ES2927112T3 - Método para evaluar la calidad de células madre mesenquimatosas humanas y un anticuerpo monoclonal para su uso en dicho método - Google Patents

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Abstract

La presente invención tiene como objetivo obtener un método para la evaluación de la calidad de las células madre mesenquimales humanas, un método para el aislamiento, selección y cultivo de células madre mesenquimales humanas, una población celular de células madre mesenquimales humanas de rápida proliferación, así como anticuerpos monoclonales que reconozcan específicamente células madre mesenquimales humanas de rápida proliferación. A partir de una población celular que contiene células madre mesenquimatosas humanas, se aíslan, seleccionan y cultivan células madre mesenquimatosas humanas que proliferan rápidamente. La proporción de abundancia de células que expresan Ror2 o Fzd5 en la población celular así aislada, seleccionada y cultivada se cuantifica para determinar si cada población celular es aceptable o no. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método para evaluar la calidad de células madre mesenquimatosas humanas y un anticuerpo monoclonal para su uso en dicho método
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para la evaluación de la calidad de células madre mesenquimatosas humanas, y un método para el aislamiento, la selección y el cultivo de las células madre mesenquimatosas humanas.
Antecedentes de la técnica
Las células madre mesenquimatosas (MSC, del inglés mesenchymal stem cells) son un tipo de células madre somáticas que se utilizan cada vez más para aplicaciones clínicas, después de las células madre hematopoyéticas, porque tienen menos problemas éticos asociados con la recogida de células y tienen potencia de diferenciación en varios tipos de tejidos tales como hueso, cartílago, grasa, etc. Las células madre mesenquimatosas se pueden aislar a través de manipulaciones relativamente simples, como se describe más adelante, y, por lo tanto, se utilizan ampliamente como materiales para biomateriales, por ejemplo, mediante la inducción a diferenciarse en cartílago, hueso y otros, principalmente en tubos de ensayo y después utilizándolas para el trasplante local.
Como método para el aislamiento y el cultivo de células madre mesenquimatosas humanas se utiliza normalmente el método de cultivo descrito en el documento no de patente 1. Sin embargo, una población celular obtenida mediante este método convencional contiene muchas células contaminantes de menor calidad (que han perdido su potencia de diferenciación, proliferación y migración) y estas células contaminantes sirven como factor que provoca una mayor pérdida de calidad porque afectan a las células que deberían tener el consiguiente potencial.
En estas circunstancias convencionales, se ha establecido un método para el aislamiento y el cultivo de células madre mesenquimatosas humanas, que consigue una potencia de proliferación, una potencia de diferenciación y una potencia de migración mayores que las de los métodos convencionales (Documentos no de patente 2 y 3 y documento de patente 1). De acuerdo con estos documentos no de patente 2 y 3 y el documento de patente 1, los anticuerpos contra CD271 (LNGFR) y CD90 (Thy1) se utilizan para seleccionar células LNGFR+ Thy1+ de la médula ósea humana, el corion placentario, el tejido adiposo, la sangre periférica, la pulpa dental, etc., con lo que se pueden enriquecer las células madre mesenquimatosas humanas.
Además, las células LNGFR+ Thy1+ seleccionadas se someten a un cultivo unicelular (clon) para seleccionar un lote de rápida expansión (REC: Rapidly Expanding Clone, clon de expansión rápida), mediante el cual se pueden obtener células madre mesenquimatosas humanas excelentes en potencia de proliferación, potencia de diferenciación y potencia de migración de alta pureza.
Se encontró que las células madre mesenquimatosas humanas de alta pureza (REC) así obtenidas tenían una potencia de proliferación, una potencia de diferenciación y una potencia de migración que eran 1000 veces superiores o más que las de las células madre mesenquimatosas obtenidas por métodos convencionales.
De acuerdo con las características del método anterior para el aislamiento y el cultivo de células madre mesenquimatosas humanas, el cultivo de células sueltas permite la formación de condiciones sin células contaminantes y, por lo tanto, permite el cultivo de expansión mientras se mantiene la calidad de las células. En particular, al conservar la potencia de migración, las células resultantes se pueden administrar por vía intravenosa y, por lo tanto, se puede esperar que se utilicen en enfermedades sistémicas graves tales como la hipoplasia de huesos y cartílagos.
