CN112931410B - 人源化胶质瘤pdx小鼠模型及其制备方法和应用 - Google Patents

人源化胶质瘤pdx小鼠模型及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人源化胶质瘤PDX小鼠模型，人源化胶质瘤PDX小鼠模型是通过移植人胶质瘤细胞和胶质瘤细胞同源的功能性淋巴细胞获得。本发明的人源化胶质瘤PDX小鼠模型，通过移植人胶质瘤细胞和胶质瘤细胞同源的功能性淋巴细胞获得。在免疫缺陷小鼠体内移植入淋巴细胞，使其具有人的免疫功能，使得小鼠在负荷人胶质瘤的同时表达病人的免疫系统，可模拟人体肿瘤细胞与免疫系统之间的相互作用，在肿瘤免疫治疗药物的研发与临床前评估方面具有重要的应用前景。而且，人源化胶质瘤PDX小鼠模型具有较高的T细胞诱导分化的能力，为胶质瘤的免疫治疗、新药物以及新设备的研发提供了重要的研究工具。

Description

人源化胶质瘤PDX小鼠模型及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及肿瘤领域，特别地，涉及一种人源化胶质瘤PDX小鼠模型。此外，本发明还涉及一种包括上述人源化胶质瘤PDX小鼠模型的制备方法和应用。
背景技术
长时期以来，为了研究肿瘤，习惯采用肿瘤细胞株移植到免疫缺陷的小鼠体内，建立肿瘤模型。但是，由于小鼠残存的免疫系统和缺乏人自身的免疫系统，导致实验结果与临床实际出现较大偏差。而且，随着科技的发展，肿瘤免疫治疗是继手术、放疗、化疗与分子靶向治疗后，又一种新的能够改善肿瘤患者生存期的治疗方法。肿瘤免疫治疗的进一步研究需要建立人体肿瘤与人体免疫系统相互作用的动物模型。通常肿瘤模型是利用免疫缺陷动物移植入人体肿瘤细胞或组织，例如：基于临床肿瘤标本建立的人源肿瘤组织来源移植瘤模型(patient-derived xenograft,PDX)较好的保持了原发瘤的特征，但是人源肿瘤细胞系异种移植(cell derived xenograft,CDX)或者PDX模型由于缺乏完整的免疫系统，无法完整的评估抗肿瘤疗效，尤其是免疫治疗的研究，该类动物由于缺乏人体免疫系统，无法针对特定患者的肿瘤细胞或组织开展免疫治疗、靶向治疗研究，免疫治疗如CTLA4、PD-1、PD-L1等，靶向治疗如单克隆抗体。
发明内容
本发明提供了一种人源化胶质瘤PDX小鼠模型，以解决通常肿瘤模型是利用免疫缺陷动物移植入人体肿瘤细胞或组织，由于缺乏完整的免疫系统，无法完整的评估抗肿瘤疗效的技术问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种人源化胶质瘤PDX小鼠模型，人源化胶质瘤PDX小鼠模型是通过移植人胶质瘤细胞和胶质瘤细胞同源的功能性淋巴细胞获得。
根据本发明的另一方面，还提供了一种人源化胶质瘤PDX小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：
S1、裸鼠胶质瘤模型构建：将病人来源的胶质瘤细胞植入小鼠；
S2、培养：饲养小鼠，待胶质瘤细胞体积增长至62mm3～100mm3；
S3、人源化胶质瘤PDX小鼠模型构建：对小鼠以亚致死剂量X射线进行辐照，并移植同源的功能性淋巴细胞，检测小鼠的胶质瘤细胞生长情况和淋巴细胞的增殖分化，获得人源化胶质瘤PDX小鼠模型。
进一步地，步骤S3中淋巴细胞移植方式采用腹腔注射方式。
进一步地，步骤S3中淋巴细胞采用PBMC，PBMC注射量为0.5×106个l～5×106个。
