WO2017078029A1 - 筋衛星細胞培養用材料および筋衛星細胞の培養方法 - Google Patents

筋衛星細胞培養用材料および筋衛星細胞の培養方法 Download PDF

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WO2017078029A1
WO2017078029A1 PCT/JP2016/082490 JP2016082490W WO2017078029A1 WO 2017078029 A1 WO2017078029 A1 WO 2017078029A1 JP 2016082490 W JP2016082490 W JP 2016082490W WO 2017078029 A1 WO2017078029 A1 WO 2017078029A1
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laminin
muscle satellite
culture
human
muscle
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PCT/JP2016/082490
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French (fr)
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智宏 赤澤
喜晴 鈴木
洋 馬渕
佳菜 石井
一郎 関矢
関口　清俊
Original Assignee
国立大学法人 東京医科歯科大学
国立大学法人大阪大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a material for culturing muscle satellite cells coated with laminin, a method for culturing muscle satellite cells using the same, a kit for culturing muscle satellite cells, and the like.
  • Muscle satellite cells which are tissue stem cells of skeletal muscle, exist in the gap between the muscle fibers and the basement membrane, and usually remain in the quiescent phase of the cell cycle and maintain an undifferentiated state. However, once muscles are damaged, muscle satellite cells are activated and repair and regenerate muscle tissue through proliferation and differentiation. It is known that the number and function of muscle satellite cells decrease with aging, and as a result, it became vulnerable to damage and atrophy of muscle fibers, leading to a decrease in muscle mass and strength, and sarcopenia. It is thought to develop (see Non-Patent Document 1).
  • Matrigel (trade name) is widely used as an adhesion substrate coated on a culture dish (see Non-Patent Document 2).
  • Matrigel is a protein-mixed gel with unknown constituents derived from a mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor, and therefore is not suitable as a cell culture substrate for human transplantation therapy.
  • Laminin is a heterotrimeric protein composed of three subunits of ⁇ , ⁇ , and ⁇ chains, and 15 types of laminin isoforms have been identified by combinations of ⁇ , ⁇ , and ⁇ chains.
  • laminin ⁇ chain is known to be expressed in a tissue-specific and developmental stage-specific manner.
  • integrins ⁇ 6 ⁇ 1, ⁇ 7 ⁇ 1, ⁇ 6 ⁇ 4, etc.
  • Laminin has a large molecular weight of 200 to 400 kD for each subunit chain, and it is not easy to express and associate them as a recombinant protein and purify it as a heterotrimeric protein.
  • a recombinant E8 fragment was created as the smallest unit retaining laminin integrin-binding activity, enabling mass expression and purification under xenofree conditions. Furthermore, recombinant E8 fragments of the main laminin isoforms [laminin-111 ( ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ 1), laminin-211 ( ⁇ 2 ⁇ 1 ⁇ 1), laminin-332 ( ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ 2), laminin-411 ( ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1), laminin-511 ( ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1)] were prepared. It has been found that the E8 fragment of laminin-511 or laminin-332 is effective in an undifferentiated maintenance culture method for pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells (see Patent Document 1).
  • an object of the present invention is to provide a material for culturing muscle satellite cells to be grown while maintaining undifferentiation and a culture method using the same.
  • Preferred embodiments of the present invention relate to the following matters.
  • a material for culturing muscle satellite cells containing the first laminin 1.
  • the first laminin comprises at least one human laminin selected from the group consisting of human laminin ⁇ 2 ⁇ 1 ⁇ 1, human laminin ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ 2, human laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1, and human laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1. Materials.
  • a method for culturing muscle satellite cells comprising a contact step of bringing muscle satellite cells into contact with the first laminin.
  • the first laminin is a) contained in the medium; 8.
  • the second laminin comprises at least one human laminin selected from the group consisting of human laminin ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ 2, human laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1 and human laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1.
  • kits for culturing muscle satellite cells according to 21 above further comprising at least one selected from the group consisting of a culture device, a second laminin, and a medium for muscle satellite cell cells.
  • a culture material for culturing muscle satellite cells that can be grown while maintaining the undifferentiated state of muscle satellite cells, and a culture method for growing while maintaining the undifferentiated state of muscle satellite cells. it can.
  • Example 1 The analysis result of the expression of the laminin alpha chain in the mouse skeletal muscle tissue of Example 1 is shown.
  • 1B shows an enlarged view of a stained image of laminin ⁇ 3, ⁇ 4, ⁇ 5 chain in FIG. 1A.
  • FIG. The analysis result of the expression of laminin alpha chain around mouse muscle satellite cells after muscle regeneration is shown.
  • the result of the cell adhesion experiment of the mouse muscle satellite cell using the laminin E8 fragment in Example 2 is shown.
  • mouth muscle satellite cell using the laminin E8 fragment in Example 3-1 and the calculation result of the relative value of a Pax7 positive cell rate are shown.
  • the results of mouse muscle satellite cell culture experiments with various laminin E8 fragment combinations in Example 3-2 are shown.
  • Example 4 The analysis result of the expression of the laminin alpha chain in the human muscle tissue of Example 4 is shown.
  • cultivation experiment of the human muscle satellite cell using the laminin E8 fragment in Example 5 is shown.
  • the analysis result of the transplant experiment to the anterior tibial muscle of the mouse muscle satellite cell in Example 6 is shown.
  • the muscle satellite cell culture material of the present embodiment (hereinafter sometimes simply referred to as “culture material”) includes the first laminin.
  • “including” the first laminin is sufficient if the muscle satellite cell culture material and the first laminin are in contact with each other.
  • the first laminin may be coated on the muscle satellite cell culture material. , May be included, or both.
  • the muscle satellite cell culture material is preferably a culture substrate for muscle satellite cell culture or a medium for muscle satellite cell culture.
  • Laminin has been identified with five ⁇ chains, three ⁇ chains, and three ⁇ chains that can form 15 different isoforms.
  • laminin composed of ⁇ 1, ⁇ 1, and ⁇ 1 chains is referred to as “laminin ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ 1” or “laminin 111”.
  • laminin may be a full length or a part thereof.
  • laminin 111 has a full length independently of each other of ⁇ 1, ⁇ 1, and ⁇ 1 chains. Or a part thereof.
  • the laminin of this embodiment preferably contains at least the E8 fragment, and more preferably an E8 fragment because it is easily purified as a recombinant protein. From the viewpoint of practical use, it is more preferably an E8 fragment of human laminin.
  • the E8 fragment of laminin is sometimes simply referred to as “laminin E8”, and for example, the E8 fragment of laminin 111 is also referred to as “laminin 111E8” (another laminin isoform). The same applies to forms).
  • laminin E8 the laminin isoform is not limited, and may be a laminin E8 fragment of any isoform.
  • the E8 fragment of laminin was identified as a fragment having strong cell adhesion activity among fragments obtained by digesting mouse laminin ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ 1 (hereinafter also referred to as “mouse laminin 111”) with elastase ( Edgar D., Timpl R., Thoenen H.
  • the heparin-binding domain of laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth and neuronal survival.
  • EMBO J., 3: 1463-1468, 1984., Goodmanzmann, R. Von der Mark K.Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105: 589-598, 1987.).
  • the E8 fragment of human laminin used in the present invention does not need to be a corresponding elastase digestion product of human laminin, has the same cell adhesion activity as mouse laminin 111E8, has the same structure, Any fragment of human laminin having a molecular weight of the order may be used.
  • the production method of laminin E8 fragment is not particularly limited.
  • the full length of a desired laminin isoform is digested with a proteolytic enzyme such as elastase, and the desired fragment is separated and purified.
  • the manufacturing method etc. are mentioned. From the viewpoint of production amount, quality uniformity, production cost, etc., it is preferable to produce it as a recombinant protein.
  • Recombinant human laminin (full length or a part thereof) can be produced by appropriately using known gene recombination techniques.
  • a method for producing recombinant human laminin 211E8 will be described below as an example.
  • Table 1 shows an example of base sequence information and amino acid sequence information of ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain constituting laminin.
  • the first laminin only needs to have adhesion to muscle satellite cells.
  • the first laminin is a protein in which at least one amino acid is deleted, substituted, and / or added. Also good.
  • the first laminin is preferably an animal laminin, more preferably a mammalian laminin, and even more preferably a mouse, rat, pig, rabbit, monkey or human laminin. From the viewpoint of practical use, human laminin is particularly preferable.
  • the first laminin contained in the culture material may be only one type of laminin or two or more types of laminin.
  • the first laminin is not particularly limited, but preferably includes human laminin, and more preferably includes an E8 fragment of human laminin.
  • the first laminin isoform preferably includes at least one human laminin selected from the group consisting of human laminin ⁇ 2 ⁇ 1 ⁇ 1, human laminin ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ 2, human laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1, and human laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1, and more preferably includes human laminin ⁇ 2 ⁇ 1 ⁇ 1.
  • the first laminin preferably contains at least one E8 fragment of human laminin selected from the group consisting of human laminin ⁇ 2 ⁇ 1 ⁇ 1E8, human laminin ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ 2E8, human laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1E8 and human laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1E8, and more preferably includes an E8 fragment of human laminin ⁇ 2 ⁇ 1 ⁇ 1.
  • the ratio of the E8 fragment of human laminin ⁇ 2 ⁇ 1 ⁇ 1 in all laminins contained in the first laminin is preferably 50% by mass or more, more preferably 70% by mass or more, and 90% by mass. % Or more is more preferable, and may be 100% by mass.
  • the culture substrate for muscle satellite cell culture and the culture medium for muscle satellite cell culture will be described as the culture material of this embodiment.
  • the muscle satellite cell culture material may be a material used for culturing muscle satellite cells.
  • the present invention is not particularly limited thereto.
  • the culture substrate for culturing muscle satellite cells of the present embodiment (sometimes simply referred to as “culture substrate”) includes the first laminin.
  • the first laminin may be coated on the culture substrate or may be encapsulated, and an embodiment in which the first laminin is at least coated on the culture substrate is preferable.
  • the first laminin may be coated on a part or the whole of the culture substrate, and is preferably coated on the surface in contact with the medium during the culture.
  • the culture substrate of this embodiment is preferably coated with the first laminin on the surface of an incubator or the like.
  • the incubator is not limited as long as it can be used for culturing muscle satellite cells. For example, petri dishes, flasks, dishes, plates, coverslips, multiwell plates, culture slides, microcarriers, polyvinylidene fluoride membranes, etc.
  • the polymer film etc. are mentioned.
  • the incubator material include glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, polyolefin, polycarbonate, and acrylic block copolymer (BCF).
  • the culture substrate of the present embodiment may be a scaffold such as a microcarrier, gelatin hydrogel, or collagen sponge.
  • the shape of these scaffolds is not specifically limited, For example, a granular form may be sufficient and a sheet form may be sufficient.
  • Commercially available products may be used as the scaffold, such as Cytodex manufactured by GE Healthcare Biosciences, MedGel manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., and the like.
  • these scaffolds may be coated with the first laminin, may be encapsulated, or both.
  • the method for producing the culture substrate of the present embodiment is not particularly limited, but the first laminin is treated with an appropriate solvent such as PBS, physiological saline, trishydroxymethylaminomethane or 4- (2-hydroxyethyl) -1- Dilute with physiological saline or the like adjusted to neutral pH with piperazine ethanesulfonic acid, and add this solution to a suitable incubator, for example, about 2 ° C. to about 40 ° C., preferably about 2 ° C. to about 37 ° C.
  • the culture substrate having laminin coated on the surface of the incubator can be obtained by allowing to stand for about 1 hour to about 24 hours, preferably about 1 hour to about 15 hours.
  • the incubator is not limited as long as it can be used for culturing muscle satellite cells. Examples thereof include petri dishes, flasks, multiwell plates, culture slides, microcarriers, polymer membranes such as polyvinylidene fluoride membranes, and the like. .
  • the incubator material include glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, polyolefin, polycarbonate, and acrylic block copolymer (BCF).
  • Coating concentration of the first laminin is not particularly limited, but is preferably about 0.5 [mu] g / cm 2 ⁇ about 25 [mu] g / cm 2, from about 0.8 [mu] g / cm 2 ⁇ about 10 [mu] g / cm 2 is more preferable.
  • the coating may be performed at once or twice or more.
  • one isoform of laminin may be coated on a culture substrate and then another isoform of laminin may be further coated thereon.
  • the culture substrate of this embodiment may be coated with human-derived components other than laminin.
  • human-derived components other than laminin.
  • serum components extracellular matrix molecules, growth factors, differentiation inducing factors, morphogenic factors (morphogens) and the like can be mentioned.
  • non-biological components such as a synthetic polymer gel (synthetic polymer) may be coated.
  • the culture substrate of the present embodiment is coated with laminin, so that it is possible to maintain and culture muscle satellite cells while maintaining undifferentiation without using the conventionally used Matrigel. Furthermore, if a medium from which components of different origins are excluded is used, muscle satellite cells can be cultured under culture conditions that are completely free of components of different origins (Xeno-Free). For example, human laminin By culturing human muscle satellite cells using a coated culture substrate, it is possible to provide highly safe human muscle satellite cells that are very unlikely to be immunogenic to humans. .
  • laminin may be included in the culture substrate of the present embodiment.
  • concentration of the first laminin is not particularly limited.
  • it is preferably about 0.5 ⁇ g / cm 2 to about 25 ⁇ g / cm 2 , and about 0.8 ⁇ g / cm 2 to about 10 ⁇ g / cm 2. 2 is more preferable.
  • ⁇ Muscular satellite cell culture medium As one aspect of the culture material of the present invention, it may be a muscle satellite cell culture medium containing the first laminin.
  • the medium for culturing muscle satellite cells the medium described in the explanation of the method for culturing muscle satellite cells described later may be used.
  • the first laminin contained in the muscle satellite cell culture medium the same laminin as the first laminin contained in the muscle satellite cell culture culture substrate can be used.
  • This embodiment provides a method for culturing muscle satellite cells.
  • One aspect of the method for culturing muscle satellite cells of the present invention includes a contact step of bringing the muscle satellite cells into contact with the first laminin.
  • the culture method of the present invention it is possible to proliferate while maintaining the undifferentiated nature of muscle satellite cells.
