KR102475776B1 - 암 오가노이드 및 내피 집락 세포를 이용한 대장암 이종이식 동물 모델 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 일 실시예는, 대장암 환자 유래의 암 오가노이드 및 내피 집락 형성 세포(ECFC)를 포함하는 세포주를 함께 이식하여 이루어진 대장암 이종이식 동물 모델 및 그 제조방법을 제공한다.
Description
본 발명은 암 오가노이드 및 내피 집락 세포(Endothelial Colony Forming Cell, ECFC)를 이용한 대장암 이종이식 동물 모델 및 그 제조방법에 대한 것으로, 보다 구체적으로 우수한 대장암 성장 능력을 갖는 동물 모델 및 그 제조방법에 관한 것이다.
대장암은 전 세계적으로 사망원인 4위의 질병으로, 우리나라 역시 서구식 식습관으로 인해 과거에 비해 대장암 발병률이 급속도로 증가하고 있다. 최근에는 우리나라 대장암 사망자 수는 위암 사망자 수 보다 많아지면서, 대장암이 위암을 앞질러, 폐암, 간암과 함께 3대 암으로 알려져 있다. 대장암은 초기에 발견하여 치료하는 경우에는 생존율이 매우 높지만, 암이 다른 곳으로 퍼진 후에는 그 치료가 어렵기 때문에, 암을 조기에 발견하고 빠른 기간 이내에 치료하는 것이 대장암 치료에서 가장 중요하다고 할 수 있다.
또한, 대장암 연구 및 치료에 있어서 환자의 특성을 잘 나타내는 환자유래 조직 이식암 모델(patient-derived xenograft model, PDX)이 중요하다. 환자유래 조직 이식암 모델은 환자의 특성을 파악하여, 각 환자에게 적절한 치료방법을 제공하고, 항암제의 부작용을 최소화 할 수 있기 때문에, 대장암으로 인한 사망률 및 부작용을 크게 낮출 수 있다. 따라서, 최근 환자 맞춤형 항암치료를 통해 암을 극복하기 위하여, 환자유래 조직 이식암 동물 모델에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
다만, 기존의 환자유래 조직 이식암 모델(patient-derived xenograft model, PDX)은, 동물에 암 조직을 이식하여 암을 형성하는데 소요되는 시간이 길며, 그 성공률도 저조한 편으로, 실제 환자에게 적용하는 것은 한계가 있다.
최근에는 환자의 암 조직으로부터 채취한 줄기세포 유래로 3D 구조를 구현한 오가노이드가 개발되었다. 다만, 오가노이드는 인체 장기와 유사한 구조, 세포의 구성 및 기능을 보유한 조직으로 제시될 수 있으나, 면역계, 혈관계 등 인체 내의 환경을 모사하는 것에는 한계가 있다. 또한, 오가노이드의 제작 및 배양은 초기 단계로서, 암의 종류에 따라 그 배양 조건이 까다로워 최적의 조건을 찾는 것이 어렵다는 문제점이 있다.
PDX 및 오가노이드 각각이 갖는 단점을 보완한 방법으로, 암 오가노이드를 동물에 이식한 환자 유래 이식암 동물 모델이 개발되어, 기존의 PDX가 가지는 단점인 소요되는 형성 시간을 단축할 수 있었다. 그러나, 이 또한, 환자 개개인의 특성에 따라 증식 속도의 차이를 보이고, 약물 평가 및 예후 분석까지 적용하기 위해서는 최소 2세대 이상의 계대 배양이 필요하므로 문제점을 가지고 있다.
따라서, 소요 시간이 짧으면서 환자 개개인에게 효과적인 환자 맞춤형 진단 또는 치료를 위한 방법이 필요하다.
Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature medicine. vol.21 no.3 pp.256-262.
이에, 본 발명은 대장암 연구 및 치료에 유용하게 사용될 수 있는 동물 모델을 제공하고자 한다. 특히, 본 발명은 환자유래 이식암 모델의 제작 기간을 단축시켜 항암 평가 및 치료 시스템의 효율을 향상시킬 수 있는 동물 모델을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 암 오가노이드 및 내피 집락 형성 세포(ECFC)를 이용한 대장암 이종이식 동물 모델을 제공하고자 한다.
본 발명은 암 오가노이드 및 내피 집락 형성 세포(ECFC)를 이용한 대장암 이종이식 동물 모델을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시예는, 암 오가노이드; 및 내피 집락 형성 세포(ECFC)를 포함하는 세포주를 동물에 이식하여 이루어진 대장암 이종이식 동물 모델을 제공한다.
상기 암 오가노이드는 크기가 200 μm 이상이다.
상기 세포주에서 상기 내피 집락 형성 세포(ECFC)는 1.00 x 103 내지 5.00 x 103 cells/mL 의 농도를 갖는다.
