CN110812496B

CN110812496B - 一种抗肿瘤药物的快速药敏检测方法

Info

Publication number: CN110812496B
Application number: CN201810916601.5A
Authority: CN
Inventors: C.赵; D.陈; 朱燕萍; 王志强
Original assignee: Nanjing Puenrui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Puenrui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-08-13
Filing date: 2018-08-13
Publication date: 2022-10-21
Anticipated expiration: 2038-08-13
Also published as: CN110812496A

Abstract

本发明涉及一种抗肿瘤药物的快速药敏检测方法，其包括将肿瘤组织和/或细胞接种到小鼠肾包膜中，其中所述小鼠为免疫缺陷小鼠或裸小鼠，优选为生长抑素基因敲除的免疫缺陷小鼠；给予所述小鼠测试肿瘤药物，一定时间后处死小鼠取出肿瘤组织通过观测肿瘤细胞坏死率和/或肿瘤细胞Ki67蛋白表达量判定药物敏感性。本发明所述方法可以快速准确提供药敏结果，为临床实现肿瘤个性化治疗提供可能。本发明方法也可以用于异种移植肿瘤动物模型制备及抗肿瘤药物筛选。

Description

一种抗肿瘤药物的快速药敏检测方法

发明领域

本发明涉及一种抗肿瘤药物的快速药敏检测方法。更具体地说，本发明涉及肿瘤组织和/或细胞异种移植小鼠模型的建立及其药敏检测方法。本发明方法也可以用于抗肿瘤药物筛选。

背景技术

近年来，恶性肿瘤已成为全球人类头号杀手，尽管在肿瘤的基础研究、转化医学及临床研究等方面取得了不少成绩，但是多数抗肿瘤化疗药物的疗效并不尽人意，化疗有效率仅25-30%，同时引起患者极大的毒副反应，威胁患者生命。因此，如何开展肿瘤个体化精准诊疗，为各个患者筛选合适的治疗药物和/或方案，提高治疗有效率是临床上亟待解决的问题。

目前抗肿瘤新药研发及临床化疗选择常基于肿瘤细胞体外培养药敏测试、基因检测及传代肿瘤细胞移植的体内模型（cell line-derived xenografts，CDX）等，具有一定的研究和临床价值，但是并不能真正反映临床个体对于治疗药物的敏感性，故临床疗效预测性较差，无临床实用性。目前应用于抗肿瘤药物检测最好的技术是人源性肿瘤组织异种移植模型（patient-derived tumor xenograft models，PDTX），是将来自患者的新鲜肿瘤组织以组织块的形式接种到免疫缺陷小鼠体内，其在基因组层面、蛋白组层面及组织形态学层面保留了患者肿瘤分子生物学特征，保持了与病人肿瘤相似的遗传特性和肿瘤异质性。然而，目前传统PDTX模型应用于药物筛选的方法具有建模和药效检测时间长等缺点，主要原因是传统PDTX药敏评价方法主要基于肿瘤体积的测定，因为肿瘤生长到可测量体积的时间较长（至少为2个月），例如原代移植加上药敏检测时间需要2-6个月，且建模成本高昂，这也限制了PDTX的发展与应用。

因此，为了适应临床肿瘤个体化精准诊疗和药物筛选的需要，亟需一种快速准确的药敏检测方法，包括改进的PDTX建模方法与新的药敏评价方法，其能够降低建模和药敏检测时间，降低成本，在保证肿瘤异质性与建模成功率的同时利于推广应用。

发明内容

本发明提供一种新的抗肿瘤药物快速药敏检测方法（下文简称SuperPDTX），其包括提供肿瘤组织和/或细胞。所述肿瘤组织和/或细胞可以来源于人或者非人动物，所述非人动物例如小鼠、大鼠、牛、羊、猿猴等。所述肿瘤组织和/或细胞优选为来自肿瘤病人。对取自肿瘤病人的肿瘤组织进行常规处理，例如机械除去除结缔组织、脂肪组织和肿瘤坏死组织等；然后将肿瘤组织适当剪碎，例如制成约0.5×0.5×1mm³至约2×2×3mm³大小的组织块，优选为约1×1×2mm³大小的组织块。

在本发明中，术语“肿瘤”是指任何来源的任何组织/细胞类型的恶性肿瘤和癌症，包括但不限于胃癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、口腔癌、骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌、脑部肿瘤（例如神经胶质瘤）、白血病、神经内分泌肿瘤、肝癌、肾癌、胰腺癌、肺癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、软组织肉瘤、皮肤癌、甲状腺癌、淋巴癌等。

