JP7478720B2 - 条件付き再プログラム化細胞から動物モデルを得るための方法および抗腫瘍薬のスクリーニングのための動物モデルの使用 - Google Patents
条件付き再プログラム化細胞から動物モデルを得るための方法および抗腫瘍薬のスクリーニングのための動物モデルの使用 Download PDFInfo
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Description
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方の条件で患者の腫瘍生検試料より得られた原発腫瘍細胞を増殖させるための組成物、得られた原発腫瘍細胞を組成物中で増殖させるための方法、動物モデルを用いた抗腫瘍薬の効果のスクリーニングのための動物モデルを得るための方法に関する。
条件付き再プログラミング（ＣＲ）とは、正常細胞および腫瘍細胞を含む疾患細胞から、患者由来培養細胞を迅速かつ効率的に確立するための細胞培養技術である。ＣＲの最も大きな利点は、その患者組織サンプルからの迅速かつ効率的な培養細胞の増殖にある。これによって、臨床利用のための情報を提供するのに十分な速さで、研究者が抗癌剤や免疫療法に対する腫瘍の感受性をスクリーニングすることができるようになる。
動物モデルにおける抗腫瘍薬の効果についての試験は、このような動物モデルが抗腫瘍薬のスクリーニングにおいて重要であることから、重要である。このような動物モデルは、患者のｉｎ ｖｉｖｏの環境を模倣し、患者の応答を反映するため、より効果的である。動物モデルを確立するためには、当業者は、通常、十分に大量の腫瘍細胞を得る必要がある。しかし、患者から得た腫瘍試料は、その入手方法によっては非常に少量もしくはトレース量しか腫瘍細胞を含んでいないこともある。例えば、針生検で得た腫瘍試料は、非常に少量の腫瘍細胞しか含んでおらず、よって、当業者が抗腫瘍薬のスクリーニングのための所望の動物モデルを確立するために使用するのは非常に困難な場合もある。
条件付き再プログラミングによる腫瘍細胞の不死化は、細胞に基づく診断、薬剤感受性アッセイ、およびｉｎ ｖｉｔｒｏのバイオバンキングのための増殖腫瘍細胞を作製するための貴重なツールである。しかし、患者から得た原発腫瘍細胞、特に少量またはトレース量しかない（例えば、針生検の）細胞検体をいかに効果的且つ上手く培養するかは、未だに課題である。
上記課題を解決するために、本発明者は、いろいろな種類の腫瘍由来の原発腫瘍細胞を不死化に向けて条件付き再プログラム化し、条件付き再プログラム化腫瘍細胞を、抗腫瘍薬の試験のための動物モデルの確立に使用した。原発腫瘍細胞は切除組織、生検または針生検試料から得た。本発明で得られた条件付き再プログラム化原発腫瘍細胞は、極低温凍結の際の保存性の高い、典型的なコロニー化増殖を示した。いくつかのケースでは、細胞を複数回継代することも可能であり、有用な細胞系となる。原発腫瘍細胞と同様に、条件付き再プログラム化腫瘍細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの試験薬感受性について信頼できるものである。本発明者は、薬効の試験のための条件付き再プログラム化腫瘍細胞（ＣＲＣ）の動物モデルへの移植に成功し、動物モデルを用いて抗腫瘍薬のスクリーニングを行った。さらに本発明は、条件付き再プログラム化腫瘍細胞の薬効試験における使用を開示する。
本発明の一態様は、抗腫瘍薬のスクリーニングのための動物モデルを得るための方法を提供し、当該方法は、患者の腫瘍生検試料から得た原発腫瘍細胞を、下記成分：
ａ）０．０１～１．０ｍｇ／Ｌのヒドロコルチゾン、
ｂ）１．０～１０．０ｍｇ／Ｌのインスリン、
ｃ）１．０～２０．０μｇ／Ｌのコレラトキシン、
ｄ）２．０～５０．０ｍｇ／Ｌのアデニン、
ｅ）１．０～３０．０μｇ／ＬのＥＧＦ、
ｆ）１．０～３０．０μｍｏｌ／ＬのＹ－２７６３２、
ｇ）ペニシリン／ストレプトマイシン、
ｈ）２～２０％のＦＢＳ、
ｉ）Ｆ１２培地、
ｊ）高グルコースＤＭＥＭ、および任意で
ｋ）非必須アミノ酸溶液、
ｌ）ＧｌｕｔａＭＡＸ添加剤
を含む組成物中で培養する工程（１）と、前記工程（１）で得た原発腫瘍細胞を動物に移植する工程（２）とを含む。実施の形態において、本発明の方法の工程（１）の組成物は、下記成分：
ａ）０．３～０．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．４ｍｇ／Ｌのヒドロコルチゾン、
ｂ）４～６ｍｇ／Ｌ、好ましくは５ｍｇ／Ｌのインスリン、
ｃ）７～９μｇ／Ｌ、好ましくは８．３μｇ／Ｌのコレラトキシン、
ｄ）２０～３０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２４．２ｍｇ／Ｌのアデニン、
ｅ）８～１２μｇ／Ｌ、好ましくは１０μｇ／ＬのＥＧＦ、
ｆ）８～１２μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０μｍｏｌ／ＬのＹ－２７６３２、
ｇ）ペニシリン／ストレプトマイシン、
ｈ）８～１２％、好ましくは１０％のＦＢＳ、
ｉ）Ｆ１２培地、
ｊ）高グルコースＤＭＥＭ、および任意で
ｋ）非必須アミノ酸溶液、
ｌ）ＧｌｕｔａＭＡＸ添加剤を含む。
ａ）０．０１～１．０ｍｇ／Ｌのヒドロコルチゾン、
ｂ）１．０～１０．０ｍｇ／Ｌのインスリン、
ｃ）１．０～２０．０μｇ／Ｌのコレラトキシン、
ｄ）２．０～５０．０ｍｇ／Ｌのアデニン、
ｅ）１．０～３０．０μｇ／ＬのＥＧＦ、
ｆ）１．０～３０．０μｍｏｌ／ＬのＹ－２７６３２、
ｇ）ペニシリン／ストレプトマイシン、
ｈ）２～２０％のＦＢＳ、
ｉ）Ｆ１２培地、
ｊ）高グルコースＤＭＥＭ、および任意で
ｋ）非必須アミノ酸溶液、
ｌ）ＧｌｕｔａＭＡＸ添加剤
を含む組成物中で培養する工程（１）と、前記工程（１）で得た原発腫瘍細胞を動物に移植する工程（２）とを含む。実施の形態において、本発明の方法の工程（１）の組成物は、下記成分：
ａ）０．３～０．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．４ｍｇ／Ｌのヒドロコルチゾン、
ｂ）４～６ｍｇ／Ｌ、好ましくは５ｍｇ／Ｌのインスリン、
ｃ）７～９μｇ／Ｌ、好ましくは８．３μｇ／Ｌのコレラトキシン、
ｄ）２０～３０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２４．２ｍｇ／Ｌのアデニン、
ｅ）８～１２μｇ／Ｌ、好ましくは１０μｇ／ＬのＥＧＦ、
ｆ）８～１２μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０μｍｏｌ／ＬのＹ－２７６３２、
ｇ）ペニシリン／ストレプトマイシン、
ｈ）８～１２％、好ましくは１０％のＦＢＳ、
ｉ）Ｆ１２培地、
ｊ）高グルコースＤＭＥＭ、および任意で
ｋ）非必須アミノ酸溶液、
ｌ）ＧｌｕｔａＭＡＸ添加剤を含む。
実施の形態において、腫瘍生検試料は針生検試料である。実施の形態において、針生検で得られた検体の原発腫瘍細胞の濃度は、約２×１０
６
／ｍｌ未満、約１．９×１０
６
／ｍｌ未満、約１．８×１０
６
／ｍｌ未満、約１．７×１０
６
／ｍｌ未満、約１．６×１０
６
／ｍｌ未満、約１．５×１０
６
／ｍｌ未満、約１．４×１０
６
／ｍｌ未満、約１．３×１０
６
／ｍｌ未満、約１．２×１０
６
／ｍｌ未満、約１．１×１０
６
／ｍｌ未満、約１．０×１０
６
／ｍｌ未満、約０．９×１０
６
／ｍｌ未満、約０．８×１０
６
／ｍｌ未満、約０，７×１０
６
／ｍｌ未満、約０．６×１０
６
／ｍｌ未満、約０．５×１０
６
／ｍｌ未満、約０．４×１０
６
／ｍｌ未満、約０．３×１０
６
／ｍｌ未満、約０．２×１０
６
／ｍｌ未満、約０．１×１０
６
／ｍｌ以下、例えば、約２×１０
６
／ｍｌ未満、約１．７×１０
６
／ｍｌ未満、約０．８×１０
６
／ｍｌ未満、約０．６４×１０
６
／ｍｌ未満、約０．５９×１０
６
／ｍｌ未満である。実施の形態において、原発腫瘍細胞は工程（１）の組成物中でフィーダー細胞と共に培養され、具体的には、フィーダー細胞はマウス胎児繊維芽（ＭＥＦ）細胞である。実施の形態において、ＭＥＦ細胞はマイトマイシンＣで処理されたものである。