상기 암 오가노이드의 이식 량은 개체당 50 내지 150 μL이다.
상기 세포주의 이식 량은 개체당 50 내지 150 μL이다.
본 발명의 다른 일 실시예는, 환자로부터 분리된 대장암 조직을 세포화 하는 오가노이드 준비 단계; 세포화한 상기 대장암 조직을 배양액에 투입하여 암 오가노이드를 배양하는 오가노이드 배양 단계; 내피 집락 형성 세포(ECFC)를 배양하여 세포주를 제조하는 세포주 제조 단계; 및 상기 배양액에서 추출한 상기 암 오가노이드 및 상기 세포주를 동물에 이식하는 이식 단계;를 포함하는 대장암 이종이식 동물 모델 제조방법을 제공한다.
상기 이식 단계에서, 상기 암 오가노이드를 먼저 이식하고, 이후에 상기 세포주를 이식한다.
상기 이식 단계에서, 상기 세포주의 이식 부위는 상기 오가노이드를 이식한 부위로부터 0.5 내지 2.0 cm 주변 부위이다.
상기 이식 단계에서, 상기 암 오가노이드는 크기가 200 μm 이상이다.
상기 이식 단계에서, 상기 세포주의 상기 내피 집락 형성 세포(ECFC)는 1.00 x 103 내지 5.00 x 103 cells/mL의 농도를 갖는다.
상기 이식 단계에서, 상기 암 오가노이드의 이식 량은 개체당 50 내지 150 μL이다.
상기 이식 단계에서, 상기 세포주의 이식 량은 개체당 50 내지 150 μL이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 동물 모델은 기존의 이식암 모델의 한계점을 극복하기 위해 해당 환자 유래 암 오가노이드를 내피 집락 형성 세포(ECFC)와 함께 이식하여, 신생혈관을 필요로 하는 암의 미세환경을 구현할 수 있다. 따라서, 형성 시간을 단축하고 암 증식을 촉진하여 이식암 모델의 구축에 소요되는 시간을 단축시킨 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 동물 모델은 기존의 이식암 모델에 비하여 높은 성공률과 빠른 성장률을 가지는 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 동물 모델은 환자 개인별 항암제의 항암 효능 평가 및 방사선 치료와 같은 환자 개인 맞춤형 치료 시스템과 같이 폭 넓게 활용 가능한 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 동물 모델은 신약 개발 스크리닝에서 임상 대체 시험 방법으로 활용이 가능한 동물 모델을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 동물 모델은 대장암 발생, 증식 및 치료에 대한 기초연구에 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물 모델의 제작 모식도이다.
도 2는 실시예 1에 따른 마우스에서의 종양 성장 그래프이다.
도 3은 실시예 2에 따른 마우스에서의 종양 성장 그래프이다.
도 4는 실시예 3에 따른 마우스에서의 종양 성장 그래프이다.
도 5는 비교군의 종양 성장 그래프이다.
도 6은 실시예 2에 따른 동물 모델의 항암 효능 평가 방법의 모식도이다.
도 7는 실시예 2에 따른 동물 모델의 항암 효능 평가의 결과 그래프이다.
도 2는 실시예 1에 따른 마우스에서의 종양 성장 그래프이다.
도 3은 실시예 2에 따른 마우스에서의 종양 성장 그래프이다.
도 4는 실시예 3에 따른 마우스에서의 종양 성장 그래프이다.
도 5는 비교군의 종양 성장 그래프이다.
도 6은 실시예 2에 따른 동물 모델의 항암 효능 평가 방법의 모식도이다.
도 7는 실시예 2에 따른 동물 모델의 항암 효능 평가의 결과 그래프이다.
이하 실시예를 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이하 설명되는 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 실시예에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.
시간 관계에 대한 설명에 있어서, 예를 들어, '~후에', '~에 이어서', '~다음에', '~전에' 등으로 시간적 선후 관계가 설명되는 경우, '바로' 또는 '직접'이 사용되지 않는 이상 연속적이지 않은 경우도 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예는, 암 오가노이드; 및 내피 집락 형성 세포(ECFC)를 포함하는 세포주;를 함께 동물에 함께 이식하여 이루어진 대장암 이종이식 동물 모델을 제공한다.