  • the first laminin is a) contained in the medium; b) contained in the culture substrate; or c) coated on the culture substrate. Accordingly, a mode in which the muscle satellite cell and the first laminin are in contact with each other is preferable, and at least one mode among a), b), and c) may be included, and two or more modes may be included.
  • the above-described culture substrate for muscle satellite cell culture containing the first laminin and / or the medium for muscle satellite cells containing the first laminin More preferably, a culture substrate for culturing muscle satellite cells containing the first laminin is used.
  • the muscle satellite cells used in the culture method of the present embodiment are preferably animal muscle satellite cells, more preferably mammalian muscle satellite cells, and mouse, rat, pig, rabbit, monkey or human muscle. More preferably, it is a satellite cell, more preferably a human or mouse muscle satellite cell, and particularly preferably a human muscle satellite cell.
  • the muscle satellite cell is preferably a muscle satellite cell separated from a tissue, and may be separated from a tissue of an animal such as a human or a mouse using a flow cytometer (FACS (fluorescence activated cell sorting)) or the like. For example, Fukada S, Higuchi S, Segawa M et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody.Exp Cell Res 2004; 296: 245-255.
  • muscle satellite cells may be produced from ES cells or iPS cells.
  • the medium for maintaining undifferentiated muscle satellite cells used in the culture method of the present embodiment is not particularly limited, but a synthetic medium is preferable, and a synthetic medium containing no heterogeneous components (xenofree) is particularly preferable.
  • Commercially available or planned synthetic media include mTeSR1 (trade name, StemCell Technologies), TeSR2 (trade name, StemCell Technologies), StemPro hESC SFM (trade name, Invitrogen), hESF-GRO (trade name, Cell Science Research Co., Ltd.) )). Of these, TeSR2 is a medium that does not contain foreign components.
  • DMEM with GlutaMAX manufactured by Life Technologies
  • FBS fetal bovine serum
  • Chick Embryo Bio manufactured by Exotic Bio
  • Ml penicillin
  • 100 ⁇ g / ml streptomycin manufactured by Life Technologies
  • 5 ng / ml basic-FGF manufactured by ReproCell
  • the media described in the following documents (1) to (5) can be used with appropriate modifications as necessary.
  • a culture material containing the first laminin of the present embodiment may be used, and the cell can be maintained or amplified. If it is, it will not specifically limit.
  • the seeding density of the muscle satellite cells is not particularly limited, but is preferably about 2.0 ⁇ 10 3 cell / cm 2 to about 2.0 ⁇ 10 4 cell / cm 2 , and about 5.0 ⁇ 10 3 cell / cm 2. To about 1.5 ⁇ 10 4 cell / cm 2 , more preferably about 7.0 ⁇ 10 3 cell / cm 2 to about 1.25 ⁇ 10 4 cell / cm 2 .
  • a suitable example of the culture temperature is, for example, a range of 30 to 40 ° C., preferably a range of 36 to 38 ° C., and more preferably 37 ° C.
  • the frequency of medium exchange is not particularly limited as long as cells can be maintained or amplified, but may be, for example, every 1 to 5 days, preferably every 3 days. In the medium exchange, all of the medium may be exchanged or only a part of the medium may be exchanged.
  • passage may be performed as necessary, and the frequency of passage is not particularly limited as long as the cells can be maintained or amplified. For example, every 4 to 12 days, preferably every 6 to 10 days.
  • the first laminin of this embodiment is contained in the medium.
  • the amount of the first laminin contained in the culture medium is not particularly limited, but for example, the first laminin is preferably 0.1 to 0.5 ⁇ g, more preferably, to 7.5 ⁇ 10 3 muscle satellite cells. May be mixed so as to be 0.2 to 0.4 ⁇ g.
  • the muscle satellite cells and a second laminin different from the first laminin it is preferable to include the process of making these contact. Less than, i) a contact step of contacting a muscle satellite cell with a second laminin (hereinafter also referred to as “step (i)”), and ii) culturing the muscle satellite cell using a culture substrate containing the first laminin. Step (hereinafter also referred to as “step (ii)”) Will be described.
  • step (ii) may be included, but by including step (i) and step (ii), muscles that have maintained undifferentiation compared with the case where only step (ii) is performed. Muscle satellite cells can be grown with a higher percentage of satellite cells.
  • step (i) and step (ii) are performed is not limited, both steps may be performed simultaneously, step (ii) may be performed after step (i), and vice versa. Alternatively, step (i) and step (ii) may be repeated alternately.
  • the muscle satellite cell is brought into contact with the second laminin.
  • the second laminin isoform may be one type or two or more types.
  • the second laminin may be full length or a part thereof, and preferably contains an E8 fragment.
  • the isoforms and sizes of the first laminin and the second laminin are independent of each other, and a part or all of them may be the same or different.
  • the second laminin isoform is not particularly limited, but preferably contains at least one human laminin selected from the group consisting of human laminin ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ 2, human laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1, and human laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1. That is, it may be one selected from the group consisting of human laminin ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ 2, human laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1, and human laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1, may be two types, or may include all three types. Of these, it is particularly preferred that the second laminin comprises a mixture of human laminins ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ 2, ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1, and ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1.
  • the total content of human laminin ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ 2, human laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1 and human laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1 is preferably 50% by mass or more, more preferably 70% by mass or more, and more preferably 90% by mass or more. More preferably, it may be 100% by mass.
  • the second laminin preferably contains an E8 fragment of each laminin, and more preferably an E8 fragment of human laminin from the viewpoint of practical use.
  • the mixing ratio of each laminin is not particularly limited.
  • human laminin 332E8 human laminin 411E8 and human laminin 511E8 are used, it is preferable that human laminin 411E8 and human laminin 511E8 each independently represent 50 to 200% by weight, and 70 to 150% by weight with respect to 100% by weight of human laminin 332E8. %, More preferably 80 to 120% by weight, and particularly preferred that each laminin is approximately the same weight.
  • the proliferation of the undifferentiated muscle satellite cell can be further promoted.
  • the present inventors have contacted the second laminin and the muscle satellite cell, so that the second laminin adheres around the muscle satellite cell and the muscle satellite cell is coated, It is presumed that it may easily interact with the first laminin on the culture substrate.
  • the second laminin may be included in the culture medium of muscle satellite cells. That is, it is preferable that the muscle satellite cell and the second laminin are in contact with each other in the culture medium of the muscle satellite cell.
  • the order and method in which the muscle satellite cells and the second laminin are added to the culture medium are not particularly limited.
  • step (ii) of step (i) that is, before seeding the muscle satellite cell on the culture substrate
  • the muscle satellite cell and the second laminin are added. You may perform the contact process made to contact.
  • the second laminin and part or all of the muscle satellite cells to be seeded are included in a medium for muscle satellite cells, and preincubation is performed.
  • a preferred method is to seed the muscular satellite cells in a culture substrate coated with the first laminin.
  • the pre-incubation is preferably about 36 to 38 ° C., more preferably about 37 ° C., preferably about 10 minutes to 2 hours, more preferably about 20 minutes to 1 hour.
  • the muscle satellite cells and the second laminin may be mixed in a medium or the like without being preincubated at a predetermined temperature and time, and transferred directly onto the culture substrate.
  • the muscle satellite cells and the second laminin may be separately transferred onto the culture substrate.
  • the second laminin may be added to the culture medium after seeding the muscle satellite cells together with the medium on the culture substrate, or after the medium containing the second laminin is transferred onto the culture substrate, the muscle satellite cells
  • the second laminin and the muscle satellite cell may be added separately after transferring the medium onto the culture substrate.
  • the amount of the second laminin used in step (i) is not particularly limited.
  • the amount of the second laminin is preferably 0.1 to 0.5 ⁇ g for 7.5 ⁇ 10 3 muscle satellite cells. It may be mixed so that the amount is preferably 0.2 to 0.4 ⁇ g.
  • the muscle satellite cells and the second laminin are added so that the number of the muscle satellite cells is about 5.0 ⁇ 10 3 to 1.0 ⁇ 10 4 per 50 ⁇ l of the medium. And in a medium, and pre-incubation are preferred.
  • step (iii) in addition to the above step (ii) or in addition to the above step (i) and step (ii), A step of bringing a muscle satellite cell into contact with a growth stimulating substance of the muscle satellite cell (hereinafter also referred to as step (iii)). It is preferable to contain.
  • the method for bringing the muscle satellite cells into contact with the growth stimulating substance is not particularly limited, but it is more preferable that the proliferation stimulating substance is contained in the culture medium for the muscle satellite cells to come into contact with the muscle satellite cells.
  • the growth stimulating substance is not particularly limited, and examples thereof include a JAK / STAT inhibitor and an alternative serum. Use of a growth stimulating substance is preferable because the proliferation rate of muscle satellite cells can be improved while maintaining the undifferentiation of muscle satellite cells at a high rate.
  • JAK / STAT inhibitor refers to any compound that can reduce or suppress the amount and / or activity of a JAK / STAT interaction.
  • the JAK / STAT inhibitor may be a JAK inhibitor or a STAT inhibitor.
  • JAK inhibitors down regulate the amount or activity of JAK molecules.
  • STAT inhibitors down-regulate the amount or activity of STAT molecules. Inhibition of these JAK / STAT pathways may involve a variety of mechanisms including direct binding to JAK, direct binding to STAT, or inhibition of expression of a gene encoding JAK or STAT (eg, the JAK / STAT pathway).
  • RNAi for gene silencing, antisense oligonucleotides for down-regulating the JAK / STAT pathway, and the like.
  • a JAK / STAT inhibitor can be a small molecule compound (eg, 4- (4'-hydroxyphenyl) amino-6,7-dimethoxyquinazoline), protein, polypeptide or nucleic acid.
  • JAK / STAT inhibitors for example, non-patent literature “Price FD, von Malt leopard J, Bentzinger CF, Dumont NA, Yin H, Chang NC, Wilson DH, Frenette J, Rudnicki MA. Inhibition of JAK-statlitelite stim cell function. Nat. Med., 20, 1174-81, 2014. ".
  • examples of the JAK / STAT inhibitor include AG490, 5,15-DPP, S3i-201, WP-1034, Static, ruxolitinib, tofacitinib, and varicitinib.
  • the content thereof is not particularly limited, but is preferably 0.5 to 50 nM.
  • the content in the medium is preferably 1.0 to 5 ⁇ 10 3 nM.
  • cultivate may be pluripotent stem cells other than a muscle satellite cell. That is, a cell culturing method comprising a contact step of bringing a pluripotent stem cell into contact with a second laminin, and a step of culturing the pluripotent stem cell on a culture substrate coated with the first laminin. Also good.
  • pluripotent stem cells examples include ES cells (embryonic stem cells) or iPS cells (artificial pluripotent stem cells), particularly skin fibroblast-derived iPS cells, fetal lung cell-derived iPS cells, and foreskin fibers.
  • Examples include blast-derived iPS cells, or cardiac fibroblast-derived iPS cells, mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, and intestinal epithelial stem cells.
  • GS cells pluripotent germ stem cells
  • fusion cells of ES cells and somatic cells can be used.
  • the pluripotent stem cells that can be preferably used in the present invention are primate or rodent cells, and more specifically human, mouse, or rat cells. Alternatively, porcine, rabbit, monkey pluripotent stem cells can also be used.
  • the present invention provides a kit for culturing muscle satellite cells (hereinafter also simply referred to as “kit”).
  • kit for culturing muscle satellite cells
  • the kit of this embodiment includes a first laminin.
  • the kit comprises an incubator, a second laminin, a culture medium for maintaining the undifferentiation of muscle satellite cells, an additive added to the culture medium, a cell growth stimulating factor, an instruction manual, and Other accessories may also be included.
  • the kit of the present embodiment preferably includes an incubator and / or a second laminin in addition to the first laminin.
  • the first laminin, the incubator, and the second laminin included in the kit include, but are not limited to, those described in the present specification.
  • the culture medium may be in any form such as liquid, solid, gel, powder, etc., and may be thawed or dissolved in water.
  • the culture medium may contain all the components in one container, or may be divided into a plurality of containers for each component, and there is no limitation on the type, number, etc. of the culture medium included in the kit. Further, the medium may be used after adding any supplement.
  • the first laminin contains an E8 fragment of human laminin.
  • the first laminin isoform preferably includes at least one human laminin selected from the group consisting of human laminin ⁇ 2 ⁇ 1 ⁇ 1, human laminin ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ 2, human laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1, and human laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1, and more preferably includes human laminin ⁇ 2 ⁇ 1 ⁇ 1. More preferably, the first laminin comprises human laminin ⁇ 2 ⁇ 1 ⁇ 1E8.
  • the second laminin preferably contains an E8 fragment of human laminin.
  • the second laminin isoform preferably includes at least one human laminin selected from the group consisting of human laminin ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ 2, human laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1 and human laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1, and is selected from the group consisting of human laminin ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ 2E8, human laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1E8 and human laminin ⁇ 5 ⁇ 1. More preferably, it comprises at least one human laminin E8 fragment.
  • the second laminin of the kit may be a mixture of human laminin ⁇ 3 ⁇ 3 ⁇ 2, human laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1 and human laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1, and the mixing ratio (weight ratio) may be 1: 1: 1.
  • the first laminin and the second laminin are suitable solvents such as PBS, saline, trishydroxymethylaminomethane or 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethanesulfonic acid. And may be diluted with physiological saline or the like having a neutral pH.
  • the incubator is not limited as long as it can be used for culturing muscle satellite cells, such as a petri dish, flask, multiwell plate, culture slide, microcarrier, polyvinylidene fluoride membrane, etc. A polymer film etc. are mentioned.
  • the material for the incubator include glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, polyolefin, polycarbonate, and acrylic block copolymer (BCF).
  • the muscle satellite cells of this embodiment can be differentiated into myoblasts, myotubes, and muscle fibers by inducing differentiation.
  • differentiation induction for example, the culture medium is changed to DMEM with GlutaMAX (manufactured by Life Technologies), 5% horse serum (manufactured by Life Technologies), 100 units / ml penicillin (manufactured by Life Technologies), and 100 ⁇ g / ml streptomycin (5 ⁇ g / ml streptomycin) It can be performed by culturing under conditions of% CO 2 and 37 ° C.
