laminin 511 the E8 fragment of laminin 511
- laminin 511 E8 other laminin isozymes.
- laminin E8 the isoform of laminin is not limited, It may be an E8 fragment of laminin of any isoform.
- An E8 fragment of human laminin 511 protein is used as a substrate for culturing stem cells including ES cells and iPS cells by coating the surface of a culture vessel such as a slide glass or petri dish.
- the present inventors have unexpectedly found that, without using laminin as a coating on the bottom of the culture vessel, by including it with a retinoid in the liquid culture medium, the undifferentiated state of the muscle stem cells is efficiently maintained. It has been found that it is possible to grow cells.
- the combination of such retinoid and laminin can provide an unexpected synergistic effect.
- the combined use of the addition of laminin to the liquid medium and the coating on the surface of the culture vessel is not excluded.
- mouse laminin 111 the E8 fragment of laminin has been identified as a fragment having strong cell adhesion activity ( EMBO J., 3: 1463-1468, 1984., Goodman SL., Edgar D., Timpl R., Thoe nen H.
- the heparin-binding domain of laminin is responsible for its effects on neural outgrowth and neuronal survival. Deutzmann R., von der Mark K. Two distinct cell-binding domains in laminin canin dependently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J.
- the E8 fragment of human laminin used in the present invention does not have to be the elastase-digested product of the corresponding human laminin, and has the same cell adhesion activity as mouse laminin 111E8, and has the same structure, It may be a fragment of human laminin having a certain molecular weight.
- the method for producing the E8 fragment of laminin is not particularly limited.
- a method of digesting the full length of the desired isoform of laminin with a proteolytic enzyme such as elastase, separating and purifying the desired fragment, or as a recombinant protein The method of manufacturing etc. are mentioned. From the viewpoint of production amount, uniformity of quality, production cost, etc., it is preferable to produce as a recombinant protein.
- Recombinant human laminin (full length or a part thereof) can be produced by using known sequence information and known genetic recombination techniques as appropriate.
- the method for producing recombinant human laminin 511 E8 will be described below as an example.
- the expression vector can be co-introduced into a suitable host cell for expression, and the protein forming the trimer can be produced by purification by a known method. For example, Ido et al.
- the base sequence information and the amino acid sequence information of each chain encoding each of the ⁇ 5 chain, ⁇ 1 chain, and ⁇ 1 chain constituting human laminin 511 can be obtained from a known database (such as GenBank).
- Laminin may be, for example, a protein in which at least one amino acid is deleted, substituted and / or added in these specific amino acid sequences.
- iMatrix 511-E8 is a recombinant protein derived from recombinant CHO-S cells, which has the same sequence as human laminin 511-E8 fragment.
- iMatrix 511-E8-silk is a recombinant protein derived from a transgenic silkworm production system, which has the same sequence as human laminin 511-E8 fragment.
- One aspect of the present invention relates to a method for culturing muscle satellite cells, comprising culturing cells using a medium containing (i) retinoid and (ii) laminin.
- the cells are cultured, for example, using a growth medium (20% fetal bovine serum, penicillin / streptomycin, DMEM supplemented with 2 to 10 ng / ml final concentration of bFGF) at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator be able to.
- the composition of the medium and the culture conditions can be appropriately adjusted by those skilled in the art.
- G-CSF G-CSF, bFGF, IL-1 ⁇ , IL-13, IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , GSK3 inhibitor, sal003, p38 inhibitor (eg, Stem cell reports, 2015, 5, p621-632)
- Other factors may also be included, such as the described SB 203 580) or (R) -PFI-2 (Cell stem cell 22, 177-190, 2018).
- the culture vessel for example, petri dishes, cell culture dishes, cell culture flasks and the like can be used.
- oxygen concentration can be appropriately adjusted.
- the concentration of O 2 can be at least 0.5% or more, 1% or more, 2% or more, 3% or more, 4% or more, 5% or more, or 6% or more.
- O 2 can be 10% or less, 8% or less, 6% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less.
- the O 2 concentration can be any combination of the above upper and lower limits, for example, in the range of 1% to 5%, preferably in the range of 2% to 4%.
- a suitable O 2 concentration is, for example, 2.5 to 3.5%, more specifically 3%.
- culture of human cells can be carried out, for example, using growth medium (DMEM supplemented with 20% fetal bovine serum, penicillin / streptomycin / glutamic acid, bFGF at a final concentration of 2.5 ng / ml, High Glucose at 37 ° C., 3% O 2 can be carried out in 2, 5% CO 2 incubator.
- growth medium DMEM supplemented with 20% fetal bovine serum, penicillin / streptomycin / glutamic acid, bFGF at a final concentration of 2.5 ng / ml
- High Glucose at 37 ° C. 3% O 2 can be carried out in 2, 5% CO 2 incubator.
- the oxygen concentration of 2-4% that preferably culturing the cells in the presence of 3% O 2
- the present invention relates to a method for culturing muscle satellite cells.
- Retinoids are at least 10 -13 M or more, 10 -12 M or more, 10 -11 M or more, 10 -10 M or more, 10 -9 M or more, 10 -8 M or more, 10 -7 M or more, 10 -6 M or more
- the medium can be added at a concentration of 10 -5 M or more, 10 -4 M or more, or 10 -3 M or more.
- retinoid is less than 10 -2 M, less than 10 -3 M, less than 10 -4 M, less than 10 -5 M, less than 10 -6 M, less than 10 -7 M, less than 10 -8 M, 10 -9 It can be added at any concentration of less than M, less than 10 -10 M, less than 10 -11 M, or less than 10 -12 M.
- retinoid can be any combination of the above upper and lower limits, eg, a concentration range of 10 -11 M to 10 -5 M, preferably a concentration range of 10 -10 M to 10 -6 M, 10 -9 M to It can be added at any concentration in the 10 -7 M concentration range.
- concentration of retinoid is, for example, 10 -8 M or 10 -7 M.
- 10 -8 M or 10 -7 M atRA or AM 80 can be used.
- Laminin on the basis of the bottom area of the culture vessel, at least 0.01 [mu] g / cm 2 or more, 0.05 [mu] g / cm 2 or more, 0.1 [mu] g / cm 2 or more, 0.2 [mu] g / cm 2 or more, 0.3 [mu] g / cm 2 above, 0.4 [mu] g / cm 2 or more, 0.5 [mu] g / cm 2 or more, 0.6 [mu] g / cm 2 or more, 0.7 [mu] g / cm 2 or more, 0.8 [mu] g / cm 2 or more, 0.9 [mu] g / cm 2 or more,
- the medium can be added to or coated on the culture vessel at a concentration of 1.0 ⁇ g / cm 2 or more, 1.5 ⁇ g / cm 2 or more, or 2.0 ⁇ g / cm 2 or more.
- retinoids less than 5.0 [mu] g / cm 2, less than 2.0 [mu] g / cm 2, less than 1.5 [mu] g / cm 2, less than 1.0 [mu] g / cm 2, less than 0.9 ⁇ g / cm 2, 0.8 ⁇ g / cm less than 2, less than 0.7 [mu] g / cm 2, less than 0.6 [mu] g / cm 2, less than 0.5 [mu] g / cm 2, less than 0.4 ⁇ g / cm 2, 0.3 ⁇ g / cm less than 2, less than 0.2 [mu] g / cm 2
- the culture medium can be added to or coated on a culture vessel at any concentration of less than 0.1 ⁇ g / cm 2 and less than 0.05 ⁇ g / cm 2 .
- retinoids may have any combination of the above upper and lower limits, for example, a concentration range of 0.01 ⁇ g / cm 2 to 5.0 ⁇ g / cm 2 , preferably 0.1 ⁇ g / cm 2 to 1.0 ⁇ g / cm 2
- the medium can be added to the medium or coated on the culture vessel at a concentration in the range of 0.2 ⁇ g / cm 2 to 0.5 ⁇ g / cm 2 .
- the preferred use concentration of laminin is, for example, 0.2 ⁇ g / cm 2 or 0.5 ⁇ g / cm 2 .
- laminin is at least 0.1 ⁇ g / ml, 0.5 ⁇ g / ml, 1.0 ⁇ g / ml, 1.5 ⁇ g / ml, 2.0 ⁇ g / ml or more. 0 ⁇ g / ml or more, 4.0 ⁇ g / ml or more, 5.0 ⁇ g / ml or more, 6.0 ⁇ g / ml or more, 7.0 ⁇ g / ml or more, 8.0 ⁇ g / ml or more, 9.0 ⁇ g / ml or more, 10.0 ⁇ g or more It can be added to the culture medium at any concentration of / ml or more.
- retinoid is less than 15.0 ⁇ g / ml, less than 10.0 ⁇ g / ml, less than 9.0 ⁇ g / ml, less than 8.0 ⁇ g / ml, less than 7.0 ⁇ g / ml, less than 6.0 ⁇ g / ml, 5.0 ⁇ g / Ml, less than 4.0 ⁇ g / ml, less than 3.0 ⁇ g / ml, less than 2.0 ⁇ g / ml, less than 1.5 ⁇ g / ml, less than 1.0 ⁇ g / ml, less than 0.5 ⁇ g / ml, 0.1 ⁇ g / ml It can be added to the culture medium at any concentration of less than ml or less than 0.05 ⁇ g / ml.
- retinoid can be selected from any combination of the above upper and lower limits, for example, a concentration range of 0.05 ⁇ g / ml to 15.0 ⁇ g / ml, preferably a concentration range of 1.0 ⁇ g / ml to 10.0 ⁇ g / ml, It can be added at any concentration in the concentration range of 5 ⁇ g / ml to 5.0 ⁇ g / ml.
- a laminin concentration of 0.2 ⁇ g / cm 2 corresponds to 1.5 to 2 ⁇ g / ml.
- a suitable additive concentration of laminin is, for example, 1.5 ⁇ g / ml, 2.0 ⁇ g / ml or 5.0 ⁇ g / ml.
- 0.2 ⁇ g / cm 2 or 0.5 ⁇ g / cm 2 of human laminin 511 E8 fragment can be used. In some aspects of the invention, 1.5 ⁇ g / ml, 2.0 ⁇ g / ml or 5.0 ⁇ g / ml of human laminin 511 E8 fragment can be used.
- One aspect of the present invention relates to a composition for suppressing muscle differentiation of muscle satellite cells, which comprises (i) retinoid and (ii) laminin.
- a composition for suppressing muscle differentiation of muscle satellite cells which comprises (i) retinoid and (ii) laminin.
- a culture medium and culturing muscle satellite cells preferably human muscle satellite cells
- cells can be proliferated while suppressing the muscle differentiation of the cells.
- Such compositions can also be referred to as differentiation inhibitors.
- the types, concentrations, etc. of retinoid used, laminin and other components in the composition can be appropriately determined based on the disclosure of the present specification and common technical knowledge.
- the medium may be a differentiation medium (for example, containing no differentiation inhibitor according to the present invention) , 2% horse serum, DMEM containing penicillin / streptomycin) can be used to culture the cells.
- a differentiation medium for example, containing no differentiation inhibitor according to the present invention
- 2% horse serum, DMEM containing penicillin / streptomycin can be used to culture the cells.
- a cell culture media characterized in that it comprises (i) a retinoid and (ii) laminin.
- a retinoid By culturing muscle satellite cells, preferably human muscle satellite cells, using such a medium, the cells can be proliferated while maintaining the undifferentiated nature of the muscle satellite cells.
- the types, concentrations, etc. of retinoid used, laminin and other components in the medium composition can be appropriately determined based on the disclosure of the present specification and common technical knowledge.
- One embodiment of the present invention is a liquid cell culture medium for culturing human muscle satellite cells, comprising (i) retinoid and (ii) laminin, wherein the retinoid is atRA or AM80 and the concentration of retinoid is at least Human muscle satellites of 10 -8 M, laminin is a human laminin 511 E8 fragment, laminin is included in the liquid medium, the concentration of laminin is at least 1.5 ⁇ g / ml, and cultured in the medium Cell culture medium, wherein the undifferentiated nature of the cells is maintained.
- a cell culture media supplement characterized in that it comprises (i) retinoid and (ii) laminin.
- retinoid By adding such a supplement to the culture medium and culturing muscle satellite cells, preferably human muscle satellite cells, cells can be proliferated while suppressing the muscle differentiation of the cells.
- the types, concentrations and the like of retinoid used, laminin and other components in the supplement can be determined as appropriate based on the disclosure of the present specification and common technical knowledge.
- the supplement may be in the form of a liquid or in the form of a powder. This media supplement may be included as one of the elements in a kit used to culture muscle satellite cells.
- the cell culture medium supplement may be prepared, for example, such that the concentration of retinoid when added to the cell culture medium is at least 10 -8 M. Also, the cell culture medium supplement may be prepared, for example, such that the concentration of laminin when added to the cell culture medium is at least 1.5 ⁇ g / ml.
- This cell culture medium supplement is G-CSF, bFGF, IL-1 ⁇ , IL-13, IFN-13, TNF- ⁇ , GSK3 inhibitor, sal003, p38 inhibitor (eg, Stem cell reports, 2015, 5, p621)
- the agent may further comprise at least one factor selected from the group consisting of SB203580), (R) -PFI-2 (Cell stem cell 22, 177-190, 2018) described in-632 and a mixture thereof.
- One aspect of the present invention is a method for producing a cell for use in cell transplantation, comprising the step of culturing muscle satellite cells using a medium containing (i) retinoid and (ii) laminin. And a method of producing a cell.
- Muscle satellite cells to be cultured can be prepared using any method known to those skilled in the art. The composition of the medium to be used and the culture conditions (temperature, period, etc.) can be appropriately adjusted by those skilled in the art.
- Transplantation of cells can be performed, for example, for the purpose of regenerating a damaged site, or for the purpose of regenerating a reduced function organ or tissue.
- the target of transplantation is preferably human, but is not particularly limited.
- GMP grade reagents are used to culture the cells.
- the muscle satellite cells used in the present production method may be cells whose gene has been modified by genome editing technology such as CRISPR / Cas system.
- Cell Composition One aspect of the present invention relates to a cell composition comprising at least 10 5 muscle satellite cells.
- a cell composition comprising at least 10 5 muscle satellite cells.
- the present cell composition contains at least 10 5 muscle satellite cells, for example, 10 6 or more, preferably 10 7 or more, more preferably 10 8 or more, and still more preferably 10 9 or more.
- cells other than muscle satellite cells may be mixed in the present cell composition, it is preferable that the muscle satellite cells have high purity.
- the purity of muscle satellite cells in the present cell composition is at least 50% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, 90% or more, or 95% or more.
- the cells contained in the present cell composition are preferably human cells, but are not particularly limited.