오가노이드는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포 등을 3차원적으로 배양하거나 재조합해서 만든 장기유사체로서, 실제 장기의 구조와 기능을 재현하는 것이 가능하다. 기존에 2차원 배양접시에 세포를 배양하던 것과 달리, 3차원 세포 구조체를 하이드로겔 안에서 배양한다. 본 발명의 암 오가노이드는 대장암 환자의 암 조직으로부터 채취한 줄기세포를 배지 조성물을 이용하여 3차원 구조로 배양함으로써 제조한다. 제조된 암 오가노이드를 통해 지속적으로 배양 가능하여 대량 제작할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 암 오가노이드의 3차원 형태는 구(sphere) 형태로 형성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 내피 집락 형성 세포(ECFC)는 클론 증식 잠재력과 고유한 생체내 혈관 형성 능력을 지니는 세포로, 특히 제대혈에 풍부한 희귀한 순환 내피 세포이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 암 오가노이드; 및 내피 집락 형성 세포(ECFC)를 포함하는 세포주;를 함께 이식하여, 이식한 암 오가노이드 주변의 혈관 형성을 촉진할 수 있는 암 미세환경을 구축할 수 있다. 이는 암 오가노이드를 단독으로 이식할 때와 비교하여, 암 형성 기간을 단축시키고, 암 증식을 촉진시켜 높은 성공률의 대장암 이종이식 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 대장암 이종이식 동물 모델로 이용 가능한 동물은 실험 동물로 쓰이는 것이면 무엇이든 가능하다. 일반적으로 마우스, 랫, 기니피그, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 원숭이, 돼지, 염소, 닭 등이 있다. 구체적으로 마우스, 랫, 기니피그, 햄스터 및 토끼와 같은 설치류가 대표적이다. 보다 구체적으로, 마우스가 가장 적합하며, 특히 실험실에서 주로 쓰이는 SCID, NRG 및 NSG 마우스가 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 대상 동물에 이식하는 암 오가노이드는 그 크기가 200 μm 이상인 것을 이용한다. 암 오가노이드의 크기가 200 μm 미만인 경우, 이식 후 증식하지 못하고, 사멸할 수도 있어 동물 모델 제조의 성공률이 떨어진다.
암 오가노이드는 그 크기가 200 μm 이상인 것을 이용하며, 개체당 50 내지 150μL의 암 오가노이드가 대상 동물에 이식될 수 있다. 암 오가노이드의 이식 량이 50μL 미만인 경우, 이식 후 증식의 속도가 느리거나, 증식을 하지 못하고 사멸할 수 있어 대장암 이종이식 동물 모델을 얻지 못할 수 있다. 반면에, 이식 량이 150μL 초과하는 경우에는, 대장암 이종이식 동물 모델을 얻기 위해 요구되는 필요량을 초과하여, 효율이 떨어지고, 또한, 이식 부위의 공간 부족으로 인하여 얻고자 하는 대장암 이종이식 동물 모델을 얻기 어려울 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 내피 집락 형성 세포(ECFC)를 포함하는 세포주에서, 내피 집락 형성 세포(ECFC)는 1.00 x 103 내지 5.00 x 103 cells/mL의 농도를 가질 수 있다. 세포주에서 내피 집락 형성 세포(ECFC)의 농도가 1.00 x 103 cells/mL 미만인 경우, 내피 집락 형성 세포(ECFC) 첨가에 의한 효과가 발휘되지 못할 수 있다. 반면, 세포주에서 내피 집락 형성 세포(ECFC)의 농도가 5.00 x 103 cells/mL를 초과하는 경우, 필요 농도보다 과량의 내피 집락 형성 세포(ECFC)를 투입하는 것으로, 비효율적이다. 구체적으로, 세포주에서 내피 집락 형성 세포(ECFC)는 1.02 x 103 내지 1.10 x 103 cells/mL의 농도를 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 내피 집락 형성 세포(ECFC)는 약 1.06 x 103 cells/mL의 농도를 가질 수 있다.
세포주의 내피 집락 형성 세포(ECFC)는 1.00 x 103 내지 5.00 x 103 cells/mL의 농도를 가지며, 세포주의 이식량은 동물의 크기와 건강 상태, 세포주에 포함된 각 세포주들의 농도에 따라 달라질 수 있다. 구체적으로, 마우스의 상태 등을 체크하고, 개체당 50 내지 150μL의 세포주를 마우스에 이식할 수 있다. 세포주의 이식 량이 50μL 미만인 경우, 암 오가노이드의 증식을 위한 혈관 형성을 촉진할 수 있는 암 미세환경을 구축하기 어려워 효율이 떨어진다. 반면에, 세포주의 이식 량이 150μL 초과하는 경우, 피하 주사를 하는 이식 부위의 공간이 부족할 수 있고, 필요량보다 과량을 투입하는 것으로, 효율성도 떨어진다.
예를 들어, 내피 집락 형성 세포(ECFC)의 농도가 1.06 x 103 cells/mL인 세포주 100μL가 마우스에 이식될 수 있으며, 그 결과 1.06 x 102 개의 내피 집락 형성 세포(ECFC)가 마우스에 이식될 수 있다.