  • the method of differentiation induction is described in, for example, the non-patent document "ISOLATION AND GROWTH OF MOUSE PRIMARY MYOBLASTS Springer, ML, T. Rando, and HM Blau (1997). Gene delivery to muscle. In Current Protocols in Human Genetics.” You may refer to the method.
  • the present inventors first analyzed the expression of laminin ⁇ chain existing around muscle satellite cells in vivo before examining a method for maintaining undifferentiated muscle satellite cells. It was investigated whether laminin ⁇ chain was functioning. Based on the in vivo expression data, the in vitro culture conditions of muscle satellite cells in an undifferentiated state such as a combination of laminin E8 fragment types were examined. These new culture methods were verified using mouse muscle satellite cells and human muscle satellite cells. This will be specifically described below.
  • Example 1 Expression of laminin ⁇ chain in mouse skeletal muscle tissue> (Tissue immunofluorescence chemical staining) First, the expression of laminin ⁇ chain existing around muscle satellite cells in vivo was analyzed. After 8 weeks old mice were euthanized, the anterior tibial muscle was removed and frozen with isopentane (Wako) cooled with liquid nitrogen. Cryostat (Leica) was used to prepare frozen sections with a thickness of 8 ⁇ m, dried, and then fixed with 4% paraformaldehyde / PBS for 10 minutes at room temperature. M.M. O. M.M.
  • rat anti-laminin ⁇ chain ( ⁇ 1-5) antibody and mouse anti-Pax7 antibody are reacted overnight at 4 ° C. as primary antibodies.
  • mouse / rat IgG-Alexa488 / -Alexa594 was reacted as a secondary antibody for 1 hour at room temperature.
  • it was encapsulated using Mounting medium for fluorescence with DAPI (Vector Laboratories) and analyzed with a confocal laser microscope (Zeiss). It should be noted that the expression of “Pax7” serves as an index of quiescent undifferentiated muscle satellite cells.
  • FIGS. 1A and 1B are images obtained by detecting laminin ⁇ chain and Pax7 by immunofluorescent chemical staining using mouse muscle tissue (anterior tibial muscle).
  • DAPI ′, 6-diamino-2-phenylindole
  • Merge is a diagram in which laminin, Pax7, and DAPI images are electronically fused. From the left are stained images of laminin ⁇ 1, 2, 3, 4, 5 chains. Expression of laminin ⁇ 2 chain derived from the basement membrane was confirmed along the margin of the muscle fiber. Furthermore, the expression of laminin ⁇ 3, 4 and 5 chain was also observed around the periphery of the muscle fiber and particularly around the muscle satellite cell (Pax7 positive cell) (FIG. 1B). Expression of laminin ⁇ 1 chain was not observed.
  • FIG. 1B shows an enlarged view of the stained image of the laminin ⁇ 3, ⁇ 4, ⁇ 5 chain of FIG. 1A.
  • Laminin ⁇ 3, ⁇ 4 and ⁇ 5 chains were expressed and localized around muscle satellite cells.
  • FIG. 1C shows the analysis result of laminin ⁇ chain expressed around muscle satellite cells that seem to have self-replicated after muscle regeneration.
  • Cardiotoxin was injected into mouse anterior tibial muscle to induce muscle regeneration, and a frozen section of the regenerated muscle 7 days later was prepared. From the top, the results of immunostaining of laminin ⁇ 3, 4, 5 chains were analyzed by z-stack images with a confocal laser microscope. The ⁇ 3, ⁇ 4, and ⁇ 5 chains were strongly expressed and localized around the muscle satellite cells that seemed to be self-replicating so as to wrap the muscle satellite cells.
  • the following references (6) to (8) were referred.
  • Example 2 Comparison of adhesion efficiency of mouse muscle satellite cells to laminin E8 fragment> (Isolation of mouse muscle satellite cells) Eight-week-old mice were euthanized, skeletal muscle tissues of the forelimbs and lower limbs were excised, cut with scissors, and then 0.14% type II collagenase (manufactured by Worthington Biochemical) at 37 ° C. for one hour. Processed. Thereafter, the cells were filtered with a cell strainer of 100 ⁇ m and 40 ⁇ m (manufactured by BD Biosciences) to perform antibody labeling.
  • anti-CD31 antibody manufactured by BD Biosciences
  • anti-CD45 antibody manufactured by BD Biosciences
  • anti-Sca1 antibody manufactured by BD Biosciences
  • biotinylated anti-SM / C-2.6 antibody was allowed to react on ice for 20 minutes.
  • Streptavidin-APC BD Biosciences
  • the antibody-reacted cells were suspended in HBSS (manufactured by WAKO) supplemented with 20% FBS (manufactured by Hyclone), 10% HEPES (manufactured by gigco), 100 ⁇ g / ml streptomycin (Life Technologies), and Prodium Iodide ( PI) was added.
  • CD31 negative, CD45 negative, Sca1 negative and SM / C-2.6 positive fractions were sorted as muscle satellite cells.
  • the following cell adhesion experiment was conducted.
  • the muscle satellite cells sorted by the flow cytometer were washed twice with 0.1% BSA / DMEM with GlutaMAX and then seeded on a 96-well plate coated with protein (Matrigel or laminin E8 of each isoform shown in FIG. 2). Incubated for 3 hours at 37 ° C. Thereafter, the culture solution was removed, 0.2% crystal violet / 20% methanol was added, fixed and stained for 10 minutes, and washed twice with pure water. After air drying, the number of stained cells was measured.
  • the laminin used in this example and the following examples is an isoform of human laminin.
  • the horizontal axis represents the type of protein coated on the 96-well plate, and the vertical axis represents the relative ratio of the number of adhered cells in each laminin-coated plate, where the number of cells adhered to Matrigel is 1.
  • “LM” on the horizontal axis represents an E8 fragment of each laminin isoform.
  • “LM111” represents “E8 fragment of human laminin ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ 1”.
  • error bars indicate standard errors in 3 or more independent experiments (n ⁇ 3). Student's t-test is performed, and ** indicates P ⁇ 0.01 with respect to the Matrigel experimental value.
  • laminin (LM) 332, 411, 511E8 showed equivalent or higher cell adhesion activity.
  • LM511E8 significantly increased cell adhesion activity.
  • Example 3-1 Comparison of culture of mouse muscle satellite cells using laminin E8 fragment> The coating was carried out overnight at 4 ° C. in an 8-well chamber (MATUNAMI) with Matrigel or E8 fragment (1.02 ⁇ g / cm 2 ) of each isoform of human laminin (LM) described in FIG. 3A. Washing with PBS was performed before seeding the cells.
  • MATUNAMI 8-well chamber
  • Matrigel or E8 fragment (1.02 ⁇ g / cm 2
  • PBS washing with PBS was performed before seeding the cells.
  • mouse muscle satellite cells sorted with a flow cytometer were prepared, and proteins (matrigel or human laminin described in FIG. 3A) were prepared so that the cell density was 7.5 ⁇ 10 3 cells / cm 2 .
  • the 8 well chamber coated with E8 fragment was seeded.
  • FIG. 3A shows an outline of a method for preparing the sample (ii) and the sample (iii).
  • Culture medium for muscle satellite cell culture is DMEM with GlutaMAX, 20% fetal bovine serum (FBS; Sigma-Aldrich), 1% Chick Embryo extract (US Biological) (US Biological), 100 units / ml penicillin. , used after adding 5ng / ml basic-FGF (ReproCell ), it was 4-6 days of culture under the condition of 5% CO 2, 37 °C. On the third day of culture, the culture medium was changed, and from the fourth day onwards, half of the culture medium was changed every day.
  • Cells of each sample cultured as described above were fixed with 4% paraformaldehyde / PBS for 10 minutes at room temperature, and permeabilized with 0.2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) / PBS for 10 minutes at room temperature. .
  • mouse anti-Pax7 antibody was reacted overnight at 4 ° C. as a primary antibody, washed with PBS, and then mouse IgG-Alexa 488 as a secondary antibody. was allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing with PBS, it was encapsulated using a mounting medium for fluorescence with DAPI, and analyzed with an all-in-one fluorescence microscope BZ-X700 (Keyence).
  • FIGS. 3A (b) and (c) The results are shown in FIGS. 3A (b) and (c).
  • “LM511E8” represents a sample in which muscle satellite cells are seeded in a chamber coated with laminin 511E8, and “pre3 / 4 / 5-LM2” represents laminin 332E8, laminin 411E8, And a sample cultured on a dish coated with laminin 211E8 after preincubation treatment with laminin 511E8 and human muscle satellite cells.
  • FIG. 3A (b) shows an image detected by immunofluorescent chemical staining performed in the same manner as in Example 1. “A Pax7 positive cell number / DAPI relative value” in the upper graph of FIG.
  • 3A (c) is a Pax7 positive cell rate, specifically, the Pax7 positive cell number is divided by the total cell number (DAPI positive cell number). These values are shown as relative values with the value when cultured on Matrigel as 1.
  • the “relative value of Pax7-positive cells” in the lower graph of FIG. 3A (c) shows the relative value of the number of Pax7-positive cells as 1 when cultured on Matrigel.
  • error bars indicate standard errors in three or more independent experiments (n ⁇ 3). Student's t-test is performed, and * indicates P ⁇ 0.05 with respect to the Matrigel experimental value, and ** indicates P ⁇ 0.01.
  • the Pax7 positive cell rate was significantly increased in the sample cultured on LM511E8 and pre3 / 4 / 5-LM2 was further significantly increased compared to the sample of muscle satellite cells cultured on Matrigel. Also, regarding the number of Pax7 positive cells, pre3 / 4 / 5-LM2 was higher than that of the sample cultured on Matrigel.
  • Example 3-1 for a sample cultured with the first laminin type coated on the dish serving as the culture substrate and the second laminin type when preincubation was performed as shown in FIG. 3B.
  • the relative value of the Pax7 positive cell rate was calculated in the same manner as above, and the culture conditions were examined in more detail.
  • the abbreviations in FIG. 3B are as follows.
  • the second laminin was added in an amount of 0.3 ⁇ g in 50 ⁇ l of the culture solution, and when a plurality of laminins were contained in the second laminin, each laminin was equiweighted so that the total amount was 0.3 ⁇ g / 50 ⁇ l.
  • a sample not described for preincubation means a sample in which muscle satellite cells are seeded without using the second laminin.
  • the rate of Pax7 positive cells was significantly increased in samples cultured on dishes coated with LM511E8 compared to samples of muscle satellite cells cultured on Matrigel, prelm3 / 4 / 5-lm2, lm3 / 4/5 On lm2 and solutionlm3 / 4 / 5-lm2 were particularly significant. Among these, prelm3 / 4 / 5-lm2 had the highest average value of Pax7 strong positive cells.
  • Example 4 Expression of laminin ⁇ chain in human muscle tissue> (Immunofluorescent chemical staining of human muscle tissue)
  • laminin ⁇ chain expression was analyzed in the same manner as mouse skeletal muscle tissue.
  • the tissue derived from the half-tendon-like muscle extracted during the anterior cruciate ligament reconstruction was taken out and frozen with isopentane (Wako) cooled with liquid nitrogen.
  • Cryostat (Leica) was used to prepare frozen sections with a thickness of 8 ⁇ m, dried, and then fixed with 4% paraformaldehyde / PBS for 10 minutes at room temperature.
  • mice anti-laminin ⁇ chain ( ⁇ 1-5) antibody and mouse anti-Pax7 antibody are reacted overnight at 4 ° C as primary antibodies.
  • mouse / rat IgG-Alexa488 / -Alexa594 was reacted as a secondary antibody for 1 hour at room temperature. Mounting medium for fluorescence after washing with PBS The sample was encapsulated with DAPI (Vector Laboratories) and analyzed with a confocal laser microscope (Zeiss).
  • FIG. 4 is an image of laminin and Pax7 detected by immunofluorescent chemical staining using human muscle tissue.
  • the expression of laminin ⁇ 2 chain was confirmed along the muscle fiber (FIG. 4 (a)).
  • the expression of laminin ⁇ 3, ⁇ 4 and ⁇ 5 chains was observed around the muscle satellite cells (FIG. 4 (b)). Expression of laminin ⁇ 1 chain was not observed.
  • Example 5 Culture of human muscle satellite cells> (Separation of human muscle satellite cells) Experiments using human samples have been approved by the Tokyo Medical and Dental University School of Medicine Ethics Review Board. The tissue derived from the tendon-like muscle extracted during anterior cruciate ligament reconstruction at the Tokyo Medical and Dental University Hospital is cut with scissors and treated with 0.1% type II collagenase at 37 ° C for 1 hour. did. Thereafter, the cells were filtered through cell strainers of 100 ⁇ m and 40 ⁇ m, followed by antibody labeling.
  • Anti-CD31 antibody, anti-CD45 antibody, anti-CD235a antibody (manufactured by BD Biosciences), anti-CD11b antibody (manufactured by BD Biosciences), anti-CD34 antibody (manufactured by BD Biosciences), anti-CD56 antibody (manufactured by BD Biosciences), anti-integrin ⁇ 7 antibody (manufactured by BD Biosciences) was reacted on ice for 30 minutes. The antibody-reacted cells were suspended in HBSS and PI was added. For FACS, fractions of CD31 negative, CD45 negative, CD235a negative, CD11 negative, CD34 negative, CD56 positive, integrin ⁇ 7 positive were sorted as muscle satellite cells using MoFlo flow cytometer. The following culture experiment was conducted using the sorted human muscle satellite cells.
  • Example 3-1 On the third day of culture, the culture medium was changed, and from the fourth day onwards, half of the culture medium was changed every day.
  • the preincubation treatment was performed in the same manner as in Example 3-1, except that human muscle satellite cells were used instead of mouse muscle satellite cells.
  • human muscle satellite cells were cultured on a dish coated with matrigel.
  • the relative value of the Pax7 positive cell rate and the relative value of the number of Pax7 positive cells were calculated by the same method as in Example 3-1.
  • results are shown in FIGS. 5 (a) and (b).
  • pre345 on2 means a sample cultured on a dish coated with laminin 211E8 after preincubation treatment of laminin 332E8, laminin 411E8, and laminin 511E8 with human muscle satellite cells.
  • “Mt” means a sample cultured on a matrigel-coated dish.
  • FIG. 5A shows an image detected by immunofluorescent chemical staining performed in the same manner as in Example 1.