本发明方法进一步包括将来自肿瘤病人或者非人动物的肿瘤组织和/或细胞接种到小鼠血供丰富的部位，优选肾包膜中。优选，所述小鼠可以为任何免疫缺陷型小鼠或裸鼠，包括但不限于NCG和B-NDG免疫缺陷小鼠。在本发明中，所述小鼠优选为生长抑素基因敲除的所述免疫缺陷小鼠，例如生长抑素基因敲除的NCG或者B-NDG免疫缺陷小鼠。从所述免疫缺陷小鼠中敲除生长抑素基因的方法可以是本领域已知的常规方法，例如通过基因打靶敲除。在本发明方法中，肿瘤组织或细胞在所述小鼠体内生长3-10天形成肿瘤异种移植模型，优选3-9天、优选3-7天，更优选3、4、5天，最优选4天形成肿瘤异种移植模型。

所述接种肿瘤组织和/或细胞的小鼠血供丰富部位包括但不限于：肾包膜内、接近心脏的表皮下和大网膜下原位接种等。

在本发明方法中，对所述携带肿瘤的肿瘤异种移植模型小鼠给予测试肿瘤药物，给予肿瘤药物方法可以是任何合适的方式，例如经口、腹膜内给予、局部给药、注射等。

本发明方法进一步包括在给予抗肿瘤药物后3-10天、优选4-9天、优选5-9天后处死小鼠取出肿瘤组织并观测肿瘤生长情况，图3图示了本发明的SuperPDTX方法观测肿瘤生长情况检测示意图。优选，处死肿瘤异种移植模型小鼠观测肿瘤生长情况的时间为给予抗肿瘤药后第5、6、7、8、9天，最优选第7天。在本发明方法中，观测肿瘤生长情况包括观测肿瘤细胞坏死率（tumor cell necrosis rate, TCNR）和/或肿瘤细胞的Ki67蛋白表达量，所述TCNR和Ki67表达量为药物疗效的评价指标。与空白对照组进行比较判断结果。

另一方面，本发明所述方法也可以用于筛选抗肿瘤药物。

因此，本发明也提供一种快速的筛选抗肿瘤药物的方法，其包括将肿瘤组织和/或细胞接种到小鼠血供丰富部位、优选肾包膜中。在所述筛选抗肿瘤药物的方法，所述肿瘤组织和/或细胞既可以来源于人或者非人动物，所述非人动物例如小鼠、大鼠、牛、羊、猿猴等。最优选地，对取自肿瘤病人的肿瘤组织进行常规处理，例如机械除去除结缔组织、脂肪组织和肿瘤坏死组织等；然后将肿瘤组织适当剪碎，例如制成约0.5×0.5×1mm³至约2×2×3mm³大小的组织块，优选为约1×1×2mm³大小的组织块。此外，所述异种移植到所述小鼠建立肿瘤模型的细胞也可以为任何已经建立的肿瘤细胞系细胞。本发明还提供新的抗肿瘤药物，所述药物通过本发明所述方法筛选获得。

再一方面，本发明还涉及TCNR和/或Ki67蛋白在抗肿瘤药物药敏检测方法和抗肿瘤药物筛选方法中的用途。

再一方面，本发明还涉及包括用于检测Ki67蛋白的试剂(例如抗Ki67的抗体，包括抗Ki67的单克隆抗体和多克隆抗体)的试剂盒。所述试剂盒用于抗肿瘤药物药敏检测方法或者抗肿瘤药物筛选方法中。

在本发明方法中，将肿瘤组织和/或细胞接种到小鼠体内血管丰富的部位例如肾包膜中，可加速肿瘤在小鼠体内的生长速度。目前对治疗效果评估最直接的方法为观察肿瘤化疗后的肿瘤组织/细胞病理学改变，并计算肿瘤细胞坏死率，而本发明在对药敏评价过程中，加入了另一种评价指标Ki67。因此，本发明方法的优势包括保留了原代肿瘤样品组织学和病理学的特性、有较高的建模成功率（90%以上），提高药敏准确性以及更高的临床效果一致性（70%以上），又大幅度缩短建模与药敏检测时间，例如动物试验时间6-15天，检测及结果评价时间1-5天，能够更快提供药敏检测结果。此外，与传统的PDTX相比，P1代小鼠就可以做药敏试验，缩短了小鼠饲养时间，本发明检测方法需要的小鼠数量也减少了，因此本发明方法使得药敏测定的成本显著降低，费用降低到传统PDTX费用的1/10。

附图简要说明

图1. 图示肿瘤体积变化曲线图。

图2. 图示实验肿瘤大小。

图3. 本发明的SuperPDTX方法观测肿瘤生长情况检测示意图。

图4. 本发明方法的Ki67和TCNR结果。

实施例

1. 实验材料与试剂：

Leibovitz's L-15培养基（下文简称L-15）	Gibco
		青霉素/链霉素（双抗）	Gibco
胎牛血清	Gibco
		RNAlatter	Thermo
DMSO	SIGMA
		PBS	HyClone
培养皿
		组织固定液（10%中性甲醛）	北京益利精细化学品有限公司