Shen et al. (Documento no de patente 4) describe cómo Wnt5a procedente de células madre mesenquimatosas de la médula ósea inhibe la progresión de las células leucémicas in vitro a través de la activación de la vía de señalización Wnt no canónica. Xin et al. (Documento no de patente 5) describe cómo la vía Wnt5a/Ror2 está asociada con la determinación del destino de diferenciación de las células madre mesenquimatosas de la médula ósea en la calcificación vascular. Liu et al. (Documento no de patente 6) describe cómo el receptor huérfano tirosina cinasa Ror2 promueve la diferenciación de osteoblastos y mejora la formación ósea ex vivo. Dickinson et al. (Documento no de patente 7) describe cómo el receptor Wnt5a, receptor huérfano similar a la tirosina cinasa 2, es un marcador de superficie celular predictivo de las células madre mesenquimatosas humanas con una mayor capacidad para la diferenciación condrogénica. Miyamoto et al. (Documento no de patente 8) describe mecanismos para mantener estados indiferenciados mediante miARN específico de células madre mesenquimatosas humanas. El documento JP2006524508A (Documento de patente 2) describe un método para modular la actividad relacionada con los huesos. El documento JP2009513708A (Documento de patente 3) describe composiciones y métodos para diagnosticar y tratar el cáncer. El documento JP2009527485A (Documento de patente 4) describe la modulación de la formación ósea. El documento JP2015043768A (Documento de patente 5) describe un anticuerpo monoclonal que reconoce de manera específica células madre mesenquimatosas humanas y métodos para la separación y/o evaluación de la calidad de las células madre mesenquimatosas humanas.
Documentos de la técnica anterior
Documentos de patente
Documento de patente 1: JP 2009-60840 A
Documento de patente 2: JP2006524508A
Documento de patente 3: JP2009513708A
Documento de patente 4: JP2009527485A
Documento de patente 5: JP2015043768A
Documentos no de patente
Documento no de patente 1: Pittenger, M. F., Mackay, A. M., Beck, S. C., Jaiswal, R. K., Douglas, R., Mosca, J. D., Moorman, M. A., Simonetti, D. W., Craig, S., y Marshak, D. R. (1999). Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 143-147.
Documento no de patente 2: Mabuchi Y., Morikawa S., Harada S., Niibe K., Suzuki S., Renault-Mihara F., Houlihan D. D., Akazawa C., Okano H., Matsuzaki Y. (2013). LNGFR+THY-1+VCAM-1hi+ Cells Reveal Functionally Distinct Subpopulations in Mesenchymal Stem Cells. Stem Cell Reports 1, 152-165.
Documento no de patente 3: CGH array data, Gene Expression Omnibus (GEO) (Número de registro: GSE34484) Documento no de patente 4: Shen, Y. L., Luo, Q., Guo, Y. X., Zheng, G H., Yu, J., y Xu, Y. H. (2014). Bone marrow mesenchymal stem cell-derived Wnt5a inhibits leukemia cell progression in vitro via activation of the non-canonical Wnt signaling pathway. Oncology Letters, 8, 85-90.
Documento no de patente 5: Xin, H., Xin, F., Zhou, S., y Guan, S. (2013). The Wnt5a/Ror2 pathway is associated with determination of the differentiation fate of bone marrow mesenchymal stem cells in vascular calcification. International Journal of Molecular Medicine, 31, 583-588.
Documento no de patente 6: Yan Liu, Ramesh A. Bhat, Laura M. Seestaller-Wehr, Shoichi Fukayama, Annamarie Mangine, Robert A. Moran, Barry S. Komm, Peter V. N. Bodine, Julia Billiard, The Orphan Receptor Tyrosine Kinase Ror2 Promotes Osteoblast Differentiation and Enhances ex Vivo Bone Formation, Molecular Endocrinology, volumen 21, tema 2, 1 de febrero de 2007, páginas 376-387.
Documento no de patente 7: Dickinson, S. C., Sutton, C. A., Brady, K., Salerno, A., Katopodi, T., Williams, R. L., West, C. C., Evseenko, D., Wu, L., Pang, S., Ferro de Godoy, R., Goodship, A. E., Péault, B., Blom, A. W., Kafienah, W. y Hollander, A. P. (2017), The Wnt5a Receptor, Receptor Tyrosine Kinase - Like Orphan Receptor 2, Is a Predictive Cell Surface Marker of Human Mesenchymal Stem Cells with an Enhanced Capacity for Chondrogenic Differentiation. Stem Cells, 35: 2280-2291.