  • FIG. 5B shows the relative value of the Pax7 positive cell rate and the relative value of the number of Pax7 positive cells. Compared with the case where the dish was coated with Matrigel, the pre345 on2 human muscle satellite cells increased in both the Pax7 positive cell rate and the Pax7 positive cell number.
  • Example 6 Cell transplantation experiment of mouse muscle satellite cells> Similar to the method described in Example 2, mouse muscle satellite cells sorted with a flow cytometer were prepared from C57BL / 6-GFP transgenic mice, and the protein density was adjusted to a cell density of 4.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2. 6-well plates (Thermo Fisher Scientific) coated with (Matrigel or human laminin E8 fragment). (I) A sample in which muscle satellite cells were seeded in a matrigel-coated chamber, and (ii) laminin 332E8, laminin 411E8, laminin 511E8, and muscle satellite cells were preincubated and then E8 fragment of human laminin.
  • a sample (pre3 / 4 / 5-on2) cultured on a chamber coated with laminin 211E8 was prepared.
  • the cells were suspended in a solution (0.3 ⁇ g / 50 ⁇ l) containing laminin 332E8, laminin 411E8, and laminin 511E8 at a mixing weight ratio of 1: 1: 1. After becoming cloudy and reacting at 37 ° C. for 30 minutes, it was seeded on a 6-well plate coated with protein (laminin 211E8).
  • Culture medium is 20% fetal bovine serum (FBS; Sigma-Aldrich), 1% Chick Embryo extract (US Biological) and 100 units / ml penicillin in DMEM with GlutaMAX. used after addition of FGF (ReproCell), it was 4-6 days of culture under the condition of 5% CO 2, 37 °C. On the third day of culture, the culture medium was changed, and from the fourth day onwards, half of the culture medium was changed every day.
  • FBS fetal bovine serum
  • Chick Embryo extract US Biological
  • FGF ReproCell
  • the cultured cells were detached with Trypsin-EDTA (Gibco), adjusted to 2.0 ⁇ 10 5 cells / 50 ⁇ l, and transplanted into the anterior tibial muscle of C57BL / 6 mice that promoted skeletal muscle regeneration. Two weeks after transplantation, the transplanted anterior tibial muscle was removed and frozen with isopentane (Wako) cooled with liquid nitrogen. Cryostat (Leica) was used to prepare frozen sections with a thickness of 8 ⁇ m, dried, and then fixed with 4% paraformaldehyde / PBS for 10 minutes at room temperature. M.M. O.
  • rat anti-Laminin ⁇ 2 chain antibody was reacted overnight at 4 ° C. as the primary antibody, washed with PBS, and then rat IgG-Alexa594 (Invitrogen) as the secondary antibody. Was allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing with PBS, it was encapsulated using Mounting medium for fluorescence with DAPI (Vector Laboratories) and analyzed with a confocal laser microscope (Zeiss).
  • FIG. 6 “pre3 / 4/5 on 2” was preincubated with laminin 332E8, laminin 411E8, laminin 511E8, and human muscle satellite cells, and then cultured on a dish coated with laminin 211E8. It means a sample (sample (ii) above).
  • FIG. 6 (a) is an image in which laminin ⁇ 2, DAPI and GFP are detected by immunofluorescent chemical staining, and the lower part is an enlarged view of each upper part.
  • FIG. 6B shows the relative value of the number of GFP-positive muscle fibers
  • FIG. 6C shows the relative value of the GFP-positive muscle fiber rate.
  • FIG. 6 shows the relative value of the number of GFP-positive muscle fibers
  • the culture substrate for culturing muscle satellite cells coated with laminin according to the present invention it is possible to cultivate muscle satellite cells while maintaining xenofree and undifferentiated without using conventional matrigel. Therefore, it can be expected to be used for efficient cell transplantation regeneration treatment for damaged muscles.

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Abstract

未分化性を維持したまま増殖させる筋衛星細胞の培養用材料及びこれを用いた培養方法を提供することを目的とする。本発明は、ラミニンを含む筋衛星細胞培養用材料、およびこれを用いた筋衛星細胞の培養方法に関する。

Description

筋衛星細胞培養用材料および筋衛星細胞の培養方法
　本発明は、ラミニンがコーティングされている筋衛星細胞培養用材料、これを用いた筋衛星細胞の培養方法および筋衛星細胞培養用キット等に関する。
　骨格筋の組織幹細胞である筋衛星細胞は、筋繊維と基底膜との間隙に存在し、通常は細胞周期の静止期にとどまり未分化状態を維持している。しかし、ひとたび筋が損傷を受けると筋衛星細胞は活性化され、増殖と分化を経て筋組織を修復・再生する。加齢と共に筋衛星細胞の数及び機能が低下することが知られており、そのことにより筋繊維の損傷や萎縮に対して脆弱となった結果、筋量・筋力の低下へと繋がり、サルコペニアを発症すると考えられている（非特許文献１参照）。このような筋衛星細胞の機能不全による筋疾患や筋萎縮、または筋ジストロフィーなどの遺伝性筋疾患の新たな治療法として、局所に筋衛星細胞を移植して筋機能を再生することを目指した細胞移植治療の研究が注目されている。ｉＰＳ細胞から分化誘導する方法が試みられているが、安全性・品質を満たす筋衛星細胞は得られていない。一方、生体組織から得られる筋衛星細胞はわずかであり、移植治療に十分な量を確保するためには、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養して細胞数を増やさなくてはならない。現在、筋衛星細胞の培養には、培養ディッシュ上にコートする接着基質としてマトリゲル（商品名）が汎用されている（非特許文献２参照）。しかしマトリゲルは、マウスＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ腫瘍由来の構成成分未知な蛋白質混合ゲルであるため、ヒト移植治療用の細胞の培養基質としては適さない。
　前述したように、静止期筋衛星細胞は筋繊維と基底膜に挟まれるように存在している。基底膜の主要構成蛋白質の一つにラミニンがある。ラミニンは、α、β、γ鎖の３つのサブユニットから構成されているヘテロ三量体蛋白質で、α、β、γ鎖の組合せによって１５種類のラミニンアイソフォームが同定されている。特にラミニンα鎖は組織特異的・発生段階特異的に発現していることが知られている。ラミニンの細胞接着活性を介する細胞表面レセプターはいくつか同定されているが、その主たるものはインテグリン（α６β１、α７β１、α６β４など）である。ラミニンは、各々サブユニット鎖の分子量がいずれも２００～４００ｋＤと巨大で、それらを組換え蛋白質として発現・会合させヘテロ三量体蛋白質として精製することは容易ではない。
　そこで、ラミニンのインテグリン結合活性を保持した最小単位として組換えＥ８フラグメントが作成され、ゼノフリー条件での大量発現・精製が可能となっている。さらに、主たるラミニンアイソフォーム［ラミニン－１１１（α１β１γ１）、ラミニン－２１１（α２β１γ１）、ラミニン－３３２（α３β３γ２）、ラミニン－４１１（α４β１γ１）、ラミニン－５１１（α５β１γ１）］の組換えＥ８フラグメントが調製され、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞といった多能性幹細胞の未分化維持培養法において、ラミニン－５１１またはラミニン－３３２のＥ８フラグメントが効果的であることが見出されている（特許文献１参照）。
国際公開ＷＯ２０１１／０４３４０５号公報
Grounds MD. Therapies for sarcopenia and regeneration of oldskeletal muscles: more a case of old tissue architecture than old stem cells.Bioarchitecture, 4, 81-87, 2014. Grefte S, Vullinghs S, Kuijpers-Jagtman AM, Torensma R, Von den Hoff JW. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomed Mater, 7, 055004, 2012
　しかしながら、筋衛星細胞の未分化性を維持したまま増殖する培養技術は、上述のとおりニーズが高いにも関わらず十分に確立されていなかった。そこで、本発明は、未分化性を維持したまま増殖させる筋衛星細胞の培養用材料及びこれを用いた培養方法を提供することを目的とする。
　本発明の好ましい態様は以下の事項に関する。
１．　第１のラミニンを含む筋衛星細胞培養用材料。
２．　筋衛星細胞培養用培養基材または筋衛星細胞培養用培地である、上記１記載の筋衛星細胞培養用材料。
３．　第１のラミニンがコーティングされている筋衛星細胞培養用培養基材である、上記１または２記載の筋衛星細胞培養用材料。
４．　前記第１のラミニンが、ヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことを特徴とする上記１～３のいずれかに記載の筋衛星細胞培養用材料。
５．　前記第１のラミニンが、ヒトラミニンα２β１γ１、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１から成る群より選択される少なくとも一種のヒトラミニンを含むことを特徴とする上記１～４のいずれかに記載の筋衛星細胞培養用材料。
６．　前記第１のラミニンが、ヒトラミニンα２β１γ１のＥ８フラグメントを含むことを特徴とする上記１～５のいずれかに記載の筋衛星細胞培養用材料。
７．　筋衛星細胞と第１のラミニンとを接触させる接触工程を含む、筋衛星細胞の培養方法。
８．　第１のラミニンが、
　ａ）培地に含まれている；
　ｂ）培養基材中に含まれている；または
　ｃ）培養基材にコーティングされている
ことを特徴とする、上記７記載の筋衛星細胞の培養方法。
９．　培養基材が、ディッシュ、プレート、カバースリップ、マイクロキャリア、ゼラチンハイドロゲル、またはコラーゲンスポンジであることを特徴とする、上記８記載の筋衛星細胞の培養方法。
１０．　前記接触工程において、上記１～６のいずれかに記載の培養用材料を用いることを特徴とする、上記７に記載の筋衛星細胞の培養方法。
１１．　さらに、筋衛星細胞と第２のラミニンとを接触させる接触工程を含む、上記７～１０のいずれか記載の筋衛星細胞の培養方法。
１２．　前記第２のラミニンが、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１から成る群より選択される少なくとも１種のヒトラミニンを含むことを特徴とする、上記１１に記載の培養方法。
１３．　前記第２のラミニンが、ヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことを特徴とする、上記１１または１２に記載の培養方法。
１４．　ｉ）単離した筋衛星細胞と第２のラミニンとを接触させる工程であって、該第２のラミニンがヒトラミニンα３β３γ２Ｅ８フラグメント、ヒトラミニンα４β１γ１Ｅ８フラグメント、およびヒトラミニンα５β１γ１Ｅ８フラグメントの混合物である工程、および
　ｉｉ）該筋衛星細胞を第１のラミニンがコーティングされている培養基材上で培養する工程であって、該第１のラミニンがヒトラミニンα２β１γ１Ｅ８フラグメントである工程
を含むことを特徴とする、上記１１～１３のいずれかに記載の筋衛星細胞の培養方法。
１５．　前記第２のラミニンが、筋衛星細胞の培養培地中に含まれていることを特徴とする、上記１１～１４のいずれか記載の培養方法。
１６．　前記筋衛星細胞と第２のラミニンとを接触させる接触工程が培養基材上に筋衛星細胞を播種する前に行われることを特徴とする、上記１１～１５のいずれか記載の培養方法。
１７．　さらに、
　筋衛星細胞の増殖刺激物質と筋衛星細胞とを接触させる工程
を含むことを特徴とする、上記７～１６のいずれか記載の培養方法。
１８．　前記筋衛星細胞の増殖刺激物質が、筋衛星細胞の培養培地中に含まれていることを特徴とする、上記１７記載の培養方法。
１９．　前記筋衛星細胞の増殖刺激物質が、ＪＡＫ阻害剤またはＳＴＡＴ阻害剤であることを特徴とする、上記１７または１８に記載の培養方法。
２０．　前記筋衛星細胞が、ヒトまたはマウスの筋衛星細胞であることを特徴とする上記７～１９のいずれか記載の培養方法。
２１．　第１のラミニンを含む筋衛星細胞培養用キット。
２２．　さらに、培養器、第２のラミニン、および筋衛星細胞細胞用の培地からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む、上記２１に記載の筋衛星細胞培養用キット。
２３．　前記第１のラミニンがヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことを特徴とする、上記２１または２２に記載の筋衛星細胞培養用キット。
２４．　前記第１のラミニンが、ヒトラミニンα２β１γ１、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１から成る群より選択される少なくとも一種のヒトラミニンを含むことを特徴とする、上記２１～２３のいずれかに記載の筋衛星細胞培養用キット。
２５．　前記第１のラミニンがヒトラミニンα２β１γ１Ｅ８フラグメントであり、前記第２のラミニンがヒトラミニンα３β３γ２Ｅ８フラグメント、ヒトラミニンα４β１γ１Ｅ８フラグメントおよびヒトラミニンα５β１γ１Ｅ８フラグメントの混合物であることを特徴とする、上記２１～２４のいずれかに記載の筋衛星細胞培養用キット。
　本発明によると、筋衛星細胞の未分化性を維持したまま増殖させることができる筋衛星細胞培養用培養材料、および筋衛星細胞の未分化性を維持したまま増殖させる培養方法を提供することができる。