进一步地，步骤S1的裸鼠胶质瘤模型构建具体步骤包括：将病人来源的手术标本肿瘤球培养物离心分离，离心力为200×g，离心时间为5min，将沉淀物采用Accutase细胞消化液消化成单个细胞，采用PBS制备成细胞悬液备用，将细胞悬液缓慢注入小鼠颅内。
进一步地，细胞悬液浓度为5×107/ml，细胞悬液注入量为4μL～5μL。
进一步地，细胞悬液注入速度为1μL/min～5μL/min。
进一步地，步骤S3中移植同源的功能性淋巴细胞具体步骤包括：在中线与冠状缝交点外侧1mm～2mm和冠状缝前方1mm处钻颅骨，将细胞悬液吸入立体定向仪上，通过立体定向仪上的针头对准颅骨孔，慢慢地将细胞悬液放入小鼠大脑，直至达到所需的深度。
进一步地，步骤S2中饲养小鼠至少14天，测定胶质瘤细胞体积。
根据本发明的另一方面，还提供了一种上述人源化胶质瘤PDX小鼠模型在免疫治疗评价方法或系统中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明的人源化胶质瘤PDX小鼠模型，通过移植人胶质瘤细胞和胶质瘤细胞同源的功能性淋巴细胞获得。在免疫缺陷小鼠体内移植入淋巴细胞，使其具有人的免疫功能，使得小鼠在负荷人胶质瘤的同时表达病人的免疫系统，可模拟人体肿瘤细胞与免疫系统之间的相互作用，在肿瘤免疫治疗药物的研发与临床前评估方面具有重要的应用前景。而且，人源化胶质瘤PDX小鼠模型具有较高的T细胞诱导分化的能力，为胶质瘤的免疫治疗、新药物以及新设备的研发提供了重要的研究工具。人源化胶质瘤PDX小鼠模型，通过胶质瘤病人自身的淋巴细胞建立胶质瘤病人自身人源化PDX小鼠模型，为精准和个体化治疗奠定重要的基础。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明优选实施例1的人源化PDX小鼠示意图；
图2是本发明优选对比例1的人源化PDX小鼠示意图；
图3是本发明优选实施例1的人源化PDX小鼠的外周血淋巴细胞图；以及
图4是本发明优选实施例1的人源化PDX小鼠的外周血免疫细胞Treg细胞图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
图1是本发明优选实施例1的人源化PDX小鼠示意图；图2是本发明优选对比例1的人源化PDX小鼠示意图；图3是本发明优选实施例1的人源化PDX小鼠的外周血淋巴细胞图；图4是本发明优选实施例1的人源化PDX小鼠的外周血免疫细胞Treg细胞图。
本实施例的人源化胶质瘤PDX小鼠模型，人源化胶质瘤PDX小鼠模型是通过移植人胶质瘤细胞和胶质瘤细胞同源的功能性淋巴细胞获得。
本发明的人源化胶质瘤PDX小鼠模型，通过移植人胶质瘤细胞和胶质瘤细胞同源的功能性淋巴细胞获得。在免疫缺陷小鼠体内移植入淋巴细胞，使其具有人的免疫功能，使得小鼠在负荷人胶质瘤的同时表达病人的免疫系统，可模拟人体肿瘤细胞与免疫系统之间的相互作用，在肿瘤免疫治疗药物的研发与临床前评估方面具有重要的应用前景。而且，人源化胶质瘤PDX小鼠模型具有较高的T细胞诱导分化的能力，为胶质瘤的免疫治疗、新药物以及新设备的研发提供了重要的研究工具。人源化胶质瘤PDX小鼠模型，通过胶质瘤病人自身的淋巴细胞建立胶质瘤病人自身人源化PDX小鼠模型，为精准和个体化治疗奠定重要的基础。
本实施例的人源化胶质瘤PDX小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：