Documento no de patente 8: Miyamoto K. et al., "Elucidation of mechanisms for maintaining undifferentiated states by human mesenchymal stem cell-specific miRNA", Número extra especial de Regenerative Medicine, (20140107), vol. 13, página 317.
Sumario de la invención
Problema a resolver mediante la invención
A diferencia de las líneas celulares inmortalizadas, los REC no pueden evitar la pérdida de la calidad celular cuando se subcultivan de manera repetida durante un largo período de tiempo. Sin embargo, en la actualidad, no existe un indicador preciso de la pérdida de calidad.
La presente invención tiene por objeto proporcionar un método para la evaluación de la calidad de las células madre mesenquimatosas humanas, y un método para el aislamiento, la selección y el cultivo de las células madre mesenquimatosas humanas. También se describe una población celular de células madre mesenquimatosas humanas que proliferan rápidamente, así como anticuerpos monoclonales que reconocen de manera específica las células madre mesenquimatosas humanas que proliferan rápidamente.
Además, se realizó un análisis de la expresión génica entre los REC y los otros clones de menor calidad (MEC: Moderately Expanding Clone, clon de expansión moderada, SEC: Slowly Expanding Clone, clon de expansión lenta) para seleccionar así genes específicos de los REC. También se divulgan nuevos anticuerpos monoclonales que reconocen proteínas expresadas a partir de los genes específicos.
Medios para resolver el problema
La presente invención proporciona un método para la evaluación de la calidad de células madre mesenquimatosas humanas, que comprende:
una etapa donde, a partir de una población celular, que contiene células madre mesenquimatosas humanas, se aíslan, se seleccionan y se cultivan células madre mesenquimatosas humanas que proliferan rápidamente, en donde dicha etapa comprende:
una etapa donde la población celular que contiene células madre mesenquimatosas humanas se analiza mediante citometría de flujo (FCM, del inglés flow cytometry) en busca de células teñidas con el anticuerpo monoclonal anti-Ror2 para efectuar así la clasificación celular de células Ror2+;
una etapa donde las células positivas se siembran en los pocillos de una placa de cultivo y después se aíslan y se seleccionan las células de cada pocillo que alcanzan la confluencia en el cultivo; y
una etapa donde se cuantifica la relación de abundancia de las células que expresan Ror2 en la población celular así aislada, seleccionada y cultivada para determinar si cada población celular es aceptable o no.
También se proporciona un método para el aislamiento, la selección y el cultivo de células madre mesenquimatosas humanas, que comprende:
una etapa donde, a partir de una población celular, que contiene células madre mesenquimatosas humanas, se aíslan, se seleccionan y se cultivan células madre mesenquimatosas humanas que proliferan rápidamente, en donde dicha etapa comprende:
una etapa donde la población celular que contiene células madre mesenquimatosas humanas se analiza mediante citometría de flujo (FCM, del inglés flow cytometry) en busca de células teñidas con el anticuerpo monoclonal anti-Ror2 para efectuar así la clasificación celular de células Ror2+;
una etapa donde las células positivas se siembran en los pocillos de una placa de cultivo y después se aíslan y se seleccionan las células de cada pocillo que alcanzan la confluencia en el cultivo; y
una etapa donde se cuantifica la relación de abundancia de las células que expresan Ror2 en la población celular así aislada, seleccionada y cultivada para determinar si cada población celular es aceptable o no, seleccionando así solo la población o poblaciones celulares que se hayan determinado como aceptables.
Para lograr el objetivo anterior, el método para la evaluación de la calidad de las células madre mesenquimatosas humanas de acuerdo con la presente invención se caracteriza por que se aíslan, se seleccionan y se cultivan células madre mesenquimatosas humanas que proliferan rápidamente a partir de una población celular que contiene células madre mesenquimatosas humanas, y las células que expresan Ror2 (o la relación de abundancia de las mismas) en la población celular así aisladas, seleccionadas y cultivadas se cuantifican para determinar si cada población celular es aceptable o no. De acuerdo con esta constitución, la expresión de Ror2 permite la determinación de si una población celular está compuesta de REC o no, y la determinación se puede realizar de una manera más sencilla porque también se pueden utilizar células cultivadas para este fin. Cabe señalar que LNGFR no se expresa en células cultivadas incluso cuando son REC, y Thy1 cuando se expresa solo no permite determinar si una población celular está compuesta de REC o no.