実施の形態において、本発明における動物はマウスまたはラット、具体的には、免疫不全マウス、例えば、ヌードマウスである。実施の形態において、中空繊維内の工程（１）で得られた原発腫瘍細胞が動物に移植された。実施の形態において、中空繊維は修飾フッ化ポリビニリデンで作られたものであり、より具体的には、前記中空繊維は修飾フッ化ポリビニリデンで作られたものであり、且つカットオフ値が５００，０００ダルトンである。
本発明の別の態様は、本発明の方法によって得られた、抗腫瘍薬のスクリーニングのための動物モデルを提供する。実施の形態において、本発明における動物はマウスまたはラット、具体的には、免疫不全マウス、例えば、ヌードマウスである。
本発明の別の態様は本発明の動物モデルに候補薬を投与する工程を含む、本発明の動物モデルを用いた、抗腫瘍薬のスクリーニングの方法を提供する。実施の形態において、上記方法は、本発明の動物モデルにおける腫瘍細胞成長を測定する工程をさらに含む。
本発明の一態様は、抗腫瘍薬のスクリーニングのための動物モデルを得るための方法であって、患者の腫瘍生検試料から得た原発腫瘍細胞を、下記成分：
ａ）０．０１～１．０ｍｇ／Ｌのヒドロコルチゾン、
ｂ）１．０～１０．０ｍｇ／Ｌのインスリン、
ｃ）１．０～２０．０μｇ／Ｌのコレラトキシン、
ｄ）２．０～５０．０ｍｇ／Ｌのアデニン、
ｅ）１．０～３０．０μｇ／ＬのＥＧＦ、
ｆ）１．０～３０．０ μｍｏｌ／ＬのＹ－２７６３２、
ｇ）ペニシリン／ストレプトマイシン、
ｈ）２～２０％のＦＢＳ、
ｉ）Ｆ１２培地、
ｊ）高グルコースＤＭＥＭ、および任意で
ｋ）非必須アミノ酸溶液、
ｌ）ＧｌｕｔａＭＡＸ添加剤
を含む組成物中で培養する工程（１）と、前記工程（１）で得た原発腫瘍細胞を動物に移植する工程（２）とを含む方法を提供する。実施の形態において、腫瘍生検試料は針生検試料である。実施の形態において、針生検で得られた試料中の腫瘍細胞の濃度は約２×１０ ６ ／ｍｌ未満である。
ａ）０．０１～１．０ｍｇ／Ｌのヒドロコルチゾン、
ｂ）１．０～１０．０ｍｇ／Ｌのインスリン、
ｃ）１．０～２０．０μｇ／Ｌのコレラトキシン、
ｄ）２．０～５０．０ｍｇ／Ｌのアデニン、
ｅ）１．０～３０．０μｇ／ＬのＥＧＦ、
ｆ）１．０～３０．０ μｍｏｌ／ＬのＹ－２７６３２、
ｇ）ペニシリン／ストレプトマイシン、
ｈ）２～２０％のＦＢＳ、
ｉ）Ｆ１２培地、
ｊ）高グルコースＤＭＥＭ、および任意で
ｋ）非必須アミノ酸溶液、
ｌ）ＧｌｕｔａＭＡＸ添加剤
を含む組成物中で培養する工程（１）と、前記工程（１）で得た原発腫瘍細胞を動物に移植する工程（２）とを含む方法を提供する。実施の形態において、腫瘍生検試料は針生検試料である。実施の形態において、針生検で得られた試料中の腫瘍細胞の濃度は約２×１０ ６ ／ｍｌ未満である。
工程（１）の組成物中のヒドロコルチゾンの濃度は、０．０１～１．０ｍｇ／Ｌ、具体的には約０．０５～１．０ｍｇ／Ｌ、約０．１～１．０ｍｇ／Ｌ、約０．１～０．９ｍｇ／Ｌ、約０．２～０．８ｍｇ／Ｌ、約０．２～０．７ｍｇ／Ｌ、約０．２５～０．６５ｍｇ／Ｌ、約０．２５～０．６ｍｇ／Ｌ、約０．３～０．５ｍｇ／Ｌ、約０．３５～０．５５ｍｇ／Ｌ、約０．３５～０．４ｍｇ／Ｌ、約０．４～０．４５ｍｇ／Ｌ、約０．３５～０．４５ｍｇ／Ｌ、約０．４５～０．５５ｍｇ／Ｌ、約０．０５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ、約０．３１ｍｇ／Ｌ、約０．３２ｍｇ／Ｌ、約０．３３ｍｇ／Ｌ、約０．３４ｍｇ／Ｌ、約０．３５ｍｇ／Ｌ、約０．３６ｍｇ／Ｌ、約０．３７ｍｇ／Ｌ、約０．３８ｍｇ／Ｌ、約０．３９ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ、約０．４１ｍｇ／Ｌ、約０．４２ｍｇ／Ｌ、約０．４３ｍｇ／Ｌ、約０．４４ｍｇ／Ｌ、約０．４５ｍｇ／Ｌ、約０．４６ｍｇ／Ｌ、約０．４７ｍｇ／Ｌ、約０．４８ｍｇ／Ｌ、約０．４９ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ、約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌとなり得る。
工程（１）の組成物中のインスリンの濃度は、１．０～１０ｍｇ／Ｌ、具体的には約１～１０ｍｇ／Ｌ、約２～９ｍｇ／Ｌ、約３～８ｍｇ／Ｌ、約３～７ｍｇ／Ｌ、約４．５～６．５ｍｇ／Ｌ、約４～６ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌ、約７ｍｇ／Ｌ、約８ｍｇ／Ｌ、約９ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌとなり得る。
工程（１）の組成物中のコレラトキシンの濃度は、１～２０μｇ／Ｌ、具体的には約２～２０μｇ／Ｌ、約３～１８μｇ／Ｌ、約４～１５μｇ／Ｌ、約５～１０μｇ／Ｌ、約６～１０μｇ／Ｌ、約７～９μｇ／Ｌ、約７．５～８．５μｇ／Ｌ、約１μｇ／Ｌ、約２μｇ／Ｌ、約３μｇ／Ｌ、約４μｇ／Ｌ、約５μｇ／Ｌ、約６μｇ／Ｌ、約７μｇ／Ｌ、約８μｇ／Ｌ、約８．１μｇ／Ｌ、約８．２μｇ／Ｌ、約８．３μｇ／Ｌ、約８．４μｇ／Ｌ、約８．５μｇ／Ｌ、約８．６μｇ／Ｌ、約８．７μｇ／Ｌ、約８．８μｇ／Ｌ、約８．９μｇ／Ｌ、約９μｇ／Ｌ、約１０μｇ／Ｌ、約１１μｇ／Ｌ、約１２μｇ／Ｌ、約１３μｇ／Ｌ、約１４μｇ／Ｌ、約１５μｇ／Ｌ、約１６μｇ／Ｌ、約１７μｇ／Ｌ、約１８μｇ／Ｌ、約１９μｇ／Ｌ、約２０μｇ／Ｌとなり得る。
工程（１）の組成物中のアデニンの濃度は、２～５０ｍｇ／Ｌ、具体的には約５～４０ｍｇ／Ｌ、約１０～３０ｍｇ／Ｌ、約１５～３０ｍｇ／Ｌ、約２０～３０ｍｇ／Ｌ、約２２～２７ｍｇ／Ｌ、約２３～２６ｍｇ／Ｌ、約２４～２５ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌ、約８ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、約１２ｍｇ／Ｌ、約１４ｍｇ／Ｌ、約１６ｍｇ／Ｌ、約１８ｍｇ／Ｌ、約２０ｍｇ／Ｌ、約２１ｍｇ／Ｌ、約２２ｍｇ／Ｌ、約２３ｍｇ／Ｌ、約２４ｍｇ／Ｌ、約２４．１ｍｇ／Ｌ、約２４．２ｍｇ／Ｌ、約２４．３ｍｇ／Ｌ、約２４．４ｍｇ／Ｌ、約２４．５ｍｇ／Ｌ、約２４．６ｍｇ／Ｌ、約２４．７ｍｇ／Ｌ、約２４．８ｍｇ／Ｌ、約２４．９ｍｇ／Ｌ、約２５ｍｇ／Ｌ、約２６ｍｇ／Ｌ、約２７ｍｇ／Ｌ、約２８ｍｇ／Ｌ、約２９ｍｇ／Ｌ、約３０ｍｇ／Ｌ、約３５ｍｇ／Ｌ、約４０ｍｇ／Ｌとなり得る。
工程（１）の組成物中のＥＧＦの濃度は、１～３０μｇ／Ｌ、具体的には約２～２０μｇ／Ｌ、約４～１８μｇ／Ｌ、約６～１６μｇ／Ｌ、約８～１２μｇ／Ｌ、約９～１１μｇ／Ｌ、約９．５～１０．５μｇ／Ｌ、約２μｇ／Ｌ、約４μｇ／Ｌ、約６μｇ／Ｌ、約７μｇ／Ｌ、約８μｇ／Ｌ、約９μｇ／Ｌ、約１０μｇ／Ｌ、約１１μｇ／Ｌ、約１２μｇ／Ｌ、約１４μｇ／Ｌ、約１６μｇ／Ｌ、約１８μｇ／Ｌ、約２０μｇ／Ｌ、約２５μｇ／Ｌ、約３０μｇ／Ｌとなり得る。
工程（１）の組成物中のＹ～２７６３２濃度は、１～３０μｍｏｌ／Ｌ、具体的には、約２～２０μｍｏｌ／Ｌ、約４～１８μｍｏｌ／Ｌ、約６～１６μｍｏｌ／Ｌ、約８～１２μｍｏｌ／Ｌ、約９～１１μｍｏｌ／Ｌ、約９．５～１０．５μｍｏｌ／Ｌ、約２μｍｏｌ／Ｌ、約４μｍｏｌ／Ｌ、約６μｍｏｌ／Ｌ、約７μｍｏｌ／Ｌ、約８μｍｏｌ／Ｌ、約９μｍｏｌ／Ｌ、約１０μｍｏｌ／Ｌ、約１１μｍｏｌ／Ｌ、約１２μｍｏｌ／Ｌ、約１４μｍｏｌ／Ｌ、約１６μｍｏｌ／Ｌ、約１８μｍｏｌ／Ｌ、約２０μｍｏｌ／Ｌ、約２５μｍｏｌ／Ｌ、約３０μｍｏｌ／Ｌとなり得る。
工程（１）の組成物中のＦＢＳの濃度は、２～２０％、具体的には約４～１５％、約５～１８％、約６～１６％、約７～１４％、約８～１２％、約９～１１％、約９．５～１０．５％、約２％、約４％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１４％、約１６％、約１８％、約２０％となり得る。
実施の形態において、本発明は、抗腫瘍薬のスクリーニングのための動物モデルを得るための方法であって、患者の腫瘍生検試料から得た原発腫瘍細胞を、下記成分：
ａ）０．３～０．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．４ｍｇ／Ｌのヒドロコルチゾン、
ｂ）４～６ｍｇ／Ｌ、好ましくは５ｍｇ／Ｌのインスリン、
ｃ）７～９μｇ／Ｌ、好ましくは８．３μｇ／Ｌのコレラトキシン、