내피 집락 형성 세포(ECFC)를 포함하는 세포주는, 이식할 대상 동물의 세포에서 유래된 단백질 복합체를 더 포함할 수 있다. 이식 대상 동물의 세포에서 유래된 단백질 복합체로 마트리젤(Matrigel, TM)이 있다. 따라서, 세포주는 마트리젤(Matrigel, TM)을 포함할 수 있다. 이식 대상 동물의 세포에서 유래된 단백질 복합체는 내피 집락 형성 세포(ECFC)가 용이하게 혼합되도록 하며, 내피 집락 형성 세포(ECFC)의 생존 환경을 제공해준다.
세포주에 있어서, 마우스의 세포에서 유래된 단백질 복합체인 마트리젤은 10 내지 30 중량%의 농도를 가질 수 있다. 구체적으로, 마트리젤은 약 10 중량%의 농도를 가질 수 있다.
이하, 도면을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 대장암 이종이식 동물 모델 제조방법을 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물 모델의 제작 모식도이다.
도 1을 참조하면, 환자의 대장암 조직(종양 조직, Tumor)을 채취하여 세포화하고, 세포화한 대장암 조직을 배양액에서 배양하여 제1 암 오가노이드가 제조된다(Organoid incubation). 제조된 암 오가노이드는 원심분리(Centrifuge)한 후, 상등액을 제거하고, 상등액을 제거한 암 오가노이드를 내피 집락 형성 세포(ECFC)를 포함하는 세포주와 함께 대상 동물(마우스)에 이식(Organoid injection in NRGA mouse)하여 1세대 대장암 이종이식 동물 모델을 제조한다. 여기까지가 1세대 동물 모델 제조과정으로, 1세대 동물 모델로부터 다시 대장암 조직을 채취하고, 채취한 대장암 조직을 이용하여 제2 암 오가노이드를 제조하고, 제2 암 오가노이드를 계대배양 및 다수의 동물에 이식하는 2세대 동물 모델 제조과정을 추가로 실시한다. 2세대 동물 모델 제조과정을 통하여 다수의 2세대 대장암 이종이식 동물 모델을 제조한다(Subculture 2nd generation).
그 결과 이종 이식이 이루어져, 대장암 이종 이식된 동물 모델이 제조된다.
보다 구체적으로, 대장암 환자의 대장암 조직을 채취하고, 채취한 대장암 조직을 세포화하는 오가노이드 준비 단계; 세포화한 대장암 조직을 3차원 배양액에 투입하여 암 오가노이드를 배양하는 오가노이드 배양 단계; 내피 집락 형성 세포(ECFC)를 배양하여 세포주를 제조하는 세포주 제조 단계; 및 배양액에서 추출한 암 오가노이드 및 세포주를 동물에 이식하는 이식 단계를 통하여 대장암 이종이식 동물 모델이 제조된다.
오가노이드 준비 단계에서, 세포화란 채취된 대장암 조직으로부터 대장암 세포로 분해하는 것으로, 오가노이드를 배양하기 위해 대장암 조직을 세포단위로 만드는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 대장암 조직의 세포화는 공지된 프로토콜에 의해 진행된다. 대장암 환자로부터 대장암 조직을 2 내지 3 mm2 절단한 후, 세척 용액(PBS)을 이용하여 세척하였다. 세척한 대장암 조직은 소화 용액(collagenase buffer)을 넣고 배양기에서 반응시킨다. 반응이 끝나면, 다시 세척 용액으로 세척한 후, 원심분리하고, 상등액을 제거한다. 세척, 원심분리 및 상등액 제거를 몇 차례 반복하여 대장암 조직을 세포화할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 오가노이드 배양 단계는 대장암 조직의 세포화를 통해 얻은 대장암 세포를 플레이트에 분주하고, 배양액을 첨가하여 배양할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포주 제조단계는, 내피 집락 형성 세포(ECFC)를 EGM-2 배지에서 배양하고, 마트리젤을 첨가하여 세포주를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 이식 단계에서, 암 오가노이드를 먼저 이식하고, 이후에 세포주를 이식할 수 있다. 내피 집락 형성 세포(ECFC)를 포함하는 세포주를 암 오가노이드를 이식한 부위 주변에 이식함으로써 암 미세환경을 효율적으로 구축하기 위함이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 세포주는 암 오가노이드를 이식한 부위로부터 0.5 내지 2.0 cm 주변 부위에 이식할 수 있다. 0.5 cm 미만의 부위에 이식하는 경우, 오히려 암 오가노이드의 증식을 방해할 수 있다. 반면에, 2.0 cm 초과하는 부위에 이식하는 경우, 암 오가노이드 증식에 기여하는 암 미세환경을 구축하기 어려워, 암 오가노이드의 증식 속도가 떨어진다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 이식 단계에서, 대상 동물에 이식되는 암 오가노이드는 그 크기가 200 μm 이상인 것을 이식할 수 있다.