例１のマウス骨格筋組織におけるラミニンα鎖の発現の解析結果を示す。 図１Ａのラミニンα３、α４、α５鎖の染色像の拡大図を示す。 筋再生後におけるマウス筋衛星細胞周囲のラミニンα鎖の発現の解析結果を示す。 例２におけるラミニンＥ８フラグメントを用いたマウス筋衛星細胞の細胞接着実験の結果を示す。 例３－１におけるラミニンＥ８フラグメントを用いたマウス筋衛星細胞の培養実験における概要図およびＰａｘ７陽性細胞率の相対値の算出結果を示す。 例３－２における様々なラミニンＥ８フラグメントの組み合わせによるマウス筋衛星細胞の培養実験の結果を示す。 例４のヒト筋組織におけるラミニンα鎖の発現の解析結果を示す。 例５におけるラミニンＥ８フラグメントを用いたヒト筋衛星細胞の培養実験の結果を示す。 例６におけるマウス筋衛星細胞の前脛骨筋への移植実験の解析結果を示す。
　本実施形態の筋衛星細胞培養用材料（以下、単に「培養用材料」と記載することもある）は第１のラミニンを含む。ここで、第１のラミニンを「含む」とは、筋衛星細胞培養用材料と第１のラミニンとが接触していればよく、例えば、筋衛星細胞培養用材料にコーティングされていてもよいし、内包されていてもよいし、その両方であってもよい。第１のラミニンを含む培養用材料を用いて筋衛星細胞の培養を行うと、筋衛星細胞が培養用材料に対する十分な接着力を有し、かつ、未分化状態を維持したまま筋衛星細胞を増殖させることができる。筋衛星細胞培養用材料としては、筋衛星細胞培養用培養基材または筋衛星細胞培養用培地であることが好ましい。
（ラミニン）
　ラミニンは、１５種類のアイソフォームを形成しうる、５種のα鎖、３種のβ鎖、および３種のγ鎖が特定されている。本明細書においては、例えば、α１鎖、β１鎖及びγ１鎖から構成されるラミニンを「ラミニンα１β１γ１」または「ラミニン１１１」と記載する。本実施形態においてラミニンは、全長であってもよいしその一部であってもよく、例えば、ラミニン１１１は、そのα１鎖、β１鎖及びγ１鎖のそれぞれが、互いに独立に、全長であってもよいしその一部であってもよい。
　ラミニンのＥ８フラグメントは筋衛星細胞への接着活性が高いことから、本実施形態のラミニンは、少なくともＥ８フラグメントを含むことが好ましく、組換えタンパク質として精製しやすいことからＥ８フラグメントであることがより好ましく、実用化の観点からヒトラミニンのＥ８フラグメントであることがさらに好ましい。本明細書においては、ラミニンのＥ８フラグメントのことを単に「ラミニンＥ８」と記載することもあり、また、例えば、ラミニン１１１のＥ８フラグメントのことを「ラミニン１１１Ｅ８」とも記載する（他のラミニンのアイソフォームについても同様）。なお、単に「ラミニンＥ８」と記載したときは、ラミニンのアイソフォームは限定されず、いずれのアイソフォームのラミニンのＥ８フラグメントであってもよいものとする。
　ラミニンのＥ８フラグメントは、マウスラミニンα１β１γ１（以下、「マウスラミニン１１１」とも記す。）をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（Edgar D., Timpl R., Thoenen H. The heparin-binding domain of laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth and neuronal survival. EMBO J., 3:1463-1468, 1984.、Goodman SL., Deutzmann R., von der Mark K.Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105:589-598, 1987.）。例えば、ヒトラミニンについてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン１１１のＥ８フラグメント（マウスラミニン１１１Ｅ８）に相当するフラグメントの存在が推定されるが、これらを分離・同定したことは報告されていない。したがって、本発明に用いられるヒトラミニンのＥ８フラグメントは、対応するヒトラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、マウスラミニン１１１Ｅ８と同様の細胞接着活性を有し、同様の構造を有し、同程度の分子量を有するヒトラミニンのフラグメントであればよい。
　ラミニンのＥ８フラグメントの製造方法は特に限定されず、例えば、ラミニンの所望のアイソフォームの全長をエラスターゼ等のタンパク質分解酵素で消化し、目的のフラグメントを分取、精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。製造量、品質の均一性、製造コスト等の観点から、組換えタンパク質として製造することが好ましい。
　組換えヒトラミニン（全長またはその一部）は、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。組換えヒトラミニン２１１Ｅ８の製造方法を例として以下説明する。組換えヒトラミニン２１１Ｅ８の製造方法としては、例えば、ヒトラミニン２１１Ｅ８のα鎖、β鎖およびγ鎖の各タンパク質をコードするＤＮＡをそれぞれ取得し、これをそれぞれ発現ベクターに挿入し、得られた３種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ、３量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造できる。例えば、Ｉｄｏら（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.）に記載の方法に従って作製することができるが、これに限定されるものではない。例えばヒトラミニン２１１を構成するα２鎖、β１鎖、γ１鎖をそれぞれコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は、表１に記載したアクセッション番号で公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。表１にラミニンを構成するα鎖、β鎖、γ鎖の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報の一例を記載する。第１のラミニンは、筋衛星細胞との接着性を有していればよく、例えば、これら特定のアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたタンパク質であってもよい。
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　本実施形態において、第１のラミニンは、動物のラミニンであることが好ましく、哺乳動物のラミニンであることがより好ましく、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、サルまたはヒトのラミニンであることがさらに好ましく、実用化の観点からヒトのラミニンであることが特に好ましい。
　培養用材料中に含まれる第１のラミニンは、１種のみのラミニンでもよいし、２種以上のラミニンであってもよい。第１のラミニンとしては、特に限定されないが、ヒトラミニンを含むことが好ましく、ヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことがより好ましい。第１のラミニンのアイソフォームとしては、ヒトラミニンα２β１γ１、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１からなる群より選択される少なくとも一種のヒトラミニンを含むことが好ましく、ヒトラミニンα２β１γ１を含むことがより好ましい。また、第１のラミニンとして、ヒトラミニンα２β１γ１Ｅ８、ヒトラミニンα３β３γ２Ｅ８、ヒトラミニンα４β１γ１Ｅ８およびヒトラミニンα５β１γ１Ｅ８からなる群より選択される少なくとも一種のヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことが好ましく、ヒトラミニンのα２β１γ１のＥ８フラグメントを含むことがより好ましい。本実施形態の一態様として、第１のラミニンに含まれる全ラミニン中、ヒトラミニンα２β１γ１のＥ８フラグメントの割合が５０質量％以上であることが好ましく、７０質量％以上であることがより好ましく、９０質量％以上であることがさらに好ましく、１００質量％であってもよい。これら第１のラミニンを含む培養用材料を用いると、未分化の筋衛星細胞の割合が高い状態を維持して、細胞を培養することができる。
　以下、本実施形態の培養用材料として、筋衛星細胞培養用培養基材および筋衛星細胞培養用培地について説明するが、筋衛星細胞培養用材料は、筋衛星細胞の培養に用いられる材料であればよく、特にこれらに限定されるものではない。
＜筋衛星細胞培養用培養基材＞
　本実施形態の筋衛星細胞培養用培養基材（単に「培養基材」と記載することもある）は、第１のラミニンを含む。第１のラミニンは、培養基材にコーティングされていてもよいし、内包されていてもよく、第１のラミニンが培養基材に少なくともコーティングされている態様が好ましい。第１のラミニンが培養基材にコーティングされている場合、第１のラミニンが培養基材の一部または全部にコーティングされていてよく、好ましくは培養時に培地と接する面にコーティングされている。
　本実施形態の培養基材は、培養器等の表面が第１のラミニンでコーティングされているのが好ましい。培養器としては、筋衛星細胞の培養に使用できるものであれば限定されず、例えば、シャーレ、フラスコ、ディッシュ、プレート、カバースリップ、マルチウェルプレート、カルチャースライド、マイクロキャリア、ポリビニリデンフルオリド膜等のポリマー膜などが挙げられる。また、培養器の素材としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、またはアクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）等が挙げられる。
　また、本実施形態の培養基材は、マイクロキャリア、ゼラチンハイドロゲル、コラーゲンスポンジなどの足場であってもよい。これら足場の形状は特に限定されず、例えば粒状であってもよいし、シート状であってもよい。足場として、市販品を用いてもよく、例えば、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製のＣｙｔｏｄｅｘ、和光純薬工業株式会社製のＭｅｄＧｅｌ等が挙げられる。本実施形態においては、これら足場に第１のラミニンがコーティングされていてもよいし、内包されていてもよいし、その両方であってもよい。
　（筋衛星細胞培養用培養基材の製造方法）
　本実施形態の培養基材の製造方法は、特に限定されないが、第１のラミニンを適当な溶媒、例えばＰＢＳ、生理食塩水、トリスヒドロキシメチルアミノメタンあるいは４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルフォン酸で中性ｐＨとした生理的食塩水などで希釈し、この溶液を適当な培養器に添加して、例えば、約２℃～約４０℃、好ましくは約２℃～約３７℃で、約１時間～約２４時間、好ましくは約１時間から約１５時間静置することにより、ラミニンが培養器表面にコーティングされた培養基材を得ることができる。培養器としては、筋衛星細胞の培養に使用できるものであれば限定されず、例えば、シャーレ、フラスコ、マルチウェルプレート、カルチャースライド、マイクロキャリア、ポリビニリデンフルオリド膜等のポリマー膜などが挙げられる。また、培養器の素材としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、またはアクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）等が挙げられる。
　第１のラミニンのコーティング濃度は、特に限定されないが、約０．５μｇ／ｃｍ２～約２５μｇ／ｃｍ２が好ましく、約０．８μｇ／ｃｍ２～約１０μｇ／ｃｍ２がより好ましい。
　第１のラミニンを培養器上にコーティングする際、コーティングは一度に行ってもよいし、２回以上行ってもよい。例えば、１種のアイソフォームのラミニンを培養基材上にコーティングした後、別のアイソフォームのラミニンをさらにその上にコーティングしてもよい。
　本実施形態の培養基材は、ラミニン以外のヒト由来成分等がコーティングされていてもよい。例えば血清成分、細胞外マトリックス分子、成長因子、分化誘導因子、形態形成因子（モルフォゲン）などが挙げられる。また、合成高分子ゲル（合成ポリマー）などの非生物成分がコーティングされていてもよい。
　本実施形態の培養基材は、ラミニンがコーティングされていることにより、従来用いられていたマトリゲルを用いずに未分化性を保持したまま筋衛星細胞を維持培養することが可能となる。さらに、異種由来の成分が排除されている培地を使用すれば、完全に異種由来の成分を含まない培養条件（ゼノフリー：Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ）で筋衛星細胞を培養することができ、例えば、ヒトラミニンでコーティングされた培養基材を用いてヒト筋衛星細胞を培養することにより、ヒトに対して免疫原性を発現する可能性が非常に低い、安全性の高いヒト筋衛星細胞を提供することができる。
　また、本実施形態の培養基材は、ラミニンが内包されていてもよい。第１のラミニンの内包濃度は、特に限定されないが、例えば、ディッシュのコーティングの場合、約０．５μｇ／ｃｍ２～約２５μｇ／ｃｍ２が好ましく、約０．８μｇ／ｃｍ２～約１０μｇ／ｃｍ２がより好ましい。
＜筋衛星細胞培養用培地＞
　本発明の培養用材料の一態様として、第１のラミニンを含む筋衛星細胞培養用培地であってもよい。筋衛星細胞培養用培地としては後述の筋衛星細胞の培養方法の説明中に記載の培地を用いてよい。また、筋衛星細胞培養用培地に含まれる第１のラミニンとしては、上記筋衛星細胞培養用培養基材に含まれる第１のラミニンと同様のものを用いることができる。
＜筋衛星細胞の培養方法＞
　本実施形態は、筋衛星細胞の培養方法を提供する。本発明の筋衛星細胞の培養方法の一態様は、筋衛星細胞と第１のラミニンとを接触させる接触工程を含む。本発明の培養方法によると、筋衛星細胞の未分化性を維持したまま増殖させることができる。本発明の筋衛星細胞の培養方法においては、第１のラミニンが、ａ）培地に含まれている；ｂ）培養基材中に含まれている；またはｃ）培養基材にコーティングされていることにより、筋衛星細胞と第１のラミニンとが接触する態様が好ましく、ａ）、ｂ）、およびｃ）のうち少なくとも１つの態様を含めばよく、２つ以上の態様を含んでもよい。
　本実施形態の筋衛星細胞の培養方法においては、上述の第１のラミニンを含む筋衛星細胞培養用培養基材および／または第１のラミニンを含む筋衛星細胞用培地を用いることが好ましく、少なくとも第１のラミニンを含む筋衛星細胞培養用培養基材を用いることがより好ましい。
（筋衛星細胞）
　本実施形態の培養方法に用いる筋衛星細胞は、動物の筋衛星細胞であることが好ましく、哺乳動物の筋衛星細胞であることがより好ましく、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、サルまたはヒトの筋衛星細胞であることがさらに好ましく、ヒトまたはマウスの筋衛星細胞であることがさらに好ましく、ヒトの筋衛星細胞であることが特に好ましい。筋衛星細胞は、組織から分離した筋衛星細胞であることが好ましく、ヒトまたはマウス等の動物の組織からフローサイトメーター（ＦＡＣＳ(fluorescence activated cell sorting）)等を用いて分離してもよい。組織から筋衛星細胞を分離する方法は、例えば、Fukada S, Higuchi S, Segawa M et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp Cell Res 2004;296:245-255.を参照してもよい。別の態様として、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から筋衛星細胞を作製してもよい。
（培地）
　本実施形態の培養方法で使用する筋衛星細胞の未分化維持用の培地は、特に限定されないが、合成培地が好ましく、異種成分を含まない（ゼノフリー）合成培地が特に好ましい。市販または市販予定の合成培地としては、ｍＴｅＳＲ１（商品名、StemCell Technologies）、ＴｅＳＲ２（商品名、StemCell Technologies）、ＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ（商品名、Invitrogen）、ｈＥＳＦ－ＧＲＯ（商品名、株式会社細胞科学研究所）等が挙げられる。このうちＴｅＳＲ２が異種成分を含まない培地である。本願の実施例においては、未分化培地として、ＤＭＥＭ　ｗｉｔｈ　ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、２０％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；　Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、１％　Ｃｈｉｃｋ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ｅｘｔｒａｃｔ（ＵＳ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　ａｎｄ　１００μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、および５ｎｇ／ｍｌ　ｂａｓｉｃ－ＦＧＦ（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社製）の混合培地が用いられている。また、以下の文献（１）～（５）に記載された培地も必要に応じて適宜改変を加えて用いられうる。
(1) Liu, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 346:131-139, 2006.
(2) Vallier, L. et al., J. Cell Sci. 118:4495-4509, 2005.
(3) Li, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 91:688-698, 2005.
(4) Yao, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:6907-6912, 2006.
(5) Lu, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:5688-5693, 2006.