ｄ）２０～３０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２４．２ｍｇ／Ｌのアデニン、
ｅ）８～１２μｇ／Ｌ、好ましくは１０μｇ／ＬのＥＧＦ、
ｆ）８～１２μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０ μｍｏｌ／ＬのＹ－２７６３２、
ｇ）ペニシリン／ストレプトマイシン、
ｈ）８～１２％、好ましくは１０％のＦＢＳ、
ｉ）Ｆ１２培地、
ｊ）高グルコースＤＭＥＭ、および任意で
ｋ）非必須アミノ酸溶液、
ｌ）ＧｌｕｔａＭＡＸ添加剤．
を含む組成物中で培養する工程（１）と、前記工程（１）で得た原発腫瘍細胞を動物に移植する工程（２）とを含む方法を提供する。実施の形態において、腫瘍生検試料は針生検試料である。実施の形態において、針生検で得られた試料中の腫瘍細胞の濃度は約２×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．９×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．８×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．７×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．６×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．５×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．４×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．３×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．２×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．１×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．０×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．９×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．８×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０，７×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．６×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．５×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．４×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．３×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．２×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．１×１０ ６ ／ｍｌ以下、例えば、約２×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．７×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．８×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．６４×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．５９×１０ ６ ／ｍｌ未満である。実施の形態において、原発腫瘍細胞は、工程（１）の組成物中でフィーダー細胞と共に培養され、具体的にはフィーダー細胞はマウス胎児繊維芽（ＭＥＦ）細胞である。実施の形態において、ＭＥＦ細胞はマイトマイシンＣで処理されたものである。
ａ）０．３～０．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．４ｍｇ／Ｌのヒドロコルチゾン、
ｂ）４～６ｍｇ／Ｌ、好ましくは５ｍｇ／Ｌのインスリン、
ｃ）７～９μｇ／Ｌ、好ましくは８．３μｇ／Ｌのコレラトキシン、
ｄ）２０～３０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２４．２ｍｇ／Ｌのアデニン、
ｅ）８～１２μｇ／Ｌ、好ましくは１０μｇ／ＬのＥＧＦ、
ｆ）８～１２μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０ μｍｏｌ／ＬのＹ－２７６３２、
ｇ）ペニシリン／ストレプトマイシン、
ｈ）８～１２％、好ましくは１０％のＦＢＳ、
ｉ）Ｆ１２培地、
ｊ）高グルコースＤＭＥＭ、および任意で
ｋ）非必須アミノ酸溶液、
ｌ）ＧｌｕｔａＭＡＸ添加剤．
を含む組成物中で培養する工程（１）と、前記工程（１）で得た原発腫瘍細胞を動物に移植する工程（２）とを含む方法を提供する。実施の形態において、腫瘍生検試料は針生検試料である。実施の形態において、針生検で得られた試料中の腫瘍細胞の濃度は約２×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．９×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．８×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．７×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．６×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．５×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．４×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．３×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．２×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．１×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．０×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．９×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．８×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０，７×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．６×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．５×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．４×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．３×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．２×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．１×１０ ６ ／ｍｌ以下、例えば、約２×１０ ６ ／ｍｌ未満、約１．７×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．８×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．６４×１０ ６ ／ｍｌ未満、約０．５９×１０ ６ ／ｍｌ未満である。実施の形態において、原発腫瘍細胞は、工程（１）の組成物中でフィーダー細胞と共に培養され、具体的にはフィーダー細胞はマウス胎児繊維芽（ＭＥＦ）細胞である。実施の形態において、ＭＥＦ細胞はマイトマイシンＣで処理されたものである。