암 오가노이드 이식 단계에서의 이식하는 암 오가노이드는 그 크기가 200 μm 이상인 것을 이용하며, 개체당 50 내지 150μL의 암 오가노이드가 대상 동물에 이식될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 이식 단계에서, 세포주의 내피 집락 형성 세포(ECFC)는 1.00 x 103 내지 5.00 x 103 cells/mL의 농도를 가질 수 있다. 구체적으로, 세포주에서 내피 집락 형성 세포(ECFC)는 1.02 x 103 내지 1.10 x 103 cells/mL의 농도를 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 내피 집락 형성 세포(ECFC)는 약 1.06 x 103 cells/mL의 농도를 가질 수 있다.
세포주의 내피 집락 형성 세포(ECFC)는 1.00 x 103 내지 5.00 x 103 cells/mL의 농도를 가지며, 개체당 50 내지 150μL의 세포주가 대상 동물에 이식될 수 있다.
예를 들어, 내피 집락 형성 세포(ECFC)의 농도가 1.06 x 103 cells/mL인 세포주 100μL가 마우스에 이식될 수 있으며, 그 결과 1.06 x 102 개의 내피 집락 형성 세포(ECFC)가 마우스에 이식될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 이식 단계에서, 내피 집락 형성 세포(ECFC)를 포함하는 세포주는, 이식할 대상 동물의 세포에서 유래된 단백질 복합체를 더 포함할 수 있다. 이식 대상 동물의 세포에서 유래된 단백질 복합체로 마트리젤(Matrigel, TM)이 있다. 따라서, 세포주는 마트리젤(Matrigel, TM)을 포함할 수 있다.
세포주에 있어서, 마우스의 세포에서 유래된 단백질 복합체인 마트리젤은 10 내지 30 중량%의 농도를 가질 수 있다. 구체적으로, 마트리젤은 약 10 중량%의 농도를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 대장암 이종이식 동물 모델 제조방법은, 이식 단계에 의해 제조된 대장암 이종이식 동물 모델을 1세대 대장암 이종이식 동물 모델이라하고, 본 제조방법을 1세대 대장암 이종이식 동물 모델 제조방법이라 한다. 이에 추가로, 제조된 1세대 대장암 이종이식 동물 모델에 형성된 대장암 조직을 채취하여 또 다른 암 오가노이드를 제조하고, 이를 계대배양하여 서로 다른 수개의 동물에 이식하는 계대배양 2세대(subculture 2nd generation) 이식 단계를 더 포함할 수 있다. 대장암 환자로부터 대장암 조직을 채취하여 제조된 암 오가노이드 및 대장암 이종이식 동물 모델을 각각 제1 암 오가노이드 및 1세대 대장암 이종이식 동물 모델이라 하였을 때, 대장암 이종이식 동물 모델로부터 대장암 조직을 채취하여 제조된 것들을 제2 암 오가노이드 및 2세대 대장암 이종이식 동물모델이라 한다. 2세대 대장암 이종이식 동물 모델 제조방법은 다수의 대장암 이종이식 동물 모델을 제조할 수 있어, 환자 치료뿐만 아니라 대장암 연구 및 치료법 개발에 더욱 효과적이다.
암 오가노이드 및 내피 집락 형성 세포(ECFC)를 포함하는 세포주를 이식한 동물을 대상으로, 종양 형성 여부 및 종양의 성장을 관찰한다.
이하, 시험예를 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
[오가노이드의 준비 단계]
내시경을 통해 얻은 대장암 환자 조직을 2 내지 3 mm2 로 절단한다. 절단한 조직은 PBS를 이용하여 2 번 헹군 후, 37oC 쉐이킹인큐베이터(shaking incubator)를 이용해 콜라게나제 완충액(collagenase buffer)과 30 내지 60 분 간 반응시킨다. FBS 2 ml를 첨가한 후, 100 μM 셀 스트레이너(cell strainer)를 통과시키고, 300 rpm, 3 분간 원심분리 한다.
상등액을 제거하고 기저 배양기(basal culture medium)를 이용하여 2 번 헹군 후, 300 rpm, 3 분간 원심분리 한다. 가라앉은 펠릿(pellet)은 마트리젤(matrigel) 2 mL 으로 균질화한 후, 4 well 플레이트에 50 μL씩 분주하다. 각 well 당 10,000 내지 20,000 개의 세포로 분주한다.
