CN117598248A - 一种肿瘤药敏动物模型的建模方法及其用途 - Google Patents

一种肿瘤药敏动物模型的建模方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种肿瘤药敏动物模型的建模方法及其用途，属于动物肿瘤模型领域。本发明利用患者的肿瘤组织样本或肿瘤组织来源的类器官移植到小鼠眼前房中，快速构建肿瘤药敏体内模型。该模型通过活体成像技术，可以快速、动态、实时观测靶向药物对肿瘤定植、肿瘤增殖和血管形成的影响，可以用于药物快速筛选。该模型具有高敏感性，可以对药效进行动态无损评价，解决了药物筛选周期长和可靠性低等问题，为临床肿瘤治疗提供了新的指导模型。

Description

一种肿瘤药敏动物模型的建模方法及其用途
技术领域
本发明属于动物肿瘤模型领域。具体涉及一种肿瘤药敏动物模型的建模方法及其用途。
背景技术
肿瘤是目前人类面临的严重的恶性疾病，在治疗时个体差异大，目前临床上主要是基于医生经验的治疗尝试，无法迅速确定最佳治疗方案，导致治疗效果不佳，因此建立可靠的临床前模型，检测个体对药物的敏感性，对于个性化治疗的发展是至关重要的。理想的临床前模型应该是可复制的、高特异性、高敏感性、快速的，并且应该充分概括原位肿瘤的生物学特征。
到目前为止，已经开发了几种临床前肿瘤实验模型，包括2D细胞系，患者来源的异种移植模型(PDX模型)，患者来源的外植体(PDE模型)，动物模型(基因工程小鼠模型-gemms)和患者来源的类器官(PDO)。
2D细胞系是用于药敏研究的最简单，最实惠和最常用的模型。目前全球已经产生了数千种肿瘤细胞系，它们可以被分类为代表不同肿瘤的不同组织学亚型的组。然而，这些细胞系不能完全反映肿瘤的异质性，也不能在分子遗传学水平上完全表征。此外，比较基因组学和转录组学分析显示，细胞系与相同组织学类型的临床样本之间几乎没有相关性，细胞系的广泛传代可能会引入具有不可预测的生物学意义的遗传改变。尽管细胞系是基础研究和药物筛选的宝贵替代工具，但尚不清楚细胞系研究产生的数据在多大程度上具有临床意义。
PDX模型的原理是将新鲜的肿瘤组织移植到免疫缺陷型小鼠体内。在不同的研究中，PDX的成功率差异很大，但人们普遍认为，异种移植物再现了原始癌症组织的组织学和基因组图谱。但PDX模型的生成相当费时费力，其传代操作也不容易。
PDE模型相对容易生成，因为它们代表新鲜切除的肿瘤组织的离体培养。尽管PDE模型具有可行性，并且在形态和遗传上与肿瘤组织相似，但其在肿瘤研究中的应用受到限制，主要是因为其生存能力问题和短期性限制了这些外植体的潜在应用。
类器官技术于2009年作为一种开创性的3D原代组织培养模型被引入，并迅速发展成为一种复杂且有前景的癌症研究临床前模型。类器官是一种，来源于干细胞(多能或组织驻留)或分化的正常细胞或癌细胞的3D培养模型，它们模仿健康或癌症组织的生物学和功能特征。目前，肿瘤类器官被应用于各种癌症(胃肠道、胰腺、肝脏、前列腺等)的基础研究中。尽管文献显示，类器官作为药敏模型，具有速度快，敏感性和特异性高的特点，但其缺少肿瘤微环境，限制了类器官的临床应用。
由于前述模型存在的诸多问题，目前患者临床靶向治疗主要还是依赖于基因检测的结果指导临床用药。依然存在很多弊端：1.当前基因检测所需时间较长，患者用药前的等待周期大概在1-1.5个月；2.基因检测受到检测技术的限制，可能会出现假阴性或假阳性结果，出现假阳或者假阴性结果均可能会影响临床治疗效果；3.基因检测同时可能存在基因检测的覆盖率不足，基因检测技术并不能覆盖所有基因或所有区域，有些突变基因可能未被检测到。因此基因检测并不能完整的反应整个肿瘤对于药物的敏感性；4.患者对基因检测推荐药物耐药后，存在无药可用的尴尬；5.基因检测在实验实施后，存在组织不可再利用性。
因此亟需构建一个较传统体内模型更高效，更敏感以及性价比更高的快速药敏模型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤药敏动物模型的建模方法及其用途。