S1、裸鼠胶质瘤模型构建：将病人来源的胶质瘤细胞植入小鼠；
S2、培养：饲养小鼠，待胶质瘤细胞体积增长至62mm3～100mm3；
S3、人源化胶质瘤PDX小鼠模型构建：对小鼠以亚致死剂量X射线进行辐照，并移植同源的功能性淋巴细胞，检测小鼠的胶质瘤细胞生长情况和淋巴细胞的增殖分化，获得人源化胶质瘤PDX小鼠模型。
人源化胶质瘤PDX小鼠模型的制备方法，在负荷人胶质瘤的同时表达病人的免疫系统，此模型给肿瘤细胞提供与人体更相似的生长微环境，可以从组织病理学、基因表达、基因突变、炎症和治疗反应等方面真实准确的反映了临床肿瘤患者的表现，在肿瘤的发生、发展和转移机制研究等方面具有重要的应用价值，而且具有较高的T细胞诱导分化的能力，为胶质瘤的免疫治疗、新药物以及新设备的研发提供了重要的研究工具。必将为癌症免疫学和个性化医学提供关键性的研究平台。
在免疫系统人源化小鼠体内移植入特定患者的肿瘤组织的模型的构建与肿瘤移植的时间和人源化的方法密切相关。如果在免疫缺陷小鼠体内直接移植入人造血干细胞或功能性的淋巴细胞，使其具有人的免疫功能，但是，小鼠模型免疫重建维持时间较短，无法实现精准化治疗。另外，在免疫缺陷小鼠体内移植入人造血干细胞，成本高，对T细胞的诱导分化能力比较弱。因此，采用移植功能性的淋巴细胞，先移植患者的肿瘤组织，待肿瘤体积达增长至62mm3～100mm3，对小鼠进行亚致死性辐照后，再移植同源的功能性淋巴细胞。人源化胶质瘤PDX小鼠模型给肿瘤细胞提供与人体更相似的生长微环境，可以从组织病理学、基因表达、基因突变、炎症和治疗反应等方面真实准确的反映了临床肿瘤患者的表现，在肿瘤的发生、发展和转移机制研究等方面具有重要的应用价值，尤其在肿瘤免疫治疗研究方面，是理想的肿瘤模型。
本实施例中，步骤S3中淋巴细胞移植方式采用腹腔注射方式。淋巴细胞的注射方式与剂量，使得淋巴细胞在小鼠中充分且稳定表达，便于对检测干预对免疫系统的影响。上述淋巴细胞移植方式采用腹腔注射方式，使得淋巴细胞被吸收进入外周血中并有效增殖分化，相比于尾静脉注射，腹腔注射方式更简便易行，容易重复，不会阻塞血管形成心脑血栓，提高了小鼠的模型的成功率。
如图1和图2所示，本实施例中，步骤S3中淋巴细胞采用PBMC，PBMC注射量为0.5×106个～5×106个。上述PBMC注射入腹腔，PBMC注射量为0.5×106个～5×106个，超出范围容易很快出现移植物抗宿主反应，如图2所示的小白鼠，无法获得相对稳定的模型进行研究。
本实施例中，步骤S1的裸鼠胶质瘤模型构建具体步骤包括：将病人来源的手术标本肿瘤球培养物离心分离，离心力为200×g，离心时间为5min，将沉淀物采用Accutase细胞消化液消化成单个细胞，采用PBS制备成细胞悬液备用，将细胞悬液缓慢注入小鼠颅内。
本实施例中，细胞悬液浓度为5×107个/ml，细胞悬液注入量为4μL～5μL。小鼠的颅腔比较小，4μL～5μL为安全体积，超过容易导致颅内压升高，威胁小鼠生命。细胞数目在2～2.5×105，如果进一步提高细胞密度，容易造成细胞死亡影响细胞活性，有损建模成功率。
本实施例中，细胞悬液注入速度为1μL/min～5μL/min。
本实施例中，步骤S3中移植同源的功能性淋巴细胞具体步骤包括：在中线与冠状缝交点外侧1mm～2mm和冠状缝前方1mm处钻颅骨，将细胞悬液吸入立体定向仪上，通过立体定向仪上的针头对准颅骨孔，慢慢地将细胞悬液放入小鼠大脑，直至达到所需的深度。通常情况下，直至达到2mm～3mm。