（培養方法）
　筋衛星細胞の培養方法は、本実施形態の第１のラミニンを含む培養用材料（好ましくは第１のラミニンがコーティングされている培養基材）を用いればよく、細胞を維持または増幅し得る方法であれば特に限定されない。筋衛星細胞の播種密度は、特に限定されないが、約２．０×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２～約２．０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２が好ましく、約５．０×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２～約１．５×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２がより好ましく、約７．０×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２～約１．２５×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２がさらに好ましい。培養温度としては、例えば、３０～４０℃の範囲内、好ましくは３６～３８℃の範囲内、より好ましくは３７℃を好適に例示することができる。また、細胞をより好適に維持または増幅する観点から、培地交換を適当な時期に行うことが好ましい。培地交換の頻度としては、細胞を維持または増幅し得る限り特に制限されないが、例えば１～５日間経過毎、好ましくは３日間経過毎としてもよい。培地交換においては、培地の全部を交換してもよいし、一部のみを交換してもよい。また、筋衛星細胞の培養においては必要により継代を行ってもよく、継代の頻度としては、細胞を維持または増幅し得る限り特に制限されず、細胞の集団が大きくなってきたタイミングで適宜行うことができ、例えば、４～１２日間経過毎、好ましくは６～１０日間経過毎とすることができる。
　また、筋衛星細胞の培養方法は、本実施形態の第１のラミニンが培地に含まれていれば、必ずしもラミニンがコーティングされている培養基材を用いる必要はない。培地に含められる第１のラミニンの使用量は、特に限定されないが、例えば、筋衛星細胞７．５×１０３個に対し、第１のラミニンを好ましくは０．１～０．５μｇ、より好ましくは０．２～０．４μｇとなるように混合してもよい。
　筋衛星細胞の培養方法の一態様として、筋衛星細胞を本実施形態の培養基材を用いて培養する工程に加え、さらに、筋衛星細胞と、第１のラミニンとは別の第２のラミニンとを接触させる工程を含むことが好ましい。以下、
　ｉ）筋衛星細胞と第２のラミニンとを接触させる接触工程（以下、「工程（ｉ）」とも記載する）、および
　ｉｉ）筋衛星細胞を、第１のラミニン含む培養基材を用いて培養する工程（以下、「工程（ｉｉ）」とも記載する）
として、説明する。
　本実施形態の培養方法においては、少なくとも工程（ｉｉ）を含めばよいが、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）を含むことにより、工程（ｉｉ）のみを行う場合より未分化性を維持した筋衛星細胞の割合がさらに高い状態で筋衛星細胞を増殖させることができる。工程（ｉ）と工程（ｉｉ）を行う順序は限定されず、両工程を同時に行ってもよいし、工程（ｉ）を行った後工程（ｉｉ）を行ってもよいし、その逆であってもよく、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）とを交互に繰り返し行ってもよい。
　工程（ｉ）においては、筋衛星細胞と、第２のラミニンとを接触させる。第２のラミニンのアイソフォームは、１種であっても２種以上であってもよい。また、第２のラミニンは全長であってもその一部であってもよく、Ｅ８フラグメントを含むことが好ましい。なお、第１のラミニンと第２のラミニンのアイソフォームおよびサイズ等は互いに独立であり、その一部または全部が同一であっても異なっていてもよい。
　第２のラミニンのアイソフォームとしては、特に限定されないが、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１からなる群より選択される少なくとも１種のヒトラミニンを含むことが好ましい。すなわち、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１からなる群より選択される１種であってもよいし、２種であってもよいし、３種すべてを含んでもよい。これらのうち、第２のラミニンがヒトラミニンα３β３γ２、α４β１γ１およびα５β１γ１の混合物を含むことが特に好ましい。第２のラミニンに含まれる全ラミニン中、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１の合計含有量が５０質量％以上であることが好ましく、７０質量％以上であることがより好ましく、９０質量％以上であることがさらに好ましく、１００質量％であってもよい。
　第２のラミニンは、各ラミニンのＥ８フラグメントを含むことが好ましく、実用化の観点からヒトラミニンのＥ８フラグメントであることがさらに好ましい。第２のラミニンとして複数のラミニンを用いる場合、各ラミニンの混合比は特に限定されない。例えば、ヒトラミニン３３２Ｅ８、ヒトラミニン４１１Ｅ８及びヒトラミニン５１１Ｅ８を用いる場合、ヒトラミニン３３２Ｅ８の重量１００重量％に対し、ヒトラミニン４１１Ｅ８及びヒトラミニン５１１Ｅ８が、それぞれ独立に、５０～２００重量％であるのが好ましく、７０～１５０重量％であるのがより好ましく、８０～１２０重量％であるのがさらに好ましく、各ラミニンがほぼ等重量であることが特に好ましい。第２のラミニンと筋衛星細胞とを接触させることにより、未分化筋衛星細胞の増殖をさらに促進することができる。この理由は定かではないが、本発明者らは、第２のラミニンと筋衛星細胞とが接触することにより、筋衛星細胞の周囲に第２のラミニンが付着して筋衛星細胞がコーティングされ、培養基材上の第１のラミニンと相互作用しやすくなるのではないかと推測している。
　工程（ｉ）の一態様として、第２のラミニンが、筋衛星細胞の培養培地中に含まれていてもよい。すなわち、筋衛星細胞の培養培地中で、筋衛星細胞と第２のラミニンとが接触した状態となることが好ましい。培養培地中に、筋衛星細胞と第２のラミニンが加えられる順序および方法は特に限定されない。
　本実施形態の培養方法の一態様として、工程（ｉ）の後工程（ｉｉ）を行う、すなわち、筋衛星細胞を培養基材上に播種する前に、筋衛星細胞と第２のラミニンとを接触させる接触工程を行ってもよい。工程（ｉ）においては、例えば、第２のラミニンと、播種する筋衛星細胞の一部または全部とを、筋衛星細胞用の培地等の中に含ませてプレインキュベーションを行い、このプレインキュベーション後の筋衛星細胞を第１のラミニンがコーティングされている培養基材中に播種する方法が好適に挙げられる。プレインキュベーションは、好ましくは３６～３８℃程度、より好ましくは約３７℃で、好ましくは１０分～２時間程度、より好ましくは２０分～１時間程度インキュベートする方法が挙げられる。あるいは、所定の温度、時間でプレインキュベーションすることなく、筋衛星細胞と第２のラミニンとを培地等の中で混合して、そのまま培養基材上に移してもよい。
　工程（ｉ）の別の一態様として、培養基材上に筋衛星細胞と第２のラミニンとを別々に移してもよい。例えば、培養基材上に培地とともに筋衛星細胞を播種した後に第２のラミニンを培地中に加えてもよいし、第２のラミニンを含む培地を培養基材上に移した後、筋衛星細胞を播種してもよいし、培養基材上に培地を移した後、第２のラミニンと筋衛星細胞とを別々に加えてもよい。
　工程（ｉ）における第２のラミニンの使用量は、特に限定されないが、例えば、筋衛星細胞７．５×１０３個に対し、第２のラミニンを好ましくは０．１～０．５μｇ、より好ましくは０．２～０．４μｇとなるように混合してもよい。また、工程（ｉ）においては、特に限定されないが、培地５０μｌに対し、筋衛星細胞が５．０×１０３～１．０×１０４個程度になるように筋衛星細胞と第２のラミニンとを培地中で混合してプレインキュベーションする態様が好ましく挙げられる。
　本実施形態の培養方法の好ましい一態様として、
　ヒトラミニン３３２Ｅ８、ヒトラミニン４１１Ｅ８及びヒトラミニン５１１Ｅ８から選ばれる少なくとも一種と、筋衛星細胞とを接触させて、プレインキュベーションされた筋衛星細胞を調製する工程と、
　該プレインキュベーションされた筋衛星細胞を、ヒトラミニン２１１Ｅ８がコーティングされた培養基材中に播種する工程と
を含む培養方法が挙げられる。
　本実施形態の培養方法の一態様として、上記工程（ｉｉ）に加えて、または上記工程（ｉ）および工程（ｉｉ）に加えて、
　筋衛星細胞と、筋衛星細胞の増殖刺激物質とを接触させる工程（以下、工程（ｉｉｉ）とも記載する）
を含むことが好ましい。
　筋衛星細胞と増殖刺激物質とを接触させる方法は、特に限定されないが、増殖刺激物質が筋衛星細胞の培養用培地中に含まれることにより筋衛星細胞と接触することがより好ましい。
　増殖刺激物質としては、特に限定されないが、例えばＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、代替血清が挙げられる。増殖刺激物質を用いると、筋衛星細胞の未分化性を高い割合で維持したまま筋衛星細胞の増殖率も向上させることができ好ましい。
　本明細書において、「ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤」は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ相互作用の量および／または活性を、減少もしくは抑制することができる任意の化合物のことをいう。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤は、ＪＡＫ阻害剤またはＳＴＡＴ阻害剤であってもよい。ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ分子の量または活性をダウンレギュレートする。ＳＴＡＴ阻害剤は、ＳＴＡＴ分子の量または活性をダウンレギュレートする。これらのＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路への阻害は、ＪＡＫに対する直接的な結合、ＳＴＡＴに対する直接的な結合、またはＪＡＫもしくはＳＴＡＴをコードする遺伝子の発現を阻害することを含む様々な機構（例えばＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の遺伝子サイレンシングのためのＲＮＡｉ）、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路をダウンレギュレートするためのアンチセンスオリゴヌクレオチド等によって達成され得る。一般に、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤は、小分子化合物（例えば４‐（４’‐ヒドロキシフェニル）アミノ‐６，７‐ジメトキシキナゾリン）、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸であり得る。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤については、例えば非特許文献「Price FD, von Maltzahn J, Bentzinger CF, Dumont NA, Yin H, Chang NC, Wilson DH, Frenette J, Rudnicki MA. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat. Med., 20, 1174-81, 2014.」を参照することができる。具体的には、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤として、例えば、ＡＧ４９０、５，１５－ＤＰＰ、Ｓ３ｉ－２０１、ＷＰ－１０３４、Ｓｔａｔｔｉｃ、ルキソリチニブ、トファシチニブ、バリシチニブ等が挙げられる。
　代替血清としては、例えば、Ultroser G Serum substitute（Pall社製）が挙げられる。
　増殖刺激物質が筋衛星細胞の培養用培地に含まれる場合、その含有量は、特に限定されないが、０．５～５０ｎＭであることが好ましい。増殖刺激物質がＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤の場合の培地中の含有量は、好ましくは１．０～５×１０３ｎＭである。
　なお、上記培養方法は筋衛星細胞の培養方法として記載したが、培養する細胞は筋衛星細胞以外の多能性幹細胞であってもよい。すなわち、多能性幹細胞と第２のラミニンとを接触させる接触工程、および多能性幹細胞を第１のラミニンでコーティングされている培養基材上で培養する工程を含む細胞の培養方法であってもよい。本発明において利用可能な多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）またはｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、特に、皮膚線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、胎児肺細胞由来ｉＰＳ細胞、包皮線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、もしくは心臓線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、腸管上皮幹細胞が挙げられる。また、ＧＳ細胞（多能性生殖幹細胞）、ＥＳ細胞と体細胞との融合細胞も用いられうる。本発明において好ましく利用可能な多能性幹細胞は、霊長類または齧歯類の細胞であり、より具体的にはヒト、マウス、またはラットの細胞のいずれかである。あるいは、ブタ、ウサギ、サルの多能性幹細胞も使用されうる。
　＜キット＞
　本発明は、一態様として、筋衛星細胞培養用のキット（以下、単に「キット」とも呼ぶ）を提供する。本実施形態のキットは第１のラミニンを含む。これに加えて、キットは、培養器、第２のラミニン、筋衛星細胞の未分化性を維持するための培養培地、該培養培地に添加する添加剤、細胞増殖刺激因子、取扱説明書、および他の付属品等を含んでもよい。これらのうち、本実施形態のキットは、第１のラミニンに加えて、培養器及び／又は第２のラミニンを含む態様が好ましい。
　本キットに含まれる第１のラミニン、培養器、および第２のラミニンは、本明細書に記載のものが挙げられるが限定されない。培養培地の形態は、液体、固体、ゲル、粉末など任意のものでよく、解凍して、あるいは水に溶解して用いるものでもよい。培養培地は、１つの容器に全ての成分が含まれていても、成分ごとに複数の容器に分けられていてもよく、キットに含まれる培養培地の種類、数等に制限はない。また、培地は任意のサプリメントを加えて用いるものであってもよい。
　本キットの一つの態様において、第１のラミニンとして、ヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことが好ましい。第１のラミニンのアイソフォームとしては、ヒトラミニンα２β１γ１、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１からなる群より選択される少なくとも一種のヒトラミニンを含むことが好ましく、ヒトラミニンα２β１γ１を含むことがより好ましい。さらに好ましくは、第１のラミニンがヒトラミニンα２β１γ１Ｅ８を含む。
　本キットの一つの態様において、第２のラミニンとして、ヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことが好ましい。第２のラミニンのアイソフォームとしては、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１からなる群より選択される少なくとも１種のヒトラミニンを含むことが好ましく、ヒトラミニンα３β３γ２Ｅ８、ヒトラミニンα４β１γ１Ｅ８およびヒトラミニンα５β１γ１Ｅ８からなる群より選択される少なくとも１種のヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことがより好ましい。好適な例として、本キットの第２のラミニンは、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１の混合物であってもよく、その混合比（重量比）は１：１：１であってもよい。
　本キットの一つの態様において、第１のラミニンおよび第２のラミニンは適当な溶媒、例えばＰＢＳ、生理食塩水、トリスヒドロキシメチルアミノメタンあるいは４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルフォン酸で中性ｐＨとした生理的食塩水などで希釈されていてもよい。
　本キットの一つの態様において、培養器としては、筋衛星細胞の培養に使用できるものであれば限定されず、シャーレ、フラスコ、マルチウェルプレート、カルチャースライド、マイクロキャリア、ポリビニリデンフルオリド膜等のポリマー膜などが挙げられる。培養器の素材としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、またはアクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）等が挙げられる。
＜分化誘導＞
　本実施形態の筋衛星細胞は、分化誘導を行って筋芽細胞、筋管細胞、筋繊維へ分化させることができる。分化誘導は、例えば、培養液をＤＭＥＭ　ｗｉｔｈ　ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、５％　ｈｏｒｓｅ　ｓｅｒｕｍ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎおよび１００μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に変えて、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養することで行うことができる。分化誘導の方法は、例えば、非特許文献「ISOLATION AND GROWTH OF MOUSE PRIMARY MYOBLASTS Springer, M.L., T. Rando, and H.M. Blau (1997). Gene delivery to muscle. In Current Protocols in Human Genetics.」に記載の方法を参照してもよい。
　以下、実施例を示して本実施形態を詳細に説明するが、本実施形態は以下の実施例に限定されるものではない。
　本発明者らは、筋衛星細胞の未分化維持培養方法を検討する前に、まず生体内での筋衛星細胞の周囲に存在するラミニンα鎖の発現を解析し、筋衛星細胞のニッチとしてどのラミニンα鎖が機能しているかを調べた。そのｉｎ　ｖｉｖｏでの発現データに基づき、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、ラミニンＥ８フラグメントの種類の組合せ等、未分化を維持した状態での筋衛星細胞の培養条件を検討した。これら新規の培養方法を、マウスの筋衛星細胞とヒトの筋衛星細胞とを用いて検証した。以下、具体的に説明する。
＜例１：マウス骨格筋組織でのラミニンα鎖の発現＞
（組織免疫蛍光化学染色）
　まず、生体内での筋衛星細胞の周囲に存在するラミニンα鎖の発現を解析した。生後８週齢のマウスを安楽死させた後、前脛骨筋を取り出し、液体窒素で冷やしたイソペンタン（Ｗａｋｏ）で凍結させた。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ）を用いて、８μｍの厚みで凍結切片を作成し、乾燥させた後に４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで室温で１０分間固定した。Ｍ．Ｏ．Ｍ．　ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて室温で１時間ブロッキンングした後、一次抗体としてラット抗ラミニンα鎖（α１－５）抗体、マウス抗Ｐａｘ７抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｓｔｕｄｉｅｓ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｂａｎｋ）を４℃で一晩反応させ、ＰＢＳで洗浄後、二次抗体としてマウス／ラットＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８／－Ａｌｅｘａ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で一時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、Ｍｏｕｎｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて封入し、共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）により解析を行った。なお、「Ｐａｘ７」の発現は、静止期の未分化の筋衛星細胞の指標となる。
　結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。図１Ａ及び図１Ｂは、マウス筋組織（前脛骨筋）を用いて免疫蛍光化学染色により、ラミニンα鎖とＰａｘ７を検出した像である。図１Ａ中、「ＤＡＰＩ（4',6-diamino-2-phenylindole）」は、ＵＶ励起光下で青色蛍光を発し、細胞内の核の局在を示す。「ｍｅｒｇｅ」は、ラミニン、Ｐａｘ７及びＤＡＰＩの画像を電子情報的に融合した図である。左からラミニンα１、２、３、４、５鎖の各染色像である。筋繊維の辺縁に沿って基底膜由来のラミニンα２鎖の発現が確認された。さらに同じく筋線維辺縁と、特に筋衛星細胞（Ｐａｘ７陽性細胞）の周囲にラミニンα３、４、５鎖の発現がみられた（図１Ｂ）。ラミニンα１鎖の発現はみられなかった。
　図１Ｂは、図１Ａのラミニンα３、α４、α５鎖の染色像の拡大図を示している。筋衛星細胞の周囲にラミニンα３、α４、α５鎖が発現し局在していた。
　図１Ｃは、筋再生後、自己複製したと思われる筋衛星細胞の周囲に発現しているラミニンα鎖の解析結果を示している。マウス前脛骨筋にカルディオトキシンを注入し、筋再生を誘発し７日後の再生筋の凍結切片を作製した。上からラミニンα３、４、５鎖の免疫染色結果につき、共焦点レーザー顕微鏡によるｚ－ｓｔａｃｋ画像を解析したものである。自己複製したと思われる筋衛星細胞の周囲にα３、α４、α５鎖が筋衛星細胞を包み込むように強く発現・局在していた。なお、「マウス前脛骨筋にカルディオトキシンを注入し、筋再生を誘発する」方法は、下記文献（６）～（８）を参照した。
(6) Biochemistry. 1975 Jul;14(13):2865-71. The complete covalent structure of a cardiotoxin from the venom of Naja nigricollis (African black-necked spitting cobra). Fryklund L, Eaker D.