本发明提供了一种构建肿瘤药敏动物模型的方法，包括如下步骤：
a)取肿瘤组织样本，得到组织标本；
b)将组织标本切块得到组织块，或者将组织标本消化为单细胞，培养得到肿瘤类器官；
c)将组织块或类器官移植到动物眼前房内，待眼前房移植物内出现新生血管，即可。
进一步地，所述肿瘤组织包括肝癌组织，肺癌组织，结肠癌组织，胃癌组织，胰腺癌组织，甲状腺癌组织，头颈肿瘤组织，甲状旁腺瘤组织，肾上腺肿瘤组织，胆管细胞癌组织，乳腺癌组织。
进一步地，步骤b)中，所述组织块大小为(0.5-2)mm×(0.5-2)mm×(0.5-2)mm；移植量为1-3块。
进一步地，将组织块移植到动物眼前房内，经过3-5天后动物眼前房移植物内出现新生血管。
进一步地，步骤b)中，肿瘤类器官的制备方法如下：
1)将组织标本剪成组织碎块，使用组织消化液消化肿瘤细胞组织，得到肿瘤组织单细胞；
2)使用基质胶重悬细胞，接种并培养，待类器官增殖密度达到50％以上后，收集。
进一步地，步骤1)中组织消化液为终浓度为0.5mg/ml胶原酶XI和0.2mg/ml的DNA酶的Advanced DMEM F12溶液；
步骤2)中采用培养类器官培养基为加入添加有1％vol/vol的青霉素及链霉素双抗溶液，1％vol/vol L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，10mmol/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液，2％vol/vol B27培养基补充剂，1％vol/vol N2培养基补充剂，1.25μmol/LN-乙酰-L-半胱氨酸，100ng/mL表皮细胞生长因子(EGF)，25ng/ml重组人R-spondin 1蛋白，100ng/mL成纤维细胞生长因子10(FGF10)，10mmol/L烟酰胺，和10.5μmol/L Y-27632小分子抑制剂的DMEM/F12溶液；
所述基质胶为Matrigel基质胶；培养条件为在37℃、5％CO2环境中进行培养。
进一步地，选取大小为(5-30)μm*(5-30)μm的类器官移植到动物眼前房；移植量1-3片类器官；移植类器官后，经过14-17天移植物内出现新生血管。
进一步地，所述动物为小鼠、大鼠或兔子；优选为小鼠。
本发明还提供了一种上述的方法制备得到的动物模型。
本发明还提供了一种上述的动物模型在药物筛选、药物毒性试验或免疫治疗试验中用途。
本发明提供了一种肿瘤药敏动物模型的建模方法及其用途，该模型以患者手术或穿刺组织本，或组织构建的肿瘤类器官到小鼠眼前房中，快速构建肿瘤药敏模型，该建模方法成功率高，建模速度快。
本发明方法所得到的模型通过使用活体成像技术，可以快速、动态地实时观测靶向药物肿瘤增殖(主要是肿瘤体积变化)和血管形成(新生血管的数量以及血管直径变化)的影响，实现了快速药物筛选，以寻找肿瘤治疗的最佳药物，可以为患者个体化精准医疗提供强有力的支持和保障。
本发明模型具有高敏感性，可以对药效进行动态无损评价，解决了药物筛选周期长和可靠性低等问题，为临床肿瘤治疗提供了新的指导模型。
本发明可以为医生提供立体的肿瘤形态和血管分布信息，有助于制定更为精准的治疗方案。此外，通过体外构建肿瘤的类器官模型以及眼前房内肿瘤的再植，可以实现肿瘤的再利用。同时，该模型还可以用于探索肿瘤干细胞直接或间接转化分新生血管的机制，寻找逆转血管转分化的关键靶点，为开发相关靶向药物提供体内模型支持。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1小鼠眼前房植入肺癌组织后，不同时间点小鼠眼前房的活体成像结果图。
图2为实施例3小鼠眼前房植入甲状腺乳头状癌类器官后，不同时间点小鼠眼前房的活体成像结果图。
图3为抗肿瘤药物奥希替尼对实施例1小鼠模型的眼前房内与肿瘤组织相连的新生血管的影响图。