- the cellular composition comprising muscle satellite cells is contained in one container.
- the cell composition can be used, for example, in transplantation for therapeutic purposes. Transplantation of cells can be performed, for example, for the purpose of regenerating a damaged site, or for the purpose of regenerating a tissue with reduced function.
- the target of transplantation is preferably human, but is not particularly limited.
- One embodiment of the present invention is at least 10 5 , for example 10 6 or more, preferably 10 7 or more, more preferably 10 8 or more, more preferably 10 9 or more, for use in treating a disease or injury.
- the present invention relates to a cell composition comprising one or more muscle satellite cells.
- Diseases to be treated include, for example, muscular dystrophy, congenital myopathy, distal myopathy, myotonic disease, inflammatory myopathy, periodic quadriplegia, metabolic myopathy, myasthenia gravis, congenital myasthenic syndrome , Mitochondrial disease, and sarcopenia, but not limited thereto.
- the muscle satellite cells contained in the present cell composition may be cells derived from a patient having any disease or a subject having a genetic predisposition to develop the disease.
- the disease is, for example, muscular dystrophy.
- Cell compositions associated with such diseases can be used in screening and assays for the purpose of drug development.
- the muscle satellite cells may be cells whose genes have been modified by genome editing techniques such as CRISPR / Cas system.
- the muscle satellite cells may be cells derived from iPS cells.
- At least 5 ⁇ 10 5 for example, 10 6 or more, preferably 10 7 or more, more preferably 10 8 or more, still more preferably 10 9 or more muscle satellite cells Relating to the enclosed vial or container of
- the vial or container may be made of glass or plastic.
- the cells in the vial or container may be frozen or anti-frozen.
- One aspect of the present invention is a method of treating a disease or injury in a patient, comprising the steps of culturing muscle satellite cells using a medium comprising (i) a retinoid and (ii) laminin, and
- the present invention relates to a therapeutic method comprising implanting muscle satellite cells or cells derived therefrom into a patient.
- Muscle satellite cells to be cultured can be prepared using any method known to those skilled in the art.
- the muscle satellite cells may be cells whose genes have been modified by genome editing techniques such as CRISPR / Cas system.
- the muscle satellite cells may be cells derived from iPS cells. Cells derived from muscle satellite cells include cells differentiated from muscle satellite cells.
- the composition of the medium to be used and the culture conditions can be appropriately adjusted by those skilled in the art.
- Transplantation of cells can be performed, for example, for the purpose of regenerating a damaged site, or for the purpose of regenerating a reduced function organ or tissue.
- the patient to be transplanted is preferably a human but is not particularly limited.
- the subject of treatment may be non-human mammals including dogs, cats, monkeys and the like.
- Diseases to be treated include, for example, muscular dystrophy, congenital myopathy, distal myopathy, myotonic disease, inflammatory myopathy, periodic quadriplegia, metabolic myopathy, myasthenia gravis, congenital myasthenic syndrome , Mitochondrial disease, and sarcopenia, but not limited thereto.
- Diseases to be treated include, for example, diabetes.
- Diseases can also be treated by implanting muscle satellite cells genetically modified to secrete substances effective for treatment of diseases or injuries or cells derived therefrom.
- Transplantation can be performed, for example, by direct injection of cells at the transplantation site.
- cells may be cultured, for example, on a scaffold, and both scaffold and cells may be implanted into the body.
- One embodiment of the present invention is a method of screening for substances that affect differentiation, proliferation or survival of muscle satellite cells or cells derived therefrom, and (i) muscle satellites in the presence of retinoid and (ii) laminin Culturing the cells, contacting the cultured muscle satellite cells or cells derived therefrom with the test substance, and evaluating whether the test substances affect the differentiation, proliferation or survival of the muscle satellite cells or cells derived therefrom
- the present invention relates to a method characterized by including a step.
- the muscle satellite cells may be cells derived from iPS cells.
- the muscle satellite cells may be cells derived from a patient having any disease or a subject having a genetic predisposition to develop the disease.
- the disease is, for example, muscular dystrophy.
- substances that improve the proliferation or survival of muscle satellite cells of muscular dystrophy patients or cells derived therefrom may be useful for the treatment of muscular dystrophy.
- “Influencing cell differentiation” includes promoting or suppressing cell differentiation.
- “Influencing cell growth” includes promoting or suppressing cell growth.
- “Influencing cell survival” includes improving cell survival time or survival rate, or killing cells by apoptosis, necrosis or the like.
- the muscle satellite cells used in the present screening method may be cells whose genes have been modified by genome editing technology such as the CRISPR / Cas system.
- the test substance includes low molecular weight compounds, peptides, proteins, nucleic acids and the like, but is not particularly limited.
- Example 1 Preparation of skeletal muscle stem cells Skeletal muscle stem cells Skeletal muscle stem cells were isolated from hindlimb muscles (large, quadriceps, anterior tibia, gastrocnemius, etc.) of C57BL / 6J mice (3-10 weeks old). (I) Treatment with DMEM medium containing 0.14% protease (Sigma-Aldrich) at 37 ° C. for 30 minutes, followed by washing with DMEM medium, and then seeding (ii) Enzyme A method (Exp Cell Res. 10, 245-255, 2004; Nat Med. 20, 255-264, 2014) was used after digestion, which was isolated by a flow cytometer (BD, Aria II).
- the obtained skeletal muscle stem cells were grown in growth medium (20% fetal bovine serum, penicillin / streptomycin, 2 to 10 ng / ml final concentration of bFGF (Peprotec)) in DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate (Thermo Fisher Scientific) The cells were cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
- growth medium (20% fetal bovine serum, penicillin / streptomycin, 2 to 10 ng / ml final concentration of bFGF (Peprotec)
- DMEM High Glucose
- GlutaMAX High Glucose
- Pyruvate Pyruvate
- Example 2 Effect of retinoid compounds on maintenance of undifferentiated properties of skeletal muscle stem cells
- all-trans-retinoic acid hereinafter referred to as atRA
- synthetic retinoid compound Am80 was added to the growth medium at a concentration of 10 -11 M to 10 -5 M, and cultured for 3 days in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
- the undifferentiated nature of skeletal muscle stem cells was analyzed by the immunostaining method shown below. First, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature and then washed three times with PBS.
- the cells After washing 3 times with PBS, the cells are treated with secondary antibodies (anti-mouse IgG-Alexa Fluor 594 and anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 488) for 1 hour at room temperature, washed 3 times with PBS again, and then nuclei using Hoechst 33342 Staining was performed and observed with a fluorescence microscope (Olympus).
- secondary antibodies anti-mouse IgG-Alexa Fluor 594 and anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 482
- MyoD positive cells in the total number of cells were calculated, and the purity of the muscle cell culture system used in the experiment was analyzed. As a result, it was confirmed that the cells were MyoD positive cells with 100% myogenic lineage.
- the percentage of Pax7 positive cells (skeletal muscle stem cells), which are undifferentiated markers, in MyoD positive cells was analyzed. As a result, the percentage of Pax7 positive cells was significantly increased at a concentration of 10 -7 M to 10 -5 M for both atRA and Am80 (FIGS. 1a and b).
- Example 3 Effect of Retinoid Compounds on Myotube Formation Ability of Skeletal Muscle Stem Cells
- the skeletal muscle stem cell culture system prepared in Example 1 is cultured in differentiation medium (DMEM containing 2% horse serum, penicillin / streptomycin), and muscle differentiation Induced.
- atRA or Am80 was added to the differentiation medium at a concentration of 10 -11 M to 10 -5 M to analyze the effect of the retinoid compound on the differentiation ability.
- immunostaining with an anti-myosin heavy chain antibody (Developmental Studies HybridomaBank) was performed in the same manner as in Example 2 to visualize the myotubes in which myocytes were fused.
- both atRA and Am80 significantly inhibited the formation of myotubes at concentrations of 10 -7 M and 10 -5 M (FIG. 2).
- Example 4 Effect of retinoid compounds on the proliferation ability of skeletal muscle stem cells
- the proliferation medium of skeletal muscle stem cell culture system prepared in Example 1 was added with atRA at a concentration of 10 -7 M, and the proliferation ability of retinoid compounds in myocytes
- the analysis was conducted according to a standard method using Click-iT (R) Plus EdU AlexaFluor (R) 594 Imaging Kit (Thermo Fisher SCIENTIFIC) and anti-MyoD antibody.
- immunostaining was performed in the same manner as in Example 2.
- Example 5 Long-term maintenance of skeletal muscle stem cells by addition of retinoid compound
- the skeletal muscle stem cell culture prepared in Example 1 was cultured in a growth medium supplemented with or without 10 -7 M atRA and passaged 5 times.
- Pax7, myosin heavy chain and beta-tubulin ( ⁇ -Tubulin) as an endogenous control in these cells were analyzed by Western blotting according to a standard method.
- the undifferentiated nature in the skeletal muscle muscle stem cell culture system which was passaged 16 times in a growth medium supplemented with 10 -7 M atRA, was analyzed in the same manner as in Example 2 using an anti-Pax7 antibody and an anti-MyoD antibody.
- skeletal muscle stem cells cultured in atRA-free medium after 5 passages show many flat and huge morphologies, whereas many cells in atRA-added cells pass through. It showed round morphology as well as no primary skeletal muscle cells (Fig. 4a and b).
- skeletal muscle cells in the atRA-added area highly expressed the stem cell marker Pax7 as compared to cells in the non-addition area, and the expression of the differentiation marker myosin heavy chain (MyHC) was attenuated (Fig. 4c).
- Example 6 Effect of other retinoid compounds on suppression of muscle differentiation
- the skeletal muscle stem cells prepared in Example 1 were treated as differentiation medium with RAR agonists atRA, Am80, AM580, Am555S, Es80, Es580, Re80, Fv80, Ch55, Az80
- RXR agonists PA024, HX630 and LG268 were added at a concentration of 10 -6 M to 10 -8 M and cultured for 96 hours. Then, the effects of retinoid compounds on myogenic differentiation inhibition were analyzed by comparing myotube formation ability.
- Example 7 Effect of culture substrate iMatrix-511 on suppression of undifferentiated maintenance and differentiation of skeletal muscle stem cells Differentiation of skeletal muscle stem cells using culture substrate iMatrix 511-E8-silk purchased from Nippi Co., Ltd. (Tokyo, Japan) We examined the inhibitory effect. Until now, it has been reported that iMatrix-511 can perform from establishment to expansion of human ES cells and iPS cells (Sci Rep 4: 3594). In addition, it has been reported that adding iMatrix-511 to the cell suspension at passage can achieve the same effect as pre-coating in culture dishes (Sci Rep 7: 41165).
- culture dishes prepared by pre-coating skeletal muscle stem cells prepared in Example 1 with Matrigel culture dishes pre-coated with iMatrix-511 to a concentration of 0.5 ⁇ g / cm 2, and cell suspension at passage 0 It was added .2 ⁇ g / cm 2, or 0.5 [mu] g / cm 2 and so as, seeded in culture dishes without coating, and cultured for 48 hours.
- RNA was extracted using NucleoSpin RNA from MACHEREY-NAGEL, and reverse transcription was performed using Revo trac AqPCR RT Master Mix with gDNA Remover from TOYOBO to prepare cDNA.
- the amounts of expression of Pax7, Myogenin (Myog) and Muscle Creatine Kinase (MCK) were analyzed by qRT-PCR using KAPA SYBR FAST qPCR MasterMix of KAPA Biosystems.
- Example 8 Synergistic effect of retinoid compound and iMatrix-511 on maintenance and differentiation suppression of skeletal muscle stem cells
- Skeletal muscle stem cells were cultured by the following three methods in the same manner as in Example 6.
- iMatrix-511 was added to the cell suspension at 0.2 ⁇ g / cm 2 at passage, seeded in a culture dish without coating, and cultured in growth medium supplemented with 10 -7 M atRA how to.
- Example 9 Effect on culture substrate iMatrix-511 and addition of retinoid compound on the undifferentiated maintenance / differentiation inhibition of skeletal muscle stem cells Using the culture substrate iMatrix 511-E8-silk purchased from Nippi Co., Ltd. (Tokyo, Japan) The differentiation inhibitory effect of muscle stem cells was examined. Until now, it has been reported that iMatrix-511 can perform from establishment to expansion of human ES cells and iPS cells (Sci Rep 4: 3594). In addition, it has been reported that adding iMatrix-511 to the cell suspension at passage can achieve the same effect as pre-coating in culture dishes (Sci Rep 7: 41165).
- skeletal muscle stem cells prepared in Example 1 were seeded in the following six experimental sections and analyzed 48 hours after culture.
- Example 10 Preparation of Human Skeletal Muscle Stem Cells
- Skeletal muscle stem cells were isolated from a human skeletal muscle sample (intermediate muscle).
- a method (Methods Mol Biol. 1460: 241-253, 2016) was used in which a muscle sample was subjected to enzyme digestion and the isolated cells were cultured and purified with a flow cytometer (BD, Aria II).
- the obtained skeletal muscle stem cells were prepared using DMEM, High Glucose (Thermo Fisher Scientific) supplemented with growth medium (20% fetal bovine serum, penicillin / streptomycin / glutamic acid, bFGF (Peprotec) at a final concentration of 2.5 ng / ml).
- the cells were cultured at 37 ° C., 3% O 2 , 5% CO 2 incubator.
- Example 11 Effects of Retinoid Compounds on the Proliferation of Human Skeletal Muscle Stem Cells
- atRA or Am80 is added to the growth medium at a concentration of 10 ⁇ 8 M to 10 ⁇ 6 M.
- the cells were cultured at 37 ° C., 3% O 2 , 5% CO 2 incubator for 3 days.
- Proliferation of skeletal muscle stem cells was evaluated by WST-8 assay (Dojindo). Three hours after addition of the assay solution, cell proliferation was quantified by measuring absorbance at 450 nm using Multiskan JX (Thermo Fisher Scientific).
- Example 12 Effects of Retinoid Compounds on Myotube Formation Ability of Human Skeletal Muscle Stem Cells
- the human skeletal muscle stem cell culture system prepared in Example 10 is cultured in differentiation medium (DMEM containing 5% horse serum, penicillin streptomycin glutamate). And induced muscle differentiation. Furthermore, atRA or Am80 was added to the differentiation medium at a concentration of 10 -8 M to 10 -6 M to analyze the effect of the retinoid compound on the differentiation ability. Specifically, immunostaining with an anti-myosin heavy chain antibody (Developmental Studies Hybridoma Bank) was performed in the same manner as in Example 2 to visualize myotubes in which myocytes were fused.