実施の形態において、本発明の方法における動物は、マウスまたはラット、具体的にはヌードマウスなどの免疫不全マウスである。実施の形態において、中空繊維内の、工程（１）で得られた原発腫瘍細胞が動物に移植される。実施の形態において、中空繊維は修飾フッ化ポリビニリデンで作られたものであり、より具体的には、前記中空繊維は修飾フッ化ポリビニリデンで作られたものであり、且つカットオフ値が５００，０００ダルトンである。
本発明の別の態様は、本発明の方法で得られた、抗腫瘍薬のスクリーニングのための動物モデルを提供する。実施の形態において、本発明の動物は、マウスまたはラット、具体的にはヌードマウスなどの免疫不全マウスである。
本発明の別の態様は、本発明の動物を用いた、抗腫瘍薬のスクリーニングの方法であって、本発明の動物モデルに候補薬を投与する工程を含む方法を提供する。実施の形態において、上記方法は、本発明の動物モデルにおける腫瘍細胞成長を測定する工程をさらに含む。
腫瘍細胞は、いろいろな種類の腫瘍から得ることができ、消化管（例えば、胃、腸、十二指腸、直腸、膵臓など）、乳房、肺、肝臓、および内分泌腺（例えば、副腎、副甲状腺、脳下垂体、精巣、卵巣、および胸腺、甲状腺）、泌尿器系および生殖系（例えば、腎臓、膀胱、卵巣、精巣、前立腺など）、骨格筋系（例えば、骨、平滑筋、横紋筋など）、皮膚等の腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、腫瘍細胞は胃癌、結腸直腸癌の生検試料および肺癌から誘導することができる。
条件付き再プログラム化原発腫瘍細胞は、注射、あるいは当業界で知られる他の方法または装置を用いて動物に移植することができる。実施の形態において、条件付き再プログラム化原発腫瘍細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長のためのＰＤＸモデルの製造方法によって動物に移植される。例えば、以下を参照：“Melanoma patient～derived xenografts accurately model the disease and develop fast enough to guide treatment decisions”，Oncotarget, Vol. 5, No. 20, Berglind O. Einarsdottir et.al.，２０１４年９月８日発行； “Personalizing Cancer Treatment in the Age of Global Genomic Analyses: PALB2 Gene Mutations and the Response to DNA Damaging Agents in Pancreatic Cancer”, Molecular Cancer Therapies，２０１０年１２月６日発行、DOI: 10.1158/1535～7163.MCT～10～0893, Maria C. Villarroel。実施の形態において、条件付き再プログラム化原発腫瘍細胞を中空糸管に移動し、次にそれを動物に移植した。中空繊維は修飾フッ化ポリビニリデンで作られたものであって、カットオフ値が５００，０００ダルトンのものでよい、本発明においては、ミニ－ＰＤＸデバイス（mini-PDX device）とは、修飾フッ化ポリビニリデンで作られた中空繊維であって、そのカットオフ値が５００，０００ダルトンのものを意味し、患者から得られた原発腫瘍細胞を含有してもよく、候補動物に移植することのできるもの、例えば、候補動物に皮下移植することのできるものである。本発明において、ミニ－ＰＤＸモデルは、本発明のミニ－ＰＤＸモデルを移植された動物を意味する。ミニ－ＰＤＸ動物モデルは、本発明に記載した方法／試験に使用することができる。
本発明の別の態様は、本発明の動物を用いた抗腫瘍薬のスクリーニングの方法であって、本発明の動物モデルに候補薬を投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、本発明の動物モデルが保有する腫瘍細胞の成長を投与の前と後に測定する工程をさらに含む。いくつかの態様において、腫瘍のサイズは本発明の動物モデルに薬剤を投与する前および５～１４日後、具体的には５～７日後に測定する。いくつかの態様において、腫瘍細胞のアポトーシスを、本発明の動物モデルに薬剤を投与する前および５～１４日後、具体的には５～７日後に測定する。いくつかの態様において、腫瘍細胞の分化を、本発明の動物モデルに薬剤を投与する前および５～１４日後、具体的には５～７日後に測定する。当業者は、本発明の動物モデルが保有する腫瘍細胞の成長を投与の前と後に測定するための適切な方法を選択することができる。
薬剤の投与は、いかなる適切な経路、経口または非経口、で実施してもよい。例えば。候補薬を本発明の動物モデルに経口投与または注射（例えば、筋肉内、皮下または静脈内への注入）、局所投与、吸入、および皮膚パッチ等の経皮送達、移植、座薬で与えることができる。当業者は需要に応じて適切な投与経路を選択する。
本発明においてスクリーニングする候補薬は、公知の抗腫瘍薬やそれらの組み合わせ、新規な抗腫瘍薬やそれらの組み合わせ、または公知の抗腫瘍薬の新規の組み合わせでもよい。本発明の方法においてスクリーニングする薬剤は、固体状、半固体状または液状でもよい。
候補動物への薬剤の投与は、経口投与あるいは注射（例えば、筋肉内、皮下または静脈内の点滴によって）、局所投与、吸入、ならびに皮膚パッチなどの経皮送達、移植、坐剤、などで行うことができる。当分野の技術者は、その需要に応じて、適切な経路を選択する。
添付の図面に参照しながら、本発明をより詳細に説明する。
条件付き再プログラミング培地
培地は、以下の原料を含む。
・ ３７５ｍＬのＦ１２培地（市販品）、１２５ｍＬの高グルコースＤＭＥＭ（市販品）、２５ｍＬ（即ち１０％）のＦＢＳ（市販品）、５ｍＬのヒドロコルチゾン、５ｍＬのインスリン、５ｍＬのコレラトキシン、５ｍＬのアデニン、５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（市販品）、５ｍＬのＥＧＦ、１ｍＬのＹ－２７６３２。
・ 任意の原料：非必須アミノ酸溶液（市販品）、およびＧｌｕｔａＭＡＸ添加剤（市販品）。
培地は、以下の原料を含む。
・ ３７５ｍＬのＦ１２培地（市販品）、１２５ｍＬの高グルコースＤＭＥＭ（市販品）、２５ｍＬ（即ち１０％）のＦＢＳ（市販品）、５ｍＬのヒドロコルチゾン、５ｍＬのインスリン、５ｍＬのコレラトキシン、５ｍＬのアデニン、５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（市販品）、５ｍＬのＥＧＦ、１ｍＬのＹ－２７６３２。
・ 任意の原料：非必須アミノ酸溶液（市販品）、およびＧｌｕｔａＭＡＸ添加剤（市販品）。
準備：
以下の原料を調製した。
・ ヒドロコルチゾン：２５ｍｇの市販のヒドロコルチゾンを５ｍＬの冷たい１００％エタノールに溶解して、５ｍｇ／ｍＬ溶液を作る。０．８ｍＬの当該５ｍｇ／ｍＬ溶液を１００ｍＬの、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＨＢＥＳに加える。ろ過滅菌し、１０ｍＬ等量を－２０℃で保存する。ヒドロコルチゾンの最終濃度は０．４ｍｇ／Ｌである。
・ コレラトキシン：１．２ｍＬの滅菌水を１ｍｇのコレラトキシン（市販品）を含むバイアルに添加して、１０μＭ溶液を得る。５０μＬの当該１０μＭ溶液を５０ｍＬの、０．１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＨＢＥＳで希釈する。ろ過滅菌し、１０ｍＬ等量を４℃で保存する。コレラトキシンの最終濃度は８．３μｇ／Ｌである。
・ インスリン：１２．５ｍｇの市販のインスリンを２５ｍＬの０．００５ＭのＨＣＬに溶解する。ＦＢＳで予め湿らせたシリンジフィルターでろ過滅菌する。インスリンの最終濃度は５ｍｇ／Ｌである。
・ アデニン：１２１ｍｇの市販のアデニンを５０ｍＬの０．０５ＭのＨＣｌに加えて１時間撹拌して溶解する。ろ過滅菌し、１０ｍＬ等量を－２０℃で保存する。アデニンの最終濃度は２４．２ｍｇ／Ｌである。