37oC에서 플레이트를 20 분간 배양하고, 각 well 의 마트리젤(matrigel) 이 굳은 것을 확인한 후 배양액을 500 μL를 첨가한다. 지속적인 관찰하는 동안 오가노이드가 200 μm 이상 자라면 계대배양을 한다.
[오가노이드 배양 단계]
크기가 200 μm 이상이 된 오가노이드는 배양액을 버리고 PBS를 이용해 2 번 헹군다. 피펫을 이용해 각 well 당 세포 해리 시약(gentle cell dissociation reagent)을 400 μL씩 첨가한 후, 파이펫팅하여 오가노이드를 작은 조각으로 조각낸다. Basal culture 배양액을 500 μL 첨가 후 EP tube 에 옮기고, 600 rcf, 5 분간 원심분리 한다. 상등액을 버리고 가라앉은 펠릿(pellet)에 basal culture 배양액을 이용해 1:2 또는 1:4 비율로 균질화한 후, 마트리젤(matrigel)을 이용하여 분주한다.
[내피집락형성세포 (ECFC)의 배양 및 세포주 제조 단계]
내피 집락 형성 세포(ECFC)를 1% 젤라틴이 코팅된 플레이트에서 10% FBS를 포함한 EGM-2 배지에서 배양한다. PBS로 헹군 후 트립신-EDTA로 떼어내고, 10% 마트리젤(matrigel)에 1 x 107 cells/mL의 농도로 만들어 준비한다.
[암 오가노이드 및 내피 집락 형성 세포를 포함하는 세포주 이식 단계]
4 well 플레이트에 배양된 크기가 200 μm 이상이 된 오가노이드는 배양액을 버리고 PBS를 이용해 2 번 헹군다. 피펫을 이용해 각 well 당 PBS 500 μL씩 첨가한 후, 파이펫팅하여 오가노이드를 작은 조각으로 조각낸다.
조각난 오가노이드는 15 mL tube 에 옮긴 후, 1,200 rpm, 5 분 간 원심분리 한다. 상등액 제거하고, 적당량의 PBS를 넣어 균질화 시킨 후, 얼음통에 넣어 실험동물실로 이동한다.
오가노이드는 6 주령이 된 NRGA 마우스에게 100 μL을 1 mL 실린지에 넣고 26 G 바늘을 이용하여 대퇴부 부위에 피하주사로 이식한다.
내피 집락 형성 세포(ECFC)는 1 x 106 cells/100 μL을 1 mL 실린지에 넣고 26 G 바늘을 이용하여 오가노이드를 이식한 부위 주변에 피하주사로 이식한다.
[종양의 형성 및 크기 측정]
육안으로 확인되는 종양이 있는지 사육실에서 사육되는 마우스(Balb/c nude마우스)를 주 3회 관찰하고 체중을 측정한다.
육안으로 종양 형성된 것을 확인한 후부터, 일주일에 3번씩 캘리퍼(caliper)를 이용하여, 종양의 장축 및 단축 길이를 측정하여 기록한 후, 종양의 부피(Tumor volume)를 하기 계산식 1에 따라 계산한다.
<계산식 1>
종양부피(mm3) = 0.5 Х 장축길이(mm) Х 단축길이(mm)2
종양의 부피를 기준으로, 종양 생성 유무 및 성장 곡선을 기록한다.
각 실시예의 측정 결과는 도 2 내지 도 4에 도시되어 있다.
[계대배양 2세대]
앞서 제조된 대장암 이종이식 동물 모델로부터 대장암 조직을 다시 채취 및 계대배양하고, 동일한 방법에 따라 다수의 동물에 이식하여 2세대 대장암 이종이식 동물 모델을 제조한다.
이하, 도 2 내지 도 4를 참조하여, 본 발명의 실시예 및 측정 결과를 상세히 설명한다.
도 2 내지 도 4은 실시예 1 내지 실시예 3에 따른 대장암 이종이식 동물 모델의 종양 성장 그래프이다.
<실시예 1>
[암 오가노이드와 내피집락형성세포(ECFC)의 공동 이식에 의한 종양 증식 곡선(1세대)] - 환자 1
본 실시예 1은 환자 1로부터 채취된 암 조직으로부터 전술한 시험예에 의해 제조된 1세대 대장암 이종이식 동물 모델이다. 이식할 마우스는 종양 크기 차이를 비교하기 위해 두 마리를 준비한다.
200 μm 이상이 된 암 오가노이드를 "암 오가노이드 및 내피집락형성세포(ECFC)를 포함하는 세포주 이식" 방법에 따라, NRGA 마우스에 피하주사로 이식한다. 두 마리의 마우스 중 한 마리에게만 ECFC 1106 cells/100 μL을 1 mL 실린지에 넣고 26 G 바늘을 이용하여 오가노이드를 이식한 부위 주변에 피하주사로 이식한다. 이를 실시예 1이라 한다.