- DMEM differentiation medium
- atRA or Am80 was added to the differentiation medium at a concentration of 10 -8 M to 10 -6 M to analyze the effect of the retinoid compound on the differentiation ability.
- immunostaining with an anti-myosin heavy chain antibody (Developmental Studies Hybridoma Bank)
- Example 13 Effect of atRA on the expression of a muscle differentiation regulator in human skeletal muscle stem cells At a concentration of 10 -7 M to 10 -6 M in the growth medium of the human skeletal muscle stem cell culture system prepared in Example 10
- the effects of atRA on the expression of muscle differentiation regulator were analyzed. After 3 days of culture, RNA was isolated using RNeasy Micro Kit (Qiagen), and reverse transcription was performed using QuantiTect RT Kit (Qiagen).
- the gene expression of MYOD1 and MYOG was relatively quantitatively analyzed by real-time PCR (Thermal Cycler Dice: Takara) using the obtained cDNA. NDUFA13 was used as an internal control gene.
- Example 14 Synergistic Effect of atRA and iMatrix-511 on the Expression of Muscle Differentiation Regulator in Human Skeletal Muscle Stem Cells
- iMatrix-511 was added to 0.1 to 0.5 ⁇ g / cm 2 and cultured for 3 days.
- gene expression of MYOD1 and MYOG was relatively quantitatively analyzed by real-time PCR.
- Example 15 Synergistic effect of atRA and iMatrix-511 on proliferation of human skeletal muscle stem cells
- Human skeletal muscle stem cells were treated with 10 -6 M atRA and 0.1 ⁇ g / cm 2 of iMatrix in the same manner as in Example 11. The cells were cultured for 3 days in the presence of 511. Cell proliferation was quantified in the same manner as in Example 11.
- Example 16 Effect of atRA and iMatrix-511 on transplantation efficiency of human skeletal muscle stem cells
- human skeletal muscle stem cells were treated with 10 -6 M atRA and 0.1 ⁇ g / cm 2 iMatrix- The cells were cultured in the presence of 511.
- Cultured cells were transplanted into the tibialis anterior muscle of 5-week-old NOG-mdx mice (cell number: 4 ⁇ 10 5 ).
- a quick frozen section of the tibialis anterior muscle is prepared, and rabbit anti-dystrophin antibody (Abcam), mouse anti-human spectrin antibody (Leica), rat anti-laminin ⁇ 2 chain antibody (Santa Cruz) are used. Stained.
- the present inventors have found that by culturing cells in a medium containing retinoid and laminin, it is possible to grow cells while maintaining the undifferentiated nature of muscle stem cells. Since this technology is simple and safe, and can maintain the undifferentiated nature of muscle stem cells with high efficiency, it is expected to be applied to cell transplantation treatment for muscle diseases including muscular dystrophy, compound screening system, and regenerative medicine. .
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Abstract
本発明は，筋幹細胞の未分化性を保持したまま細胞を培養する方法を提供する。より具体的には、レチノイドとラミニンを含む培地を用いて細胞を培養することにより，筋幹細胞の未分化性を保持したまま細胞を培養することを可能とする。レチノイドとしては例えば，ａｔＲＡ，ＡＭ８０などが使用できる。レチノイドとラミニンを含む培地を用いて培養することにより増殖させた筋幹細胞は，細胞移植による筋ジストロフィーの治療等に利用されうる。
Description
本願は、特願２０１７－１２１７８７号（出願日：２０１７年６月２２日）の優先権を主張する出願であり、これは引用することによりその全体が本明細書に取り込まれる。
本発明は，筋幹細胞の培養方法に関する。より詳細には，筋幹細胞の未分化性を保持したまま培養する方法に関する。また，本発明は，細胞移植などに利用可能な筋幹細胞の製造方法，およびそれに用いる組成物にも関する。
骨格筋は，運動や姿勢の保持に必要であるだけでなく，最大のエネルギー利用器官として代謝調節にも重要である。また，骨格筋は再生能が高いという特徴をもつ。骨格筋は，骨格筋幹細胞（筋サテライト細胞）が活性化され，分化・融合することによって再生される（非特許文献１）。
筋ジストロフィーは筋線維の壊死と再生を繰り返しながら筋萎縮が進行する遺伝性の疾患であり，有効な治療法は未だに確立されていない。開発段階にある筋ジストロフィーの治療法としては，例えば，核酸医薬品を用いたエキソンスキッピング療法がある（非特許文献２）。核酸医薬品とならび，細胞移植治療の応用も期待されているが，ｉｎ ｖｉｔｒｏで筋幹細胞を培養すると，幹細胞としての未分化性が失われ，増殖を停止してしまうことが知られている（非特許文献３）。
Comai and Tajbakhsh, Curr Top Dev Biol. 2014;110:1-73. doi: 10.1016/B978-0-12-405943-6.00001-4.
Fairclough et al., Nat Rev Genet. 2013;14(6):373-8. doi: 10. 1038/nrg3460.
Fu et al., Cell Res. 2015;25(6):655-73. doi: 10.1038/cr.2015 .58.
本発明は，筋幹細胞の未分化性を保持したまま培養する方法を提供することを目的の一つとする。また，本発明は，筋幹細胞の未分化性を保持したまま培養する方法において用いる組成物を提供することを別の目的の一つとする。
本発明者らは，レチノイドおよびラミニンを含む培地中で細胞を培養することによって，筋幹細胞の未分化性を保持したまま，細胞を増殖させることが可能であることを見出した。本技術は簡便かつ安全で，高い効率で筋幹細胞の未分化性を維持できることから，筋ジストロフィーをはじめとした筋疾患に対する細胞移植治療や，化合物スクリーニング系の開発，再生医療への応用が期待される。本発明はこのような知見に基づくものであり，以下の態様を包含する：
［態様１］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて細胞を培養することを特徴とする，筋サテライト細胞の培養方法。
［態様２］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１記載の培養方法。
［態様３］
レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，態様１または２記載の培養方法。
［態様４］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１～３のいずれか記載の培養方法。
［態様５］
培地がレチノイドおよびラミニンを含む液体培地である，態様１～４のいずれか記載の培養方法。
［態様６］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様１～５のいずれか記載の培養方法。
［態様７］
培地がＧ－ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１α，ＩＬ－１３，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）－ＰＦＩ－２およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，態様１～６のいずれか記載の培養方法。
［態様８］
筋サテライト細胞の未分化性が維持される，態様１～７のいずれか記載の培養方法。
［態様９］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様１～８のいずれか記載の培養方法。
［態様１０］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む液体培地を用いて細胞を培養することを特徴とする，ヒト筋サテライト細胞の培養方法であって，
レチノイドがａｔＲＡまたはＡＭ８０であり，レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍであり，
ラミニンがヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントであり，ラミニンが液体培地中に含められており，ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌであり，そして
ヒト筋サテライト細胞の未分化性が維持される，培養方法。
［態様１１］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，筋サテライト細胞の筋分化を抑制するための組成物。
［態様１２］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１１記載の組成物。
［態様１３］
レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，態様１１または１２記載の組成物。
［態様１４］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１１～１３のいずれか記載の組成物。
［態様１５］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様１１～１４のいずれか記載の組成物。
［態様１６］
筋サテライト細胞の未分化性が維持される，態様１１～１５のいずれか記載の組成物。
［態様１７］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様１１～１６のいずれか記載の組成物。
［態様１８］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，細胞培養培地。
［態様１９］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１８記載の細胞培養培地。
［態様２０］
レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，態様１８または１９記載の細胞培養培地。
［態様２１］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１８～２０のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２２］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様１８～２１のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２３］
培地がＧ－ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１α，ＩＬ－１３，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）－ＰＦＩ－２およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，態様１８～２２のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２４］
筋サテライト細胞の培養に用いるための態様１８～２３のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２５］
筋サテライト細胞の未分化性を維持するための態様１８～２４のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２６］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様１８～２５のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２７］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，細胞培養培地サプリメント。
［態様２８］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様２７記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２９］
細胞培養培地に加えられた際のレチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，態様２７または２８記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３０］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様２７～２９のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３１］
細胞培養培地に加えられた際のラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様２７～３０のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３２］
Ｇ－ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１α，ＩＬ－１３，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）－ＰＦＩ－２およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，態様２７～３１のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３３］
筋サテライト細胞の培養に用いるための態様２７～３２のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３４］
筋サテライト細胞の未分化性を維持するための態様２７～３３のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３５］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様２７～３４のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３６］
細胞移植に用いるための細胞の製造方法であって，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程を含む，方法。
［態様３７］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様３６記載の製造方法。
［態様３８］
レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，態様３６または３７記載の製造方法。
［態様３９］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様３６～３８のいずれか記載の製造方法。
［態様４０］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様３６～３９のいずれか記載の製造方法。
［態様４１］
培地がＧ－ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１α，ＩＬ－１３，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）－ＰＦＩ－２およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，態様３６～４０のいずれか記載の製造方法。
［態様４２］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様３６～４１のいずれか記載の製造方法。
［態様４３］
筋サテライト細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である，態様３６～４２のいずれか記載の製造方法。
［態様４４］
筋サテライト細胞が筋ジストロフィー患者由来の細胞である，態様３６～４３のいずれか記載の製造方法。
［態様４５］
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である，態様３６～４４のいずれか記載の製造方法。
［態様４６］
細胞が糖尿病の治療に用いるための細胞である，態様３６～４５のいずれか記載の製造方法。
［態様４７］
患者における疾患または傷害の治療方法であって，（ｉ）レチノイド，および（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程，および培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞を患者に移植する工程を含む，方法。
［態様４８］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様４７記載の治療方法。
［態様４９］
レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，態様４７または４８記載の治療方法。
［態様５０］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様４７～４９のいずれか記載の治療方法。
［態様５１］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様４７～５０のいずれか記載の治療方法。
［態様５２］
培地がＧ－ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１α，ＩＬ－１３，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）－ＰＦＩ－２およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，態様４７～５１のいずれか記載の治療方法。
［態様５３］
患者がヒトである，態様４７～５２のいずれか記載の治療方法。
［態様５４］