・ 上皮成長因子（ＥＧＦ）：１００μｇの市販のＥＧＦを１０ｍＬの滅菌水に溶解する。９０ｍＬの、０．１％ウシ血清アルブミンを含むＨＢＥＳを添加する。ろ過滅菌し、１０ｍＬ等量を－２０℃で保存する。ＥＧＦの最終濃度は１０μｇ／Ｌである。
・ Ｙ－２７６３２：最終濃度はＤＭＳＯ中で１０μｍｏｌ。市販品。
培地は使用のために冷たい場所に適宜保管した。
以下の原料を調製した。
・ ヒドロコルチゾン：２５ｍｇの市販のヒドロコルチゾンを５ｍＬの冷たい１００％エタノールに溶解して、５ｍｇ／ｍＬ溶液を作る。０．８ｍＬの当該５ｍｇ／ｍＬ溶液を１００ｍＬの、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＨＢＥＳに加える。ろ過滅菌し、１０ｍＬ等量を－２０℃で保存する。ヒドロコルチゾンの最終濃度は０．４ｍｇ／Ｌである。
・ コレラトキシン：１．２ｍＬの滅菌水を１ｍｇのコレラトキシン（市販品）を含むバイアルに添加して、１０μＭ溶液を得る。５０μＬの当該１０μＭ溶液を５０ｍＬの、０．１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＨＢＥＳで希釈する。ろ過滅菌し、１０ｍＬ等量を４℃で保存する。コレラトキシンの最終濃度は８．３μｇ／Ｌである。
・ インスリン：１２．５ｍｇの市販のインスリンを２５ｍＬの０．００５ＭのＨＣＬに溶解する。ＦＢＳで予め湿らせたシリンジフィルターでろ過滅菌する。インスリンの最終濃度は５ｍｇ／Ｌである。
・ アデニン：１２１ｍｇの市販のアデニンを５０ｍＬの０．０５ＭのＨＣｌに加えて１時間撹拌して溶解する。ろ過滅菌し、１０ｍＬ等量を－２０℃で保存する。アデニンの最終濃度は２４．２ｍｇ／Ｌである。
・ 上皮成長因子（ＥＧＦ）：１００μｇの市販のＥＧＦを１０ｍＬの滅菌水に溶解する。９０ｍＬの、０．１％ウシ血清アルブミンを含むＨＢＥＳを添加する。ろ過滅菌し、１０ｍＬ等量を－２０℃で保存する。ＥＧＦの最終濃度は１０μｇ／Ｌである。
・ Ｙ－２７６３２：最終濃度はＤＭＳＯ中で１０μｍｏｌ。市販品。
培地は使用のために冷たい場所に適宜保管した。
フィーダー細胞の調製：
ＭＥＦ（マウス胎児繊維芽）細胞を、Ｃ５７マウスのｅ１３．５胚から単離し、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭで増殖させた。３～５継代後の単離ＭＥＦ細胞をマイトマイシンＣ（１０μｇ／ｍｌ）で２時間処理し、ＰＢＳで洗浄した。処理後のＭＥＦを回収し、フィーダー細胞として凍結保存した。
ＭＥＦ（マウス胎児繊維芽）細胞を、Ｃ５７マウスのｅ１３．５胚から単離し、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭで増殖させた。３～５継代後の単離ＭＥＦ細胞をマイトマイシンＣ（１０μｇ／ｍｌ）で２時間処理し、ＰＢＳで洗浄した。処理後のＭＥＦを回収し、フィーダー細胞として凍結保存した。
実施例１
１． 材料
１．１ 条件付き再プログラミングのための腫瘍
ＭＤＸ０７９、ＭＤＸ０８３、ＭＤＸ０９５、ＭＤＸ１０７、ＭＤＸ１２３の条件付き再プログラミング細胞はそれぞれ個別に回収した。ＭＤＸ０７９は女性肺癌患者由来であり、ＭＤＸ０８３モデルは２７歳男性腺様嚢胞癌患者由来であり、ＭＤＸ０９５モデルは５４歳男性悪性腹膜中皮腫患者由来であり、ＭＤＸ１０７モデルは５４歳男性神経膠芽腫患者由来であり、ＭＤＸ１２３モデルは５３歳男性結腸直腸癌患者由来であった。
１． 材料
１．１ 条件付き再プログラミングのための腫瘍
ＭＤＸ０７９、ＭＤＸ０８３、ＭＤＸ０９５、ＭＤＸ１０７、ＭＤＸ１２３の条件付き再プログラミング細胞はそれぞれ個別に回収した。ＭＤＸ０７９は女性肺癌患者由来であり、ＭＤＸ０８３モデルは２７歳男性腺様嚢胞癌患者由来であり、ＭＤＸ０９５モデルは５４歳男性悪性腹膜中皮腫患者由来であり、ＭＤＸ１０７モデルは５４歳男性神経膠芽腫患者由来であり、ＭＤＸ１２３モデルは５３歳男性結腸直腸癌患者由来であった。
１．２ 動物
１．２．１ Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス、雌、上海ラボラトリー動物センター（Shanghai Laboratory Animal Center）（中国、上海、Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ、ＳＣＸＫ（ＳＨ）２０１３～００１８）
週齢：６～８週
性別：雌
体重：１８～２２ｇ
１．２．１ Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス、雌、上海ラボラトリー動物センター（Shanghai Laboratory Animal Center）（中国、上海、Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ、ＳＣＸＫ（ＳＨ）２０１３～００１８）
週齢：６～８週
性別：雌
体重：１８～２２ｇ
１．２．２ 飼育条件
マウスは、定温、定湿のＳＰＦ室内で、各ケージに３匹を飼育した。
温度：２０～２６℃
湿度：４０～７０％
明暗サイクル：明環境を１２時間、暗環境を１２時間
マウスは、定温、定湿のＳＰＦ室内で、各ケージに３匹を飼育した。
温度：２０～２６℃
湿度：４０～７０％
明暗サイクル：明環境を１２時間、暗環境を１２時間
ケージ：ポリカーボネート製。サイズは３２５ｍｍ×２１０ｍｍ×１８０ｍｍ。床敷材はトウモロコシの穂軸であり、週２回交換した。
飼料：研究期間全体を通じて、動物は照射滅菌済みの乾燥粒状飼料を自由に食べることができた。
飼料：研究期間全体を通じて、動物は照射滅菌済みの乾燥粒状飼料を自由に食べることができた。
水：動物は、滅菌済飲料水自由に飲むことができた。
ケージの識別：各ケージの識別ラベルは以下の情報を含んでいた：動物の数、性別、種、受取日、処置、研究番号、群番号、および処置開始日。
動物の識別：動物は耳へのコード付けによって印を付けた。
１．３ 装置
逆相顕微鏡ＤＭＩＬ、ＬＥＩＣＡ社製。バランスＡＬＣ－３１０．３、Ａｃｃｌｕｌａｂ社製。マイクロバランスＢＳＡ２２４Ｓ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製。遠心分離機５８１０Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製。
逆相顕微鏡ＤＭＩＬ、ＬＥＩＣＡ社製。バランスＡＬＣ－３１０．３、Ａｃｃｌｕｌａｂ社製。マイクロバランスＢＳＡ２２４Ｓ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製。遠心分離機５８１０Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製。
ミニ－ＰＤＸデバイス：修飾フッ化ポリビニリデン製で、カットオフ値が５００，０００ダルトン、内径１～２ｍｍの中空繊維。所望の長さに切断。
２． 手順と方法
２．１ 細胞培養
腫瘍組織試料を緩衝溶液で洗浄し、バイオセーフティキャビネット内ですべての非腫瘍組織および壊死した腫瘍組織を除去する。腫瘍を１～３ｍｍ３の断片に切断し、ペレットを１×コラーゲナーゼ溶液に懸濁し、３７℃で１～２時間インキュベートする。単一細胞を７０ｕＭのストレイナーによって回収し、腫瘍細胞濃度を求めるために細胞数を計数する（切除および生検／針生検腫瘍試料より得た試料の腫瘍細胞数の計数を参照）。細胞を条件付き再プログラミング培地で培養し、腫瘍細胞の増殖後に条件付き再プログラミング細胞を回収する。
２．１ 細胞培養
腫瘍組織試料を緩衝溶液で洗浄し、バイオセーフティキャビネット内ですべての非腫瘍組織および壊死した腫瘍組織を除去する。腫瘍を１～３ｍｍ３の断片に切断し、ペレットを１×コラーゲナーゼ溶液に懸濁し、３７℃で１～２時間インキュベートする。単一細胞を７０ｕＭのストレイナーによって回収し、腫瘍細胞濃度を求めるために細胞数を計数する（切除および生検／針生検腫瘍試料より得た試料の腫瘍細胞数の計数を参照）。細胞を条件付き再プログラミング培地で培養し、腫瘍細胞の増殖後に条件付き再プログラミング細胞を回収する。
生検／針生検で得た腫瘍組織を１×コラーゲナーゼ溶液に懸濁し、３７℃で１～２時間インキュベートする。単一細胞を７０ｕＭのストレイナーによって回収し、腫瘍細胞濃度を求めるために細胞数を計数する（「９．切除および生検／針生検腫瘍試料より得た試料の腫瘍細胞数の計数」を参照）。細胞を条件付き再プログラミング培地で培養し、腫瘍細胞の増殖後に条件付き再プログラミング細胞を回収する。