图4为抗肿瘤药物伦伐替尼对实施例3小鼠模型的眼前房内与甲状腺乳头状癌类器官相连的新生血管的影响图。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
本发明使用的建模小鼠为SCID小鼠。
组织清洗液：磷酸盐缓冲液(PBS)+1％ Anti-Anti溶液(Gibco，15240062)。
Anti-Anti溶液(Gibco，15240062)是一种抗生素抗性剂，主要作用是为了防止真菌及细菌污染。
组织消化液：终浓度为0.5mg/ml胶原酶XI(C7657；Sigma Aldrich)和0.2mg/ml的DNA酶(17105041；Sigmal-Aldrich)的Advanced DMEM F12溶液。
Advanced DMEM F12溶液：是一种广泛使用的基础培养基，与经典DMEM/F-12相比，血清添加量可减少50-90％，而细胞生长速率或形态无变化，购自Invitrogen，货号12634010。
消化终止液：含10％浓度的胎牛血清的Advanced DMEM F12溶液。
基质胶：Matrigel基质胶，购买自康宁，货号：354230。
类器官完全培养基：DMEM/F12溶液添加1％vol/vol青霉素及链霉素双抗溶液(15140122，Life Technologies)；1％vol/vol L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMAX，BE-17-605E/U1，Westburg BV)；10mmol/L HEPES溶液(be-17-737E，Westburg BV)；2％vol/vol的B27培养基补充剂(17504-001，Life Technologies Europe BV)；1％vol/vol的N2培养基补充剂(17502001，Life Technologies)；1.25μmol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetylcysteine)(A7250，Sigma-Aldrich)；100ng/mL的表皮生长因子(EGF，AF-100-15，PeproTech)；重组人R-spondin 1蛋白(25ng/ml，2593，Prospec)；100ng/mL的成纤维细胞生长因子10(FGF10，100-26，PeproTech)；10mmol/L的烟酰胺(nicotinamide，N0636，Sigma-Aldrich)；10.5μmol/L的Y-27632小分子抑制剂(Y0503，Sigma-Aldrich)。
实施例1、使用肿瘤组织构建本发明肿瘤组织眼前房药敏模型
一、建模方法
(一)准备组织标本
1.本模型适用于所有来源于手术或穿刺的实体肿瘤(良性或恶性肿瘤均适用)，大小至少0.5cm*0.1cm*0.1cm。以肺癌为例，取手术肺癌肿瘤组织样本，大小约0.5cm*0.5cm*0.5cm大小，置于UW液(Biolifesoultion,101102)后于冰上保存，在1小时内运送至实验室。
2.选用新鲜组织样本，将组织样本放置于无菌培养皿，使用组织清洗液清洗，去除组织中的坏死组织、钙化点、血凝块和非脂肪组织来源样本中的脂肪组织，得到组织标本。
(二)组织移植
1.将组织标本置于无菌的培养皿中，加入含5％浓度血清的PBS保持组织湿润，切割为大小为1mm×1mm×1mm的组织块，备用。
2.小鼠吸入2％异氟烷致全身麻醉，并用立体定位头支架约束小鼠头部。通过0.4mm聚乙烯管将切好的组织块吸入27号套管中，该套管连接1ml Hamilton注射器。在体视显微镜下，用一根27号的针刺穿靠近巩膜位置的角膜，将吸入组织块的套管插入，将组织块注射到眼前房，固定在虹膜上，每只小鼠眼前房内移植一块肿瘤组织块。
移植成功后，培养3～5天，即可得到本发明药敏模型。
二、模型检测
(一)检测方法
采用活体成像方法检测新生血管情况：
1.使用2％的异氟烷气体对小鼠进行气体麻醉，1％-1.5％用于维持麻醉。
2.用立体定位头支架约束小鼠头部，并将含有移植组织的眼睛朝上定位，完全暴露眼球。
3.使用莱卡多功能光谱型活体显微成像系统(Multi-functional spectral invivo microscopy imaging system)，共聚焦配备405nm单谱线激光器；440-790nm 350根连续可调激光器，双光子配备了1040nm单谱线激光器；680-1300nm可调谱线激光器。采用远距浸水透镜(Leica HXC APO 10×0.3W)进行Z轴的活体成像。使用PBS作为小鼠眼球与镜头之间的介质。
4.为了观察组织形态，在639nm处激发，613～675nm处检测，获得肿瘤组织的背景反射光图，如图1反射光组所示。
5.观察血管：通过眼眶后静脉窦注射异硫氰酸荧光素-葡聚糖(10mg/mL)。在491nm处激发，508～576nm处检测，获得眼前房血管的活体成像图，即FITC的绿色荧光图，如图1绿色荧光组所示。将活体成像得到肿瘤组织背景反射光图，以及眼前房血管的FITC的绿色荧光图进行重叠，得到如图1的重叠图像组所示图像为眼前房血管血管图。通过观察培养不同时间后的血管图与移植当天(第0天)的比较，确认是否有新生血管(血管结构变的更加致密或者血管增粗)。
分别在0，3，4，5，7，14、45天，采用前述活体成像方法对建模小鼠眼前房进行活体成像，得到小鼠眼前房血管图，观察移植物内是否有新生血管。
(二)检测结果
检测结果显示，此次建模共20只，眼前房植入肺癌组织后第3天-第5天均出现新生血管，发生血管重建，并且植入肺癌组织的血管及形态可得以长时间的保持，其中18只至少能维持45天，2只建模小鼠均在移植后早期出现眼部感染导致小鼠死亡，此次建模成功率为90％。其中，一只造模成功小鼠的检测结果图如图1所示，可以看到小鼠自身的血管由瞳孔至眼周为疏松放射状结构，而瘤内新生血管结构较致密(图1黄色箭头)以及瘤周滋养血管随时间增粗(图1红色箭头)。
实验结果说明，采用本实施例的方法，可以有效建立肺癌组织眼前房药敏模型，建模时间短，模型稳定，建模成功率高。
实施例2使用肿瘤构建本发明肿瘤组织眼前房药敏模型
除了实施例1展示的肺癌组织眼前房药敏模型以外，我们也在多种良恶性肿瘤中进行了重复，采用实施例1的建模方法建立其他肿瘤组织眼前房药敏模型。
目前已使用近200只免疫缺陷型小鼠，完成了对包括甲状旁腺瘤，肝癌，肺癌，结肠癌，胃癌，胰腺癌，甲状腺癌，头颈肿瘤，甲状旁腺瘤，肾上腺肿瘤的建模(甲状旁腺瘤等良恶性肿瘤组织均来源于手术或穿刺，按照实施例1中第一(一)的方法处理肿瘤组织，采用实施例1中第一(二)的组织移植方法制备药敏模型)，总的建模成功率为89.5％，且均在第3-5天建模成功。10.5％的小鼠眼前房移植建模失败的主要原因为移植后早期出现眼部感染导致小鼠死亡。
本发明采用移植肿瘤组织构建的药敏模型，肿瘤组织中包含有免疫细胞，成纤维细胞，肿瘤细胞等，因此保留了肿瘤发生发展的微环境，为体内药敏过程中探索微环境对肿瘤细胞可塑性的研究提供了模型基础。
实验结果说明，采用本实施例的方法，可以有效建立肿瘤组织眼前房药敏模型，建模时间短，模型稳定，建模成功率高，并且可以适用于不同的肿瘤组织，临床应用前景特别优良。
实施例3、使用类器官构建本发明肿瘤类器官眼前房药敏模型
一、建模方法
(一)标本准备
使用手术甲状腺乳头状癌样本，其余同实施例1，得到甲状腺乳头状癌组织标本。
(二)构建类器官
1.将组织标本转移至样本收集容器，用剪刀将组织标本剪成1mm3～2mm3的组织块；添加组织三倍体积的组织消化液，将组织消化管放入37℃细胞培养箱或水浴锅孵育45min；每5～15min取出，上下颠倒摇晃组织消化管3～5次。
2.终止消化：加入与步骤1中使用的组织消化液总体积等体积的消化终止液，用移液器轻轻抽吸混匀。
3.采用70μm细胞筛过滤步骤2的终产物，收集过滤液；为了充分收集细胞，组织消化液过滤完毕应采用组织清洗液冲洗细胞筛2～3次，每次冲洗体积不小于1mL，并收集冲洗液至上述滤液收集管，盖紧密封后放入预冷的4℃台式离心机，300g离心5min，弃上清，收集细胞沉淀。
4.细胞沉淀呈现红色时，采用红细胞裂解液破解红细胞。细胞沉淀中加入1mL红细胞裂解液，轻柔吹打混匀，冰浴1～2min；加入等体积的组织清洗液，轻轻抽吸混匀，终止反应；盖紧密封后放入预冷的4℃台式离心机，300g离心5min。
5.弃上清，收集细胞沉淀，加入1ml体积的PBS重悬细胞沉淀中，用移液器轻轻抽吸混匀；盖紧密封后放入预冷的4℃台式离心机，300g离心5min，弃上清，收集细胞沉淀；可重复洗涤一次。
6.添加300μL体积的PBS重悬细胞沉淀，轻轻抽吸混匀获得均一的细胞悬液，取10～50μL细胞悬液用于细胞计数；剩余细胞悬液盖紧密封后，放入预冷的4℃台式离心机，300g离心5min，弃上清，收集细胞沉淀。
7.步骤6得到的细胞沉淀中加入基质胶，使细胞密度为1×104细胞/μL，然后在0-4℃冰浴条件下重悬细胞沉淀，将基质胶与细胞充分混匀，得到细胞/基质胶混悬液。
8.接种细胞/基质胶混悬液至细胞培养孔板，每孔2.0μL。将细胞培养孔板放入37℃、5％CO2培养箱，孵育10～15min。每孔添加100μL类器官完全培养基；将细胞培养孔板放入37℃、5％CO2培养箱。
9.待类器官增殖密度达到80％后，在0-4℃冰浴条件下在5ml PBS溶液中收集并重悬类器官，在显微镜下选择类器官大小大于5um*5um的肿瘤类器官，数量1-3片。
10.通过0.4mm聚乙烯管将类器官吸入27号套管中，该套管连接1ml Hamilton注射器。
(二)类器官移植
小鼠吸入2％异氟烷致全身麻醉，并用立体定位头支架约束小鼠头部。在体视显微镜下，用一根27号的针刺穿靠近巩膜位置的角膜，将吸入类器官的套管插入，将类器官注射到眼前房，固定在虹膜上，每只小鼠眼前房内移植一个肿瘤类器官。
移植成功后，培养14～17天，即可得到本发明药敏模型。
二、模型检测
(一)检测方法
检测方法同实施例1中活体成像方法检测新生血管情况的方法，分别在0，14，17，20，30、60天时对建模小鼠眼前房进行活体成像(二)检测结果，观察移植物内是否有新生血管。
(二)检测结果
检测结果显示，眼前房植入甲状腺乳头状癌类器官后第14天-第17天均出现新生血管，并且植入甲状腺乳头状癌类器官小鼠的血管及形态可得以长时间的保持，目前至少能维持60天。此次建模共20只，建模成功16只，均在移植后14-17天建模成功，此次建模成功率为80％，3只建模失败小鼠为移植后早期出现眼部感染导致小鼠死亡，1只小鼠为类器官移植后无新生血管形成。其中，一只造模成功小鼠的检测结果图如图2所示，可以看到小鼠自身的血管由瞳孔至眼周为疏松放射状结构，而瘤内新生血管结构较致密(图2黄色箭头)以及瘤周滋养血管随时间增粗(图2红色箭头)。
实验结果说明，采用本实施例的方法，可以有效建立甲状腺乳头状癌类器官眼前房药敏模型，建模时间短，模型稳定，建模成功率高。
实施例4、使用类器官构建本发明肿瘤类器官眼前房药敏模型
除了实施例3展示的甲状腺乳头状癌类器官眼前房药敏模型以外，我们也在多种良恶性肿瘤中进行了重复，采用前述建模方法建立其他肿瘤组织类器官眼前房药敏模型。
目前，本团队已使用100多只免疫缺陷型小鼠，完成了对包括胰腺癌，肺癌，甲状腺癌等类器官移植模型的构建，并构建了肿瘤类器官眼前房药敏模型(胰腺癌等良恶性肿瘤组织均来源于手术或穿刺，采用实施例3第一部分建模方法制备药敏模型)，建模成功率为86.3％，且均在移植后14-17天建模成功，如表1。建模失败的原因主要为早期移植后出现眼部感染导致小鼠死亡，仅2.1％为类器官移植后无新生血管形成。
表1通过构建各肿瘤类器官构建药敏动物模型
肿瘤类型 建模数 成功建模数
胰腺癌 27 25
肺癌 22 19
甲状腺癌 38 33
乳腺癌 15 11
目前有研究认为，在药物治疗中，肿瘤干细胞会导致肿瘤耐药以及对靶向药物的不敏感。如果候选药物能够直接抑制由于类器官抑制新生的血管，以及杀死移植进入眼前房的类器官，可以证明药物的治疗效果特别优异。
实验结果说明，采用本实施例的方法，可以有效建立肿瘤类器官眼前房药敏模型，建模时间短，模型稳定，建模成功率高，并且可以适用于不同的肿瘤，临床应用前景特别优良。
以下通过实验例证明本发明构建的小鼠模型的有益效果。
实验例1、本发明实施例1小鼠模型药敏性能验证
一、实验方法
(一)实验分组
通过眼前房活体成像结果确定，实施例1的肺癌组织眼前房药敏模型眼前房移植物内形成新生血管，造模成功。下述进行药物治疗验证其药物敏感性。
将实施例1建模成功小鼠随机分为2组，每组9只，给药方案如下：
对照组1：将0.2ml的PBS溶液灌胃给予小鼠，每日一次，连续处理14天。该组小鼠未接受任何药物治疗。
实验组1：将奥希替尼以0.5mg/kg的剂量溶于0.2ml的PBS溶液中，对小鼠进行灌胃处理，每日一次，连续进行14天。
(二)活体成像方法检测新生血管情况
14天后，对对照组1和实验组1进行活体成像检测(活体成像方法同实施例1)，得到对照组1和实验组1的肿瘤组织的背景反射光图以及眼前房血管的活体成像图，即FITC的绿色荧光图并将两者图像进行重叠，得到重叠图像(图3)。
通过观察新生血管以及肿瘤体积变化，验证药物治疗效果。对于新生血管，主要观察指标为新生血管数量变化以及新生血管直径变化；针对肿瘤体积观察，主要通过活体成像测量移植瘤体短径(W)、长径(L)，按公式V(mm3)＝L×W2/2计算肿瘤的体积，每两天测量肿瘤大小1次。
二、实验结果
实验组1与对照组1相比，肿瘤体积显著减小，分别为1.01±0.09mm3和0.48±0.14mm3，p<0.01。同时，新生血管抑制率显著性增加，实验组1为1.70±0.57，对照组1为0.48±0.14，p<0.01。此外，新生血管最大直径变化率也表现出显著性差异，实验组1为1.11±0.11，对照组1为0.38±0.37，p<0.01。
给药组相比对照组，模型的眼前房中肿瘤体积、新生血管数量以及新生血管直径均有非常显著的变化，说明该模型对药物具有高敏感性，可以判断药物对肿瘤的治疗效果。
实验结果表明，使用本发明肿瘤组织眼前房药敏模型可以用于快速筛选药物，以寻找肿瘤治疗的最佳药物。
实验例2、本发明实施例3小鼠模型药敏性能验证
一、实验方法
(一)实验分组
通过眼前房活体成像结果确定，实施例3的甲状腺乳头状癌类器官眼前房药敏模型移植物内形成新生血管，造模成功。下述进行药物治疗验证其药物敏感性。
将实施例2建模成功小鼠随机分为2组，每组8只，给药方案如下：
对照组2：将0.2ml的PBS溶液灌胃给予小鼠，每日一次，连续处理14天。该组小鼠未接受任何药物治疗。
实验组2：将伦伐替尼以10mg/kg的剂量溶于0.2ml的PBS溶液中，对小鼠进行灌胃处理，每日一次，连续进行14天。
(二)活体成像方法检测新生血管情况
14天后，对对照组2和实验组2进行活体成像检测(活体成像方法同实施例1)，得到对照组2和实验组2的肿瘤组织的背景反射光图以及眼前房血管的活体成像图，即FITC的绿色荧光图并将两者图像进行重叠，得到重叠图像(图4)。
通过观察新生血管以及肿瘤体积变化，验证药物治疗效果。对于新生血管，主要观察指标为新生血管出现时间，新生血管数量变化以及新生血管直径变化；针对肿瘤体积观察，主要通过莱卡多功能光谱型活体显微成像系统测量移植瘤体短径(W)、长径(L)，按公式V(mm3)＝L×W2/2计算肿瘤的体积，每两天测量肿瘤大小1次。新生血管数量变化，计算新生血管抑制率。
二、实验结果
实验组2与对照组2相比，肿瘤体积显著减小，分别为1.04±0.21mm3和0.63±0.19mm3，p<0.01。同时，新生血管抑制率也出现显著性改变，实验组2为1.40±0.31，对照组2为0.67±0.19，p<0.01。此外，新生血管最大直径变化率也表现出显著性差异，实验组2为1.07±0.05，对照组2为0.57±0.40，p<0.01。这些结果表明，实验组2的药物治疗对肿瘤的生长和新生血管的形成具有显著抑制作用。
实验结果表明，给药组相比对照组，模型的眼前房中肿瘤体积、新生血管数量以及新生血管直径均有非常显著的变化，说明该模型对药物具有高敏感性，可以判断药物对肿瘤的治疗效果。
实验结果表明，使用本发明肿瘤类器官眼前房药敏模型可以用于快速筛选药物，以寻找肿瘤治疗的最佳药物。
本发明提供了一种体内肿瘤药敏动物模型的建模方法及其用途，该模型具有高敏感性，可以对药效进行动态无损评价，解决了药物筛选周期长和可靠性低等问题，为临床肿瘤治疗提供了新的指导模型。本发明不仅可以为医生提供立体的肿瘤形态和血管分布信息，有助于制定更为精准的治疗方案，还可以用于探索肿瘤干细胞直接或间接转化分新生血管的机制，寻找逆转血管转分化的关键靶点，为开发相关靶向药物提供体内模型支持，应用前景非常优良。

Claims (10)

1.一种构建肿瘤药敏动物模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)取肿瘤组织样本，得到组织标本；
b)将组织标本切块得到组织块，或者将组织标本消化为单细胞，培养得到肿瘤类器官；
c)将组织块或类器官移植到动物眼前房内，待眼前房移植物内出现新生血管，即可。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤组织包括肝癌组织，肺癌组织，结肠癌组织，胃癌组织，胰腺癌组织，甲状腺癌组织，头颈肿瘤组织，甲状旁腺瘤组织，肾上腺肿瘤组织，胆管细胞癌组织，乳腺癌组织。
3.如权利要求1或2所述的构建肿瘤药敏动物模型的方法，其特征在于，步骤b)中，所述组织块大小为(0.5-2)mm×(0.5-2)mm×(0.5-2)mm；移植量为1-3块。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，将组织块移植到动物眼前房内，经过3-5天后动物眼前房移植物内出现新生血管。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤b)中，肿瘤类器官的制备方法如下：
1)将组织标本剪成组织碎块，使用组织消化液消化肿瘤细胞组织，得到肿瘤组织单细胞；
2)使用基质胶重悬细胞，接种并培养，待类器官增殖密度达到50％以上后，收集。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，
步骤1)中组织消化液为终浓度为0.5mg/ml胶原酶XI和0.2mg/ml的DNA酶的AdvancedDMEM F12溶液；
步骤2)中采用培养类器官培养基为加入添加有1％vol/vol的青霉素及链霉素双抗溶液，1％vol/vol L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，10mmol/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液，2％vol/vol B27培养基补充剂，1％vol/vol N2培养基补充剂，1.25μmol/L N-乙酰-L-半胱氨酸，100ng/mL表皮细胞生长因子(EGF)，25ng/ml重组人R-spondin 1蛋白，100ng/mL成纤维细胞生长因子10(FGF10)，10mmol/L烟酰胺，和10.5μmol/L Y-27632小分子抑制剂的DMEM/F12溶液；
所述基质胶为Matrigel基质胶；培养条件为在37℃、5％CO2环境中进行培养。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，选取大小为(5-30)μm*(5-30)μm的类器官移植到动物眼前房；移植量1-3片类器官；移植类器官后，经过14-17天移植物内出现新生血管。
8.如权利要求1-7所述的方法，其特征在于，所述动物为小鼠、大鼠或兔子；优选为小鼠。
9.权利要求1～8所述的方法制备得到的动物模型。
10.权利要求9所述的动物模型在药物筛选、药物毒性试验或免疫治疗试验中用途。
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