疾患が筋ジストロフィー，先天性ミオパチー，遠位型ミオパチー，筋強直性疾患，炎症性筋疾患，周期性四肢麻痺，代謝性筋疾患，重症筋無力症，先天性筋無力症候群，ミトコンドリア病，サルコペニアおよび糖尿病から成る群より選択される，態様４７～５３のいずれか記載の治療方法。
［態様５５］
筋サテライト細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である，態様４７～５４のいずれか記載の治療方法。
［態様５６］
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である，態様４７～５５のいずれか記載の治療方法。
［態様５７］
少なくとも５×１０５個の筋サテライト細胞を含む，細胞組成物。
［態様５８］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンをさらに含む，態様５７記載の細胞組成物。
［態様５９］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様５７または５８記載の細胞組成物。
［態様６０］
レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，態様５７～５９のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６１］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様５７～６０のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６２］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様５７～６１のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６３］
筋サテライト細胞の純度が少なくとも８５％である，態様５７～６２のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６４］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様５７～６３のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６５］
筋サテライト細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である，態様５７～６４のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６６］
筋サテライト細胞が筋ジストロフィー患者由来の細胞である，態様５７～６５のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６７］
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である，態様５７～６６のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６８］
凍結されている，態様５７～６７のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６９］
１つの容器に納められている，態様５７～６８のいずれか記載の細胞組成物。
［態様７０］
筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化，増殖または生存に影響する物質のスクリーニング方法であって，
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンの存在下で筋サテライト細胞を培養する工程，
培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞に試験物質を接触させる工程，
試験物質が筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化，増殖または生存に影響するか否かを評価する工程
を含む，方法。
［態様７１］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様７０記載のスクリーニング方法。
［態様７２］
レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，態様７０または７１記載のスクリーニング方法。
［態様７３］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様７０～７２のいずれか記載のスクリーニング方法。
［態様７４］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様７０～７３のいずれか記載のスクリーニング方法。
［態様７５］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様７０～７４のいずれか記載のスクリーニング方法。
［態様７６］
筋サテライト細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である，態様７０～７５のいずれか記載のスクリーニング方法。
［態様７７］
筋サテライト細胞が筋ジストロフィー患者由来の細胞である，態様７０～７６のいずれか記載のスクリーニング方法。
［態様７８］
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である，態様７０～７７のいずれか記載のスクリーニング方法。
［態様１］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて細胞を培養することを特徴とする，筋サテライト細胞の培養方法。
［態様２］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１記載の培養方法。
［態様３］
レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，態様１または２記載の培養方法。
［態様４］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１～３のいずれか記載の培養方法。
［態様５］
培地がレチノイドおよびラミニンを含む液体培地である，態様１～４のいずれか記載の培養方法。
［態様６］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様１～５のいずれか記載の培養方法。
［態様７］
培地がＧ－ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１α，ＩＬ－１３，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）－ＰＦＩ－２およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，態様１～６のいずれか記載の培養方法。
［態様８］
筋サテライト細胞の未分化性が維持される，態様１～７のいずれか記載の培養方法。
［態様９］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様１～８のいずれか記載の培養方法。
［態様１０］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む液体培地を用いて細胞を培養することを特徴とする，ヒト筋サテライト細胞の培養方法であって，
レチノイドがａｔＲＡまたはＡＭ８０であり，レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍであり，
ラミニンがヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントであり，ラミニンが液体培地中に含められており，ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌであり，そして
ヒト筋サテライト細胞の未分化性が維持される，培養方法。
［態様１１］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，筋サテライト細胞の筋分化を抑制するための組成物。
［態様１２］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１１記載の組成物。
［態様１３］
レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，態様１１または１２記載の組成物。
［態様１４］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１１～１３のいずれか記載の組成物。
［態様１５］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様１１～１４のいずれか記載の組成物。
［態様１６］
筋サテライト細胞の未分化性が維持される，態様１１～１５のいずれか記載の組成物。
［態様１７］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様１１～１６のいずれか記載の組成物。
［態様１８］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，細胞培養培地。
［態様１９］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１８記載の細胞培養培地。
［態様２０］
レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，態様１８または１９記載の細胞培養培地。
［態様２１］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１８～２０のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２２］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様１８～２１のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２３］
培地がＧ－ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１α，ＩＬ－１３，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）－ＰＦＩ－２およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，態様１８～２２のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２４］
筋サテライト細胞の培養に用いるための態様１８～２３のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２５］
筋サテライト細胞の未分化性を維持するための態様１８～２４のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２６］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様１８～２５のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２７］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，細胞培養培地サプリメント。
［態様２８］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様２７記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２９］
細胞培養培地に加えられた際のレチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，態様２７または２８記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３０］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様２７～２９のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３１］
細胞培養培地に加えられた際のラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様２７～３０のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３２］
Ｇ－ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１α，ＩＬ－１３，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）－ＰＦＩ－２およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，態様２７～３１のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３３］
筋サテライト細胞の培養に用いるための態様２７～３２のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３４］
筋サテライト細胞の未分化性を維持するための態様２７～３３のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３５］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様２７～３４のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３６］
細胞移植に用いるための細胞の製造方法であって，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程を含む，方法。
［態様３７］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様３６記載の製造方法。
［態様３８］
レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，態様３６または３７記載の製造方法。
［態様３９］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様３６～３８のいずれか記載の製造方法。
［態様４０］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様３６～３９のいずれか記載の製造方法。
［態様４１］
培地がＧ－ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１α，ＩＬ－１３，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）－ＰＦＩ－２およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，態様３６～４０のいずれか記載の製造方法。
［態様４２］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様３６～４１のいずれか記載の製造方法。
［態様４３］
筋サテライト細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である，態様３６～４２のいずれか記載の製造方法。
［態様４４］
筋サテライト細胞が筋ジストロフィー患者由来の細胞である，態様３６～４３のいずれか記載の製造方法。
［態様４５］
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である，態様３６～４４のいずれか記載の製造方法。
［態様４６］
細胞が糖尿病の治療に用いるための細胞である，態様３６～４５のいずれか記載の製造方法。
［態様４７］
患者における疾患または傷害の治療方法であって，（ｉ）レチノイド，および（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程，および培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞を患者に移植する工程を含む，方法。
［態様４８］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様４７記載の治療方法。
［態様４９］
レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，態様４７または４８記載の治療方法。
［態様５０］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様４７～４９のいずれか記載の治療方法。
［態様５１］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様４７～５０のいずれか記載の治療方法。
［態様５２］
培地がＧ－ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１α，ＩＬ－１３，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）－ＰＦＩ－２およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，態様４７～５１のいずれか記載の治療方法。
［態様５３］
患者がヒトである，態様４７～５２のいずれか記載の治療方法。
［態様５４］
疾患が筋ジストロフィー，先天性ミオパチー，遠位型ミオパチー，筋強直性疾患，炎症性筋疾患，周期性四肢麻痺，代謝性筋疾患，重症筋無力症，先天性筋無力症候群，ミトコンドリア病，サルコペニアおよび糖尿病から成る群より選択される，態様４７～５３のいずれか記載の治療方法。
［態様５５］
筋サテライト細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である，態様４７～５４のいずれか記載の治療方法。
［態様５６］
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である，態様４７～５５のいずれか記載の治療方法。
［態様５７］
少なくとも５×１０５個の筋サテライト細胞を含む，細胞組成物。
［態様５８］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンをさらに含む，態様５７記載の細胞組成物。
［態様５９］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様５７または５８記載の細胞組成物。
［態様６０］
レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，態様５７～５９のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６１］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様５７～６０のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６２］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様５７～６１のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６３］
筋サテライト細胞の純度が少なくとも８５％である，態様５７～６２のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６４］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様５７～６３のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６５］
筋サテライト細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である，態様５７～６４のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６６］
筋サテライト細胞が筋ジストロフィー患者由来の細胞である，態様５７～６５のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６７］
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である，態様５７～６６のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６８］
凍結されている，態様５７～６７のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６９］
１つの容器に納められている，態様５７～６８のいずれか記載の細胞組成物。
［態様７０］
筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化，増殖または生存に影響する物質のスクリーニング方法であって，
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンの存在下で筋サテライト細胞を培養する工程，
培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞に試験物質を接触させる工程，