실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 암 오가노이드는 이식하지만 ECFC를 이식하지 않은 마우스를 비교예 1이라 한다.
ECFC의 유무에 따른 암 오가노이드의 증식 차이를 평가한다.
도 2는, 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에 따른 마우스 종양의 증식 곡선이다.
ECFC를 함께 이식한 실시예 1의 경우, 종양의 형성을 육안으로 확인할 수 있고, 증식 곡선을 그릴 정도의 크기로 증식 하였다. 반면, 암 오가노이드만 이식한 비교예 1의 경우, 평가가 가능할 정도의 종양의 형성을 확인할 수 없었다. 따라서, ECFC가 함께 이식된 실시예 1에서의 종양 생성률이, ECFC가 이식되지 않은 비교예 1에서의 종양 생성률에 비하여 우수하다는 것을 확인할 수 있다.
<실시예 2>
[암 오가노이드와 내피집락형성세포(ECFC)의 공동 이식에 의한 종양 증식 곡선(2세대)] - 환자 2(여성)
본 실시예 2은 여성 환자 2로부터 채취된 암 조직으로부터 전술한 시험예에 의해 제조된 2세대 대장암 이종이식 동물 모델이다. 다만, 본 발명의 암 오가노이드 및 내피집락형성세포(ECFC)를 함께 이용하여 만들어진 이종이식 동물 모델에서 다시 종양을 채취하여, 2세대로 계대배양하여 제조된 대장암 이종이식 동물 모델이다.
2세대 계대배양은 NRGA 마우스에서 배양한 오가노이드 조직을 적출하여 1 내지 2 mm2 크기로 자른 후, 2 마리의 Balb/c 누드 마우스의 대퇴부 피하를 절개하여 각각 종양을 이식한다.
ECFC (1 x 106 cells) 세포를 10% matrigel에 넣어주고, 1마리에게만 ECFC 세포를 이식한 종양 조직 주변에 주입한다. ECFC를 이식한 마우스를 실시예 2라 한다.
실시예 2와 동일한 방법으로 제조하되, 암 오가노이드는 이식하지만 ECFC를 이식하지 않은 마우스를 비교예 2이라 한다.
ECFC의 유무에 따른 암 오가노이드의 증식 차이를 평가한다.
도 3는, 본 발명의 실시예 2 및 비교예 2에 따른 마우스 종양의 증식 곡선이다. ECFC를 함께 이식한 실시예 2의 경우, 2세대의 종양 증식 속도가 빨라서, 빠른 시일 내로 양물 효능 평가가 가능할 정도가 되었다. 반면에, ECFC를 이식하지 않은 비교예 2의 경우, 종양의 증식을 확인할 수 없었다.
<실시예 3>
[암 오가노이드와 내피집락형성세포(ECFC)의 공동 이식에 의한 종양 증식 곡선(2세대)] 환자 3(남성)
실시예 3는 남성 환자 3로부터 채취된 암 조직으로부터 실시예 2와 동일한 조건에 의해 제조된 대장암 이종이식 동물 모델이다. 비교예 3 역시 비교예 2와 동일한 방식으로 제조되었다. 따라서, 실시예 3은 실시예 2와 대장암 조직을 채취한 환자만 다르고, 제조방법은 동일하다.
실시예 2와 동일하게, ECFC의 유무에 따른 암 오가노이드의 증식 차이를 평가한다.
도 4는, 본 발명의 실시예 3 및 비교예 3에 따른 마우스 종양의 증식 곡선이다. ECFC를 함께 이식한 실시예 3의 경우, 2세대의 종양 증식 속도가 빠르고 꾸준히 증가하여, 양물 효능 평가가 가능한 동물 모델로 사용 가능하였다. 반면에, ECFC를 이식하지 않은 비교예 3의 경우, 종양의 증식을 확인할 수 없고, 오히려 종양의 크기가 감소하였다.
도 5는 본 발명의 실시예를 시행하기 이전에, 내피 집락 형성 세포(ECFC)는 제외하고, 환자 2 및 3 환자 유래 암 오가노이드만 단독으로 이식하여 얻은 이종이식 동물모델의 종양 증식 곡선을 표시한다. 본 비교예는 본 발명의 대장암 이종이식 동물 모델 제조방법 중에서 2세대 이식 제조방법에 의해 제조된 2세대 NRGA 마우스로부터 오가노이드 조직을 적출하여, 1 내지 2 mm2 크기로 자른 후, Balb/c 누드 마우스의 대퇴부 피하를 절개하여 각각 종양을 이식하고, 육안으로 측정되는 종양의 크기를 캘리퍼로 측정한 것이다. 환자 2와 3을 비교하였을 때, 종양의 크기뿐만 아니라, 종양의 증식 속도에서 큰 차이를 보이는 것을 알 수 있다. 반면, 도 3 및 도 4를 비교하였을 때, 본 발명의 일 실시예에 의해 제조된 대장암 이종이식 동물 모델은 환자 2와 3의 동물 모델의 종양 증식 차이가 상대적으로 작은 것을 알 수 있다
도 6은 본 발명의 실시예 2의 대장암 이종이식 동물 모델을 활용한 항암효능 평가 방법을 표시하는 것이다.