Las células que expresan Ror2 pueden cuantificarse mediante el uso de anticuerpos monoclonales anti-Ror2. La expresión de ARNm de Ror2 se puede cuantificar mediante PCR cuantitativa o, de manera alternativa, las células que expresan Ror2 pueden cuantificarse mediante inmunotinción. Ror2 se expresa de manera extracelular y, por lo tanto, el análisis mediante citometría de flujo (en lo sucesivo, "FCM") es fácilmente aplicable para el propósito anterior.
Por otro lado, para lograr el objetivo anterior, el método de aislamiento, selección y cultivo de células madre mesenquimatosas humanas se caracteriza por que a partir de una población celular, que contiene células madre mesenquimatosas humanas, se aíslan, se seleccionan y se cultivan células madre mesenquimatosas humanas que proliferan rápidamente, y las células que expresan Ror2 (o la relación de abundancia de las mismas) en la población celular así aisladas, seleccionadas y cultivadas se cuantifican para determinar si cada población de células es aceptable o no, seleccionando así solo la población o poblaciones celulares que se hayan determinado como aceptables.
Las células que expresan Ror2 pueden cuantificarse mediante el uso de anticuerpos monoclonales anti-Ror2. Las células que expresan ARNm de Ror2 pueden cuantificarse mediante PCR cuantitativa o, de manera alternativa, las células que expresan Ror2 mediante inmunotinción.
Además, la etapa anterior donde se aíslan, se seleccionan y se cultivan las células madre mesenquimatosas humanas que proliferan rápidamente puede comprender una etapa donde la población celular que contiene células madre mesenquimatosas humanas se analiza mediante FCM en busca de células teñidas de manera simultánea con el anticuerpo monoclonal anti-LNGFR y el anticuerpo monoclonal anti-Thyl para efectuar así la clasificación celular de células LNGFR+ Thy1+.
De manera adicional, cada uno de los métodos anteriores puede comprender una etapa donde la población celular anterior se prepara directamente a partir de células procedentes de cada tejido, incluida la médula ósea. Por otro lado, el método que comprende la etapa de efectuar la clasificación celular de células Ror2+ puede comprender una etapa donde la población celular anterior se prepara mediante cultivo de adhesión de células procedentes de cada tejido, incluida la médula ósea. Esto se debe a que las células cultivadas de REC no son positivas para LNGFR pero sí para Ror2.
En los métodos anteriores, la etapa de clasificación de células anterior comprende una etapa donde las células positivas se siembran en los pocillos de una placa de cultivo, y después se aíslan y se seleccionan las células de cada pocilio que alcanzan la confluencia en el cultivo.
La población celular de células madre mesenquimatosas humanas de proliferación rápidamente se caracteriza por que a partir de una población celular, que contiene células madre mesenquimatosas humanas, se aíslan, se seleccionan y se cultivan células madre mesenquimatosas humanas que proliferan rápidamente, y las células que expresan Ror2 (o la relación de abundancia de las mismas) en la población celular así aisladas, seleccionadas y cultivadas se cuantifican para determinar si cada población de células es aceptable o no, seleccionando así solo la población o poblaciones celulares que se hayan determinado como aceptables.
En esta característica, la población celular que contiene células madre mesenquimatosas humanas se puede analizar mediante FCM en busca de células teñidas de manera simultánea con el anticuerpo monoclonal anti-LNGFR y el anticuerpo monoclonal anti-Thyl para efectuar así la clasificación celular de células LNGFR+ Thy1+, y estas células doble positivas pueden sembrarse en los pocillos de una placa de cultivo y las células de cada pocillo que alcanzan la confluencia en el cultivo se pueden aislar y seleccionar antes de la cuantificación anterior.
La población celular que contiene células madre mesenquimatosas humanas se analiza mediante FCM en busca de células teñidas con el anticuerpo monoclonal anti-Ror2 para efectuar así la clasificación celular de células Ror2+, y estas células positivas se siembran en los pocillos de una placa de cultivo, y las células de cada pocillo que alcanzan la confluencia en el cultivo se pueden aislar y seleccionar antes de la cuantificación anterior.
De acuerdo con la divulgación, un nuevo anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal anti-Ror2 cuyo nombre del clon es 7C9. También se divulga el anticuerpo monoclonal anti-Fzd5, nombre del clon 6F5.