試験物質が筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化，増殖または生存に影響するか否かを評価する工程
を含む，方法。
［態様７１］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様７０記載のスクリーニング方法。
［態様７２］
レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，態様７０または７１記載のスクリーニング方法。
［態様７３］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様７０～７２のいずれか記載のスクリーニング方法。
［態様７４］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様７０～７３のいずれか記載のスクリーニング方法。
［態様７５］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様７０～７４のいずれか記載のスクリーニング方法。
［態様７６］
筋サテライト細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である，態様７０～７５のいずれか記載のスクリーニング方法。
［態様７７］
筋サテライト細胞が筋ジストロフィー患者由来の細胞である，態様７０～７６のいずれか記載のスクリーニング方法。
［態様７８］
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である，態様７０～７７のいずれか記載のスクリーニング方法。
上述のとおり，レチノイドとラミニンを含む培地中で細胞を培養することによって，筋幹細胞の未分化性を保持したまま，細胞を増殖させることが可能であることが見出された。以下に，本発明を詳細に説明する。
筋幹細胞（筋サテライト細胞）
骨格筋の組織幹細胞は，筋幹細胞あるいは筋サテライト細胞と呼ばれる小さな多能性の細胞であり，基底膜と筋鞘の間に存在している。筋サテライト細胞は，通常は細胞周期の静止期にとどまり未分化状態を維持しているが，骨格筋に何らかの損傷を受けると活性化して分裂し，筋芽細胞へと分化し，筋管を形成して筋線維を再生させる。
骨格筋の組織幹細胞は，筋幹細胞あるいは筋サテライト細胞と呼ばれる小さな多能性の細胞であり，基底膜と筋鞘の間に存在している。筋サテライト細胞は，通常は細胞周期の静止期にとどまり未分化状態を維持しているが，骨格筋に何らかの損傷を受けると活性化して分裂し，筋芽細胞へと分化し，筋管を形成して筋線維を再生させる。
静止期の未分化の筋サテライト細胞は，Ｐａｘ７の発現を指標として同定することができる。筋サテライト細胞の活性化により筋芽細胞が分化するにつれて，Ｐａｘ７の発現は減少し，ＭｙｏＤの発現が上昇する。さらに，筋芽細胞が筋管を形成するのに伴い，ミオゲニンの発現が上昇する。また，筋細胞が融合した筋管は，抗ミオシン重鎖抗体による免疫染色により可視化することができる。
細胞の形態に関しては，未分化の筋サテライト細胞は丸い形態を示すのに対し，分化の進んだ細胞は扁平で巨大な形態を示すことから，未分化の筋サテライト細胞を同定することができる。
本発明において用いる筋サテライト細胞は，動物の筋サテライト細胞であることが好ましく，哺乳動物の筋サテライト細胞であることがより好ましく，マウス，ラット，ブタ，ウサギ，サルまたはヒトの筋サテライト細胞であることがさらに好ましく，ヒトまたはマウスの筋サテライト細胞であることがさらに好ましく，ヒトの筋サテライト細胞であることが特に好ましい。
本発明において用いる筋サテライト細胞は，動物の組織から単離することができる。単離方法としては，（ｉ）０．１４％プロテアーゼ（Sigma-Aldrich社）を含むＤＭＥＭ培地で３７°Ｃ，３０分間処理し，ＤＭＥＭ培地による洗浄を行った後に播種する方法，（ｉｉ）酵素消化後にフローサイトメーター（ＢＤ社，AriaII）により単離する方法（Exp Cell Res. 10, 245-255, 2004; Nat Med. 20, 255-264,2014）などが挙げられるが，これらに限定はされない。組織から筋サテライト細胞を分離する方法は，当業者には公知であり，例えば，Fukada et al. Exp Cell Res2004;296:245-255.を参照してもよい。
本発明において用いる筋サテライト細胞は，動物のＥＳ細胞，ｉＰＳ細胞や，他の幹細胞から作製してもよい。なお，ｉＰＳ細胞等から誘導された細胞は，「サテライト細胞様」筋幹細胞であり得るが，本願においては，これも筋サテライト細胞に含まれるものとみなす。
レチノイド
レチノイドとは，ビタミンＡまたはそれに化学的に関連する一群の化合物のことをいう。ビタミンＡとは，レチノール，レチナール，レチノイン酸（これらをビタミンＡ１と呼ぶ）およびこれらの３－デヒドロ体（ビタミンＡ２と呼ぶ）と，その誘導体の総称で，ビタミンの中の脂溶性ビタミンに分類される。レチノイドは，上皮細胞の増殖を調節する医薬として使用されている。レチノイドは，視力における役割，細胞増殖および分化の調節，骨組織の増殖，免疫機能，および腫瘍抑制遺伝子の活性化など，全身において多くの重要な機能を有している。本発明者らは，レチノイドとラミニンを含む培地中で細胞を培養することによって，筋幹細胞の未分化性を保持したまま，細胞を増殖させることが可能であることを見出した。本発明において使用されうるレチノイドには，トレチノイン，タミバロテンなどが含まれるが，これらに限定はされない。
レチノイドとは，ビタミンＡまたはそれに化学的に関連する一群の化合物のことをいう。ビタミンＡとは，レチノール，レチナール，レチノイン酸（これらをビタミンＡ１と呼ぶ）およびこれらの３－デヒドロ体（ビタミンＡ２と呼ぶ）と，その誘導体の総称で，ビタミンの中の脂溶性ビタミンに分類される。レチノイドは，上皮細胞の増殖を調節する医薬として使用されている。レチノイドは，視力における役割，細胞増殖および分化の調節，骨組織の増殖，免疫機能，および腫瘍抑制遺伝子の活性化など，全身において多くの重要な機能を有している。本発明者らは，レチノイドとラミニンを含む培地中で細胞を培養することによって，筋幹細胞の未分化性を保持したまま，細胞を増殖させることが可能であることを見出した。本発明において使用されうるレチノイドには，トレチノイン，タミバロテンなどが含まれるが，これらに限定はされない。
トレチノイン（オールトランスレチノイン酸（ａｔＲＡ）ともいう）は，ビタミンＡ誘導体の一種であり，レチノイン酸のうち，二重結合がすべてトランス型をとった，オール・トランス異性体である。
タミバロテン（ＡＭ８０，レチノ安息香酸ともいう）は，合成レチノイドであり，トレチノイン（ＡＴＲＡ）耐性急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）に対する化学療法剤として用いられる経口剤である。
本発明において使用されうるレチノイドには，ＲＡＲアゴニストが含まれ，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０などの他のＲＡＲアゴニストも含まれる。本発明において使用されうるレチノイドとしては他に，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３なども挙げられる。
ラミニン
ラミニンは，細胞外マトリクスの高分子量タンパク質（およそ４００～９００ｋＤａ）であり，基底膜の主要な構成要素となっている。ラミニンは，基底膜の重要な成分であり，細胞の分化，遊走，および接着に影響を及ぼす。ラミニンは，α鎖，β鎖およびγ鎖を含むヘテロ三量体タンパク質であり，１５種類のアイソフォームを形成しうる５種のα鎖，３種のβ鎖，および３種のγ鎖が特定されている。
ラミニンは，細胞外マトリクスの高分子量タンパク質（およそ４００～９００ｋＤａ）であり，基底膜の主要な構成要素となっている。ラミニンは，基底膜の重要な成分であり，細胞の分化，遊走，および接着に影響を及ぼす。ラミニンは，α鎖，β鎖およびγ鎖を含むヘテロ三量体タンパク質であり，１５種類のアイソフォームを形成しうる５種のα鎖，３種のβ鎖，および３種のγ鎖が特定されている。
ラミニン分子は各鎖の組成に従って命名される。本明細書においては，例えば，α５鎖，β１鎖及びγ１鎖から構成されるラミニンを「ラミニンα５β１γ１」または「ラミニン５１１」と記載する。その他の１４種類のアイソフォームは，ラミニン１１１，ラミニン２１１，ラミニン１２１，ラミニン２２１，ラミニン３３２，ラミニン３１１，ラミニン３２１，ラミニン４１１，ラミニン４２１，ラミニン５２１，ラミニン２１３，ラミニン４２３，ラミニン５２２，ラミニン５２３と記載される。ラミニンは，全長であってもよいしその一部であってもよく，例えば，ラミニン５１１は，そのα５鎖，β１鎖及びγ１鎖のそれぞれが，互いに独立に，全長であってもよいしその一部であってもよい。ラミニンは，組換えタンパク質の製造および精製が容易であることからＥ８フラグメントであることが好ましく，実用化の観点からヒトラミニンのＥ８フラグメントであることがさらに好ましい。
本明細書においては，ラミニンのＥ８フラグメントのことを単に「ラミニンＥ８」と記載することもあり，また，例えば，ラミニン５１１のＥ８フラグメントのことを「ラミニン５１１Ｅ８」とも記載する（他のラミニンのアイソフォームについても同様）。なお，単に「ラミニンＥ８」と記載したときは，ラミニンのアイソフォームは限定されず，いずれのアイソフォームのラミニンのＥ８フラグメントであってもよいものとする。
ヒトラミニン５１１タンパク質のＥ８フラグメントは，ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を含む幹細胞の培養用基質として，スライドガラスやシャーレなどの培養容器の表面をコーティングすることにより使用されている。本発明者らは，予想外なことに，ラミニンを培養容器底面のコーティングとして用いるのではなく，液体培養培地中にレチノイドと共に含めることによって，筋幹細胞の未分化性を保持したまま，効率的に細胞を増殖させることが可能であることを見出した。このようなレチノイドとラミニンとの組み合わせにより，予想を超える相乗的な効果を得ることができる。なお，ラミニンの液体培地への添加と培養容器表面のコーティングとの併用は，排除されない。
ラミニンのＥ８フラグメントは，マウスラミニンα１β１γ１（以下，「マウスラミニン１１１」とも記す。）をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で，強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（Edgar D., Timpl R., Thoe nen H. The heparin-binding domainof laminin is responsible for its effects on ne urite outgrowth and neuronal survival. EMBO J., 3:1463-1468,1984.，Goodman SL.,
Deutzmann R., von der Mark K.Two distinct cell-binding domains in laminin canin dependently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105: 589-598,1987.）。例えば，ヒトラミニンについてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン１１１のＥ８フラグメント（マウスラミニン１１１Ｅ８）に相当するフラグメントの存在が推定されるが，これらを分離・同定したことは報告されていない。したがって，本発明に用いられるヒトラミニンのＥ８フラグメントは，対応するヒトラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく，マウスラミニン１１１Ｅ８と同様の細胞接着活性を有し，同様の構造を有し，同程度の分子量を有するヒトラミニンのフラグメントであればよい。
Deutzmann R., von der Mark K.Two distinct cell-binding domains in laminin canin dependently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105: 589-598,1987.）。例えば，ヒトラミニンについてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン１１１のＥ８フラグメント（マウスラミニン１１１Ｅ８）に相当するフラグメントの存在が推定されるが，これらを分離・同定したことは報告されていない。したがって，本発明に用いられるヒトラミニンのＥ８フラグメントは，対応するヒトラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく，マウスラミニン１１１Ｅ８と同様の細胞接着活性を有し，同様の構造を有し，同程度の分子量を有するヒトラミニンのフラグメントであればよい。
ラミニンのＥ８フラグメントの製造方法は特に限定されず，例えば，ラミニンの所望のアイソフォームの全長をエラスターゼ等のタンパク質分解酵素で消化し，目的のフラグメントを分取，精製する方法や，組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。製造量，品質の均一性，製造コスト等の観点から，組換えタンパク質として製造することが好ましい。
組換えヒトラミニン（全長またはその一部）は，公知の配列情報と，公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。組換えヒトラミニン５１１Ｅ８の製造方法を例として以下説明する。組換えヒトラミニン５１１Ｅ８の製造方法としては，例えば，ヒトラミニン５１１Ｅ８のα鎖，β鎖およびγ鎖の各タンパク質をコードするＤＮＡをそれぞれ取得し，これをそれぞれ発現ベクターに挿入し，得られた３種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ，３量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造できる。例えば，Ｉｄｏら（Hiroyuki Ido, Aya Nakamu ra, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Se kiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position fr om the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins ” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154,2007.）に記載の方法に従って作製することができるが，これに限定されるものではない。例えばヒトラミニン５１１を構成するα５鎖，β１鎖，γ１鎖をそれぞれコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は，公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。ラミニンは例えば，これら特定のアミノ酸配列において，少なくとも１個のアミノ酸が欠失，置換及び／又は付加されたタンパク質であってもよい。
ラミニンは，例えば，株式会社ニッピ（東京，日本）から市販されている培養基質ｉＭａｔｒｉｘ５１１－Ｅ８またはｉＭａｔｒｉｘ５１１－Ｅ８－ｓｉｌｋを用いることができる。ｉＭａｔｒｉｘ５１１－Ｅ８は，ヒトラミニン５１１－Ｅ８フラグメントと同一の配列を有する，遺伝子組換えＣＨＯ－Ｓ細胞由来の組換えタンパク質である。ｉＭａｔｒｉｘ５１１－Ｅ８－ｓｉｌｋは，ヒトラミニン５１１－Ｅ８フラグメントと同一の配列を有する，遺伝子組換えカイコ生産系由来の組換えタンパク質である。
細胞培養方法
本発明の一つの態様は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて細胞を培養することを特徴とする，筋サテライト細胞の培養方法に関する。細胞の培養は，例えば，増殖培地（２０％ウシ胎児血清，ペニシリン・ストレプトマイシン，２～１０ｎｇ／ｍｌ最終濃度のｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭ）を用いて，５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて行うことができる。培地の組成，培養条件（温度，期間等）は，当業者であれば適宜調整することができる。培地には，Ｇ－ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１α，ＩＬ－１３，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤（例えば，Stem cell reports, 2015, 5, p621-632に記載のＳＢ２０３５８０），または（Ｒ）－ＰＦＩ－２（Cell stem cell 22, 177-190, 2018）などの他の因子がさらに含まれていてもよい。培養容器としては，例えば，シャーレ，細胞培養皿，細胞培養フラスコなどを使用することができる。
本発明の一つの態様は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて細胞を培養することを特徴とする，筋サテライト細胞の培養方法に関する。細胞の培養は，例えば，増殖培地（２０％ウシ胎児血清，ペニシリン・ストレプトマイシン，２～１０ｎｇ／ｍｌ最終濃度のｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭ）を用いて，５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて行うことができる。培地の組成，培養条件（温度，期間等）は，当業者であれば適宜調整することができる。培地には，Ｇ－ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１α，ＩＬ－１３，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤（例えば，Stem cell reports, 2015, 5, p621-632に記載のＳＢ２０３５８０），または（Ｒ）－ＰＦＩ－２（Cell stem cell 22, 177-190, 2018）などの他の因子がさらに含まれていてもよい。培養容器としては，例えば，シャーレ，細胞培養皿，細胞培養フラスコなどを使用することができる。
また，筋サテライト細胞の培養時には，酸素濃度を適宜調整することができる。例えば，Ｏ２の濃度は，少なくとも０．５％以上，１％以上，２％以上，３％以上，４％以上，５％以上，６％以上のいずれかの濃度とすることができる。また，Ｏ２は１０％以下，８％以下，６％以下，５％以下，４％以下，３％以下とすることができる。Ｏ２濃度は，上記の上限および下限の任意の組み合わせ，例えば，１％～５％の範囲，好ましくは２％～４％の範囲とすることができる。ヒト細胞の培養の場合，好適なＯ２濃度は例えば２．５～３．５％，より具体的には３％である。よって，ヒト細胞の培養は，例えば，増殖培地（２０％ウシ胎児血清，ペニシリン・ストレプトマイシン・グルタミン酸，２．５ｎｇ／ｍｌ最終濃度のｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭ，Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅを用いて３７℃，３％Ｏ２， ５％ＣＯ２インキュベーター内で行うことができる。このように，本発明の一つの態様は，２～４％の酸素濃度，好ましくは３％Ｏ２の存在下で細胞を培養することを特徴とする，筋サテライト細胞の培養方法に関する。
レチノイドは，少なくとも１０－１３Ｍ以上，１０－１２Ｍ以上，１０－１１Ｍ以上，１０－１０Ｍ以上，１０－９Ｍ以上，１０－８Ｍ以上，１０－７Ｍ以上，１０－６Ｍ以上，１０－５Ｍ以上，１０－４Ｍ以上，１０－３Ｍ以上のいずれかの濃度で培地に添加することができる。また，レチノイドは，１０－２Ｍ未満，１０－３Ｍ未満，１０－４Ｍ未満，１０－５Ｍ未満，１０－６Ｍ未満，１０－７Ｍ未満，１０－８Ｍ未満，１０－９Ｍ未満，１０－１０Ｍ未満，１０－１１Ｍ未満，１０－１２Ｍ未満のいずれかの濃度で添加することができる。よって，レチノイドは，上記の上限および下限の任意の組み合わせ，例えば，１０－１１Ｍ～１０－５Ｍの濃度範囲，好ましくは１０－１０Ｍ～１０－６Ｍの濃度範囲，１０－９Ｍ～１０－７Ｍの濃度範囲のいずれかの濃度で添加することができる。好適なレチノイドの添加濃度は例えば，１０－８Ｍまたは１０－７Ｍである。
本発明の一部の態様では，１０－８Ｍまたは１０－７ＭのａｔＲＡまたはＡＭ８０を使用することができる。