２．２ ミニ－ＰＤＸデバイスの接種
細胞懸濁液でミニ－ＰＤＸデバイスを満たし、デバイスをＮｕ／Ｎｕ－ヌードマウスの両側面に皮下接種してミニ－ＰＤＸモデルを確立した。接種日を０日とした。体重に基づきマウスをランダムに群に分け、０日に処置を開始した。各研究群における試験品の投与およびミニ－ＰＤＸデバイス番号を下記実験計画表に示した。
細胞懸濁液でミニ－ＰＤＸデバイスを満たし、デバイスをＮｕ／Ｎｕ－ヌードマウスの両側面に皮下接種してミニ－ＰＤＸモデルを確立した。接種日を０日とした。体重に基づきマウスをランダムに群に分け、０日に処置を開始した。各研究群における試験品の投与およびミニ－ＰＤＸデバイス番号を下記実験計画表に示した。
２．３ 観察
本研究におけるプロトコルおよびその変更点または動物の飼育と使用に関わる手順は、実施の前に上海ＬＩＤＥの学内動物飼育および使用検討会（Institutional Animal Care and Use Committee、ＩＡＣＵＣ）の承認を得た。研究の際には、動物の飼育および使用を実験動物ケア評価認証協会（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care、ＡＡＡＬＡＣ）の規定に沿って実施した。接種後、動物の罹患率および死亡率について毎日チェックした。日々のモニタリングの時に、正常な行動、例えば、運動性、飼料および水の消費、体重の増減（体重は週２回または１日おきに測定）、目／毛の乾燥に対する腫瘍成長および処置の影響、及びその他の異常な影響についてくまなくチェックした。各副群内の動物数に基づき、死亡および観察された臨床所見を記録した。
本研究におけるプロトコルおよびその変更点または動物の飼育と使用に関わる手順は、実施の前に上海ＬＩＤＥの学内動物飼育および使用検討会（Institutional Animal Care and Use Committee、ＩＡＣＵＣ）の承認を得た。研究の際には、動物の飼育および使用を実験動物ケア評価認証協会（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care、ＡＡＡＬＡＣ）の規定に沿って実施した。接種後、動物の罹患率および死亡率について毎日チェックした。日々のモニタリングの時に、正常な行動、例えば、運動性、飼料および水の消費、体重の増減（体重は週２回または１日おきに測定）、目／毛の乾燥に対する腫瘍成長および処置の影響、及びその他の異常な影響についてくまなくチェックした。各副群内の動物数に基づき、死亡および観察された臨床所見を記録した。
２．４ エンドポイント
２．４．１ 体重を毎日測定し、本研究の処置期間は７日とし、最終日には全マウスを賭殺し、ＣＴＧ（細胞生存率）アッセイのためにミニ－ＰＤＸデバイスを取り出した。相対腫瘍増殖速度（％）は抗腫瘍活性の指標である。
２．４．１ 体重を毎日測定し、本研究の処置期間は７日とし、最終日には全マウスを賭殺し、ＣＴＧ（細胞生存率）アッセイのためにミニ－ＰＤＸデバイスを取り出した。相対腫瘍増殖速度（％）は抗腫瘍活性の指標である。
２．４．２ ＶＣｄ７～Ｖｄ０＞０のとき、相対腫瘍増殖速度（％）＝（ＶＴｄ７～Ｖｄ０）／（ＶＣｄ７～Ｖｄ０）×１００％であり、ＶＣｄ７～Ｖｄ０＜０のとき、相対腫瘍増殖速度（％）＝ＶＴｄ７／ＶＣｄ７×１００％（ＶＴｄ７：処置群の７日目の細胞生存率、ＶＣｄ７：対照群の７日目の細胞生存率、Ｖｄ０：０日目の細胞生存率）である。
３． 結果（図２参照）
４． まとめと考察
ＭＤＸ０７９ミニ－ＰＤＸモデルにおいて、ドセタキセルおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝－２１％）は、腫瘍細胞生存率の有意な低下をもたらし得るものであり、ゲムシタビンおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝５５％）も抗腫瘍活性を示し、ペメトレキセドおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝１０３％）処置、ペメトレキセド、カルボプラチンおよびベバズリマブの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝１１９％）、エトポシドおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝１１４％）は、抗腫瘍活性を示さなかった。
ＭＤＸ０７９ミニ－ＰＤＸモデルにおいて、ドセタキセルおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝－２１％）は、腫瘍細胞生存率の有意な低下をもたらし得るものであり、ゲムシタビンおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝５５％）も抗腫瘍活性を示し、ペメトレキセドおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝１０３％）処置、ペメトレキセド、カルボプラチンおよびベバズリマブの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝１１９％）、エトポシドおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝１１４％）は、抗腫瘍活性を示さなかった。
ＭＤＸ０８３ミニ－ＰＤＸモデルにおいて、パクリタキセルおよびシスプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝４４％）、ゲムシタビンおよびシスプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝４１％）、ドセタキセルおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝５０％）、５－Ｆｕおよびシスプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝４５％）、エピルビシン、５－Ｆｕおよびシスプラチンｍｐ組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝４５％）を含む全ての処置群が腫瘍細胞生存率の低下をもたらし得るものである。
ＭＤＸ０９５ミニ－ＰＤＸモデルにおいて、５－Ｆｕ処置（Ｔ／Ｃ％＝８０％）、パクリタキセル処置（Ｔ／Ｃ％＝７９％）が、腫瘍細胞生存率の低下をもたらし、ゲムシタビンおよびシスプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝１１９％）は抗腫瘍活性を示さず、シスプラチン処置（Ｔ／Ｃ％＝１２８％）、エピルビシン処置（Ｔ／Ｃ％＝１２０％）、エトポシド処置（Ｔ／Ｃ％＝１０９％）は抗腫瘍活性を示さなかった。
ＭＤＸ１０７ミニ－ＰＤＸモデルにおいて、テモゾロミド処置は抗腫瘍活性を示さなかった。Ｉｎ ＭＤＸ１２３ミニ－ＰＤＸモデルにおいて、５－Ｆｕ処置（Ｔ／Ｃ％＝７５％）、オキサリプラチン処置（Ｔ／Ｃ％＝６１％）、イリノテカン処置（Ｔ／Ｃ％＝６８％）、ベバズリマブ処置（Ｔ／Ｃ％＝７６％）は、腫瘍細胞生存率の低下をもたらし得るものであり、ラルチトレキセド処置（Ｔ／Ｃ％＝９２％）、ベバズリマブ処置（Ｔ／Ｃ％＝１０１％）は抗腫瘍活性を示さなかった。
実施例２
５． 材料
５．１ 条件付き再プログラミングのための腫瘍
ＭＤＸ１３３、ＭＤＸ１５４、ＭＤＸ１６４、ＭＤＸ１６５、ＭＤＸ１６８、ＭＤＸ１６９、ＭＤＸ１７４、ＭＤＸ１８６、ＭＤＸ１８９、ＭＤＸ２０３ の条件付き再プログラミング細胞はそれぞれ個別に回収した。ＭＤＸ１３３は４５歳男性胃癌患者由来であり、ＭＤＸ１５４モデルは女性胆嚢癌患者由来であり、ＭＤＸ１６４モデルは４３歳男性神経膠芽腫患者由来であり、ＭＤＸ１６５モデルは６４歳男性神経膠芽腫患者由来であり、ＭＤＸ１６８モデルは６６歳女性胆嚢癌患者由来であり、ＭＤＸ１６９モデルは５２歳男性肺癌患者由来であり、ＭＤＸ１７４モデルは５９歳男性肺癌患者由来であり、ＭＤＸ１８６モデルは５４歳女性膵臓癌患者由来であり、ＭＤＸ１８９モデルは４４歳男性食道癌患者由来であり、ＭＤＸ２０３モデルは６１歳男性胆嚢癌患者由来であった。