Efectos de la invención
Las proteínas codificadas por los dos genes identificados (Fzd5 y Ror2: sus detalles se describirán más adelante) se expresan de manera específica en los REC y su expresión no se observa en poblaciones celulares de menor calidad. Además, estos genes son esenciales para mantener el estado indiferenciado de los REC y sirven como indicadores eficaces que están estrechamente relacionados con las funciones celulares y aseguran el rendimiento celular, pero no sirven como meros biomarcadores, a la luz de los siguientes resultados: 1) la inhibición de su expresión incluye pérdida de rendimiento celular; y 2) la expresión forzada de estos genes permite un estado indiferenciado prolongado, etc.
Como se ha descrito anteriormente, la presente invención proporciona un método para la evaluación de la calidad de las células madre mesenquimatosas humanas y un método para el aislamiento, la selección y el cultivo de las células madre mesenquimatosas humanas. También se divulga una población celular de células madre mesenquimatosas humanas que proliferan rápidamente, así como anticuerpos monoclonales que reconocen de manera específica las células madre mesenquimatosas humanas que proliferan rápidamente.
Breve descripción de los dibujos
En la figura 1 se muestran las etapas de selección, aislamiento, cultivo y evaluación de la calidad de las células madre mesenquimatosas (REC) de alta calidad.
En la figura 2 se muestran los resultados comparados para varios parámetros entre los REC, MEC y SEC.
En la figura 3 se muestran figuras y gráficos que indican que Ror2 y Fzd5 se expresan de manera específica en REC.
En la figura 4 se muestran figuras y gráficos que indican que la inhibición de Fzd5 induce la pérdida de propiedades celulares en los REC.
En la figura 5 se muestran fotografías y gráficos que indican que la expresión forzada de Fzd5 incluye la naturaleza indiferenciada de los REC.
En la figura 6 se muestran fotografías y gráficos que indican la capacidad de tinción del anticuerpo monoclonal anti-Fzd5 recién preparado.
En la figura 7 se muestran fotografías y figuras que indican la capacidad de tinción del anticuerpo monoclonal anti-Ror2 recién preparado.
En la figura 8 se muestra un diagrama esquemático para la evaluación de la calidad de las MSC cultivadas utilizando anticuerpos específicos de REC.
Descripción detallada
A continuación, y haciendo referencia a los dibujos, se describen las etapas de selección, aislamiento y cultivo de los REC, seguido de explicaciones sobre la finalidad y los detalles de cada etapa. Como se describe en el presente documento, en primer lugar los REC se seleccionan, se aíslan y se cultivan, y en segundo lugar se evalúan los REC cultivados. Algunas combinaciones ilustrativas de estas etapas se enumeran en la tabla 1. Se pueden aplicar todas las combinaciones excepto las expresadas como "Imposible" en la columna "Evaluación del proceso". En primer lugar, las combinaciones de los procesos P1 y P2 se describirán a continuación.
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000007_0001
 [Etapa 1] En la figura 1 se ilustra la etapa de aislamiento de los REC mediante el método de cultivo de un solo clon.
1) Las células mononucleares se preparan a partir de médula ósea humana (o tejido adiposo o corion placentario) y estas células mononucleares de la médula ósea se tiñen con anti-LNGFR y anti-Thyl (las células LNGFR+ Thy1 se denominan células LT).
2) Se utiliza citometría de flujo (FCM, clasificador de células) para efectuar la clasificación de clones de células LNGFR+ Thy1+ en una placa de cultivo de 96 pocillos (es decir, se siembra una célula por pocillo; expresada como "Individual" en la tabla 1).
Cabe señalar que puede añadirse un anticuerpo monoclonal anti-CD106 para efectuar la clasificación de clones de células LNGFR+ Thy1+ que también son fuertemente positivas para CD106.
3) Después del cultivo de células individuales durante 2 semanas, la placa de cultivo se observó al microscopio para seleccionar los pocillos que alcanzaban la confluencia y se determinó que las células contenidas en cada uno de estos pocillos eran REC (células de expansión rápida). Los pocillos que muestran expansión celular retardada, es decir, los MEC/SEC (células de expansión moderada/lenta) se descartan.
4) Las células contenidas en los pocillos seleccionados como REC se recogieron por separado pocillo por pocillo. Los REC recogidos de un pocillo se definen como un lote.
[Etapa 2] En la figura 1 se muestra además la evaluación de las células cultivadas utilizando marcadores REC (anti-Ror2 y anti-Fzd5).
1) Los REC recogidos de la placa de 96 pocillos se transfieren a placas de cultivo o matraces de cultivo pocillo por pocillo y se cultivan hasta alcanzar la confluencia (cultivo de expansión).