ラミニンは，培養容器の底面積に基づき，少なくとも０．０１μｇ／ｃｍ２以上，０．０５μｇ／ｃｍ２以上，０．１μｇ／ｃｍ２以上，０．２μｇ／ｃｍ２以上，０．３μｇ／ｃｍ２以上，０．４μｇ／ｃｍ２以上，０．５μｇ／ｃｍ２以上，０．６μｇ／ｃｍ２以上，０．７μｇ／ｃｍ２以上，０．８μｇ／ｃｍ２以上，０．９μｇ／ｃｍ２以上，１．０μｇ／ｃｍ２以上，１．５μｇ／ｃｍ２以上，２．０μｇ／ｃｍ２以上のいずれかの濃度で培地に添加あるいは培養容器にコーティングすることができる。また，レチノイドは，５．０μｇ／ｃｍ２未満，２．０μｇ／ｃｍ２未満，１．５μｇ／ｃｍ２未満，１．０μｇ／ｃｍ２未満，０．９μｇ／ｃｍ２未満，０．８μｇ／ｃｍ２未満，０．７μｇ／ｃｍ２未満，０．６μｇ／ｃｍ２未満，０．５μｇ／ｃｍ２未満，０．４μｇ／ｃｍ２未満，０．３μｇ／ｃｍ２未満，０．２μｇ／ｃｍ２未満，０．１μｇ／ｃｍ２未満，０．０５μｇ／ｃｍ２未満のいずれかの濃度で培地に添加あるいは培養容器にコーティングすることができる。よって，レチノイドは，上記の上限および下限の任意の組み合わせ，例えば，０．０１μｇ／ｃｍ２～５．０μｇ／ｃｍ２の濃度範囲，好ましくは０．１μｇ／ｃｍ２～１．０μｇ／ｃｍ２の濃度範囲，０．２μｇ／ｃｍ２～０．５μｇ／ｃｍ２の濃度範囲のいずれかの濃度で培地に添加あるいは培養容器にコーティングすることができる。好適なラミニンの使用濃度は例えば，０．２μｇ／ｃｍ２または０．５μｇ／ｃｍ２である。
ラミニンは，液体培地中における濃度の観点では，少なくとも０．１μｇ／ｍｌ以上，０．５μｇ／ｍｌ以上，１．０μｇ／ｍｌ以上，１．５μｇ／ｍｌ以上，２．０μｇ／ｍｌ以上，３．０μｇ／ｍｌ以上，４．０μｇ／ｍｌ以上，５．０μｇ／ｍｌ以上，６．０μｇ／ｍｌ以上，７．０μｇ／ｍｌ以上，８．０μｇ／ｍｌ以上，９．０μｇ／ｍｌ以上，１０．０μｇ／ｍｌ以上のいずれかの濃度で培地に添加することができる。また，レチノイドは，１５．０μｇ／ｍｌ未満，１０．０μｇ／ｍｌ未満，９．０μｇ／ｍｌ未満，８．０μｇ／ｍｌ未満，７．０μｇ／ｍｌ未満，６．０μｇ／ｍｌ未満，５．０μｇ／ｍｌ未満，４．０μｇ／ｍｌ未満，３．０μｇ／ｍｌ未満，２．０μｇ／ｍｌ未満，１．５μｇ／ｍｌ未満，１．０μｇ／ｍｌ未満，０．５μｇ／ｍｌ未満，０．１μｇ／ｍｌ未満，０．０５μｇ／ｍｌ未満のいずれかの濃度で培地に添加することができる。よって，レチノイドは，上記の上限および下限の任意の組み合わせ，例えば，０．０５μｇ／ｍｌ～１５．０μｇ／ｍｌの濃度範囲，好ましくは１．０μｇ／ｍｌ～１０．０μｇ／ｍｌの濃度範囲，１．５μｇ／ｍｌ～５．０μｇ／ｍｌの濃度範囲のいずれかの濃度で添加することができる。本発明において０．２μｇ／ｃｍ２のラミニン濃度は，１．５～２μｇ／ｍｌに相当する。よって，好適なラミニンの添加濃度は例えば，１．５μｇ／ｍｌ，２．０μｇ／ｍｌまたは５．０μｇ／ｍｌである。
本発明の一部の態様では，０．２μｇ／ｃｍ２または０．５μｇ／ｃｍ２のヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントを使用することができる。本発明の一部の態様では，１．５μｇ／ｍｌ，２．０μｇ／ｍｌまたは５．０μｇ／ｍｌのヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントを使用することができる。
分化抑制剤
本発明の一つの態様は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含むことを特徴とする，筋サテライト細胞の筋分化を抑制するための組成物に関する。このような組成物を培地に加えて筋サテライト細胞，好ましくはヒトの筋サテライト細胞を培養することにより，細胞の筋分化を抑制しながら細胞を増殖させることができる。このような組成物は，分化抑制剤と呼ぶこともできる。使用するレチノイド，ラミニンおよび組成物中の他の成分の種類，濃度等は，本明細書の開示および技術常識に基づき適宜決定することができる。
本発明の一つの態様は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含むことを特徴とする，筋サテライト細胞の筋分化を抑制するための組成物に関する。このような組成物を培地に加えて筋サテライト細胞，好ましくはヒトの筋サテライト細胞を培養することにより，細胞の筋分化を抑制しながら細胞を増殖させることができる。このような組成物は，分化抑制剤と呼ぶこともできる。使用するレチノイド，ラミニンおよび組成物中の他の成分の種類，濃度等は，本明細書の開示および技術常識に基づき適宜決定することができる。
分化誘導
本発明に係る分化抑制剤を含む培地を用いて増殖させた筋サテライト細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで筋肉細胞に分化させるためには，培地を本発明に係る分化抑制剤を含まない分化培地（例えば，２％ウマ血清，ペニシリン・ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）に交換して，細胞を培養することができる。
本発明に係る分化抑制剤を含む培地を用いて増殖させた筋サテライト細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで筋肉細胞に分化させるためには，培地を本発明に係る分化抑制剤を含まない分化培地（例えば，２％ウマ血清，ペニシリン・ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）に交換して，細胞を培養することができる。
培地組成物
本発明の一つの態様は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含むことを特徴とする，細胞培養培地に関する。このような培地を用いて筋サテライト細胞，好ましくはヒトの筋サテライト細胞を培養することにより，筋サテライト細胞の未分化性を維持しながら細胞を増殖させることができる。使用するレチノイド，ラミニンおよび培地組成物中の他の成分の種類，濃度等は，本明細書の開示および技術常識に基づき適宜決定することができる。本発明の一つの態様は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，ヒト筋サテライト細胞を培養するための液体細胞培養培地であって，レチノイドがａｔＲＡまたはＡＭ８０であり，レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍであり，ラミニンがヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントであり，ラミニンが液体培地中に含められており，ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌであり，そして，培地中で培養されたヒト筋サテライト細胞の未分化性が維持される，細胞培養培地に関する。
本発明の一つの態様は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含むことを特徴とする，細胞培養培地に関する。このような培地を用いて筋サテライト細胞，好ましくはヒトの筋サテライト細胞を培養することにより，筋サテライト細胞の未分化性を維持しながら細胞を増殖させることができる。使用するレチノイド，ラミニンおよび培地組成物中の他の成分の種類，濃度等は，本明細書の開示および技術常識に基づき適宜決定することができる。本発明の一つの態様は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，ヒト筋サテライト細胞を培養するための液体細胞培養培地であって，レチノイドがａｔＲＡまたはＡＭ８０であり，レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍであり，ラミニンがヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントであり，ラミニンが液体培地中に含められており，ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌであり，そして，培地中で培養されたヒト筋サテライト細胞の未分化性が維持される，細胞培養培地に関する。
培地サプリメント
本発明の一つの態様は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含むことを特徴とする，細胞培養培地サプリメントに関する。このようなサプリメントを培養培地に加えて筋サテライト細胞，好ましくはヒトの筋サテライト細胞を培養することにより，細胞の筋分化を抑制しながら細胞を増殖させることができる。使用するレチノイド，ラミニンおよびサプリメント中の他の成分の種類，濃度等は，本明細書の開示および技術常識に基づき適宜決定することができる。本サプリメントは，液体の形態であっても，粉末の形態であってもよい。本培地サプリメントは，筋サテライト細胞の培養に使用するキットに要素の一つとして含められてもよい。
本発明の一つの態様は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含むことを特徴とする，細胞培養培地サプリメントに関する。このようなサプリメントを培養培地に加えて筋サテライト細胞，好ましくはヒトの筋サテライト細胞を培養することにより，細胞の筋分化を抑制しながら細胞を増殖させることができる。使用するレチノイド，ラミニンおよびサプリメント中の他の成分の種類，濃度等は，本明細書の開示および技術常識に基づき適宜決定することができる。本サプリメントは，液体の形態であっても，粉末の形態であってもよい。本培地サプリメントは，筋サテライト細胞の培養に使用するキットに要素の一つとして含められてもよい。
本細胞培養培地サプリメントは，例えば，細胞培養培地に加えられた際のレチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍとなるように調製されうる。また，本細胞培養培地サプリメントは，例えば，細胞培養培地に加えられた際のラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌとなるように調製されうる。本細胞培養培地サプリメントは，Ｇ－ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１α，ＩＬ－１３，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤（例えば，Stem cell reports, 2015, 5, p621-632に記載のＳＢ２０３５８０），（Ｒ）－ＰＦＩ－２（Cell stem cell 22, 177-190, 2018）およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含んでいてもよい。
細胞製造方法
本発明の一つの態様は，細胞移植に用いるための細胞の製造方法であって，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程を含むことを特徴とする，細胞の製造方法に関する。培養する筋サテライト細胞は，当業者に公知の任意の方法を用いて調製することができる。使用する培地の組成，培養条件（温度，期間等）は，当業者であれば適宜調整することができる。
本発明の一つの態様は，細胞移植に用いるための細胞の製造方法であって，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程を含むことを特徴とする，細胞の製造方法に関する。培養する筋サテライト細胞は，当業者に公知の任意の方法を用いて調製することができる。使用する培地の組成，培養条件（温度，期間等）は，当業者であれば適宜調整することができる。
細胞の移植は，例えば，損傷した部位の再生を目的として，あるいは機能の低下した臓器・組織の再生を目的として行うことができる。移植の対象は，好ましくはヒトであるが，特に限定はされない。ヒトに対して移植を行う場合は，細胞の培養にはＧＭＰグレードの試薬が用いられる。本製造方法において用いられる筋サテライト細胞は，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのゲノム編集技術等によって遺伝子を改変した細胞であってもよい。
細胞組成物
本発明の一つの態様は，少なくとも１０５個の筋サテライト細胞を含む細胞組成物に関する。従来，筋サテライト細胞を未分化状態を維持したまま増殖させて大量に得ることは困難であったが，このような細胞組成物は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養することにより調製されうる。本細胞組成物は，少なくとも１０５個，例えば，１０６個以上，好ましくは１０７個以上，より好ましくは１０８個以上，さらに好ましくは１０９個以上の筋サテライト細胞を含む。なお，本細胞組成物には筋サテライト細胞以外の細胞が混入していても良いが，筋サテライト細胞の純度が高いことが好ましい。本細胞組成物における筋サテライト細胞の純度は，少なくとも５０％以上，好ましくは８０％以上，より好ましくは８５％以上，９０％以上，または９５％以上である。本細胞組成物に含まれる細胞は，好ましくはヒトの細胞であるが，特に限定はされない。本発明の一つの態様では，筋サテライト細胞を含む細胞組成物は１つの容器に納められている。
本発明の一つの態様は，少なくとも１０５個の筋サテライト細胞を含む細胞組成物に関する。従来，筋サテライト細胞を未分化状態を維持したまま増殖させて大量に得ることは困難であったが，このような細胞組成物は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養することにより調製されうる。本細胞組成物は，少なくとも１０５個，例えば，１０６個以上，好ましくは１０７個以上，より好ましくは１０８個以上，さらに好ましくは１０９個以上の筋サテライト細胞を含む。なお，本細胞組成物には筋サテライト細胞以外の細胞が混入していても良いが，筋サテライト細胞の純度が高いことが好ましい。本細胞組成物における筋サテライト細胞の純度は，少なくとも５０％以上，好ましくは８０％以上，より好ましくは８５％以上，９０％以上，または９５％以上である。本細胞組成物に含まれる細胞は，好ましくはヒトの細胞であるが，特に限定はされない。本発明の一つの態様では，筋サテライト細胞を含む細胞組成物は１つの容器に納められている。
本細胞組成物は，例えば，治療を目的とした移植に用いることができる。細胞の移植は，例えば，損傷した部位の再生を目的として，あるいは機能の低下した組織の再生を目的として行うことができる。移植の対象は，好ましくはヒトであるが，特に限定はされない。本発明の一つの態様は，疾患または傷害の治療に用いるための，少なくとも１０５個，例えば，１０６個以上，好ましくは１０７個以上，より好ましくは１０８個以上，さらに好ましくは１０９個以上の筋サテライト細胞を含む細胞組成物に関する。治療の対象となる疾患は例えば，筋ジストロフィー，先天性ミオパチー，遠位型ミオパチー，筋強直性疾患，炎症性筋疾患，周期性四肢麻痺，代謝性筋疾患，重症筋無力症，先天性筋無力症候群，ミトコンドリア病,およびサルコペニアであるが，これらに限定はされない。
本細胞組成物に含まれる筋サテライト細胞は，何らかの疾患を有する患者，または疾患を発症する遺伝的素因を有する被験者に由来する細胞であってもよい。疾患は例えば，筋ジストロフィーである。このような疾患に関連する細胞組成物は，医薬品の開発を目的としたスクリーニングやアッセイに用いることができる。
筋サテライト細胞は，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのゲノム編集技術等によって遺伝子を改変した細胞であってもよい。筋サテライト細胞はｉＰＳ細胞由来の細胞であってもよい。
また，本発明の一つの態様は，少なくとも５×１０５個，例えば，１０６個以上，好ましくは１０７個以上，より好ましくは１０８個以上，さらに好ましくは１０９個以上の筋サテライト細胞の封入されたバイアルまたは容器に関する。バイアルまたは容器は，ガラス製またはプラチック製でありうる。バイアルまたは容器中の細胞は，凍結状態または反凍結状態であってもよい。
治療方法
本発明の一つの態様は，患者における疾患または傷害の治療方法であって，（ｉ）レチノイド，および（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程，および，培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞を患者に移植する工程を含む，治療方法に関する。
本発明の一つの態様は，患者における疾患または傷害の治療方法であって，（ｉ）レチノイド，および（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程，および，培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞を患者に移植する工程を含む，治療方法に関する。
培養する筋サテライト細胞は，当業者に公知の任意の方法を用いて調製することができる。筋サテライト細胞は，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのゲノム編集技術等によって遺伝子を改変した細胞であってもよい。筋サテライト細胞はｉＰＳ細胞由来の細胞であってもよい。筋サテライト細胞に由来する細胞とは，筋サテライト細胞から分化した細胞を含む。使用する培地の組成，培養条件（温度，期間等）は，当業者であれば適宜調整することができる。
細胞の移植は，例えば，損傷した部位の再生を目的として，あるいは機能の低下した臓器・組織の再生を目的として行うことができる。移植の対象となる患者は，好ましくはヒトであるが，特に限定はされない。治療の対象は，イヌ，ネコ，サルなどを含む非ヒト哺乳動物であってもよい。治療の対象となる疾患は例えば，筋ジストロフィー，先天性ミオパチー，遠位型ミオパチー，筋強直性疾患，炎症性筋疾患，周期性四肢麻痺，代謝性筋疾患，重症筋無力症，先天性筋無力症候群，ミトコンドリア病,およびサルコペニアであるが，これらに限定はされない。治療の対象となる疾患には例えば，糖尿病も含まれる。疾患または傷害の治療に有効な物質を分泌するように遺伝子改変した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞を体内に埋め込むことにより，疾患を治療することも可能である。
移植は，例えば，移植部位に細胞を直接注入することにより行うことができる。あるいは，細胞を例えばスキャフォールド上で培養し，スキャフォールドと細胞を共に体内に移植してもよい。
スクリーニング方法
本発明の一つの態様は，筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化，増殖または生存に影響する物質のスクリーニング方法であって，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンの存在下で筋サテライト細胞を培養する工程，培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞に試験物質を接触させる工程，試験物質が筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化，増殖または生存に影響するか否かを評価する工程を含むことを特徴とする方法に関する。
本発明の一つの態様は，筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化，増殖または生存に影響する物質のスクリーニング方法であって，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンの存在下で筋サテライト細胞を培養する工程，培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞に試験物質を接触させる工程，試験物質が筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化，増殖または生存に影響するか否かを評価する工程を含むことを特徴とする方法に関する。
筋サテライト細胞の単離は，当業者に公知の任意の方法により行うことができる。筋サテライト細胞はｉＰＳ細胞由来の細胞であってもよい。
筋サテライト細胞は，何らかの疾患を有する患者，または疾患を発症する遺伝的素因を有する被験者に由来する細胞であってもよい。疾患は例えば，筋ジストロフィーである。例えば，筋ジストロフィー患者の筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の増殖または生存を改善する物質は，筋ジストロフィーの治療に有用となりうると考えられる。「細胞の分化に影響する」とは，細胞の分化を促進または抑制することを含む。「細胞の増殖に影響する」とは，細胞の増殖を促進または抑制することを含む。「細胞の生存に影響する」とは，細胞の生存期間もしくは生存率を改善する，または細胞をアポトーシスやネクローシス等により死滅させることを含む。本スクリーニング方法において用いられる筋サテライト細胞は，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのゲノム編集技術等によって遺伝子を改変した細胞であってもよい。試験物質には，低分子化合物，ペプチド，タンパク質，核酸などが含まれるが，特に限定はない。
以下に，実施例を示して本発明を具体的に説明するが，これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