本实施例中，步骤S2中饲养小鼠至少14天，测定胶质瘤细胞体积。上述饲养小鼠至少14天以上，测定胶质瘤细胞体积，胶质瘤细胞体积增长至62mm3～100mm3，移植同源的功能性淋巴细胞，以复制病人的免疫系统，饲养小鼠至少14天是留给胶质瘤足够的生长时间。淋巴细胞过早注射，胶质瘤细胞可能被杀灭，太晚治疗，则效果不显著，因此，经过试验优化，确定胶质瘤细胞植入小鼠的14天以上，待到胶质瘤细胞体积增长至62mm3～100mm3，再移植淋巴细胞。
根据本发明的另一方面，还提供了一种上述人源化胶质瘤PDX小鼠模型在免疫治疗评价方法或系统中的应用。
实施例
实施例1
人源化胶质瘤PDX小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：
S1、裸鼠胶质瘤模型构建：准备NRG(NOD.CgRag1tmiMom IL2rgtm1wjl/Sz)小鼠，将患者来源的新鲜手术标本肿瘤球培养物离心分离，离心力为200×g，时间为5min，将沉淀物采用Accutase细胞消化液消化成单个细胞，在冰冷的PBS中再制备成细胞悬液备用，细胞悬液浓度为5×107/ml，在中线与冠状缝交点外侧1mm～2mm和冠状缝前方1mm处钻颅骨，将细胞悬液吸入立体定向仪上的Hamilton注射器和针头中，通过针头对准颅骨孔的中心，开始注射前等待1min，细胞悬液以1μL/min速度注入小鼠大脑内，细胞悬液注入量为5μL，直至达到深度为3mm处完成注射，在拔针前等待3min，以防止注射的细胞通过针道回流；
S2、培养：饲养小鼠21天，肿瘤体积增长至62mm3～100mm3；
S3、人源化胶质瘤PDX小鼠模型构建：对小鼠以亚致死剂量X射线进行辐照，并向小鼠腹腔注射相同病人的PBMC，PBMC注射量为1×106个，检测小鼠的胶质瘤细胞生长情况和淋巴细胞的增殖分化情况，获得人源化胶质瘤PDX小鼠模型。
对比例1
与实施例1的区别为：PBMC注射量为5×107个。
(1)、实施例1的人源化胶质瘤PDX小鼠与对比例1的人源化胶质瘤PDX小鼠的活体观察
如图1和图2所示，图1为实施例1的人源化胶质瘤PDX小鼠，图2为对比例1的人源化胶质瘤PDX小鼠，与实施例1相比，对比例1的人源化胶质瘤PDX小鼠表现为毛发不齐甚至脱落，消瘦，运动障碍等，小鼠很容易快速患移植物抗宿主反应甚至死亡。而且，实施例1的小鼠患移植物抗宿主反应时间为13±1.31周，对比例1的小鼠患移植物抗宿主反应时间为8±1.19周，鉴于对比例1的小鼠胶质瘤模型在4周～6周死亡，基于在模型稳定观察差异，实施例1的PBMC注射量最佳。
(2)、实施例1的人源化胶质瘤PDX小鼠的淋巴细胞的增殖分化免疫状况
人源化胶质瘤PDX小鼠模型构建后，每周2次，连续2周监检测小鼠状态与肿瘤的生长，采血，用流式细胞仪分析小鼠的免疫状况。
结果如图3所示为人源化胶质瘤PDX小鼠的外周血淋巴细胞图，如图3中的图A、图B、图C、图D，随着时间的延长，功能性淋巴细胞发生有效的增殖分化，论证结果，人源化胶质瘤PDX小鼠能有效模拟病人的免疫状态。
(3)、实施例1的人源化胶质瘤PDX小鼠的肿瘤生成状况
试验一：人源化胶质瘤PDX小鼠模型构建后，每周采血两次，为针刺脸颊采血，每次采血约100μl～300μl，EDTA抗凝，经红细胞裂解后，离心收集淋巴细胞染色：CD4、CD8、CD25和CD127，随后经流式细胞仪检测，直至小鼠出现严重神经或免疫症状，消瘦或死亡，此时模拟胶质瘤患者免疫抑制状态(其中CD4、CD8、CD25和CD127都是T淋巴细胞的标记物，CD4+CD25+CD127-代表Treg细胞，是研究免疫状态的关键细胞类型，Treg代表调节性T细胞)。