(7) J Pharmacol Exp Ther. 1976 Mar;196(3):758-70. Mechanism of action of cobra cardiotoxin in the skeletal muscle. Lin Shiau SY, Huang MC, Lee CY.
(8) Biol Cell. 1988 62(2):171-82. Regeneration of muscles after cardiotoxin injury. I. Cytological aspects. Couteaux R, Mira JC, d’Albis A.
＜例２：マウス筋衛星細胞のラミニンＥ８フラグメントへの接着効率の比較＞
（マウス筋衛星細胞の分離）
　生後８週齢のマウスを安楽死させ、前肢と下肢の骨格筋組織を摘出し、ハサミで切り刻んだ後、０．１４％ＩＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）で３７℃の条件下で一時間処理した。その後、セルストレーナー１００μｍと４０μｍ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で細胞を濾過し、抗体標識を行った。抗ＣＤ３１抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、抗ＣＤ４５抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、抗Ｓｃａ１抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ビオチン化抗ＳＭ／Ｃ－２．６抗体を氷上で３０分間反応させた後、ストレプトアビジン－ＡＰＣ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を氷上で２０分間反応させた。抗体反応させた細胞はＨＢＳＳ（ＷＡＫＯ社製）に２０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、１０％ＨＥＰＥＳ（ｇｉｇｃｏ社製）、１００μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したものに懸濁し、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）を加えた。ＭｏＦｌｏ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて、ＣＤ３１陰性、ＣＤ４５陰性、Ｓｃａ１陰性、ＳＭ／Ｃ－２．６陽性の分画を筋衛星細胞としてソーティングした。この分離したマウス筋衛星細胞を用いて、下記の細胞接着実験を行った。
（マウス筋衛星細胞の細胞接着実験）
　９６ｗｅｌｌプレート（Ｄｙｎｅｘ　Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にマトリゲル（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）または図２に記載の各アイソフォームのラミニンＥ８フラグメント（１．５３μｇ／ｃｍ２）を４℃で一晩静置してコートした。細胞を播種する前に１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）ｗｉｔｈ　ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で室温で２時間以上ブロッキングし、０．１％ＢＳＡ／ＤＭＥＭ　ｗｉｔｈ　ＧｌｕｔａＭＡＸで２回洗浄をした。フローサイトメーターでソーティングした筋衛星細胞は０．１％ＢＳＡ／ＤＭＥＭ　ｗｉｔｈ　ＧｌｕｔａＭＡＸで２回洗浄した後、蛋白質（マトリゲルまたは図２に記載の各アイソフォームのラミニンＥ８）をコートした９６ｗｅｌｌプレートに播種し、３時間３７℃でインキュベーションした。その後、培養液を除き０．２％クリスタルバイオレット／２０％メタノールを加え１０分間固定・染色を行い、純水で２回洗浄した。風乾させた後、染色された細胞数を測定した。なお、本例及び以下の例で用いたラミニンは、ヒトラミニンの各アイソフォームである。
　マウス筋衛星細胞の細胞接着実験の結果を図２に示す。横軸は９６ｗｅｌｌプレートをコーティングしたタンパク質の種類を表し、縦軸はマトリゲルに接着した細胞数を１として、各ラミニンがコーティングされたプレートにおける接着した細胞の数の相対比を表す。図２中、横軸の「ＬＭ」は各ラミニンのアイソフォームのＥ８フラグメントを示し、例えば、「ＬＭ１１１」は、「ヒトラミニンα１β１γ１のＥ８フラグメント」を表す。図２のグラフ中、エラーバーは３個以上の独立した実験（ｎ≧３）における標準誤差を示す。スチューデントのt検定を行い、＊＊はマトリゲルの実験値に対してＰ＜０．０１であることを示す。既知の細胞外基質であり従来法で使われているマトリゲルと比較して、ラミニン（ＬＭ）３３２、４１１、５１１Ｅ８では同等以上の細胞接着活性がみられた。特にＬＭ５１１Ｅ８では細胞接着活性が有意に上昇した。
＜例３－１：マウス筋衛星細胞のラミニンＥ８フラグメントを用いた培養の比較＞
　コーティングは８ｗｅｌｌチャンバー（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）に、それぞれ、マトリゲルまたは図３Ａに記載のヒトラミニン（ＬＭ）の各アイソフォームのＥ８フラグメント（１．０２μｇ／ｃｍ２）を４℃で一晩コートした。細胞を播種する前にＰＢＳで洗浄を行った。
　例２に記載の方法と同様にフローサイトメーターでソーティングしたマウス筋衛星細胞を調製し、細胞密度７．５×１０３個／ｃｍ２となるように、蛋白質（マトリゲルまたは図３Ａ記載のヒトラミニンのＥ８フラグメント）をコートした上記８ｗｅｌｌチャンバーに播種した。マトリゲルをコーティングしたチャンバーに筋衛星細胞を播種した試料（ｉ）、ラミニン（ＬＭ）５１１Ｅ８をコーティングしたチャンバーに筋衛星細胞を播種した試料（ｉｉ）（ＬＭ５１１Ｅ８）、ラミニン３３２Ｅ８、ラミニン４１１Ｅ８、およびラミニン５１１Ｅ８と、筋衛星細胞とのプレインキュベーション処理を行った後、ラミニン２１１Ｅ８をコートしたチャンバー上で培養した試料（ｉｉｉ）（ｐｒｅ３／４／５－ｏｎ２）を作製した。図３Ａ（ａ）に試料（ｉｉ）と試料（ｉｉｉ）の調製方法の概略を示す。試料（ｉｉｉ）については、播種する前に、ラミニン３３２Ｅ８、ラミニン４１１Ｅ８、およびラミニン５１１Ｅ８を混合比（重量）１：１：１で含む培養液（０．３μｇ／５０μｌ）に約７５００個の筋衛星細胞を懸濁し、３７℃の条件下で３０分間反応させたのち、蛋白質（ラミニン２１１Ｅ８）をコートした８ｗｅｌｌチャンバーに播種した。なお、プレインキュベーションに用いた培養液は下記の筋衛星細胞培養用の培養液である。
　筋衛星細胞培養用の培養液は、ＤＭＥＭ　ｗｉｔｈ　ＧｌｕｔａＭＡＸに２０％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；　Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％　Ｃｈｉｃｋ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ｅｘｔｒａｃｔ（ＵＳ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　ａｎｄ　１００μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５ｎｇ／ｍｌ　ｂａｓｉｃ－ＦＧＦ（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ）を添加したものを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で４～６日培養を行った。培養３日目に培養液を交換し、４日目以降は毎日半量の培養液交換を行った。
（細胞免疫蛍光化学染色）
　４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを用いて、上記により培養した各試料の細胞を室温で１０分間固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）／ＰＢＳで室温で１０分間透過処理をした。Ｐｏｗｅｒ　Ｂｌｏｃｋ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で１時間ブロッキンングした後、一次抗体としてマウス抗Ｐａｘ７抗体を４℃の条件下で一晩中反応させ、ＰＢＳで洗浄後、二次抗体としてマウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８を室温で一時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、Ｍｏｕｎｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ＤＡＰＩを用いて封入し、オールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７００（キーエンス）により解析を行った。
　結果を図３Ａ（ｂ）および（ｃ）に示す。図３Ａ（ｂ）および（ｃ）において、「ＬＭ５１１Ｅ８」は、ラミニン５１１Ｅ８をコーティングしたチャンバーに筋衛星細胞を播種した試料を表し、「ｐｒｅ３／４／５－ＬＭ２」は、ラミニン３３２Ｅ８、ラミニン４１１Ｅ８、およびラミニン５１１Ｅ８と、ヒト筋衛星細胞とのプレインキュベーション処理を行った後、ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した試料を表す。図３Ａ（ｂ）は例１と同様に行った免疫蛍光化学染色により検出した画像を示す。図３Ａ（ｃ）の上側のグラフにおける「Ｐａｘ７陽性細胞数／ＤＡＰＩの相対値」はＰａｘ７陽性細胞率であり、具体的には、Ｐａｘ７陽性細胞数を全細胞数（ＤＡＰＩ陽性細胞数）で割った数値を、マトリゲル上で培養した場合の該値を１として相対値として示したものである。図３Ａ（ｃ）の下側のグラフにおける「Ｐａｘ７陽性細胞数の相対値」は、Ｐａｘ７陽性の細胞数を、マトリゲル上で培養した場合の該値を１として相対値として示したものである。なお、図３Ａ（ｃ）のグラフ中、エラーバーは３個以上の独立した実験（ｎ≧３）における標準誤差を示す。スチューデントのt検定を行い、＊はマトリゲルの実験値に対してＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１であることを示す。Ｐａｘ７陽性細胞率は、マトリゲル上で培養した筋衛星細胞の試料と比べて、ＬＭ５１１Ｅ８上で培養した試料では有意に上昇し、ｐｒｅ３／４／５－ＬＭ２はさらに有意に上昇した。また、Ｐａｘ７陽性細胞数についても、ｐｒｅ３／４／５－ＬＭ２は、マトリゲル上で培養した試料より上昇した。
＜例３－２：筋衛星細胞の培養条件の検討＞
　培養基材であるディッシュ上をコーティングする第１のラミニンの種類、およびプレインキュベーションを行う場合の第２のラミニンの種類を、図３Ｂに示すとおりに変更して培養した試料について、例３－１と同様に培養してＰａｘ７陽性細胞率の相対値を算出し、培養条件をさらに詳細に検討した。図３Ｂ中の略号は下記のとおりである。なお、第２のラミニンは培養液５０μｌ中０．３μｇ添加し、第２のラミニン中複数のラミニンを含む場合は、各ラミニンを等重量ずつ、合計０．３μｇ／５０μｌになるようにした。特にプレインキュベーションについての記載がない試料は、第２のラミニンは用いずに筋衛星細胞を播種した試料であることを意味する。
　ｍｔ：マトリゲルをコートしたディッシュ上で培養した（コントロール）
　ｌｍ２：ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した
　ｌｍ３／４／５：ラミニン３３２Ｅ８、４１１Ｅ８、５１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した
　ｌｍ５：ラミニン５１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した
　ｐｒｅｌｍ５－ｍｔ：ラミニン５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、マトリゲルをコートしたディッシュ上で培養した
　ｐｒｅｌｍ５－ｌｍ２：ラミニン５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した
　ｐｒｅｌｍ５－ｌｍ５：ラミニン５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、ラミニン５１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した
　ｐｒｅｌｍ４／５－ｍｔ：ラミニン４１１Ｅ８、５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、マトリゲルをコートしたディッシュ上で培養した
　ｐｒｅｌｍ４／５－ｌｍ２：ラミニン４１１Ｅ８、５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した
　ｐｒｅｌｍ４／５－ｌｍ５：ラミニン４１１Ｅ８、５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、ラミニン５１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した
　ｐｒｅｌｍ３／４／５－ｍｔ：ラミニン３３２Ｅ８、４１１Ｅ８、５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、マトリゲルをコートしたディッシュ上で培養した
　ｐｒｅｌｍ３／４／５－ｌｍ２：ラミニン３３２Ｅ８、４１１Ｅ８、５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養
　ｌｍ３／４／５　ｏｎ　ｌｍ２：ラミニン２１１Ｅ８を１．０２μｇ／ｃｍ２でコートした上に、ラミニン３３２Ｅ８、４１１Ｅ８、５１１Ｅ８を重量比１:１:１で含む混合物を１．０２μｇ／ｃｍ２でさらにコートしたディッシュ上で、筋衛星細胞を培養した
　ｓｏｌｕｔｉｏｎｌｍ３／４／５－ｌｍ２：ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上に筋衛星細胞を細胞密度７．５×１０３個／ｃｍ２となるように培養液とともに播種した後、培養液にラミニン３３２Ｅ８、４１１Ｅ８、５１１Ｅ８を等重量ずつ、合計０．３μｇ添加して培養した
　ｐｒｅｌｍ３／４／５－ｌｍ５：ラミニン３３２Ｅ８、４１１Ｅ８、５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、ラミニン５１１Ｅ８をコートした上で培養
　ｐｒｅｌｍ２－Ｍｔ：ラミニン２１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、マトリゲルをコートしたディッシュ上で培養した