実施例１：骨格筋幹細胞の調製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（３～１０週齢）の後肢筋（大.四頭筋，前頸骨筋，腓腹筋等）より骨格筋幹細胞を単離した。単離方法としては，（ｉ）０．１４％プロテアーゼ（Sigma-Aldrich社）を含むＤＭＥＭ培地で３７℃，３０分間処理し，ＤＭＥＭ培地による洗浄を行った後に播種する方法，あるいは（ｉｉ）酵素消化後にフローサイトメーター（ＢＤ社，AriaII）により単離する方法（Exp Cell Res. 10, 245-255, 2004; Nat Med. 20 , 255-264,2014）を用いた。得られた骨格筋幹細胞は増殖培地（２０％ウシ胎児血清，ペニシリン・ストレプトマイシン，２～１０ｎｇ／ｍｌ最終濃度のｂＦＧＦ（Peprotec社）を添加したDMEM, High Glucose, GlutaMAX,Pyruvate（Thermo FisherScientific社）で３７℃，５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（３～１０週齢）の後肢筋（大.四頭筋，前頸骨筋，腓腹筋等）より骨格筋幹細胞を単離した。単離方法としては，（ｉ）０．１４％プロテアーゼ（Sigma-Aldrich社）を含むＤＭＥＭ培地で３７℃，３０分間処理し，ＤＭＥＭ培地による洗浄を行った後に播種する方法，あるいは（ｉｉ）酵素消化後にフローサイトメーター（ＢＤ社，AriaII）により単離する方法（Exp Cell Res. 10, 245-255, 2004; Nat Med. 20 , 255-264,2014）を用いた。得られた骨格筋幹細胞は増殖培地（２０％ウシ胎児血清，ペニシリン・ストレプトマイシン，２～１０ｎｇ／ｍｌ最終濃度のｂＦＧＦ（Peprotec社）を添加したDMEM, High Glucose, GlutaMAX,Pyruvate（Thermo FisherScientific社）で３７℃，５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
実施例２：レチノイド化合物の骨格筋幹細胞の未分化性の維持に対する作用
実施例１で調製した骨格筋幹細胞培養系において，オールトランスレチノイン酸（all-trans-Retinoicacid：以下ａｔＲＡ）あるいは合成レチノイド化合物Ａｍ８０を増殖培地に１０－１１Ｍ～１０－５Ｍの濃度で添加し，３７℃，５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。骨格筋幹細胞の未分化性は，以下に示す免疫染色法によって解析した。まず細胞を４％パラホルムアルデヒドにより室温で１０分間固定した後，３回ＰＢＳによって洗浄した。次に０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳによって室温，５分間処理し，再度ＰＢＳによって３回洗浄を行った。５％ＢＳＡ／ＰＢＳで室温，１時間ブロッキング処理を行った後，抗Ｐａｘ７抗体（SantaCruz社）と抗ＭｙｏＤ抗体（Ｄａｋｏ社）を用いて４℃，overnightで処理した。ＰＢＳによって３回洗浄を行った後，二次抗体（抗マウスＩｇＧ－Alexa Fluor594と抗ウサギＩｇＧ－Alexa Fluor488）で室温，１時間処理し，再度ＰＢＳで３回洗浄した後，Hoechst33342を用いて核染色を行い，蛍光顕微鏡（オリンパス社）によって観察した。
実施例１で調製した骨格筋幹細胞培養系において，オールトランスレチノイン酸（all-trans-Retinoicacid：以下ａｔＲＡ）あるいは合成レチノイド化合物Ａｍ８０を増殖培地に１０－１１Ｍ～１０－５Ｍの濃度で添加し，３７℃，５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。骨格筋幹細胞の未分化性は，以下に示す免疫染色法によって解析した。まず細胞を４％パラホルムアルデヒドにより室温で１０分間固定した後，３回ＰＢＳによって洗浄した。次に０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳによって室温，５分間処理し，再度ＰＢＳによって３回洗浄を行った。５％ＢＳＡ／ＰＢＳで室温，１時間ブロッキング処理を行った後，抗Ｐａｘ７抗体（SantaCruz社）と抗ＭｙｏＤ抗体（Ｄａｋｏ社）を用いて４℃，overnightで処理した。ＰＢＳによって３回洗浄を行った後，二次抗体（抗マウスＩｇＧ－Alexa Fluor594と抗ウサギＩｇＧ－Alexa Fluor488）で室温，１時間処理し，再度ＰＢＳで３回洗浄した後，Hoechst33342を用いて核染色を行い，蛍光顕微鏡（オリンパス社）によって観察した。
まず全細胞数中のＭｙｏＤ陽性細胞を算出し，実験に用いた筋細胞培養系の純度を解析した。その結果，１００％筋系譜のＭｙｏＤ陽性細胞であることを確認した。次にＭｙｏＤ陽性細胞中の，未分化性マーカーであるＰａｘ７陽性の細胞（骨格筋幹細胞）割合を解析した。その結果，ａｔＲＡおよびＡｍ８０ともに１０－７Ｍ～１０－５Ｍの濃度でＰａｘ７陽性細胞割合が有意に増加した（図１ａおよびｂ）。
実施例３：レチノイド化合物の骨格筋幹細胞の筋管形成能に対する作用
実施例１で調製した骨格筋幹細胞培養系を分化培地（２％ウマ血清，ペニシリン・ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）で培養し，筋分化を誘導した。さらに分化培地にａｔＲＡあるいはＡｍ８０を１０－１１Ｍ～１０－５Ｍの濃度で添加し，レチノイド化合物の分化能に対する作用を解析した。具体的には抗ミオシン重鎖抗体（Developmental Studies HybridomaBank）による免疫染色を実施例２と同様に行い，筋細胞が融合した筋管を可視化した。
実施例１で調製した骨格筋幹細胞培養系を分化培地（２％ウマ血清，ペニシリン・ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）で培養し，筋分化を誘導した。さらに分化培地にａｔＲＡあるいはＡｍ８０を１０－１１Ｍ～１０－５Ｍの濃度で添加し，レチノイド化合物の分化能に対する作用を解析した。具体的には抗ミオシン重鎖抗体（Developmental Studies HybridomaBank）による免疫染色を実施例２と同様に行い，筋細胞が融合した筋管を可視化した。
結果として，ａｔＲＡ，Ａｍ８０ともに１０－７Ｍおよび１０－５Ｍの濃度で著しく筋管の形成を抑制した（図２）。
実施例４：レチノイド化合物の骨格筋幹細胞の増殖能に対する作用
実施例１で調製した骨格筋幹細胞培養系の増殖培地にａｔＲＡを１０－７Ｍの濃度で添加し，レチノイド化合物の筋細胞の増殖能に対する作用を解析した。解析にはClick-iT(登録商標) Plus EdU AlexaFluor(登録商標) 594 Imaging Kit（Thermo Fisher SCIENTIFIC社）と抗ＭｙｏＤ抗体を用いて，定法に従って検出した。また，免疫染色は実施例２と同様の方法で行った。
実施例１で調製した骨格筋幹細胞培養系の増殖培地にａｔＲＡを１０－７Ｍの濃度で添加し，レチノイド化合物の筋細胞の増殖能に対する作用を解析した。解析にはClick-iT(登録商標) Plus EdU AlexaFluor(登録商標) 594 Imaging Kit（Thermo Fisher SCIENTIFIC社）と抗ＭｙｏＤ抗体を用いて，定法に従って検出した。また，免疫染色は実施例２と同様の方法で行った。
結果として，１０－７ＭのａｔＲＡの添加により，ＭｙｏＤ陽性の骨格筋細胞の増殖能（ＥｄＵを取り込んだ細胞割合）が有意に増加した（図３）。
実施例５：レチノイド化合物添加による骨格筋幹細胞の長期的な維持
実施例１で調製した骨格筋幹細胞培養を１０－７ＭのａｔＲＡを添加あるいは無添加の増殖培地で培養し，５回経代した。これらの細胞におけるＰａｘ７，ミオシン重鎖および内在性コントロールとしてベータチューブリン（β-Tubulin）を定法に従いウェスタンブロット法によって解析した。さらに１０－７ＭのａｔＲＡを添加した増殖培地で１６回経代した骨格筋筋幹細胞培養系における未分化性を抗Ｐａｘ７抗体と抗ＭｙｏＤ抗体を用いて，実施例２と同様に解析した。
実施例１で調製した骨格筋幹細胞培養を１０－７ＭのａｔＲＡを添加あるいは無添加の増殖培地で培養し，５回経代した。これらの細胞におけるＰａｘ７，ミオシン重鎖および内在性コントロールとしてベータチューブリン（β-Tubulin）を定法に従いウェスタンブロット法によって解析した。さらに１０－７ＭのａｔＲＡを添加した増殖培地で１６回経代した骨格筋筋幹細胞培養系における未分化性を抗Ｐａｘ７抗体と抗ＭｙｏＤ抗体を用いて，実施例２と同様に解析した。
結果として，５回の経代によってａｔＲＡ無添加の培地で培養した骨格筋幹細胞は多くの細胞が扁平で巨大な形態を示すのに対し，ａｔＲＡ添加区の細胞はその多くが経代をしていない初代の骨格筋細胞と同様に丸い形態を示した（図４ａおよびｂ）。また，ａｔＲＡ添加区の骨格筋細胞は，無添加区の細胞と比較して幹細胞マーカーであるＰａｘ７を高く発現し，分化マーカーであるミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）の発現が減弱した（図４ｃ）。さらに１６回経代し，長期的に維持した骨格筋幹細胞においても８８％の細胞が未分化マーカーであるＰａｘ７を発現し，１０－７ＭのａｔＲＡの添加することで未分化性を長期に維持できることが明らかとなった。（図５）。また，この細胞を分化培地によって分化誘導したところ，正常にミオシン重鎖を発現する筋管を形成した（図６）。
実施例６：他のレチノイド化合物の筋分化抑制に対する作用
実施例１で調製した骨格筋幹細胞を分化培地にＲＡＲアゴニストであるａｔＲＡ，Ａｍ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，さらにＲＸＲアゴニストであるＰＡ０２４，ＨＸ６３０，ＬＧ２６８を１０－６Ｍ～１０－８Ｍの濃度で添加して９６時間培養した。その後，筋管形成能を比較することによって筋分化抑制に対するレチノイド化合物の作用を解析した。
実施例１で調製した骨格筋幹細胞を分化培地にＲＡＲアゴニストであるａｔＲＡ，Ａｍ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，さらにＲＸＲアゴニストであるＰＡ０２４，ＨＸ６３０，ＬＧ２６８を１０－６Ｍ～１０－８Ｍの濃度で添加して９６時間培養した。その後，筋管形成能を比較することによって筋分化抑制に対するレチノイド化合物の作用を解析した。
結果として，ＲＡＲアゴニストは全て筋管の形成を抑制した。一方，ＲＸＲアゴニストは筋管の形成を抑制しなかった（図７）。
実施例７：培養基質ｉＭａｔｒｉｘ－５１１の骨格筋幹細胞の未分化性維持・分化抑制に対する作用
株式会社ニッピ（東京，日本）から購入した培養基質ｉＭａｔｒｉｘ５１１－Ｅ８－ｓｉｌｋを用いて，骨格筋幹細胞の分化抑制効果を検討した。これまで，ｉＭａｔｒｉｘ-５１１によってヒトＥＳ細胞とｉＰＳ細胞の樹立から拡大まで行えることが報告されている（Sci Rep 4:3594）。また，ｉＭａｔｒｉｘ－５１１は継代時の細胞懸濁液に添加することで，培養皿にプレコーティング（ｐｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇ）した時と同様の効果が得られることが報告されている（Sci Rep 7:41165）。そこで，実施例１で調製した骨格筋幹細胞をＭａｔｒｉｇｅｌでＰｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇした培養皿，０．５μｇ／ｃｍ２となるようｉＭａｔｒｉｘ－５１１でＰｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇした培養皿，継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２，あるいは０．５μｇ／ｃｍ２となるよう添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，４８時間培養した。その後，MACHEREY-NAGEL社のNucleoSpin RNAを用いてＲＮＡを抽出し，ＴＯＹＯＢＯ社のReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Removerを用いて逆転写反応を行い，ｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡをKAPABiosystems社のKAPA SYBR FAST qPCR MasterMixを用いて，Ｐａｘ７，Ｍｙｏｇｅｎｉｎ（Ｍｙｏｇ），さらにMuscle CreatineKinase（ＭＣＫ）の発現量をｑＲＴ－ＰＣＲ法によって解析した。
株式会社ニッピ（東京，日本）から購入した培養基質ｉＭａｔｒｉｘ５１１－Ｅ８－ｓｉｌｋを用いて，骨格筋幹細胞の分化抑制効果を検討した。これまで，ｉＭａｔｒｉｘ-５１１によってヒトＥＳ細胞とｉＰＳ細胞の樹立から拡大まで行えることが報告されている（Sci Rep 4:3594）。また，ｉＭａｔｒｉｘ－５１１は継代時の細胞懸濁液に添加することで，培養皿にプレコーティング（ｐｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇ）した時と同様の効果が得られることが報告されている（Sci Rep 7:41165）。そこで，実施例１で調製した骨格筋幹細胞をＭａｔｒｉｇｅｌでＰｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇした培養皿，０．５μｇ／ｃｍ２となるようｉＭａｔｒｉｘ－５１１でＰｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇした培養皿，継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２，あるいは０．５μｇ／ｃｍ２となるよう添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，４８時間培養した。その後，MACHEREY-NAGEL社のNucleoSpin RNAを用いてＲＮＡを抽出し，ＴＯＹＯＢＯ社のReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Removerを用いて逆転写反応を行い，ｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡをKAPABiosystems社のKAPA SYBR FAST qPCR MasterMixを用いて，Ｐａｘ７，Ｍｙｏｇｅｎｉｎ（Ｍｙｏｇ），さらにMuscle CreatineKinase（ＭＣＫ）の発現量をｑＲＴ－ＰＣＲ法によって解析した。
結果として，ｉＭａｔｒｉｘ－５１１をＰｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇした実験区とｉＭａｔｒｉｘ－５１１を継代時に細胞懸濁液に添加した実験区（０．２μｇ／ｃｍ２および０．５μｇ／ｃｍ２）において，Ｍａｔｒｉｇｅｌをｐｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇした実験区と比較してＭｙｏｇとＭＣＫの発現が有意に減少した。一方，Ｐａｘ７の発現量には影響しなかった。（図８）
実施例８：レチノイド化合物とｉＭａｔｒｉｘ－５１１の骨格筋幹細胞の未分化性維持・分化抑制に対する相乗効果
実施例６と同様に，骨格筋幹細胞を下記の３通りの方法で培養した：
（１）ＭａｔｒｉｇｅｌでＰｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し，増殖培地で培養する方法；
（２）ｉＭａｔｒｉｘ－５１１を継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２となるように添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，増殖培地で培養する方法；
（３）ｉＭａｔｒｉｘ－５１１を継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２となるように添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，１０－７ＭのａｔＲＡを添加した増殖培地で培養する方法。
実施例６と同様に，骨格筋幹細胞を下記の３通りの方法で培養した：
（１）ＭａｔｒｉｇｅｌでＰｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し，増殖培地で培養する方法；
（２）ｉＭａｔｒｉｘ－５１１を継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２となるように添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，増殖培地で培養する方法；
（３）ｉＭａｔｒｉｘ－５１１を継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２となるように添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，１０－７ＭのａｔＲＡを添加した増殖培地で培養する方法。
その後，実施例２と同様の方法でＰａｘ７陽性細胞率およびＭｙｏｇ陽性細胞率から骨格筋幹細胞の未分化性・分化抑制に対するｉＭａｔｒｉｘ－５１１とａｔＲＡの相乗効果を解析した。
結果として，ｉＭａｔｒｉｘ－５１１とａｔＲＡを併用した実験区が最もＰａｘ７の陽性細胞率が高く，Ｍｙｏｇ陽性細胞率が低くなり，筋分化を抑制して未分化性が維持されていることが明らかとなった（図９）。
実施例９：培養基質ｉＭａｔｒｉｘ－５１１とレチノイド化合物添加による骨格筋幹細胞の未分化性維持・分化抑制に対する作用
株式会社ニッピ（東京，日本）から購入した培養基質ｉＭａｔｒｉｘ５１１－Ｅ８－ｓｉｌｋを用いて，骨格筋幹細胞の分化抑制効果を検討した。これまで，ｉＭａｔｒｉｘ－５１１によってヒトＥＳ細胞とｉＰＳ細胞の樹立から拡大まで行えることが報告されている（Sci Rep 4:3594）。また，ｉＭａｔｒｉｘ－５１１は継代時の細胞懸濁液に添加することで，培養皿にプレコーティング（ｐｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇ）した時と同様の効果が得られることが報告されている（Sci Rep 7:41165）。そこで，下記６通りの実験区に実施例１で調製した骨格筋幹細胞を播種し，培養４８時間後に解析した。
（１）Ｍａｔｒｉｇｅｌをｐｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し，増殖培地で培養する方法
（２）Ｍａｔｒｉｇｅｌをｐｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し，１０－７Ｍのオールトランス型レチノイン酸（ａｔＲＡ）を添加した増殖培地で培養する方法
（３）０．２μｇ／ｃｍ２となるようｉＭａｔｒｉｘ－５１１でＰｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し、増殖培地で培養する方法
（４）０．２μｇ／ｃｍ２となるようｉＭａｔｒｉｘ－５１１でＰｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し、１０－７ＭのａｔＲＡを添加した増殖培地で培養する方法
（５）継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２となるよう添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，増殖培地で培養する方法
（６）継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２となるよう添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，１０－７ＭのａｔＲＡを添加した増殖培地で培養する方法
株式会社ニッピ（東京，日本）から購入した培養基質ｉＭａｔｒｉｘ５１１－Ｅ８－ｓｉｌｋを用いて，骨格筋幹細胞の分化抑制効果を検討した。これまで，ｉＭａｔｒｉｘ－５１１によってヒトＥＳ細胞とｉＰＳ細胞の樹立から拡大まで行えることが報告されている（Sci Rep 4:3594）。また，ｉＭａｔｒｉｘ－５１１は継代時の細胞懸濁液に添加することで，培養皿にプレコーティング（ｐｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇ）した時と同様の効果が得られることが報告されている（Sci Rep 7:41165）。そこで，下記６通りの実験区に実施例１で調製した骨格筋幹細胞を播種し，培養４８時間後に解析した。
（１）Ｍａｔｒｉｇｅｌをｐｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し，増殖培地で培養する方法
（２）Ｍａｔｒｉｇｅｌをｐｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し，１０－７Ｍのオールトランス型レチノイン酸（ａｔＲＡ）を添加した増殖培地で培養する方法
（３）０．２μｇ／ｃｍ２となるようｉＭａｔｒｉｘ－５１１でＰｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し、増殖培地で培養する方法
（４）０．２μｇ／ｃｍ２となるようｉＭａｔｒｉｘ－５１１でＰｒｅ－ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し、１０－７ＭのａｔＲＡを添加した増殖培地で培養する方法
（５）継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２となるよう添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，増殖培地で培養する方法