试验二：人源化胶质瘤PDX小鼠模型构建后，进行抗CTLA4抗体治疗，给药方式：尾静脉注射，10ug/g体重，给药时间：一周2次，持续4周，每周对小鼠采血2次，为针刺脸颊采血，采血约100μl～300μl，EDTA抗凝，经红细胞裂解后，离心收集淋巴细胞染色：CD4、CD8、CD25和CD127，随后经流式细胞仪检测。
结果如图4所示为人源化胶质瘤PDX小鼠的外周血免疫细胞Treg细胞的分化状态，图4中图A、图B代表模拟胶质瘤患者免疫抑制状态，模拟胶质瘤患者免疫抑制状态，也即没经过CTLA4抗体治疗的状态。图A、图B为小鼠最后一次采血的淋巴细胞分析。图A按照淋巴细胞CD4，CD8阳性或者阴性分成4类，目的是挑出CD4阳性的细胞，进行图B的分析，图B中全部是CD4阳性，又按照CD25，CD127阳性或者阴性分成4类，目的是挑出CD4+CD25+CD127-Treg细胞。当CD4+CD25+CD127-Treg细胞/CD4比值增高时，提示免疫抑制，从而模拟肿瘤病人的免疫状态。图C、图D代表经过抗CTLA4抗体治疗状态，其为小鼠最后一次采血结果，CD4/CD8比值降低，CD4+CD25+CD127-Treg细胞/CD4比值降低，提示免疫激活，增强抗肿瘤的免疫反应。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种人源化胶质瘤PDX小鼠模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、裸鼠胶质瘤模型构建：将病人来源的胶质瘤细胞采用PBS制备成细胞悬液植入小鼠，所述细胞悬液浓度为5×107/ml，所述细胞悬液注入量为4μL～5μL；
S2、培养：饲养小鼠至少14天，测定胶质瘤细胞体积，待胶质瘤细胞体积增长至62mm3～100mm3；
S3、人源化胶质瘤PDX小鼠模型构建：对小鼠以亚致死剂量X射线进行辐照，并移植同源的功能性淋巴细胞，检测小鼠的胶质瘤细胞生长情况和淋巴细胞的增殖分化，获得人源化胶质瘤PDX小鼠模型；所述同源的功能性淋巴细胞的移植方式采用腹腔注射方式；所述同源的功能性淋巴细胞采用PBMC，所述PBMC注射量为0.5×106个～5×106个。
2.根据权利要求1所述的人源化胶质瘤PDX小鼠模型的制备方法，其特征在于，
步骤S1的裸鼠胶质瘤模型构建具体步骤包括：
将病人来源的手术标本肿瘤球培养物离心分离，离心力为200×g，离心时间为5min，将沉淀物采用Accutase细胞消化液消化成单个细胞，采用PBS制备成细胞悬液备用，将细胞悬液缓慢注入小鼠颅内。
3.根据权利要求1所述的人源化胶质瘤PDX小鼠模型的制备方法，其特征在于，
所述细胞悬液注入速度为1μL/min～5μL/min。
4.根据权利要求1所述的人源化胶质瘤PDX小鼠模型的制备方法，其特征在于，
步骤S3中移植同源的功能性淋巴细胞具体步骤包括：
在中线与冠状缝交点外侧1mm～2mm和冠状缝前方1mm处钻颅骨，将细胞悬液吸入立体定向仪上，通过立体定向仪上的针头对准颅骨孔，慢慢地将细胞悬液放入小鼠大脑，直至达到所需的深度。
5.根据权利要求1所述制备方法制备得到的人源化胶质瘤PDX小鼠模型在免疫治疗评价方法或系统中的应用。
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