NRGA 마우스에 이식한 오가노이드 조직(2세대 이식모델)의 크기가 300 mm3 이상이 되면, 적출하고 나서 PBS에 헹군다. 적출된 종양은 1 내지 2 mm2 크기로 자른 후, 항암제 효능 평가를 위해 6주 된 Balb/c 마우스(알비노 근교계 생쥐의 일종)에 대퇴부의 피하를 절개하여 종양을 이식한다. 이식한 오가노이드 조직의 부피가 대략 100 mm3 정도 되면, 대조군(Control group)과 약물처리군(Treat group)으로 마우스를 무작위로 나눈다. 대조군에는 생리식염수를, 약물처리군에는 항암제를 복강 내 투여를 하면서 항암제 효능을 평가한다.
도 7은 도 6에 의한 동물 모델 활용한 항암 효능 평가의 결과를 표시하는 것이다.
항암제는 5-FU(5-플루오로우라실) 명칭의 항악성 종양제를 사용하였고, 약물 처리군에만 항암제를 투여한 뒤, 대조군과 약물처리군의 종양 크기(Tumor volume) 및 종양 무게(Tumor weight)를 측정하여 항암제의 효능을 비교하였다. 약물처리군에 5-FU의 투여는 1일차, 3일차, 5일차 및 9일차, 총 4회 투여하였다.
5-FU를 처리한 약물 처리군은 대조군에 비해 종양의 크기가 시간이 지날수록 차이가 벌어지는 것을 볼 수 있다. 종양의 무게는 5-FU를 마지막 투여한 후 약 3주가 지난 뒤에 측정한 것으로, 대조군에 비해 약물처리군의 종양이 눈에 띄게 작은 것을 확인할 수 있다.
이상과 같이, 마우스가 적용된, 본 발명의 실시예들에 따른 동물 모델은, 대장암 환자 유래 암 오가노이드 및 내피 내피 집락 형성 세포(ECFC)가 함께 이식되어 만들어진 대장암 이종이식 동물 모델로, 대장암 진단, 치료 및 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (12)
- 암 오가노이드; 및
내피 집락 형성 세포(ECFC)를 포함하는 세포주;
를 동물에 이식하여 이루어진 대장암 이종이식 동물 모델. - 제1항에 있어서,
상기 암 오가노이드는 크기가 200 μm 이상인, 대장암 이종이식 동물 모델. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 암 오가노이드의 이식 량은 개체당 50 내지 150 μL인, 대장암 이종이식 동물 모델 - 제1항에 있어서,
상기 세포주의 이식 량은 개체당 50 내지 150 μL인, 대장암 이종이식 동물 모델. - 환자로부터 분리된 대장암 조직을 세포화 하는 오가노이드 준비 단계;
세포화한 상기 대장암 조직을 배양액에 투입하여 암 오가노이드를 배양하는 오가노이드 배양 단계;
내피 집락 형성 세포(ECFC)를 배양하여 세포주를 제조하는 내피 집락 형성 세포(ECFC) 세포주 제조 단계; 및
상기 배양액에서 추출한 상기 암 오가노이드 및 상기 세포주를 동물에 이식하는 이식 단계;
를 포함하는 대장암 이종이식 동물 모델 제조방법. - 삭제
- 제6항에 있어서,
상기 이식 단계에서, 상기 내피 집락 형성 세포(ECFC)의 이식 부위는 상기 암 오가노이드를 이식한 부위로부터 0.5 내지 2.0 cm 주변 부위인, 대장암 이종이식 동물 모델 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 이식 단계에서, 상기 암 오가노이드는 크기가 200 μm 이상인, 대장암 이종이식 동물 모델 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 이식 단계에서, 상기 세포주의 상기 내피 집락 형성 세포(ECFC)는 1.00 x 103 내지 5.00 x 103 cells/mL의 농도를 갖는, 대장암 이종이식 동물 모델 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 이식 단계에서, 상기 암 오가노이드의 이식 량은 개체당 50 내지 150 μL인, 대장암 이종이식 동물 모델 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 이식 단계에서, 상기 세포주의 이식 량은 개체당 50 내지 150 μL인, 대장암 이종이식 동물 모델 제조방법.
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