　ｐｒｅｌｍ２－ｌｍ２：ラミニン２１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した
　Ｐａｘ７陽性細胞率は、マトリゲル上で培養した筋衛星細胞の試料と比べて、ＬＭ５１１Ｅ８でコーティングされたディッシュ上で培養した試料において有意に上昇し、ｐｒｅｌｍ３／４／５－ｌｍ２、ｌｍ３／４／５　ｏｎ　ｌｍ２、ｓｏｌｕｔｉｏｎｌｍ３／４／５－ｌｍ２で特に有意に上昇した。このうち、ｐｒｅｌｍ３／４／５－ｌｍ２が最もＰａｘ７強陽性細胞率の平均値が高かった。
＜例４：ヒト筋組織でのラミニンα鎖の発現＞
（ヒト筋組織の免疫蛍光化学染色）
　ヒト骨格筋組織においてもマウス骨格筋組織と同様にラミニンα鎖の発現解析を行った。前十字靭帯再建術の際に摘出した半腱様筋由来組織を取り出し、液体窒素で冷やしたイソペンタン（Wako）で凍結させた。クライオスタット（Leica）を用いて、８μmの厚みで凍結切片を作成し、乾燥させた後に４％パラホルムアルデヒド／PBSで室温で１０分間固定した。PowerBlock（BioGenex Laboratories）を用いて室温で１時間ブロッキンングした後、一次抗体としてマウス抗ラミニンα鎖（α１－５）抗体、マウス抗Pax7抗体（Developmental Studies Hybridoma Bank）を４℃で一晩反応させ、PBSで洗浄後、二次抗体としてマウス／ラットIgG-Alexa488／-Alexa594（Invitrogen）を室温で一時間反応させた。PBSで洗浄後、Mounting medium for fluorescence
with DAPI（Vector Laboratories）を用いて封入し、共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss）により解析を行った。
　図４は、ヒトの筋組織を用いて免疫蛍光化学染色によりラミニンとＰａｘ７を検出した像である。筋繊維に沿ってラミニンα２鎖の発現が確認された（図４（ａ））。さらに、筋衛星細胞の周囲にラミニンα３、α４、α５鎖の発現がみられた（図４（ｂ））。ラミニンα１鎖の発現は見られなかった。
＜例５：ヒト筋衛星細胞の培養＞
（ヒト筋衛星細胞の分離）
　ヒト試料を用いた実験については、東京医科歯科大学医学部倫理審査委員会の承認を受けている。東京医科歯科大学附属病院整形外科での前十字靭帯再建術の際に摘出した半腱様筋由来組織をハサミで切り刻んだ後、０．１％ＩＩ型コラゲナーゼで３７℃の条件下で一時間処理した。その後、セルストレーナー１００μｍと４０μｍを通し細胞を濾過した後に抗体標識を行った。抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ２３５ａ抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、抗ＣＤ１１ｂ抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、抗ＣＤ３４抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、抗ＣＤ５６抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、抗インテグリンα７抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を氷上で３０分間反応させた。抗体反応させた細胞はＨＢＳＳに懸濁し、ＰＩを加えた。ＦＡＣＳはＭｏＦｌｏ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いてＣＤ３１陰性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ２３５ａ陰性、ＣＤ１１陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ５６陽性、インテグリンα７陽性の分画を筋衛星細胞としてソーティングした。このソーティングされたヒト筋衛星細胞を用いて下記の培養実験を行った。
（ラミニンＥ８フラグメントを用いたヒト筋衛星細胞の培養）
　上述の方法によりフローサイトメーターを用いてソーティングしたヒト筋衛星細胞を、ラミニン３３２Ｅ８、４１１Ｅ８、５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、ラミニン２１１Ｅ８でコートしたディッシュ上で細胞を培養した（ｐｒｅ３／４／５－ｏｎ２）。培養液は、ＤＭＥＭ　ｗｉｔｈ　ＧｌｕｔａＭＡＸに２０％　ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、２５ｎｇ／ｍｌ　ｂａｓｉｃ－ＦＧＦを添加し５％ＣＯ２、３７℃の条件下で４～６日培養を行った。培養３日目に培養液を交換し、４日目以降は毎日半量の培養液交換を行った。プレインキュベーション処理は、マウス筋衛星細胞の代わりにヒト筋衛星細胞を用いた以外は例３－１と同様の方法により行った。比較実験として、マトリゲルをコーティングしたディッシュ上でヒト筋衛星細胞を培養した。各培養サンプルについて、例３－１と同様の方法によりＰａｘ７陽性細胞率の相対値、Ｐａｘ７陽性細胞数の相対値を算出した。
　結果を図５（ａ）および（ｂ）に示す。図５において、「ｐｒｅ３４５　ｏｎ２」は、ラミニン３３２Ｅ８、ラミニン４１１Ｅ８、およびラミニン５１１Ｅ８と、ヒト筋衛星細胞とのプレインキュベーション処理を行った後、ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した試料を意味し、「Ｍｔ」はマトリゲルをコートしたディッシュ上で培養した試料を意味する。図５（ａ）は例１と同様に行った免疫蛍光化学染色により検出した画像を示す。図５（ｂ）はＰａｘ７陽性細胞率の相対値、Ｐａｘ７陽性細胞数の相対値を示す。マトリゲルでディッシュをコーティングした場合と比べ、ｐｒｅ３４５　ｏｎ２のヒト筋衛星細胞は、Ｐａｘ７陽性細胞率およびＰａｘ７陽性細胞数共に上昇した。
＜例６：マウス筋衛星細胞の細胞移植実験＞
　例２に記載の方法と同様にＣ５７ＢＬ／６－ＧＦＰトランスジェニックマウスからフローサイトメーターでソーティングしたマウス筋衛星細胞を調製し、細胞密度４．５×１０４個／ｃｍ２となるように、蛋白質（マトリゲルまたはヒトラミニンのＥ８フラグメント）をコートした６－ｗｅｌｌプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種した。（ｉ）マトリゲルをコーティングしたチャンバーに筋衛星細胞を播種した試料と、（ｉｉ）ラミニン３３２Ｅ８、ラミニン４１１Ｅ８、およびラミニン５１１Ｅ８と、筋衛星細胞とをプレインキュベーション処理を行った後、ヒトラミニンのＥ８フラグメントとしてラミニン２１１Ｅ８をコートしたチャンバー上で培養した試料（ｐｒｅ３／４／５－ｏｎ２）を作製した。プレインキュベーション処理を行った試料（ｉｉ）については、播種する前に、ラミニン３３２Ｅ８、ラミニン４１１Ｅ８、およびラミニン５１１Ｅ８を混合重量比１：１：１で含む溶液（０．３μｇ／５０μｌ）に細胞を懸濁し、３７℃の条件下で３０分間反応させたのち、蛋白質（ラミニン２１１Ｅ８）をコートした６－ｗｅｌｌプレートに播種した。
　培養液は、ＤＭＥＭ　ｗｉｔｈ　ＧｌｕｔａＭＡＸに２０％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；　Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％　Ｃｈｉｃｋ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ｅｘｔｒａｃｔ（ＵＳ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　ａｎｄ　１００μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５ｎｇ／ｍｌ　ｂａｓｉｃ－ＦＧＦ（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ）を添加したものを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で４～６日培養を行った。培養３日目に培養液を交換し、４日目以降は毎日半量の培養液交換を行った。
　培養した細胞をＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で剥がし、２．０×１０５個／５０μｌに調整し骨格筋再生を促したＣ５７ＢＬ／６マウスの前脛骨筋に移植した。移植２週間後に移植をした前脛骨筋を取り出し、液体窒素で冷やしたイソペンタン（Ｗａｋｏ）で凍結させた。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ）を用いて、８μｍの厚みで凍結切片を作成し、乾燥させた後に４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで室温で１０分間固定した。Ｍ．Ｏ．Ｍ　ｋｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ）を用いて室温で１時間ブロッキンングした後、一次抗体としてラット抗Ｌａｍｉｎｉｎα２鎖抗体を４℃で一晩反応させ、ＰＢＳで洗浄後、二次抗体としてラットＩｇＧ－Ａｌｅｘａ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で一時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、Ｍｏｕｎｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて封入し、共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）により解析を行った。
　結果を図６に示す。図６において、「ｐｒｅ３／４／５　ｏｎ　２」は、ラミニン３３２Ｅ８、ラミニン４１１Ｅ８、およびラミニン５１１Ｅ８と、ヒト筋衛星細胞とのプレインキュベーション処理を行った後、ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した試料（上記（ｉｉ）の試料）を意味する。図６（ａ）は、免疫蛍光化学染色によりラミニンα２、ＤＡＰＩおよびＧＦＰを検出した像であり、下段は上段それぞれの拡大図である。図６（ｂ）は、ＧＦＰ陽性筋繊維数の相対値を示し、図６（ｃ）は、ＧＦＰ陽性筋繊維率の相対値を示す。図６のグラフ中、エラーバーは３個以上の独立した実験（ｎ≧３）における標準誤差を示す。スチューデントのt検定を行い、マトリゲルの実験値に対して＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１であることを示す。マトリゲルでディッシュをコーティングした場合と比べ、ｐｒｅ３／４／５　ｏｎ２で培養した筋衛星細胞を移植した前脛骨筋では、ＧＦＰ陽性筋繊維数もＧＦＰ陽性筋繊維率も上昇した。これは、ｐｒｅ３／４／５　ｏｎ２で培養したＧＦＰ陽性筋衛星細胞の方が、マトリゲルでコーティングされたディッシュ上で培養した試料より高い割合で未分化が維持されているため、損傷組織への生着率が高く、結果的にＧＦＰ陽性筋繊維の増加につながっているからであると推察される。
　この出願は、２０１５年１１月４日に出願された日本出願特願２０１５－２１６６０９を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
　本発明のラミニンがコーティングされている筋衛星細胞培養用培養基材を用いることにより、従来のマトリゲルを用いずに、ゼノフリーで、かつ未分化性を維持したまま筋衛星細胞を培養することができるため、損傷した筋への効率的な細胞移植再生治療等への利用が期待できる。

Claims (15)

  1. 　第１のラミニンを含む筋衛星細胞培養用材料。
  2. 　筋衛星細胞培養用培養基材または筋衛星細胞培養用培地である、請求項１記載の筋衛星細胞培養用材料。
  3. 　第１のラミニンがコーティングされている筋衛星細胞培養用培養基材である、請求項１または２記載の筋衛星細胞培養用材料。
  4. 　前記第１のラミニンが、ヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の筋衛星細胞培養用材料。
  5. 　前記第１のラミニンが、ヒトラミニンα２β１γ１、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１から成る群より選択される少なくとも一種のヒトラミニンを含むことを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の筋衛星細胞培養用材料。
  6. 　前記第１のラミニンが、ヒトラミニンα２β１γ１のＥ８フラグメントを含むことを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の筋衛星細胞培養用材料。
  7. 　筋衛星細胞と第１のラミニンとを接触させる接触工程を含む、筋衛星細胞の培養方法。
  8. 　第１のラミニンが、
    　ａ）培地に含まれている；
    　ｂ）培養基材中に含まれている；または
    　ｃ）培養基材にコーティングされている
    ことを特徴とする、請求項７記載の筋衛星細胞の培養方法。
  9. 　培養基材が、ディッシュ、プレート、カバースリップ、マイクロキャリア、ゼラチンハイドロゲル、またはコラーゲンスポンジであることを特徴とする、請求項８記載の筋衛星細胞の培養方法。
  10. 　前記接触工程において、請求項１～６のいずれか一項に記載の培養用材料を用いることを特徴とする、請求項７に記載の筋衛星細胞の培養方法。
  11. 　さらに、筋衛星細胞と第２のラミニンとを接触させる接触工程を含む、請求項７～１０のいずれか一項記載の筋衛星細胞の培養方法。
  12. 　前記第２のラミニンが、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１から成る群より選択される少なくとも１種のヒトラミニンを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の培養方法。
  13. 　前記第２のラミニンが、ヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことを特徴とする、請求項１１または１２に記載の培養方法。
  14. 　前記第２のラミニンが、筋衛星細胞の培養培地中に含まれていることを特徴とする、請求項１１～１３のいずれか一項記載の培養方法。
  15. 　前記筋衛星細胞と第２のラミニンとを接触させる接触工程が培養基材上に筋衛星細胞を播種する前に行われることを特徴とする、請求項１１～１４のいずれか一項記載の培養方法。
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