（６）継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２となるよう添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，１０－７ＭのａｔＲＡを添加した増殖培地で培養する方法
培養４８時間後に細胞を４％パラホルムアルデヒドにより室温で１０分間固定した後，３回ＰＢＳによって洗浄した。次に０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳによって室温，５分間処理し，再度ＰＢＳによって３回洗浄を行った。５％ＢＳＡ／ＰＢＳで室温，１時間ブロッキング処理を行った後，抗Ｐａｘ７抗体（Santa Cruz社）と抗ＭｙｏＤ抗体（Ｄａｋｏ社）を用いて４℃，overnightで処理した。ＰＢＳによって３回洗浄を行った後，二次抗体（抗マウスＩｇＧ－Alexa Fluor 594と抗ウサギＩｇＧ－Alexa Fluor 488）で室温，１時間処理し，再度ＰＢＳで３回洗浄した後，Hoechst 33342を用いて核染色を行い，蛍光顕微鏡（オリンパス社）によって観察した。Ｐａｘ７陽性細胞率およびＭｙｏｇ陽性細胞率を解析し，ｉＭａｔｒｉｘ－５１１とレチノイド化合物の相乗効果を検討した。
結果として，ｉＭａｔｒｉｘ－５１１とａｔＲＡを併用した実験区が最もＰａｘ７の陽性細胞率が高く，Ｍｙｏｇ陽性細胞率が低くなり，筋分化を抑制して未分化性が維持されていることが明らかとなった（図１０）。
実施例１０：ヒト骨格筋幹細胞の調製
ヒト骨格筋検体（中臀筋）より骨格筋幹細胞を単離した。単離方法としては，筋検体を酵素消化し単離された細胞を培養後にフローサイトメーター（ＢＤ社，AriaII）により純化する方法（Methods Mol Biol. 1460:241-253, 2016）を用いた。得られた骨格筋幹細胞は増殖培地（２０％ウシ胎児血清，ペニシリン・ストレプトマイシン・グルタミン酸，２.５ｎｇ／ｍｌ最終濃度のｂＦＧＦ（Peprotec社）を添加したＤＭＥＭ，Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ（Thermo Fisher Scientific社）を用いて３７℃，３％Ｏ２, ５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
ヒト骨格筋検体（中臀筋）より骨格筋幹細胞を単離した。単離方法としては，筋検体を酵素消化し単離された細胞を培養後にフローサイトメーター（ＢＤ社，AriaII）により純化する方法（Methods Mol Biol. 1460:241-253, 2016）を用いた。得られた骨格筋幹細胞は増殖培地（２０％ウシ胎児血清，ペニシリン・ストレプトマイシン・グルタミン酸，２.５ｎｇ／ｍｌ最終濃度のｂＦＧＦ（Peprotec社）を添加したＤＭＥＭ，Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ（Thermo Fisher Scientific社）を用いて３７℃，３％Ｏ２, ５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
実施例１１：レチノイド化合物のヒト骨格筋幹細胞の増殖に対する効果
実施例１０で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系において，ａｔＲＡあるいはＡｍ８０を増殖培地に１０－８Ｍ～１０－６Ｍの濃度で添加し，３７℃，３％Ｏ２, ５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。骨格筋幹細胞の増殖をＷＳＴ－８アッセイ（Dojindo社）により評価した。アッセイ溶液添加３時間後，Multiskan JX（Thermo Fisher Scientific社）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定することで細胞増殖の定量を行った。
実施例１０で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系において，ａｔＲＡあるいはＡｍ８０を増殖培地に１０－８Ｍ～１０－６Ｍの濃度で添加し，３７℃，３％Ｏ２, ５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。骨格筋幹細胞の増殖をＷＳＴ－８アッセイ（Dojindo社）により評価した。アッセイ溶液添加３時間後，Multiskan JX（Thermo Fisher Scientific社）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定することで細胞増殖の定量を行った。
その結果，１０－６ＭのＡｍ８０添加によりヒト骨格筋幹細胞の増殖が抑制された（図１１）。
実施例１２：レチノイド化合物のヒト骨格筋幹細胞の筋管形成能に対する作用
実施例１０で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系を分化培地（5％ウマ血清，ペニシリン・ストレプトマイシン・グルタミン酸を含むＤＭＥＭ）で培養し，筋分化を誘導した。さらに分化培地にａｔＲＡあるいはＡｍ８０を１０－８Ｍ～１０－６Ｍの濃度で添加し，レチノイド化合物の分化能に対する作用を解析した。具体的には抗ミオシン重鎖抗体（Developmental Studies Hybridoma Bank）による免疫染色を実施例２と同様に行い，筋細胞が融合した筋管を可視化した。
実施例１０で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系を分化培地（5％ウマ血清，ペニシリン・ストレプトマイシン・グルタミン酸を含むＤＭＥＭ）で培養し，筋分化を誘導した。さらに分化培地にａｔＲＡあるいはＡｍ８０を１０－８Ｍ～１０－６Ｍの濃度で添加し，レチノイド化合物の分化能に対する作用を解析した。具体的には抗ミオシン重鎖抗体（Developmental Studies Hybridoma Bank）による免疫染色を実施例２と同様に行い，筋細胞が融合した筋管を可視化した。
結果として，ａｔＲＡ，Ａｍ８０ともに１０－７Ｍおよび１０－６Ｍの濃度で筋管の形成を抑制したが、分化抑制効果はａｔＲＡの方が強かった（図１２）。
実施例１３：ａｔＲＡのヒト骨格筋幹細胞における筋分化制御因子の発現に及ぼす影響
実施例１０で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系の増殖培地にａｔＲＡを１０－７Ｍ～１０－６Ｍの濃度で添加し，ａｔＲＡの筋分化制御因子の発現に及ぼす影響を解析した。３日間の培養後、RNeasy Micro Kit（Qiagen社）を用いてＲＮＡを単離し、QuantiTect RT Kit（Qiagen社）を用いて逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡを用いてＭＹＯＤ１，ＭＹＯＧの遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲ法（Thermal Cycler Dice: Takara社）で相対定量解析した。内部コントロール遺伝子としてＮＤＵＦＡ１３を用いた。
実施例１０で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系の増殖培地にａｔＲＡを１０－７Ｍ～１０－６Ｍの濃度で添加し，ａｔＲＡの筋分化制御因子の発現に及ぼす影響を解析した。３日間の培養後、RNeasy Micro Kit（Qiagen社）を用いてＲＮＡを単離し、QuantiTect RT Kit（Qiagen社）を用いて逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡを用いてＭＹＯＤ１，ＭＹＯＧの遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲ法（Thermal Cycler Dice: Takara社）で相対定量解析した。内部コントロール遺伝子としてＮＤＵＦＡ１３を用いた。
結果として，１０－７Ｍ～１０－６ＭのａｔＲＡの添加により，ＭＹＯＤ１，ＭＹＯＧの遺伝子発現は抑制されたが、１０－６Ｍの方がより強く抑制された（図１３）。
実施例１４：ａｔＲＡとｉＭａｔｒｉｘ－５１１がヒト骨格筋幹細胞における筋分化制御因子の発現に及ぼす相乗効果
実施例１０で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系の増殖培地にａｔＲＡは１０－６Ｍの濃度で，また，ｉＭａｔｒｉｘ－５１１は０．１～０．５μｇ／ｃｍ２となるように添加し，３日間培養した。実施例１３と同様の方法で，ＭＹＯＤ１，ＭＹＯＧの遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲ法で相対定量解析した。
実施例１０で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系の増殖培地にａｔＲＡは１０－６Ｍの濃度で，また，ｉＭａｔｒｉｘ－５１１は０．１～０．５μｇ／ｃｍ２となるように添加し，３日間培養した。実施例１３と同様の方法で，ＭＹＯＤ１，ＭＹＯＧの遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲ法で相対定量解析した。
その結果，１０－６ＭのａｔＲＡと０．１μｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ－５１１を添加した場合において，ＭＹＯＤ１，ＭＹＯＧの遺伝子発現が最も抑制された（図１４）。
実施例１５：ａｔＲＡとｉＭａｔｒｉｘ－５１１がヒト骨格筋幹細胞の増殖に及ぼす相乗効果
実施例１１と同様の方法で，ヒト骨格筋幹細胞を１０－６ＭのａｔＲＡと０．１μｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ－５１１の存在下で３日間培養した。実施例１１と同様の方法で，細胞増殖の定量を行った。
実施例１１と同様の方法で，ヒト骨格筋幹細胞を１０－６ＭのａｔＲＡと０．１μｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ－５１１の存在下で３日間培養した。実施例１１と同様の方法で，細胞増殖の定量を行った。
その結果，１０－６ＭのａｔＲＡと０．１μｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ－５１１の添加によりヒト骨格筋幹細胞の増殖が促進された（図１５）。
実施例１６：ａｔＲＡとｉＭａｔｒｉｘ－５１１がヒト骨格筋幹細胞の移植効率に及ぼす影響
実施例１１と同様の方法で，ヒト骨格筋幹細胞を１０－６ＭのａｔＲＡと０．１μｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ－５１１の存在下で培養した。５週齢のＮＯＧ－ｍｄｘマウスの前脛骨筋に，培養された細胞を移植した（細胞数４ｘ１０５個）。移植４週間後，前脛骨筋の迅速凍結切片を作成し，ウサギ抗ジストロフィン抗体（Abcam社）とマウス抗ヒトスペクトリン抗体（Leica社），ラット抗ラミニンα２鎖抗体（Santa Cruz社）を用いて染色した。二次抗体（抗ウサギＩｇＧ－Alexa Fluor 488と抗マウスＩｇＧ－Ｃｙ３，抗ラットＩｇＧ－Alexa Fluor 647）による二次染色の後，蛍光顕微鏡（Leica社）によって染色像を取得した。前脛骨筋の断面の全筋線維に対するヒトスペクトリン陽性筋線維の割合を算出し，移植効率とした。
実施例１１と同様の方法で，ヒト骨格筋幹細胞を１０－６ＭのａｔＲＡと０．１μｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ－５１１の存在下で培養した。５週齢のＮＯＧ－ｍｄｘマウスの前脛骨筋に，培養された細胞を移植した（細胞数４ｘ１０５個）。移植４週間後，前脛骨筋の迅速凍結切片を作成し，ウサギ抗ジストロフィン抗体（Abcam社）とマウス抗ヒトスペクトリン抗体（Leica社），ラット抗ラミニンα２鎖抗体（Santa Cruz社）を用いて染色した。二次抗体（抗ウサギＩｇＧ－Alexa Fluor 488と抗マウスＩｇＧ－Ｃｙ３，抗ラットＩｇＧ－Alexa Fluor 647）による二次染色の後，蛍光顕微鏡（Leica社）によって染色像を取得した。前脛骨筋の断面の全筋線維に対するヒトスペクトリン陽性筋線維の割合を算出し，移植効率とした。
その結果，１０－６ＭのａｔＲＡと０．１μｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ－５１１を添加し培養されたヒト骨格筋幹細胞が最も高い移植効率を示し（図１６ａ）、その値は細胞移植の治療効果が見込める１０％を超えた（図１６ｂ）。
本明細書には，本発明の好ましい実施態様を示してあるが，そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは，当業者には明らかであり，当業者であれば，本発明から逸脱することなく，様々な変形，変更，置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が，本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また，本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む，全ての刊行物に記載の内容は，その引用によって，本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。
本発明者らは，レチノイドとラミニンを含む培地中で細胞を培養することによって，筋幹細胞の未分化性を保持したまま，細胞を増殖させることが可能であることを見出した。本技術は簡便かつ安全で，高い効率で筋幹細胞の未分化性を維持できることから，筋ジストロフィーをはじめとした筋疾患に対する細胞移植治療や，化合物スクリーニング系の開発，再生医療への応用が期待される。
Claims (21)
- （ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて細胞を培養することを特徴とする，筋サテライト細胞の培養方法。
- レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびそれらの混合物から成る群より選択される，請求項１記載の培養方法。
- レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍである，請求項１または２記載の培養方法。
- ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびそれらの混合物から成る群より選択される，請求項１～３のいずれか一項記載の培養方法。
- 培地がレチノイドおよびラミニンを含む液体培地である，請求項１～４のいずれか一項記載の培養方法。
- ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，請求項１～５のいずれか一項記載の培養方法。
- 培地がＧ－ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１α，ＩＬ－１３，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）－ＰＦＩ－２およびそれらの混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，請求項１～６のいずれか一項記載の培養方法。
- 筋サテライト細胞の未分化性が維持される，請求項１～７のいずれか一項記載の培養方法。
- 筋サテライト細胞がヒトの細胞である，請求項１～８のいずれか一項記載の培養方法。
- （ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む液体培地を用いて細胞を培養することを特徴とする，ヒト筋サテライト細胞の培養方法であって，
レチノイドがａｔＲＡまたはＡＭ８０であり，レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍであり，ラミニンがヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントであり，
ラミニンが液体培地中に含められており，ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌであり，そして
ヒト筋サテライト細胞の未分化性が維持される，培養方法。 - ２～４％のＯ２の存在下で細胞を培養することを特徴とする，請求項１～１０のいずれか一項記載の培養方法。
- （ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，筋サテライト細胞の筋分化を抑制するための組成物。
- （ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，細胞培養培地。
- （ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，ヒト筋サテライト細胞を培養するための液体細胞培養培地であって，
レチノイドがａｔＲＡまたはＡＭ８０であり，レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍであり，
ラミニンがヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントであり，ラミニンが液体培地中に含められており，ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌであり，そして
培地中で培養されたヒト筋サテライト細胞の未分化性が維持される，細胞培養培地。 - （ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，細胞培養培地サプリメント。
- 細胞移植に用いるための細胞の製造方法であって，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程を含む，方法。
- 筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化，増殖または生存に影響する物質のスクリーニング方法であって，
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンの存在下で筋サテライト細胞を培養する工程，培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞に試験物質を接触させる工程，
試験物質が筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化，増殖または生存に影響するか否かを評価する工程
を含む，方法。 - 患者における疾患または傷害の治療方法であって，（ｉ）レチノイド，および（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程，および培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞を患者に移植する工程を含む，方法。
- レチノイドがａｔＲＡまたはＡＭ８０であり，レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍであり，ラミニンがヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントであり，ラミニンが液体培地中に含められており，ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌであり，患者がヒトであり，疾患が筋ジストロフィー，先天性ミオパチー，遠位型ミオパチー，筋強直性疾患，炎症性筋疾患，周期性四肢麻痺，代謝性筋疾患，重症筋無力症，先天性筋無力症候群，ミトコンドリア病，サルコペニアおよび糖尿病から成る群より選択される，請求項１８記載の治療方法。
- 少なくとも５×１０５個の筋サテライト細胞を含む，細胞組成物。
- （ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンをさらに含み，レチノイドがａｔＲＡまたはＡＭ８０であり，レチノイドの濃度が少なくとも１０－８Ｍであり，ラミニンがヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントであり，ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌであり，筋サテライト細胞の純度が少なくとも８５％であり，筋サテライト細胞がヒトの細胞である，請求項２０記載の細胞組成物。
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Ref document number: 2019525683 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
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| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
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| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 18821494 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |