CN115595308A - 一种用于肺癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于培养原代肺癌上皮细胞的原代细胞培养基，其含有MST1/2激酶抑制剂、ROCK激酶抑制剂、成纤维细胞生长因子7、B27添加剂和N2添加剂中的至少一种添加剂、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、白介素6、和TGFβI型受体抑制剂。本发明还涉及使用该原代细胞培养基的培养方法及其在药物疗效评估和筛选中的应用。该培养方法使用上述原代细胞培养基在包被有细胞外基质胶的培养器皿上培养原代细胞，使得原代细胞快速增殖。由本发明的原代细胞培养基和原代细胞培养方法得到的细胞模型，能够用于药物的疗效评估和筛选。

Description

一种用于肺癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体而言，涉及用于在体外培养或扩增原代肺癌上皮细胞的培养基及培养方法，还涉及培养得到的细胞在药物的疗效评估和筛选中的方法和应用。
背景技术
肺癌是目前世界上最常见的呼吸道肿瘤。世界范围内每年新增加的肺癌患者超过180万。肺癌作为临床中最常见的恶性肿瘤，其治疗方式主要为手术、化疗、放疗、分子靶向治疗以及免疫治疗等，其中最为常用的手段为手术、化疗和放疗，但其临床治疗方式的适宜人群存在局限性。近几年，在分子生物学的兴起与发展下，肿瘤药物治疗呈现多样化趋势，其中分子靶向药物因其针对性强、安全性高等优势成为肺癌临床治疗中研究的热点。但是临床上针对众多治疗方案，怎么选择适合病人的方案就尤为重要。尽管有基因检测作为指标，但是对于有些病人没有基因突变，或者有些病人即使有某种突变，但是针对该突变有多种靶向药物，这时确定治疗方案在临床上有一定的难度。除了基因测序，体外对肺癌病人样本进行原代细胞培养已经成为未来体外预测疗效和指导临床用药的重要手段，但是体外快速获得肺癌原代细胞一直是亟待解决的技术问题。
功能性测试是指在体外对抗肿瘤药物在癌症患者细胞上的敏感性进行检测的方法。应用这一方法的关键在于开发生长周期短且能够代表肺癌患者自身生物学特性的肿瘤细胞模型。另外，所述细胞模型应操作便捷，能快速高效地预测临床用药的疗效，从而及时给予癌症患者精准用药指导。然而，取自癌症患者的原代肿瘤细胞在体外建立细胞模型的成功率往往很低，生长周期长，并存在成纤维细胞等间质细胞过度增殖等问题，制约着这一领域的发展。目前有两种培养原代上皮细胞/干细胞的技术在肿瘤细胞功能性测试应用领域发展得相对成熟。一种是使用经辐射的饲养细胞和ROCK激酶抑制剂Y27632来促进原代上皮细胞的生长以考察个体患者的药物敏感性的技术，即细胞条件重编程技术(Liu等，Am JPathol，180：599-607，2012)。另一种技术是体外3D培养成体干细胞从而获得类似于组织器官的类器官技术(Hans Clevers等，Cell，11，172(1-2)：373-386，2018)。
然而，这两种技术都存在一定的局限性。细胞重编程技术是一种将患者自体原代上皮细胞与鼠源性饲养细胞共培养的技术。在对患者原代细胞进行药物敏感性测试时，这些鼠源性细胞的存在会干扰患者自体原代细胞的药物敏感性检测结果；但如果撤除鼠源性饲养细胞，病人自体原代细胞就脱离了重编程环境，细胞的增殖速率和细胞内信号通路会发生明显的改变(Liu等，Am J Pathol，183(6)：1862-1870，2013；Liu等，Cell Death Dis.，9(7)：750，2018)，从而使患者自体原代细胞对药物的响应结果受到较大影响。类器官技术是将患者自体原代上皮细胞包埋在细胞外基质内进行体外三维立体培养的技术，该技术无需饲养细胞，因此不存在鼠源性饲养细胞的干扰问题。但是类器官技术的培养基内需添加多种特定的生长因子(如Wnt蛋白和R-spondin家族蛋白)，成本昂贵，不适于普及到临床进行大规模应用。另外，类器官在整个培养过程中均需将细胞包埋在细胞外基质胶中，其细胞接种、传代和药物敏感性测试的铺板步骤相较于2D培养操作繁琐费时，且该技术所形成的类器官大小尺寸不好控制，易出现部分类器官生长过大而导致内部发生坏死的情况。因此，类器官技术相较于2D培养技术可操作性和适用性不强，需要专业技术人员操作，不适合大规模广泛应用于临床体外药物敏感性检测(Nick Barker，Nat Cell Biol，18(3)：246-54，2016)。
鉴于以上技术的局限性，临床上需要开发一种原代肺癌上皮细胞培养技术，其培养周期短，成本可控，操作便捷，不受外源性细胞干扰。在将该技术应用于构建原代肺癌肿瘤细胞模型时，所培养的肺癌肿瘤细胞能代表肺癌患者自身的生物学特性。通过体外评估抗肿瘤药物在不同癌症患者个体所衍生的细胞模型上的敏感性，来提高临床上抗肿瘤药物的响应率，减少不合适的药物给患者造成的痛苦及医疗资源的浪费。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种用于培养原代肺癌上皮细胞的培养基以及使用该培养基的原代肺癌上皮细胞的培养方法。采用本发明的原代肺癌上皮细胞培养基和培养方法进行细胞培养，能够实现体外培养周期短、成本可控、操作便捷并不受外源性细胞干扰的目的。在该技术应用于构建原代肺癌肿瘤细胞模型时，能够获得具有肺癌患者自身生物学特性的原代肺癌肿瘤细胞，并能够应用于新药筛选和体外药物敏感性检测。
本发明的一个方面在于提供一种用于培养原代肺癌上皮细胞的原代细胞培养基，其含有MST1/2激酶抑制剂；选自Y27632、法舒地尔、和H-1152中的至少一种的ROCK激酶抑制剂；成纤维细胞生长因子7(FGF7)；B27添加剂和N2添加剂中的至少一种添加剂；肝细胞生长因子(HGF)；胰岛素样生长因子1(IGF-1)；白介素6(IL-6)；选自A83-01、SB431542、Repsox、SB505124、SB525334、SD208、LY36494、和SJN2511中的至少一种的TGFβI型受体抑制剂，所述MST1/2激酶抑制剂包括式(I)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，
Figure BDA0003153482810000031
其中，
R1选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C2-C6螺环烷基、以及任选地被1-2个独立地R6取代的芳基(例如苯基和萘基等)、芳基C1-C6烷基(例如苯甲基等)和杂芳基(例如噻吩基等)；
R2和R3各自独立地选自C1-C6烷基，优选C1-C3烷基，更优选甲基；
R4和R5各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C1-C6烷基羟基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、和C3-C6杂环基C1-C6烷基(所述杂环基选自例如哌啶基、四氢吡喃基等)；
R6选自卤素(优选氟和氯，更优选氟)、C1-C6烷基(优选甲基)、C1-C6烷氧基(优选甲氧基)、和C1-C6卤代烷基(优选三氟甲基)。
优选的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂包括式(Ia)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，
Figure BDA0003153482810000041
其中，
R1选自C1-C6烷基、任选地被1-2个独立地R6取代的苯基、任选地被1-2个独立地R6取代的噻吩基、和任选地被1-2个独立地R6取代的苯甲基，R1更优选为任选地被1-2个独立地R6取代的苯基；
R5选自氢、C1-C6烷基、和C3-C6环烷基，R5更优选为氢；
R6各自独立地选自卤素、C1-C6烷基、和C1-C6卤代烷基，R6更优选为氟、甲基或三氟甲基。
优选地，所述MST1/2抑制剂是选自以下化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物中的至少一种。
Figure BDA0003153482810000042
Figure BDA0003153482810000051
Figure BDA0003153482810000061
Figure BDA0003153482810000071
Figure BDA0003153482810000081
最优选地，本发明的MST1/2激酶抑制剂为化合物1。
在本发明的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂在培养基中的含量通常为2.5μM～10μM，优选为5μM～7.5μM。
在又一实施方式中，ROCK激酶抑制剂优选地为Y27632。另外优选的，ROCK激酶抑制剂在培养基中的含量通常为2.5μM～15μM，优选为5μM～15μM，更优选为10μM～12.5μM。
在优选的实施方式中，所述成纤维细胞生长因子7的含量为5ng/ml～160ng/ml，更优选为10ng/ml～80ng/ml，进一步优选为20ng/ml～40ng/ml；所述B27添加剂或N2添加剂在培养基中的体积浓度为1:25～1:800，更优选为1:25～1:200，进一步优选1:50～1:100；所述肝细胞生长因子的含量为5ng/ml～160ng/ml，更优选为20ng/ml～80ng/ml；所述胰岛素样生长因子1的含量为5ng/ml～160ng/ml，更优选为20ng/ml～80ng/ml；所述白介素6的含量为2.5ng/ml～40ng/ml，更优选为5ng/ml～40ng/ml；所述TGFβI型受体抑制剂优选A83-01，且TGFβI型受体抑制剂的含量为62.5nM～500nM，优选为250nM～500nM。
本发明的培养基配方还含有选自DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI-1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、两性霉素B和Primocin中的一种或多种的抗生素。在一些的实施方式中，初始培养基优选为DMEM/F12，抗生素优选为Primocin。在进一步优选的实施方式中，Primocin在培养基中的含量为25～400μg/mL，优选为50～200μg/mL。
本发明的培养基配方成分与细胞条件重编程培养基和肺癌上皮细胞类器官培养基成分相比，添加了MST1/2激酶抑制剂，且不包含血清、牛垂体提取物等不确定成分，也不包含Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、BMP抑制剂等类器官培养所必须的龛因子，并且不包含烟酰胺(Nicotinamide)和N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine)，从而大大降低了培养基的成本，简化了配制培养基的操作流程，实现了成本可控和操作便捷的原代肺癌上皮细胞的体外培养。
本发明中，原代肺癌上皮细胞可以为肺癌肿瘤细胞、正常肺癌上皮细胞、肺癌上皮干细胞。
本发明的一个方面在于提供一种原代肺癌上皮细胞的培养方法，其包括以下步骤：
(1)按上述配方配制本发明的原代细胞培养基。
(2)用细胞外基质胶稀释液包被培养器皿。
具体地，该细胞外基质胶使用低生长因子型细胞外基质胶，例如，可采用市售的Matrigel(购自康宁公司)或BME(购自Trevigen公司)。更具体而言，用无血清的培养基稀释细胞外基质胶，培养基可以是DMEM/F12(购自康宁公司)。细胞外基质胶的稀释比例为1:50-1:400，优选为1:100-1:200。包被方法为将稀释后的细胞外基质胶加入培养器皿内，使其完全覆盖培养器皿底部，静置包被30分钟以上，优选在37℃条件下静置包被，优选包被时间为30～60分钟。包被结束后吸弃多余的细胞外基质胶稀释液，培养器皿备用。
(3)从肺癌组织分离得到原代肺癌上皮细胞。
原代肺癌上皮细胞例如可以来源于肺癌手术样本和活检穿刺样本。肺癌组织样本例如来源于进行过说明并获得同意的肺癌肿瘤患者手术切除癌组织样本，活检穿刺样本经由超声引导采集自肺内病灶。在患者手术切除或活检后的半小时内进行上述组织样本的收集。更具体而言，在无菌环境下，切取非坏死部位的组织样本，其体积在5mm3以上，将其置于预冷的10-15mL DMEM/F12培养基中，培养基盛在塑料无菌带盖离心管内，冰上运输至实验室；其中，DMEM/F12培养基中含有本发明的MST1/2激酶抑制剂(例如化合物1)和0.2-0.4体积％Primocin(以下简称组织运输液)。当使用本发明的MST1/2激酶抑制剂时，浓度范围为0.3μM～10μM，优选为2μM～5μM，更优选为3μM；当使用Primocin时，浓度范围为25～400μg/mL，优选为50～200μg/mL，更优选为100μg/mL。
在生物安全柜内，将组织样本转移至细胞培养皿内，用组织运输液润洗组织样本，将组织样本表面的血细胞清洗掉。将润洗后的组织样本转移至另一个新的培养皿内，加入1-3mL组织运输液，用无菌手术刀片和手术镊将组织样本分割为体积小于3mm3的组织碎块。
将组织样本碎块转移至离心管内，用台式离心机(Sigma公司3-18K)以1000～3000转/分钟离心3～5分钟；弃上清，按1:1比例加入组织运输液和组织消化液(使用量约为每10mg组织使用5mL组织消化液，其中组织消化液的配制方法为：将1～2mg/mL胶原酶Ⅱ、1～2mg/mL胶原酶Ⅳ、50～100U/mL脱氧核糖核酸Ⅰ、0.5～1mg/mL透明质酸酶、0.1～0.5mg/mL氯化钙、5～10mg/mL牛血清白蛋白溶于体积比1:1的HBSS和RPMI-1640中)，标记样本编号，封口膜密封，以37℃、200～300转恒温摇床(知楚仪器ZQLY-180N)消化，每间隔1小时观察消化是否完成；若未见明显组织块即可终止消化，否则继续消化，直至消化充分，消化时间范围为4～8小时。消化完成后，细胞滤网(细胞筛孔径为例如70μm)过滤掉未消化的组织团块，滤网上的组织团块用组织运输液冲洗，将残留细胞冲入离心管中，用台式离心机以1000～3000转/分钟离心3～5分钟。弃上清，观察剩余细胞团是否含有血细胞，若有血细胞，加3～5mL血细胞裂解液(购自Sigma公司)，混匀，4℃裂解10～20分钟，5分钟摇晃混匀一次，裂解结束后取出，以1000～3000转/分钟离心3～5分钟。弃上清，加入本发明的原代细胞培养基重悬，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。
(4)在包被好的培养器皿内接种步骤(3)中分离得到的原代肺癌上皮细胞，并采用步骤(1)中的原代细胞培养基进行培养。
更具体而言，在多孔板的一个孔中按2×104～8×104个/cm2(例如4×104个/cm2)的密度接种原代肺癌肿瘤细胞，加入适量如2-3mL原代上皮细胞培养基，在例如37℃、5％CO2的条件下于细胞培养箱中培养8-16天，期间每4天换成新鲜的原代细胞培养基，在原代肺癌上皮细胞长至占多孔板底面积80％～90％左右的细胞密度时进行消化传代。
该接种步骤无需使用饲养细胞，相比细胞条件重编程技术，免去了培养和辐照饲养细胞的操作步骤。该步骤相比类器官技术，也无需在冰上将原代细胞和基质胶混匀后形成胶滴，并等待胶滴凝固后加入培养基，预先包被好的培养器皿可直接用于原代细胞接种。此外，包被培养器皿仅需少量稀释后的细胞外基质胶，相比类器官技术，节约了价格昂贵的细胞外基质胶的使用量，也简化了操作步骤。
任选地，接种后的原代肺癌上皮细胞在培养8～16天后，当培养容器内形成的细胞克隆汇合达到底面积80％，弃去上清，加入0.5～2mL 0.05％胰酶(购自Thermo Fisher公司)进行细胞消化，室温下孵育5～20分钟；然后用含有例如5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液1～4mL重悬消化处理后的细胞，以1000～3000转/分钟离心3～5分钟，使用本发明的原代细胞培养基将消化后的单细胞重悬，将所得到的细胞悬液置入包被有细胞外基质胶的T25细胞培养瓶中继续扩大培养。T25细胞培养瓶的包被操作同步骤(2)。
扩增的肺癌上皮细胞呈2D生长，避免了类器官技术扩增出现的类器官大小不均一和生长过大的类器官出现内部坏死等情况。
另一方面，由本发明的原代肺癌上皮细胞的培养方法培养得到的肺癌上皮细胞、特别是肺癌肿瘤细胞，能够用于药物的疗效评估和筛选，所述方法包括以下步骤：
(1)获取原代肺癌上皮细胞，特别优选获取源自肺癌患者的癌组织样本或活检癌组织样本，分离得到原代肺癌上皮细胞，根据如上所述的原代肺癌上皮细胞的培养方法培养并扩增原代肺癌上皮细胞(特别是原代肺癌肿瘤细胞)达至少105数量级、优选至少106数量级的细胞数目。
(2)选定需要检测的药物。
(3)药物以其最大血浆浓度Cmax为参考，以2-5倍Cmax为起始浓度，稀释多个不同的药物浓度梯度，例如5-10个、优选6-8个药物浓度梯度。
(4)将步骤(1)中培养得到的肺癌上皮细胞消化成单细胞悬液，用流式图像计数仪进行计数，用本发明的原代细胞培养基将单细胞悬液稀释，按每孔2000-4000个的密度将稀释后的细胞悬液均匀地加入到多孔板内，例如每孔50μL细胞稀释液，并进行过夜贴壁。
该步骤避免了细胞重编程技术出现的由于饲养细胞的存在而干扰原代细胞计数和后续的原代细胞活力检测的问题，也无需像类器官技术一样，在冰上将细胞悬液与基质胶混合包埋再铺板的繁琐步骤，从而大大简化了操作流程，增强了技术的可操作性和实用性。由于接种的细胞为单细胞悬液而不是像类器官一样的3D结构，所以该技术与类器官技术相比，铺板的细胞数更加均一，铺板产生的孔间细胞数差异小，也更适合进行后续的高通量药物筛选操作。
(5)采用高通量自动化工作站，对步骤(4)中得到的贴壁细胞添加梯度稀释后的所选定的传统化疗药物、靶向药物、抗体药物或几种药物组合等候选药物，进行处理。
(6)加药处理数小时后，例如72小时后，采用Cell-Titer Glo发光法细胞活力检测试剂盒(购自Promega公司)检测肺癌上皮细胞的存活率，进行药物活性筛选。
具体而言，向每孔加入例如10μL Cell Titer-Glo试剂(购自Promega公司)，均匀震荡后，用荧光酶标仪测量各孔的化学发光强度，根据测得的数值，以药物浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，应用GraphPad Prism软件绘制药物量-效曲线，计算各个药物对所测试细胞的增殖的抑制强度。
在本发明的原代肺癌肿瘤细胞在药物筛选和体外药物敏感性检测的应用中，由于不是细胞共培养体系，所以不会出现细胞重编程技术中的饲养细胞干扰检测结果的现象。由于细胞呈2D生长，与药物的作用时间也比类器官技术的药物检测时间短(类器官技术的平均给药时间为6天)。
本发明的有益效果还包括：
(1)提高原代肺癌上皮细胞培养的成功率，成功率达到80％以上；
(2)保证体外原代培养的肺癌上皮细胞能够保持原代细胞来源病人的病理表型和异质性；
(3)所培养的原代肺癌上皮细胞不受成纤维细胞干扰，能得到纯化的肺癌上皮细胞；
(4)培养基成分不含血清，所以不受不同批次血清质量和数量的影响；
(5)扩增肺癌上皮细胞效率高，只要有104级别的细胞数量就可在两周左右时间内成功扩增出106数量级的肺癌上皮细胞，扩增出的肺癌上皮细胞还可以连续传代；
(6)传代步骤无需冰上操作和解离基质胶，10-15分钟内即可完成细胞的消化传代；
(7)培养成本可控：原代肺癌细胞培养基无需加入价格昂贵的Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、BMP抑制剂等因子，是对已有原代肺癌上皮细胞类器官培养基的简化和改进，细胞接种也无需使用浓度较高的细胞外基质与原代细胞混合形成胶滴，而只需使用少量细胞外基质胶制备的稀释液，节约了成本较高的细胞外基质的用量；
(8)操作便捷，该技术相比条件重编程技术，无需培养饲养细胞并对饲养细胞进行辐射，避免了不同批次饲养细胞的质量和数量影响原代细胞培养效率的问题，药物筛选的铺板和检测的对象只有原代肺癌上皮细胞，而不受细胞条件重编程技术所需的共培养体系中饲养细胞的干扰；相比类器官技术，本发明采用的细胞外基质胶的包被方法，培养器皿可预先准备，无需像类器官技术一样将细胞包埋于基质胶内，所述技术操作步骤简便易行；
(9)所述技术培养获得的肺癌上皮细胞数量大，均一化程度高，适合高通量筛选新候选化合物，并为病人提供高通量药物体外敏感性功能测试。
采用本实施方式的细胞培养基，可培养来源于包括人的或其他哺乳动物的肺癌上皮细胞，包括肺癌肿瘤细胞、正常肺上皮细胞、肺癌上皮干细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织。同时本发明技术的培养基还可以用于开发体外肺癌原代细胞扩增培养的试剂盒。
另外，通过本实施方式的培养方法获得的细胞可应用于再生医疗、肺癌上皮细胞的基础医学研究、药物应答的筛选、以及来源于肺癌疾病的新药研发等。
附图说明
图1A-1D为显示培养基中不同因子对肺癌原代细胞增殖的影响的图。
图2是显示培养基中不同因子递增对肺癌原代细胞增殖的影响的图。
图3A-3H是显示各添加因子的浓度对肺癌原代细胞增殖的影响的图。
图4A和4B是将从1例肺癌临床组织样本分离得到的细胞采用本发明的培养基FLM分别培养至第4天和第12天的肺癌肿瘤细胞在倒置显微镜下拍摄的照片。
图5A-5D是从1例肺癌手术切除样本分离得到的细胞采用四种不同培养基条件下培养12天后在倒置显微镜下拍摄的照片。
图6是从9例肺癌手术切除样本分离得到的细胞在四种不同培养基条件下培养16天后得到细胞增殖效果的比较图。
图7是将从1例肺癌临床组织样本分离得到的细胞分别采用四种不同培养基条件培养所获得的细胞生长曲线对比图。
图8是从1例肺癌手术切除样本分离得到的细胞采用本发明的培养基FLM培养获得的肺癌肿瘤细胞的免疫组化结果对比图。
图9是将从1例肺癌临床组织样本分离得到的细胞分别在本发明的培养基FLM以及删减不同组分后得到的培养基条件下培养的细胞的生长曲线对比图。
图10是将从1例肺癌临床组织样本分离得到的细胞分别在本发明的培养基FLM以及删减不同组分后得到的培养基条件下培养8天后，分别收集细胞计数后的比较图。
图11A和11B分别表示从两个不同的肺癌患者的手术切除癌组织样本采用本发明的培养基FLM培养的原代肺癌肿瘤细胞对不同化疗药物和靶向药物的剂量-效应曲线。
具体实施方式
本说明书中，上皮细胞包括从上皮组织获取的已分化的上皮细胞及上皮干细胞。“上皮干细胞”是指具有长期的自我更新能力和向上皮细胞分化的细胞，是指来源于上皮组织的干细胞。作为上皮组织，可例举例如角膜、口腔粘膜、皮肤、结膜、膀胱、肾小管、肾脏、消化器官(食道、胃、十二指肠、小肠(包括空肠及回肠)、大肠(包括结肠))、肝脏、胰脏、乳腺、唾液腺、泪腺、前列腺、毛根、气管、肺等。其中，本实施方式的细胞培养基较好是用于培养来源于肺上皮细胞的培养基。
此外，本说明书中，“上皮肿瘤细胞”是指来源于上述的上皮组织的细胞肿瘤化而得的细胞。
本说明书中，“类器官”是指通过使细胞在受控的空间内高密度地自发组织和聚集而成的三维立体的、类似于器官的细胞组织体。
[MST1/2激酶抑制剂的制备实施例]
本说明书中，MST1/2激酶抑制剂是指直接或间接地对MST1/2信号传导进行负调节的任意的抑制剂。一般来说，MST1/2激酶抑制剂例如与MST1/2激酶结合并降低其活性。由于MST1和MST2的结构具有相似性，MST1/2激酶抑制剂也可以是例如与MST1或MST2结合并降低其活性的化合物。
1.MST1/2激酶抑制剂化合物1的制备
4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯 磺酰胺1
Figure BDA0003153482810000161
2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A2)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸(2.0克)后加入甲醇(30毫升)，随后冰浴下滴加二氯亚砜(1.2毫升)。反应体系在85℃反应过夜。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得白色固体，直接用于下一步。
2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A3)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2克)后加入丙酮(30毫升)和碳酸钾(2.2克)，然后用冰盐浴使体系冷却到-10℃，接着缓慢加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶(3.1克)的丙酮溶液。反应体系在室温搅拌过夜。反应结束后，过滤，滤液在减压下除去溶剂，残留物经加压硅胶柱层析提纯后得化合物A3。LC/MS：M+H 359.0。
2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A4)：在圆底烧瓶中加入2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2.5克)后加入醋酸(50毫升)和铁粉(3.9克)。反应体系在60℃搅拌两小时。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得物用饱和碳酸氢钠中和至碱性。乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚洗涤后得化合物A4。LC/MS：M+H 297.0。
2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A5)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(2克)和N,N-二甲基乙酰胺(10毫升)，冷却至-35℃，加入碘甲烷(0.9毫升)，随后加入氢化钠(615毫克)，反应体系继续搅拌两小时。反应结束后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚洗涤后得化合物A5。LC/MS：M+H325.0。
4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(1)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(100毫克)、磺胺(53毫克)、对甲苯磺酸(53毫克)和仲丁醇(5毫升)。反应体系在120℃搅拌过夜。反应结束后，过滤，甲醇和乙醚洗涤得化合物1。LC/MS：M+H 461.1。
2.本发明的其他MST1/2抑制剂化合物的制备
本发明的其他MST1/2抑制剂化合物按照与化合物1类似的方法合成，其结构及质谱数据如下表所示。
Figure BDA0003153482810000171
Figure BDA0003153482810000181
Figure BDA0003153482810000191
Figure BDA0003153482810000201
Figure BDA0003153482810000211
[实施例1]
人原代肺癌上皮细胞的分离
肺癌组织样本来源于进行过说明并获得同意的肺癌肿瘤患者手术切除癌组织样本。下面以其中一例样本(编号B4)进行说明。
在患者手术切除或活检后的半小时内进行上述组织样本的收集。更具体而言，在无菌环境下，切取非坏死部位的组织样本，其体积在0.5cm3以上，将其置于预冷的4mL组织运输液(具体配制见表1)中，运输液盛在5mL塑料无菌带盖冻存管(购自广州洁特生物)内，冷链(0-10℃)运输至实验室。
表1组织运输液配方
组织运输液成分 供应商 终浓度
DMEM/F12 康宁 97.8体积％
Primocin Invivogen 0.2体积％(市售产品浓度50mg/ml)
化合物1 自制 3μM
表2组织消化液配方
组织消化液成分 供应商 终浓度
HBSS Gibco 50％(体积)
RPMI-1640 康宁 50％(体积)
胶原酶Ⅱ Sigma 2mg/mL
胶原酶Ⅳ Sigma 2mg/mL
脱氧核糖核酸Ⅰ Sigma 50U/mL
透明质酸酶 Sigma 0.5mg/mL
氯化钙 上海生工 0.33mg/mL
牛血清白蛋白 上海生工 10mg/mL
在生物安全柜内，将组织样本(编号B4)转移至100mm细胞培养皿(购自NEST公司)内，用组织运输液润洗组织样本，将组织样本表面的残留的血液清洗掉，并剔除组织样本表面的脂肪等多余的组织。将润洗后的组织样本转移至另一个新的100mm培养皿内，加入2mL运输液，用无菌手术刀片和手术镊将组织样本分割为体积小于3mm3的组织碎块。
将组织样本碎块转移至15mL离心管内，用台式离心机(Sigma公司3-18K)以1500转/分钟离心4分钟；弃上清，按1:1比例加入组织运输液和组织消化液(使用量约为每10mg组织使用5mL组织消化液，具体配制见表2)，标记样本编号，封口膜密封，以37℃、300转恒温摇床(知楚仪器ZQLY-180N)消化，每间隔1小时观察消化是否完成。
消化完成后，70μm滤网过滤掉未消化的组织团块，滤网上的组织团块用组织运输液冲洗，将残留细胞冲入离心管中，1500转/分钟离心4分钟。
弃上清，观察剩余细胞团是否含有血细胞，若有血细胞，加3mL血细胞裂解液(购自Sigma公司)，混匀，4℃裂解15分钟，5分钟摇晃混匀一次，裂解结束后取出，以1500转/分钟离心4分钟。弃上清，得到消化分离后的肺癌原代细胞，加入基础培养基(BM)重悬，其中，基础培养基是由市售的DMEM/F-12培养基中加入0.2体积％Primocin(购自Invivogen公司，浓度为50mg/mL)，以得到100μg/mL的最终浓度。使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数为121万。
[实施例2]
原代肺癌上皮细胞培养基的优化
(1)不同因子的作用
将细胞外基质胶
Figure BDA0003153482810000231
(BD生物科技公司制)使用无血清DMEM/F12培养基按1:100比例稀释，配制成细胞外基质稀释液，在48孔培养板内加入500μl/孔的细胞外基质稀释液使其完全覆盖培养板孔的底部。在37℃培养箱内静置1小时。1小时后，移除细胞外基质稀释液，得到包被有Matrigel的培养板。
配制基础培养基(缩写为BM)：向市售的DMEM/F-12培养基中加入0.2体积％Primocin(购自Invivogen公司，浓度为50mg/mL)，以得到100μg/mL的最终浓度，配制得到BM。
接着，在基础培养基(BM)中分别加入不同种类和不同浓度的添加剂因子(表3)，配制成含有不同添加成分的肺癌上皮细胞培养基。
表3不同组分培养基的配制(浓度为终浓度)
Figure BDA0003153482810000232
Figure BDA0003153482810000241
将不同成分的培养基按500μl/孔体积加入至包被有细胞外基质胶(Matrigel)的48孔板内。将按照实施例1相同方法从肺癌组织分离得到的肺癌肿瘤细胞(编号B5)以2×104个/cm2的细胞密度接种在Matrigel包被过的48孔培养板内，表面消毒后置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)，使相同数量的新鲜分离的肺癌肿瘤细胞(编号B5)在不同的培养基配方条件下进行培养。培养开始后每4天进行一次培养基的更换。培养12天后，进行细胞计数。其中，作为实验对照，使用未添加任何添加剂的基础培养基(BM)。将结果示于图1A-D。图中纵坐标表示不同培养基培养之后得到的细胞数与基础培养基BM培养之后得到细胞数的比值。如图所示，在BM基础上加入表3中不同浓度的不同因子对细胞增殖产生不同的作用。其中，在特定浓度范围下，B27添加剂、N2添加剂、成纤维细胞生长因子7、白介素6、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、化合物1、Y27632和A83-01均对细胞增殖有一定的促进作用。
(3)培养基中不同因子递增对本专利方法获得的肺癌原代细胞增殖的影响
将细胞外基质胶
Figure BDA0003153482810000242
(购自BD生物科技公司)使用无血清DMEM/F12培养基按1:100比例稀释，配制成细胞外基质稀释液。在48孔培养板内加入500μl/孔的细胞外基质稀释液使其完全覆盖培养板孔的底部。在37℃培养箱内静置1小时。1小时后，移除细胞外基质稀释液，得到包被有Matrigel的培养板。
向基础培养基BM中分别依次递加不同小分子、添加剂以及生长因子(表4)，配制成含有不同添加成分的肺癌上皮细胞培养基。
表4不同组分培养基的配制(浓度为终浓度)
培养基NO. 组分
NO.1 BM+10μM Y27632
NO.2 NO.1+5μM化合物1
NO.3 NO.2+1:50B27添加剂
NO.4 NO.3+40ng/mL成纤维细胞生长因子7
NO.5 NO.4+40ng/mL肝细胞生长因子
NO.6 NO.5+40ng/mL胰岛素样生长因子1
NO.7 NO.6+500nM A83-01
NO.8 NO.7+20ng/mL白介素6
将不同成分的培养基按500μl/孔体积加入至包被有细胞外基质胶(Matrigel)的48孔板内，同时将BM培养基作为实验对照。将按照实施例1的方法从肺癌组织分离得到的肺癌肿瘤细胞(编号B5)以2×104个/cm2的细胞密度接种在Matrigel包被过的48孔培养板内，表面消毒后置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)，使相同数量的新鲜分离的肺癌肿瘤细胞(编号B5)在不同的培养基配方条件下进行培养。培养10天后，进行细胞计数。将实验结果示于图2。如图所示，确定NO.8为本专利最优选的培养基用于培养扩增肺癌原代细胞(下文缩写为FLM)。
(4)所添加因子的不同浓度对本专利获得的肺癌原代细胞的增殖作用
将细胞外基质胶
Figure BDA0003153482810000251
(BD生物科技公司制)使用无血清DMEM/F12培养基按1:100比例稀释，配制成细胞外基质稀释液，在48孔培养板内加入200μl/孔的细胞外基质稀释液使其完全覆盖培养板孔的底部。在37℃培养箱内静置1小时。1小时后，移除细胞外基质稀释液，得到包被有Matrigel的培养板。
配制本发明的原代肺癌上皮细胞培养基(缩写为FLM)：向基础培养基(BM)中以最终浓度40ng/ml的条件添加成纤维细胞生长因子7(FGF7)，以最终浓度40ng/ml的条件添加肝细胞生长因子(HGF)，以最终浓度40ng/ml的条件添加胰岛素样生长因子1(IGF-1)，以最终浓度1:50体积比的条件添加B27添加剂，以最终浓度5μM的条件添加化合物1，以最终浓度10μM的条件添加Y27632，以最终浓度500nM的条件添加TGFβ1抑制剂A83-01，以最终浓度20ng/mL的条件添加白介素6(IL-6)，制备原代肺癌上皮细胞培养基。
使用与实施例1同样的方法从肺癌患者的癌组织(编号B6)中分离获得癌组织来源的肺癌上皮细胞。接着，将癌组织来源的肺癌上皮细胞用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。然后按4×104个/cm2密度接种至
Figure BDA0003153482810000261
(购自BD生物科技公司)包被处理过的48孔板内。向48孔板中添加2mL制备好的原代肺癌上皮细胞培养基FLM，置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)中进行培养。在培养板内细胞生长达到底面积的80％左右时，弃去48孔板内的培养基上清，加入500μL 0.05％胰酶(购自Gibco公司)对细胞进行消化，37℃下孵育10分钟，直至显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)下能观察到细胞已经消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清(购自依科赛公司)、100U/mL青霉素(购自康宁公司)和100μg/mL链霉素(购自康宁公司)的DMEM/F12培养液1mL终止消化，并收集至15mL离心管内，1500rpm离心4分钟后，弃上清。使用基础培养基BM重悬离心后的细胞沉淀，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。所得细胞用于以下培养实验。
接着，配制以下8种配方培养基进行实验：
配方1：培养基FLM组分中不含B27添加剂；
配方2：培养基FLM组分中不含成纤维细胞生长因子7；
配方3：培养基FLM组分中不含胰岛素样生长因子1；
配方4：培养基FLM组分中不含肝细胞生长因子；
配方5：培养基FLM组分中不含Y27632；
配方6：培养基FLM组分中不含化合物1；
配方7：培养基FLM组分中不含A83-01；
配方8：培养基FLM组分中不含白介素6。
分别使用上述配方1～8来稀释上述消化后的细胞悬液，按照每孔1万细胞，250微升体积种入48孔板中。
在使用配方1的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的B27添加剂每孔250微升，B27添加剂的终浓度分别为1:800、1:400、1:200、1:100、1:50、1:25；并使用配方1的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方2的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的成纤维细胞生长因子7每孔250微升，成纤维细胞生长因子7的终浓度分别为160ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL；并使用配方2的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方3的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的胰岛素样生长因子1每孔250微升，胰岛素样生长因子1的终浓度分别为160ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL；并使用配方3的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方4的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的肝细胞生长因子每孔250微升，肝细胞生长因子的终浓度分别为160ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL；并使用配方4的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方5的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的Y27632每孔250微升，Y27632的终浓度分别为20μM、15μM、12.5μM、10μM、5μM、2.5μM；并使用配方5的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方6的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的化合物1每孔250微升，化合物1的终浓度分别为20μM、10μM、7.5μM、5μM、2.5μM、1.25μM；并使用配方6的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方7的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的A83-01每孔250微升，A83-01的终浓度分别为2000nM、1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM；并使用配方7的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方8的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的白介素6每孔250微升，白介素6的终浓度分别为80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL；并使用配方8的培养基设置对照孔(BC)。
待细胞扩增至48孔的85％左右消化计数，分别参比对照孔(BC)细胞数计算比值，将结果分别示于图3A～3H。图3A～图3H中，比值为使用各培养基培养一代得到的细胞数与对应的对照孔培养一代得到的细胞数的比。比值大于1说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果优于对照孔培养基，比值小于1，则说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果较对照孔培养基促增殖效果弱。
根据图3A～3H的结果，B27添加剂在培养基中的体积浓度优选为1:25～1:800，更优选1:25～1:200，进一步优选1:50～1:100；成纤维细胞生长因子7的含量优选为5ng/ml～160ng/ml，更优选10ng/ml～80ng/ml，进一步优选为20ng/ml～40ng/ml；胰岛素样生长因子1的含量优选为5ng/ml～160ng/ml，更优选为20ng/ml～80ng/ml；肝细胞生长因子的含量优选为5ng/ml～160ng/ml，更优选20ng/ml～80ng/ml；Y27632的含量优选为2.5μM～15μM，更优选为5μM～15μM，进一步优选为10μM～12.5μM；化合物1的含量优选为2.5μM～10μM，更优选为5μM～7.5μM；A83-01的含量优选为62.5nM～500nM，更优选为250nM～500nM；白介素6的含量优选为2.5ng/ml～40ng/ml，更优选为5ng/ml～40ng/ml。
[实施例3]
肺癌组织来源的原代肺癌肿瘤细胞的培养
使用与实施例1同样的方法从肺癌患者的癌组织(样本编号B7)中分离获得癌组织来源的肺癌上皮细胞。接着，将癌组织来源的肺癌上皮细胞用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。然后按4×104个/cm2密度接种至
Figure BDA0003153482810000281
(购自BD生物科技公司)包被处理过的12孔板内。向12孔板中添加2mL制备好的原代肺癌上皮细胞培养基FLM，置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)中进行培养。
图4A是本实施例按4×104个/cm2密度接种至Matrigel包被处理过的12孔板，自接种开始后培养至第4天的镜下照片(40倍倒置相差显微镜拍照)。镜下观察可见，所培养的癌组织来源的原代肺癌肿瘤细胞纯度较高，不含有成纤维细胞。图4B是本实施例自接种后培养第12天的镜下照片(40倍倒置相差显微镜拍照)。从图4A和4B两张图可以看出，分离后得到肺癌原代细胞在体外培养4天在镜下就可以看到明显的克隆形成，并且经过12天的扩增，细胞数目得到显著的扩增，提示本发明技术是一种高效的体外扩增肺癌上皮细胞的技术。
[实施例4]
不同培养基对肺癌组织来源的原代肺癌肿瘤细胞的促增殖效果
(1)不同培养基对初代原代细胞克隆形成的影响和增殖效果的比较
使用与实施例2同样的方法制备原代肺癌上皮细胞培养基FLM，和作为对照的基础培养基BM。另外制备细胞条件重编程培养基FM作为另一对照例，配制步骤参见(Liu等，NatProtoc.，12(2):439-451，2017)，培养基配方见表5。此外，作为另一对照例，自stem cell公司购买商品化培养基EpiMCultTM Plus Medium，以下也称“EpiM培养基”，培养基配方见表6。
表5细胞条件重编程培养基(FM)成分
培养基成分 供应商 终浓度
DMEM培养基 Corning 65体积％
胎牛血清 Gibico 10体积％
Ham’s F12营养液 Gibico 25体积％
氢化可的松 Sigma-Aldrich 25ng/ml
表皮生长因子 R&D 0.125ng/ml
胰岛素 Sigma-Aldrich 5μg/ml
两性霉素B Sigma-Aldrich 250ng/ml
庆大霉素 Gibico 10μg/ml
霍乱毒素 Sigma-Aldrich 0.1nM
Y27632 Enzo 10μM
表6商品化培养基EpiMCultTM Plus Medium(EpiM)成分
Figure BDA0003153482810000291
Figure BDA0003153482810000301
使用与实施例1同样的方法获得肺癌组织来源的原代肺癌肿瘤细胞(编号B8)。接着，按照相同的密度(4×104个/cm2)分别在以下五种培养条件下培养：
A.本发明技术：按4×104个/cm2接种密度将原代肺癌肿瘤细胞接种至
Figure BDA0003153482810000302
((BD生物科技公司制)包被处理过的24孔板内，采用2mL的本发明的原代肺癌上皮细胞培养基FLM进行培养；
B.细胞条件重编程技术：按4×104个/cm2接种密度将原代肺癌肿瘤细胞接种至铺有受γ射线辐照过后的小鼠成纤维细胞系J2细胞(购自Kerafast公司)上，采用细胞条件重编程技术培养基FM在24孔板中进行培养(具体步骤参见Liu等，Am J Pathol，183(6):1862-1870，2013)；
C.按4×104个/cm2接种密度将原代肺癌肿瘤细胞接种至
Figure BDA0003153482810000303
((BD生物科技公司制)包被处理过的24孔板内，采用2mL的商品化培养基EpiM在24孔板中进行培养；
D.按4×104个/cm2接种密度将原代肺癌肿瘤细胞接种至
Figure BDA0003153482810000304
((BD生物科技公司制)包被处理过的24孔板内，采用2mL的基础培养基BM在24孔板中进行培养。
上述四种培养中，每4天对四种培养条件下培养的细胞进行换液。同时观察24孔板中各培养基培养下细胞形成克隆和细胞增殖状态，使用显微镜(Invitrogen公司EVOSM500)进行拍照记录细胞生长状况。
对于采用本发明技术培养的原代肺癌肿瘤细胞(编号B8)，分别在培养板内细胞生长达到底面积的80％左右时，弃去24孔板内的培养基上清，加入500μL 0.05％胰酶(购自GIBCO公司)对细胞进行消化，37℃下孵育10分钟，直至显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)下能观察到细胞已经消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液1mL终止消化，并收集至15mL离心管内，1500rpm离心4分钟后，弃上清。使用本发明的培养基重悬离心后的细胞沉淀，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数为46.4万。另三种培养条件下培养的细胞采用如上述同样的操作方式进行消化和计数，使用培养基FM、EpiM和BM培养得到的细胞总数分别是35万、11万和6.8万。
图5A-5D的细胞照片为编号B8的样本在四种不同的培养条件下培养至第12天时的镜下照片(40倍倒置相差显微镜下)：其中图5A为B8使用基础培养基BM培养至第12天时的镜下照片；图5B为B8使用本专利培养基FLM培养至第12天时的镜下照片；图5C为B8使用商品化培养基EpiM培养至第12天时的镜下照片；图5D为B8使用条件重编程培养基FM培养至第12天时的镜下照片。从图中可以看出，样本B8使用基础培养基BM(图5A)培养12天不能形成细胞克隆；使用EpiM(图5C)培养12天仅形成少量细胞克隆，且细胞状态不佳；使用条件重编程培养基FM(图5D)培养12天细胞有一定扩增，但是细胞密度和细胞数量均不及本专利培养基FLM培养的效果明显。
图6是9例肺癌病人样本按照实施例1获得的肺癌原代细胞在以上四种不同培养基条件下培养16天后得到细胞增殖效果的比较图，其中√代表有一般的克隆形成能力和促增殖效果，√√代表有较明显的克隆形成能力和促增殖效果，√√√代表有较强的克隆形成能力和促增殖效果，×代表不能形成克隆。从图6中可以确认，本发明的培养基在对肺癌组织来源获得的原代细胞进行培养时，克隆形成能力和促细胞增殖效果、以及培养成功率都较其他三种培养条件有明显优势。
(2)不同培养基对原代肺癌肿瘤细胞的持续培养和生长曲线的绘制
使用与本实施例(1)中同样的方法获得原代肺癌上皮细胞培养基FLM，以及作为对照的培养基BM、FM和EpiM。
使用与本实施例(1)中同样的方法将肺癌组织来源的原代肺癌肿瘤细胞(编号B9)分别在四种培养基条件下培养，并进行消化传代和计数。
当传代后的细胞在培养板内生长再次达到约80％板底面积时，再次按上述操作方法消化收集所培养获得的细胞并计数。同样按4×104个/孔密度接种并持续培养。
以下为原代肺癌上皮细胞在不同培养条件下细胞的扩增倍数(PopulationDoubling)的计算公式：
Population Doubling(PD)＝3.32*log10(消化后细胞总数/初始种入细胞数)，公式参见(Chapman等.Stem Cell Research&Therapy 2014,5:60)。
图7是采用Graphpad Prism软件绘制的四种不同培养条件下的细胞B9的生长曲线。横坐标表示细胞培养的天数，纵坐标是累计的细胞增殖倍数，表示细胞在培养周期内扩增的倍数，数值越大表示细胞在一定周期内扩增的次数越多，即扩增得到的细胞数也就越多，斜率代表的是细胞扩增的速率。从图中可以确认本发明的培养基FLM培养的肺癌上皮细胞的增殖速率优于其他四种培养条件，同时可以确认本发明的培养基可以对原代肺癌上皮细胞进行持续培养，在扩增至30天时速率仍保持不变。
[实施例5]
原代肺癌组织和传代培养后的肺癌细胞免疫组化鉴定
从一例肺癌患者的临床手术切除样本取出约绿豆粒大小的癌组织(样本编号B12)，浸泡在1mL 4％多聚甲醛中固定。剩余癌组织使用与实施例1相同的方法获得肺癌上皮细胞(样本编号B12)。使用实施例3的方法采用本发明的培养基FLM将样本B12持续培养至第四代。
采用免疫组化法检测样本B12原始组织和持续培养至第四代得到的原代细胞中与肺癌相关的重要生物标记物的表达。4％多聚甲醛固定后的组织，经石蜡包埋，用切片机切成4μm厚的组织切片。随后进行常规的免疫组织化学检测(具体步骤参见Li等，NatureConmunication，(2018)9:2983)。所使用的一抗为TTF-1抗体(购自CST公司)和Ki67抗体(购自R&D公司)。
由图8可以确认，采用本发明的培养基培养的肺癌肿瘤细胞(样本编号B12)培养至第4代时，细胞上与肺癌相关的生物标记物的表达情况与细胞来源的原始组织切片的标记物表达情况基本一致。说明采用本发明的培养基所培养的细胞保持了肺癌病人癌组织的原始病理特性。
[实施例6]
培养基中去除单一因子对原代肺癌细胞持续扩增培养的影响
使用与实施例2同样的方法制备原代肺癌上皮细胞培养基FLM。作为对照，使用与实施例2同样的方法制备基础培养基BM。另外按照表7制备其他8种不同培养基。
表7不同培养基成分(浓度为终浓度)
Figure BDA0003153482810000331
使用与实施例1同样的方法获得一例肺癌组织来源的原代肺癌肿瘤细胞(编号B13)。按4×104个/cm2接种密度将原代肺癌肿瘤细胞接种至
Figure BDA0003153482810000341
(BD生物科技公司制)包被处理过的48孔板内，采用2mL的本发明的原代肺癌上皮细胞培养基(FLM)置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)进行培养。
在培养板内细胞生长达到底面积的80％左右时，弃去48孔板内的培养基上清，加入200μL 0.05％胰酶(购自GIBCO公司)对细胞进行消化，37℃下孵育10分钟，直至显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)下能观察到细胞已经消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液800μL终止消化，并收集至15mL离心管内，1500rpm离心4分钟后，弃上清。使用本发明的培养基重悬离心后的细胞沉淀，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。按2×104个/cm2密度将细胞接种至另一包被有细胞外基质胶的48孔培养板中继续培养。
在另8种培养基条件和BM培养基条件下培养的细胞采用如上述同样的操作方式进行消化传代和计数，使用各自不同的培养基进行培养。
当传代后的细胞在培养板内生长再次达到约80％板底面积时，再次按上述操作方法消化收集所培养获得的细胞并计数。同样按2×104个/cm2密度接种并持续培养。
以下为原代肺癌上皮细胞在不同培养基条件下细胞的扩增倍数(PopulationDoubling)的计算公式：
Population Doubling(PD)＝3.32*log10(消化后细胞总数/初始种入细胞数)，公式参见(Chapman等.Stem Cell Research&Therapy 2014,5:60)。
图9是采用Graphpad Prism软件绘制的十种不同培养基条件下的细胞生长曲线。横坐标表示细胞培养的天数，纵坐标是累计的细胞增殖倍数，表示细胞在培养周期内扩增的倍数，数值越大表示细胞在一定周期内扩增的次数越多，即扩增得到的细胞数也就越多，斜率代表的是细胞扩增的速率。
图10所示是十种不同培养基条件下培养8天后，收集细胞计数后作图所得。
由图9和图10的结果可知，在本发明的培养基中单独去除各种小分子和添加剂因子之后，细胞的增殖效果都有一定程度的减弱。这提示本发明的培养基中，这些组分都是细胞增殖和持续培养所必需的。
[实施例7]
癌组织来源的原代肺癌肿瘤细胞在小鼠体内的异种移植成瘤实验
使用与实施例1同样的方法从一例病理诊断为肺癌患者的癌组织中分离获得肺癌肿瘤细胞(编号B15)，按照实施例3的方法采用本发明的培养基FLM对B15进行培养，待肺癌肿瘤细胞数量达到1×107个时，采用实施例4的方法对肺癌肿瘤细胞进行消化，并收集。采用本发明的肺癌肿瘤细胞培养基FLM和
Figure BDA0003153482810000351
(购自BD生物科技公司)按照1:1混匀，并吸取100μL与Matrigel混匀后的培养基将5×106个肺癌肿瘤细胞重悬，分别注射入6周大的雌性高度免疫缺陷小鼠(NCG)小鼠(购自南京模式动物研究所)的肺癌脂肪垫和右前肢腋下部位，每三天观察一次肺癌肿瘤细胞在小鼠体内形成肿瘤的体积和生长速率。
在肿瘤细胞接种后的第15天即可观察到小鼠的两处肿瘤细胞接种部位均有瘤体形成，自第15天起至第30天，小鼠体内肿瘤增殖明显。这说明采用本发明的培养方法所培养的癌组织来源的肺癌肿瘤细胞在小鼠体内具有成瘤性。
[实施例8]
癌组织来源的肺癌肿瘤细胞的药物敏感性功能测试
下面以肺癌患者手术切除样本为例，说明由病人来源的肺癌肿瘤样本培养得到的肺癌肿瘤细胞可以用于检测病人肿瘤细胞对不同药物的敏感性。
一、原代肺癌肿瘤细胞的铺板：按照实施例1中方法得到的分离后的肺癌肿瘤细胞(编号B13和编号B15)细胞悬液，按照4×104个/cm2密度接种至
Figure BDA0003153482810000352
(购自BD生物科技公司)包被处理过的12孔板内。向12孔板中添加2mL制备好的原代肺癌上皮细胞培养基FLM，置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)中进行培养。在培养板内细胞生长达到底面积的80％左右时，弃去12孔板内的培养基上清，加入500μL 0.05％胰酶(购自Gibco公司)对细胞进行消化，37℃下孵育10分钟，直至显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)下能观察到细胞已经消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液1mL终止消化，并收集至15mL离心管内，1500rpm离心4分钟后，弃上清。使用FLM培养基重悬离心后的细胞沉淀，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数分别为83万和76.8万。按2000～4000个/孔密度接种于384孔板中，使细胞贴壁过夜。
二、药物梯度实验：
(1)采用浓度梯度稀释的方法配制药物贮存板：分别吸取10μL的待测药物母液(药物母液浓度按2倍于该药物在人体中的最大血药浓度Cmax配制)，加入到含20μL的DMSO的0.5mL的EP管中，再从上述EP管中吸取10μL到第二个已装有20μL的DMSO的0.5mL的EP管中，即按照1:3稀释药品。重复以上方法，依次稀释，最后得到加药所需的8种浓度。将不同浓度的药物加入384孔药物储存板中。溶剂对照组各孔加入等体积的DMSO作为对照。本实施例中，待测药物为紫杉醇(购自MCE公司)、吉西他滨(购自MCE公司)、阿法替尼(购自MCE公司)和厄洛替尼(购自MCE公司)。
(2)使用高通量自动化工作站(Perkin Elmer公司JANUS)将384孔药物贮存板内的不同浓度药物和溶剂对照加入到铺有肺癌肿瘤细胞的384孔细胞培养板中，药物组和溶剂对照组都各设3个复孔。每孔加入药物体积为100nL。
(3)细胞活性检测：给药72小时后，用Cell Titer-Glo检测试剂(购自Promega公司)检测加药培养后细胞的化学发光数值，化学发光数值的大小反映细胞活力以及药物对细胞活力的影响，每孔加入10μL配制好的Cell Titer-Glo检测液，混匀后使用酶标仪(Perkin Elmer公司Envision)检测化学发光数值。
(4)细胞活性检测：按照公式细胞存活率(％)＝加药孔化学发光数值/对照孔化学发光数值*100％，计算得到不同药物作用细胞后的细胞存活率，使用Graphpad Prism软件作图并计算半数抑制率IC50。
(5)药物敏感性测试结果如图11所示。
图11A和11B分别表示从两个不同的肺癌患者的手术切除癌组织样本(编号B13和编号B15)所培养获得的肺癌肿瘤细胞，对两种化疗药物紫杉醇和吉西他滨的药物敏感性、以及对两种靶向药物阿法替尼和厄洛替尼的药物敏感性。其中图11A为编号B13样本培养获得的肺癌细胞对四种药物的敏感性测试结果；图11B为编号B15样本培养获得的肺癌细胞对四种药物的敏感性测试结果。结果显示，同一病人的细胞对不同药物具有不同的敏感性，不同病人的细胞对同一药物的敏感性也不同。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本说明书基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (13)

1.一种用于培养原代肺癌上皮细胞的原代细胞培养基，其特征在于：