保存液：9mL L-15加入90uL双抗，混合均匀。配制后4℃保存，1周内使用。

其它试剂或者药物商购获得。

2. 培养基配置：90份体积的L-15与10份体积的胎牛血清混合，加入青霉素和链霉素，得到配置的L-15培养基，其中青霉素的终浓度为50-200U/ml，链霉素的终浓度为50-200U/ml；

3. 孵育液配置：45份体积L-15培养基加上5份体积的胎牛血清，混合50份体积Matrigel胶混合，青霉素和链霉素，得到无菌孵育液；

4. 工作实施例试验动物：通过基因打靶敲除生长抑素基因获得的裸小鼠，即生长抑素基因敲除的裸小鼠免疫缺陷小鼠，饲养于SPF级别动物房，动物房位于南京医科大学医药实验动物中心内，小鼠为4-5周龄的雌性小鼠。

对比实施例

骨肉瘤样品的PDTX药敏检测试验

1. 样品选择：临床手术取病人右胫骨骨肉瘤。

2. 药敏检测方案：测试肿瘤药物包括以下10组：1）索拉菲尼+依维莫司; 2) 阿帕替尼; 3) 吉西他滨+多西他赛; 4) 吉西他滨; 5) 吉西他滨+白蛋白紫杉醇; 6) 异环磷酰胺+依托泊苷; 7) 异环磷酰胺+多柔比星; 8) 伊立替康+依托泊苷；9）环磷酰胺+依托泊苷；10）白蛋白紫杉醇。

3. 操作流程：

（1）接种方式：将手术切除的骨肉瘤肿瘤组织放入装有如上所述配置的培养基15ml的离心管中，密封，移到超净工作台后，倒入60mm规格的培养皿中，显微镜下观察，剔除结缔组织、脂肪组织和肿瘤坏死组织，选择血管较多的肿瘤组织剪成1×1×2 mm³组织块，用所述孵育液于4℃浸泡30分钟备用，再将浸泡备用的肿瘤组织分别接种到B-NDG小鼠（购于百奥赛图江苏基因生物技术有限公司）背部皮下，每只小鼠接种2个位点，接种5只B-NDG小鼠；

（2）接种后，每天观察动物状态，每周1次测量肿瘤体积大小并进行荷瘤小鼠体重称量，计算肿瘤体积V（mm³）= (a×b²)/2，a: 肿瘤长径，b: 肿瘤短径。待P1代肿瘤生长累积至600mm³（生长天数为69天），然后进行传代扩增，接种到80只B-NDG小鼠体内。

4. 药敏学实验：

（1）P2代药敏学检测：待P2代小鼠的肿瘤平均体积达到150mm³时，生长天数为57天，根据均一性原理挑选66只随机分组，1组对照组（给予不含肿瘤药物的溶媒），10组治疗组（根据上述药敏方案进行）。给药后每天观察记录小鼠一般状态，每周2次测量肿瘤体积大小，并称量荷瘤小鼠体重。持续观察21天。

（2）待观察21天后，将上述小鼠处死，剥离出肿瘤组织，测量小鼠的原位肿瘤大小，测量肿瘤长径，短径，按照以下公式计算出肿瘤体积：肿瘤体积V（mm³）= (a×b²)/2，a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。

5. 药效学评价：

终末肿瘤生长抑制率(Terminal Tumor Growth Inhibition, TGI)=[（对照组瘤体积-实验组瘤体积）/对照组瘤体积]×100%

6. 实验结果

（1）药敏实验结束后小鼠解剖情况及肿瘤体积大小。图1图示肿瘤体积变化曲线图，图2图示实验肿瘤大小。

（2）PDTX检测结果TGI参见下表1。

表1

序号号	化疗方案	抑瘤率（TGI）
			1	索拉菲尼+依维莫司	82.4%
2	阿帕替尼	28.6%
			3	吉西他滨+多西他赛	93.5%
4	吉西他滨	39.5%
			5	吉西他滨+白蛋白紫杉醇	96.7%
6	异环磷酰胺+依托泊苷	20.7%
			7	异环磷酰胺+多柔比星	71.5%
8	伊立替康+依托泊苷	87.2%
			9	环磷酰胺+依托泊苷	46%
10	白蛋白紫杉醇	96.8%