５． 材料
５．１ 条件付き再プログラミングのための腫瘍
ＭＤＸ１３３、ＭＤＸ１５４、ＭＤＸ１６４、ＭＤＸ１６５、ＭＤＸ１６８、ＭＤＸ１６９、ＭＤＸ１７４、ＭＤＸ１８６、ＭＤＸ１８９、ＭＤＸ２０３ の条件付き再プログラミング細胞はそれぞれ個別に回収した。ＭＤＸ１３３は４５歳男性胃癌患者由来であり、ＭＤＸ１５４モデルは女性胆嚢癌患者由来であり、ＭＤＸ１６４モデルは４３歳男性神経膠芽腫患者由来であり、ＭＤＸ１６５モデルは６４歳男性神経膠芽腫患者由来であり、ＭＤＸ１６８モデルは６６歳女性胆嚢癌患者由来であり、ＭＤＸ１６９モデルは５２歳男性肺癌患者由来であり、ＭＤＸ１７４モデルは５９歳男性肺癌患者由来であり、ＭＤＸ１８６モデルは５４歳女性膵臓癌患者由来であり、ＭＤＸ１８９モデルは４４歳男性食道癌患者由来であり、ＭＤＸ２０３モデルは６１歳男性胆嚢癌患者由来であった。
５．２ 動物
５．２．１ Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス、雌、上海ラボラトリー動物センター（中国、上海、Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ、上海、中国、ＳＣＸＫ（ＳＨ）２０１３～００１８）
週齢： ６～８週
性別： 雌
体重： １８～２２ｇ
５．２．１ Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス、雌、上海ラボラトリー動物センター（中国、上海、Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ、上海、中国、ＳＣＸＫ（ＳＨ）２０１３～００１８）
週齢： ６～８週
性別： 雌
体重： １８～２２ｇ
５．２．２ 飼育条件
マウスは、定温、定湿のＳＰＦ室内で、各ケージに３匹を飼育した。
温度： ２０～２６℃
湿度： ４０～７０％
明暗サイクル： 明環境を１２時間、暗環境を１２時間
マウスは、定温、定湿のＳＰＦ室内で、各ケージに３匹を飼育した。
温度： ２０～２６℃
湿度： ４０～７０％
明暗サイクル： 明環境を１２時間、暗環境を１２時間
ケージ： ポリカーボネート製。サイズは３２５ｍｍ×２１０ｍｍ×１８０ｍｍ。床敷材はトウモロコシの穂軸であり、週２回交換した。
飼料： 研究期間全体を通じて、動物は照射滅菌済みの乾燥粒状飼料を自由に食べることができた。
水： 動物は、滅菌済飲料水自由に飲むことができた。
ケージの識別： 各ケージの識別ラベルは以下の情報を含んでいた：動物の数、性別、種、受取日、処置、研究番号、群番号、および処置開始日。
動物の識別： 動物は耳へのコード付けによって印を付けた。
飼料： 研究期間全体を通じて、動物は照射滅菌済みの乾燥粒状飼料を自由に食べることができた。
水： 動物は、滅菌済飲料水自由に飲むことができた。
ケージの識別： 各ケージの識別ラベルは以下の情報を含んでいた：動物の数、性別、種、受取日、処置、研究番号、群番号、および処置開始日。
動物の識別： 動物は耳へのコード付けによって印を付けた。
５．３ 装置
逆相顕微鏡ＤＭＩＬ、ＬＥＩＣＡ社製。バランスＡＬＣ－３１０．３、Ａｃｃｌｕｌａｂ社製。マイクロバランスＢＳＡ２２４Ｓ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製。遠心分離機５８１０Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製。
逆相顕微鏡ＤＭＩＬ、ＬＥＩＣＡ社製。バランスＡＬＣ－３１０．３、Ａｃｃｌｕｌａｂ社製。マイクロバランスＢＳＡ２２４Ｓ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製。遠心分離機５８１０Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製。
ミニ－ＰＤＸデバイス：修飾フッ化ポリビニリデン製で、カットオフ値が５００，０００ダルトン、内径１～２ｍｍの中空繊維。所望の長さに切断。
６． 手順と方法
６．１ 細胞培養
腫瘍組織試料を緩衝溶液で洗浄し、バイオセーフティキャビネット内ですべての非腫瘍組織および壊死した腫瘍組織を除去する。腫瘍を１～３ｍｍ３の断片に切断し、ペレットを１×コラーゲナーゼ溶液に懸濁し、３７℃で１～２時間インキュベートする。単一細胞を７０ｕＭのストレイナーによって回収し、腫瘍細胞濃度を求めるために細胞数を計数する （切除および生検／針生検腫瘍試料より得た試料の腫瘍細胞数の計数を参照）。細胞を条件付き再プログラミング培地で培養し、腫瘍細胞の増殖後に条件付き再プログラミング細胞を回収する。
６．１ 細胞培養
腫瘍組織試料を緩衝溶液で洗浄し、バイオセーフティキャビネット内ですべての非腫瘍組織および壊死した腫瘍組織を除去する。腫瘍を１～３ｍｍ３の断片に切断し、ペレットを１×コラーゲナーゼ溶液に懸濁し、３７℃で１～２時間インキュベートする。単一細胞を７０ｕＭのストレイナーによって回収し、腫瘍細胞濃度を求めるために細胞数を計数する （切除および生検／針生検腫瘍試料より得た試料の腫瘍細胞数の計数を参照）。細胞を条件付き再プログラミング培地で培養し、腫瘍細胞の増殖後に条件付き再プログラミング細胞を回収する。
生検／針生検で得た腫瘍組織を１×コラーゲナーゼ溶液に懸濁し、３７℃で１～２時間インキュベートする。単一細胞を７０ｕＭのストレイナーによって回収し、腫瘍細胞濃度を求めるために細胞数を計数する（切除および生検／針生検腫瘍試料より得た試料の腫瘍細胞数の計数を参照）。細胞を条件付き再プログラミング培地で培養し、腫瘍細胞の増殖後に条件付き再プログラミング細胞を回収する。
６．２ ミニ－ＰＤＸデバイスの接種
細胞懸濁液でミニ－ＰＤＸデバイスを満たし、デバイスをＮｕ／Ｎｕーヌードマウスの両側面に皮下接種してミニ－ＰＤＸモデルを確立した。接種日を０日とした。体重に基づきマウスをランダムに群に分け、０日に処置を開始した。各研究群における試験品の投与およびミニ－ＰＤＸデバイス番号を下記実験計画表に示した。
細胞懸濁液でミニ－ＰＤＸデバイスを満たし、デバイスをＮｕ／Ｎｕーヌードマウスの両側面に皮下接種してミニ－ＰＤＸモデルを確立した。接種日を０日とした。体重に基づきマウスをランダムに群に分け、０日に処置を開始した。各研究群における試験品の投与およびミニ－ＰＤＸデバイス番号を下記実験計画表に示した。
６．３ 観察
本研究におけるプロトコルおよびその変更点または動物の飼育と使用に関わる手順は、実施の前に上海ＬＩＤＥの学内動物飼育および使用検討会（ＩＡＣＵＣ）の承認を得た。研究の際には、動物の飼育および使用を実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）の規定に沿って実施した。接種後、動物の罹患率および死亡率について毎日チェックした。日々のモニタリングの時に、正常な行動、例えば、運動性、飼料および水の消費、体重の増減（体重は週２回または１日おきに測定）、目／毛の乾燥に対する腫瘍成長および処置の影響、及びその他の異常な影響についてくまなくチェックした。各副群内の動物数に基づき、死亡および観察された臨床所見を記録した。
本研究におけるプロトコルおよびその変更点または動物の飼育と使用に関わる手順は、実施の前に上海ＬＩＤＥの学内動物飼育および使用検討会（ＩＡＣＵＣ）の承認を得た。研究の際には、動物の飼育および使用を実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）の規定に沿って実施した。接種後、動物の罹患率および死亡率について毎日チェックした。日々のモニタリングの時に、正常な行動、例えば、運動性、飼料および水の消費、体重の増減（体重は週２回または１日おきに測定）、目／毛の乾燥に対する腫瘍成長および処置の影響、及びその他の異常な影響についてくまなくチェックした。各副群内の動物数に基づき、死亡および観察された臨床所見を記録した。
６．４ エンドポイント
６．４．１ 体重を毎日測定し、本研究の処置期間は７日とし、最終日には全マウスを賭殺し、ＣＴＧ（細胞生存率）アッセイのためにミニ－ＰＤＸデバイスを取り出した。相対腫瘍増殖速度（％）は抗腫瘍活性の指標である。
６．４．１ 体重を毎日測定し、本研究の処置期間は７日とし、最終日には全マウスを賭殺し、ＣＴＧ（細胞生存率）アッセイのためにミニ－ＰＤＸデバイスを取り出した。相対腫瘍増殖速度（％）は抗腫瘍活性の指標である。