含有MST1/2激酶抑制剂；选自Y27632、法舒地尔、和H-1152中的至少一种的ROCK激酶抑制剂；成纤维细胞生长因子7；B27添加剂和N2添加剂中的至少一种添加剂；肝细胞生长因子；胰岛素样生长因子1；白介素6；选自A83-01、SB431542、Repsox、SB505124、SB525334、SD208、LY36494、和SJN2511中的至少一种的TGFβI型受体抑制剂，
其中，所述MST1/2激酶抑制剂包括式(I)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，
Figure FDA0003153482800000011
其中，
R1选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C2-C6螺环烷基、以及任选地被1-2个独立地R6取代的芳基、芳基C1-C6烷基和杂芳基；
R2和R3各自独立地选自C1-C6烷基；
R4和R5各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C1-C6烷基羟基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、和C3-C6杂环基C1-C6烷基；
R6选自卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和C1-C6卤代烷基。
2.如权利要求1所述的原代细胞培养基，其中
R1选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C2-C6螺环烷基、以及任选地被1-2个独立地R6取代的苯基、萘基、苯甲基和噻吩基；
R2和R3各自独立地选自C1-C3烷基；
R4和R5各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C1-C6烷基羟基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、哌啶基C1-C6烷基、和四氢吡喃基C1-C6烷基；
R6选自卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、和C1-C6卤代烷基。
3.如权利要求1所述的原代细胞培养基，其中所述MST1/2激酶抑制剂包括式(Ia)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，
Figure FDA0003153482800000021
其中，
R1选自C1-C6烷基、任选地被1-2个独立地R6取代的苯基、任选地被1-2个独立地R6取代的噻吩基、和任选地被1-2个独立地R6取代的苯甲基；
R5选自氢、C1-C6烷基、和C3-C6环烷基；
R6各自独立地选自卤素、C1-C6烷基、和C1-C6卤代烷基。
4.如权利要求3所述的原代细胞培养基，其中
R1为任选地被1-2个独立地R6取代的苯基；
R5为氢；
R6优选为氟、甲基或三氟甲基。
5.如权利要求1所述的原代细胞培养基，其中所述MST1/2激酶抑制剂选自以下化合物或其药学可接受的盐中的至少一种：
Figure FDA0003153482800000031
Figure FDA0003153482800000041
Figure FDA0003153482800000051
Figure FDA0003153482800000061
Figure FDA0003153482800000071
6.如权利要求1～5中任一项所述的原代细胞培养基，其特征在于：
所述MST1/2激酶抑制剂在培养基中的含量为2.5μM～10μM，优选为5μM～7.5μM。
7.如权利要求1～5中任一项所述的原代细胞培养基，其特征在于所述原代细胞培养基满足以下任意一项或多项或全部满足：
所述ROCK激酶抑制剂在培养基中的含量为2.5μM～15μM，优选为5μM～15μM，更优选为10μM～12.5μM；
所述成纤维细胞生长因子7的含量为5ng/ml～160ng/ml，更优选为10ng/ml～80ng/ml，进一步优选为20ng/ml～40ng/ml；
所述B27添加剂或N2添加剂在培养基中的体积浓度为1:25～1:800，更优选为1:25～1:200，进一步优选1:50～1:100；
所述肝细胞生长因子的含量为5ng/ml～160ng/ml，更优选为20ng/ml～80ng/ml；
所述胰岛素样生长因子1的含量为5ng/ml～160ng/ml，更优选为20ng/ml～80ng/ml；
所述白介素6的含量为2.5ng/ml～40ng/ml，更优选为5ng/ml～40ng/ml；
所述TGFβI型受体抑制剂的含量为62.5nM～500nM，优选为250nM～500nM。
8.如权利要求1～5中任一项所述的原代细胞培养基，其特征在于所述原代细胞培养基满足以下任意一项或多项或全部满足：
所述MST1/2激酶抑制剂为化合物1；
所述ROCK激酶抑制剂为Y27632；
所述TGFβI型受体抑制剂为A83-01。
9.如权利要求1～5中任一项所述的原代细胞培养基，其特征在于还包括：
选自DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI-1640的初始培养基；和
选自链霉素/青霉素、两性霉素B和Primocin中的一种或多种的抗生素。
10.如权利要求1～5中任一项所述的原代细胞培养基，其特征在于：
不含血清、牛垂体提取物、Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、BMP抑制剂、烟酰胺和N-乙酰半胱氨酸。
11.如权利要求1～5中任一项所述的原代细胞培养基，其特征在于：
所述原代肺癌上皮细胞选自肺癌肿瘤细胞、正常肺癌上皮细胞、和肺癌上皮干细胞。
12.一种原代肺癌上皮细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制如权利要求1～11中任一项所述的原代细胞培养基；
(2)用细胞外基质胶稀释液包被培养器皿，所述细胞外基质胶选自Matrigel和BME中的至少一种；
(3)在包被有细胞外基质胶的培养器皿内接种从肺癌组织分离得到原代肺癌上皮细胞，使用步骤(1)中的所述原代细胞培养基进行培养。
13.一种评估或筛选用于治疗肺癌疾病的药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据权利要求12所述的培养方法培养得到肺癌上皮细胞；
(2)选定需要检测的药物，稀释成不同的药物浓度梯度；
(3)向步骤(1)培养得到的肺癌上皮细胞中添加梯度稀释后的所述药物，并进行细胞活力检测。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115947728A (zh) * 2021-10-09 2023-04-11 沈阳药科大学 含磺酰基的二氢喋啶酮衍生物及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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SG193293A1 (en) * 2011-03-04 2013-10-30 Lexicon Pharmaceuticals Inc Mst1 kinase inhibitors and methods of their use
CN107151645A (zh) * 2017-05-16 2017-09-12 武汉大学深圳研究院 一种为肺癌提供离体个体化药物测试的方法及培养基
CN110452877A (zh) * 2018-05-07 2019-11-15 北京吉尚立德生物科技有限公司 一种肺癌实体瘤原代细胞的培养方法
CN108624561B (zh) * 2018-05-26 2021-09-17 复旦大学 原代肿瘤细胞培养基、培养方法以及应用
CN111039944B (zh) * 2018-10-12 2021-11-23 中国科学院合肥物质科学研究院 Mst1激酶抑制剂及其用途

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115947728A (zh) * 2021-10-09 2023-04-11 沈阳药科大学 含磺酰基的二氢喋啶酮衍生物及其应用
CN115947728B (zh) * 2021-10-09 2024-01-09 沈阳药科大学 含磺酰基的二氢喋啶酮衍生物及其应用

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