根据上表1的PDTX抑瘤率结果，检测方案疗效依次为：方案10（白蛋白紫杉醇）＞方案5（吉西他滨+白蛋白紫杉醇）＞方案3（吉西他滨+多西他赛）＞方案8（伊立替康+依托泊苷）＞方案1（索拉菲尼+依维莫司）＞方案7（异环磷酰胺+多柔比星）＞方案9（环磷酰胺+依托泊苷）＞方案4（吉西他滨）＞方案2（阿帕替尼）＞方案6（异环磷酰胺+依托泊苷）。其中方案10（白蛋白紫杉醇）、方案5（吉西他滨+白蛋白紫杉醇）、方案3（吉西他滨+多西他赛）、方案8（伊立替康+依托泊苷）、方案1（索拉菲尼+依维莫司）及方案7（异环磷酰胺+多柔比星）有较好的疗效，将其提供给临床医生参考。

工作实施例

结肠癌样品的Super PDTX药敏检测试验

作为比较，在进行以下本发明试验的同时平行按照上述对比实施例进行相应的PDTX检测实验。

1. 样本选择：手术切除的直肠前壁结肠癌转移灶肿瘤组织。

2. 药敏检测方案：测试肿瘤药物包括以下8组：1）吉西他滨; 2)白蛋白紫杉醇;3)雷替曲塞+奥沙利铂; 4)伊立替康+爱必妥; 5)瑞格非尼; 6)沃利替尼; 7)依维莫司;8)阿帕替尼。

3. 操作流程：

（1）接种方式：将手术切除的结肠癌肿瘤组织放入装有如上所述配置的培养基15ml的离心管中，密封，移到超净工作台后，倒入60mm规格的培养皿中，显微镜下观察，剔除结缔组织、脂肪组织和肿瘤坏死组织，选择血管较多的肿瘤组织剪成1×1×2 mm³组织块，用所述孵育液于4℃浸泡30分钟备用，再将浸泡备用的肿瘤组织/细胞分别接种到所述生长抑素基因敲除的免疫缺陷小鼠肾包膜中，共计9只小鼠。

（2）接种后，持续5天每天观察小鼠状态，包括一般活动及营养状态等，5天后全部小鼠的一般情况均良好，存活率100%。

4. 药效学实验：

（1）在接种所述肿瘤组织后的第6天，将上述小鼠随机分组，每组1只，共9组，其中一组为对照组（给予不含药物的溶媒），其余为8组所述药物治疗组，给药后每天观察记录小鼠的一般状态，持续观察7天。

（2）第8天将上述小鼠处死，剥离出肿瘤组织做成病理切片并作免疫组化，在显微镜下观察结果。其中肿瘤细胞比例是质控标准，如果＜5%，表示结果存在假阳性风险，参见图3。所有9只小鼠肿瘤细胞比例均＞5%，参见表2。

5. 药效学评价：

（1）病理检测：计算肿瘤细胞坏死率。

（2）免疫组化：计算肿瘤细胞Ki67。

6. 实验结果

（1）本发明方法中观察到的肿瘤组织中肿瘤细胞Ki67及肿瘤细胞坏死率由南京军区南京总医学病理科出具报告显示。图4图示本发明方法的Ki67和TCNR结果。

（2）判断标准

与对照组进行比较，肿瘤细胞坏死率越高、Ki67越低，表明该药物的效果越好。

（3）PDTX及Super PDTX结果一致性比较概述下表2：

表2

TGI (终末肿瘤生长抑制率)=[（对照组瘤体积-实验组瘤体积）/对照组瘤体积]×100%。

根据SuperPDTX结果，白蛋白紫杉醇、雷替曲塞+奥沙利铂、伊立替康+爱必妥疗效较好。

而根据PDTX结果，白蛋白紫杉醇、吉西他滨、伊立替康+爱必妥为临床推荐方案。

以上结果表明本发明SuperPDTX技术与PDTX方法检测结果基本一致。

Claims

1.一种非治疗与诊断目的的抗肿瘤药物的快速药敏检测方法，其特征在于，所述方法包括将肿瘤组织和/或细胞接种到小鼠的肾包膜中，所述小鼠为生长抑素基因敲除的免疫缺陷小鼠；移植肿瘤组织和/或细胞在所述小鼠体内生长3-10天之后给予抗肿瘤药物；在给予抗肿瘤药物后3-10天，处死小鼠取出肿瘤组织观测肿瘤生长情况；所述观测肿瘤生长情况包括观测肿瘤细胞坏死率和肿瘤细胞Ki67蛋白表达量，具体为剥离出肿瘤组织做成病理切片并作免疫组化，在显微镜下观察结果。

2.根据权利要求1所述的非治疗与诊断目的的抗肿瘤药物的快速药敏检测方法，其特征在于，所述肿瘤组织和/或细胞来自人或者非人动物。

3.根据权利要求1所述的非治疗与诊断目的的抗肿瘤药物的快速药敏检测方法，其特征在于，所述肿瘤包括胃癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、口腔癌、骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌、脑部肿瘤、白血病、神经内分泌肿瘤、肝癌、肾癌、胰腺癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌、软组织肉瘤、皮肤癌或者甲状腺癌。