６．４．２ ＶＣｄ７～Ｖｄ０＞０のとき、相対腫瘍増殖速度（％）＝（ＶＴｄ７～Ｖｄ０）／（ＶＣｄ７～Ｖｄ０）×１００％であり、ＶＣｄ７～Ｖｄ０＜０のとき、相対腫瘍増殖速度（％）＝ＶＴｄ７／ＶＣｄ７×１００％（ＶＴｄ７：処置群の７日目の細胞生存率、ＶＣｄ７：対照群の７日目の細胞生存率、Ｖｄ０：０日目の細胞生存率）である。
７． 結果（図３参照）
８．まとめと考察
ＭＤＸ１３３ミニ－ＰＤＸモデルにおいては、パクリタキセル処置（Ｔ／Ｃ％＝５２％）は、腫瘍細胞生存率の低下をもたらし得るものであり、イリノテカン処置（Ｔ／Ｃ％＝７２％）、Ｓ－１処置（Ｔ／Ｃ％＝８６％）、オキサリプラチン処置（Ｔ／Ｃ％＝８９％）も少量の抗腫瘍活性を示し、５－Ｆｕ処置（Ｔ／Ｃ％＝１０３％）は抗腫瘍活性を示さなかった。
ＭＤＸ１３３ミニ－ＰＤＸモデルにおいては、パクリタキセル処置（Ｔ／Ｃ％＝５２％）は、腫瘍細胞生存率の低下をもたらし得るものであり、イリノテカン処置（Ｔ／Ｃ％＝７２％）、Ｓ－１処置（Ｔ／Ｃ％＝８６％）、オキサリプラチン処置（Ｔ／Ｃ％＝８９％）も少量の抗腫瘍活性を示し、５－Ｆｕ処置（Ｔ／Ｃ％＝１０３％）は抗腫瘍活性を示さなかった。
ＭＤＸ１５４ミニ－ＰＤＸモデルにおいて、ゲムシタビン処置（Ｔ／Ｃ％＝１００％）、オキサリプラチン処置（Ｔ／Ｃ％＝１７４％）、５－Ｆｕ処置（Ｔ／Ｃ％＝１１１％）、Ｎａｂ－パクリタキセル処置（Ｔ／Ｃ％＝１６２％）、イリノテカン処置（Ｔ／Ｃ％＝２２７％）を含む全ての処置群が抗腫瘍活性を示さなかった。
ＭＤＸ１６４ミニ－ＰＤＸモデルにおいて、テモゾロミド処置（Ｔ／Ｃ％＝１０２％）は抗腫瘍活性を示さなかった。
ＭＤＸ１６４ミニ－ＰＤＸモデルにおいて、テモゾロミド処置（Ｔ／Ｃ％＝１０２％）は抗腫瘍活性を示さなかった。
ＭＤＸ１６５ミニ－ＰＤＸモデルにおいて、テモゾロミド処置（Ｔ／Ｃ％＝２９％）は、腫瘍細胞生存率の低下をもたらし得るものであった。
ＭＤＸ１６８ミニ－ＰＤＸモデルにおいて、Ｎａｂ－パクリタキセル処置（Ｔ／Ｃ％＝１５％）、イリノテカン処置（Ｔ／Ｃ％＝１２％）は、腫瘍細胞生存率の低下をもたらし得るものであり、ゲムシタビン処置（Ｔ／Ｃ％＝５３％）、オキサリプラチン処置（Ｔ／Ｃ％＝７５％）も少量の抗腫瘍活性を示し、５－Ｆｕ処置（Ｔ／Ｃ％＝１４６％）は抗腫瘍活性を示さなかった。
ＭＤＸ１６９ミニ－ＰＤＸモデルにおいて、ドセタキセルおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝２０％）、パクリタキセルおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝４０％）は、腫瘍細胞生存率の低下をもたらし得るものであり、ペメトレキセドおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝５５％）、ゲムシタビンおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝８２％）、ビノレルビンおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝９１％）も少量の抗腫瘍活性を示した。
ＭＤＸ１７４ミニ－ＰＤＸモデルにおいて、ゲムシタビンおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝８６％）は少量の抗腫瘍活性を示し、ペメトレキセドおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝１０４％）、パクリタキセルおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝１２０％）、ドセタキセルおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝１１０％）、ビノレルビンおよびカルボプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝１３４％）は抗腫瘍活性を示さなかった。
ＭＤＸ１８６ミニ－ＰＤＸモデルにおいて、Ｎａｂ－パクリタキセル処置（Ｔ／Ｃ％＝０％）、イリノテカン処置（Ｔ／Ｃ％＝５％）は、腫瘍細胞生存率の有意な低下をもたらし得るものであり、オキサリプラチン処置（Ｔ／Ｃ％＝４７％）は抗腫瘍活性を示し、ゲムシタビン処置（Ｔ／Ｃ％＝８３％）、５－Ｆｕ処置（Ｔ／Ｃ％＝９０％）も少量の抗腫瘍活性を示した。
ＭＤＸ１８９ミニ－ＰＤＸモデルにおいては、Ｓ－１およびオキサリプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝～２％）、ドセタキセル、シスプラチンおよび５－Ｆｕの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝１４％）、５－Ｆｕおよびシスプラチンの組み合わせ処置（Ｔ／Ｃ％＝１９％）は、腫瘍細胞生存率の有意な低下をもたらし得るものであった。
ＭＤＸ２０３ミニ－ＰＤＸモデルにおいては、オキサリプラチン処置（Ｔ／Ｃ％＝４３％）、イリノテカン処置（Ｔ／Ｃ％＝４８％）、Ｎａｂ－パクリタキセル処置（Ｔ／Ｃ％＝５２％）は、腫瘍細胞生存率の低下をもたらし得るものであり、ゲムシタビン処置（Ｔ／Ｃ％＝７７％）、５－Ｆｕ処置（Ｔ／Ｃ％＝８３％）も少量の抗腫瘍活性を示した。
９． 切除および生検／針生検腫瘍試料より得た試料の腫瘍細胞数の計数
公知の方法によって腫瘍細胞数を計数し、懸濁液中の腫瘍細胞濃度に変換した。Ｍ：×１０ ６ ／ｍｌ。
公知の方法によって腫瘍細胞数を計数し、懸濁液中の腫瘍細胞濃度に変換した。Ｍ：×１０ ６ ／ｍｌ。
Claims (9)
- 抗腫瘍薬のスクリーニングのための動物モデルを得るための方法であって、
患者の腫瘍試料から得た原発腫瘍細胞を、下記成分：
ａ）０．４ｍｇ／Ｌのヒドロコルチゾン、
ｂ）５ｍｇ／Ｌのインスリン、
ｃ）８．３μｇ／Ｌのコレラトキシン、
ｄ）２４．２ｍｇ／Ｌのアデニン、
ｅ）１０μｇ／ＬのＥＧＦ、
ｆ）１０μｍｏｌ／ＬのＹ－２７６３２、
ｇ）ペニシリン／ストレプトマイシン、
ｈ）１０％のＦＢＳ、
ｉ）Ｆ１２培地、
ｊ）高グルコースＤＭＥＭ、
ｋ）非必須アミノ酸溶液、
ｌ）ＧｌｕｔａＭＡＸ添加剤、および
ｍ）マイトマイシンＣで処理したマウス胎児繊維芽細胞
を含む組成物中で培養する工程（１）と、
前記工程（１）で得た原発腫瘍細胞を動物に移植する工程（２）と
を含み、
前記動物はヒト以外の動物である、方法。 - 前記腫瘍試料が切除試料または生検試料である、請求項１に記載の方法。
- 前記腫瘍試料の原発腫瘍細胞の濃度は、２×１０６／ｍｌ未満、１．９×１０６／ｍｌ未満、１．８×１０６／ｍｌ×１０６／ｍｌ未満、１．７×１０６／ｍｌ未満、１．６×１０６／ｍｌ未満、１．５×１０６／ｍｌ未満、１．４×１０６／ｍｌ未満、１．３×１０６／ｍｌ未満、１．２×１０６／ｍｌ未満、１．１×１０６／ｍｌ未満、１．０×１０６／ｍｌ未満、０．９×１０６／ｍｌ未満、０．８×１０６／ｍｌ未満、０，７×１０６／ｍｌ未満、０．６×１０６／ｍｌ未満、０．５×１０６／ｍｌ未満、０．４×１０６／ｍｌ未満、０．３×１０６／ｍｌ未満、０．２×１０６／ｍｌ未満、または０．１×１０６／ｍｌ以下である、請求項１に記載の方法。
- 前記動物がマウスまたはラットである、請求項１に記載の方法。
- 前記原発腫瘍細胞を動物に移植する工程（２）の前に、前記工程（１）で培養によって得られた原発腫瘍細胞を中空繊維内に封入することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記中空繊維が前記動物の皮下に移植される、請求項５に記載の方法。
- 前記抗腫瘍薬のスクリーニングが、前記動物に候補薬を投与することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記候補薬を動物に経口投与または非経口投与する、請求項７に記載の方法。
- 前記抗腫瘍薬のスクリーニングが、前記候補薬を前記動物に投与した後に、前記動物における腫瘍細胞成長を測定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
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