2) Después del cultivo de expansión, las células cultivadas en estado adherente se recogen de todos los lotes, y una alícuota (aproximadamente de 1 a 3 * 103 células) de cada lote se muestrea y se tiñe una sola vez con un anticuerpo monoclonal contra cada marcador de REC (anti-Ror2 o anti-Fzd5).
3) Las células positivas para el marcador de REC se analizan mediante citometría de flujo para determinar la relación de células positivas para el marcador de REC en las células recogidas (la expresión del ARNm de Ror2 puede cuantificarse mediante PCR cuantitativa o, de manera alternativa, esta relación puede determinarse de manera manual al microscopio).
4) Si la relación positiva anterior es igual o superior a un valor dado (por ejemplo, el 65 %), se determina que dicho lote (población celular) es aceptable.
5) Las células de los lotes aceptables se introducen en frascos de congelación y se almacenan en nitrógeno líquido.
6) Estas células congeladas se definen como células madre mesenquimatosas humanas de alta calidad (producto).
7) Después de descongelar las células de cada frasco y de expandirlas en una placa o matraz de cultivo, finalmente un usuario puede utilizar al menos 1 * 1010 células madre mesenquimatosas de alta pureza de manera estable.
En las etapas anteriores, la clasificación de clones de las células LT puede reemplazarse con la clasificación de clones de células Ror2+ (P6 y P7 en la tabla 1). Además, las células LT o las células Ror2+ pueden seleccionarse y sembrarse en grupos de dos o más por pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos (expresado como "Múltiple" en la tabla 1; P5, P9 y P14). En este caso, sin embargo, la pureza es más baja que en la clasificación de clones. Cabe señalar que el término "confluencia" o "confluente" se refiere a un estado donde el 90 % o más de la superficie del recipiente de cultivo está cubierta con células cultivadas. De igual modo, el término "semiconfluencia" o "semiconfluente" se refiere a un estado donde del 70 % al 80 % de la superficie del recipiente de cultivo está cubierta con células cultivadas. El tamaño y el tipo de dispositivos de cultivo que se van a utilizar se pueden cambiar según corresponda en función de la tasa de crecimiento de las células.
En la realización anterior, la población celular anterior se prepara directamente a partir de células procedentes de cada tejido, incluida la médula ósea. Sin embargo, en el caso de la clasificación de células Ror2+, la población celular anterior puede prepararse mediante cultivo de adhesión de células procedentes de cada tejido, incluida la médula ósea (P10 a P15 en la tabla 1; expresada como "células de cultivo de adhesión"). En este caso, se siembran células mononucleares de médula ósea en un medio complementado con el 10 % al 20 % de suero y bFGF (a 37 °C en CO2 del 1 % al 5 %) y se cultivan durante aproximadamente 2 semanas para recoger células adherentes similares a fibroblastos (CFU-F) que aparecen después del cultivo. La etapa de preparar una población celular puede comprender el tratamiento de la médula ósea con colagenasa. Como alternativa, esta etapa puede diseñarse de modo que se prepare una población celular a partir de sangre periférica después de la administración de G-CSF.
Cabe señalar que la evaluación previa al envío (Etapa 2-2) y etapa 2-3)) no siempre es necesaria, y las células de cultivo de adhesión pueden utilizarse y someterse a clasificación para aislar las células Ror2+, opcionalmente seguido por cultivo de expansión, y las células así obtenidas pueden proporcionarse para el tratamiento en la etapa 2-5) y las etapas posteriores antes del envío, como en el proceso P15 en la tabla 1.
Haciendo referencia a la figura 2, ahora se hará una comparación del rendimiento celular entre los REC y los MEC/SEC. En la figura 2 se muestran los resultados obtenidos cuando se compararon los REC, los MEC y los SEC en cuanto a su rendimiento celular utilizando varios parámetros.
En la figura 2A se muestran los resultados obtenidos cuando las células mononucleares de médula ósea humana se tiñeron con anticuerpos contra LNGFR y Thy1, seguido de análisis mediante FCM. El área dentro de la elipse representa las células LT.
La figura 2B es un diagrama esquemático para el aislamiento de células individuales (clasificación de clones) de células LT en una placa de 96 pocillos.
La figura 2C es un gráfico que muestra los resultados medidos para los recuentos de células después del cultivo de células individuales a intervalos de tiempo fijos. Los REC muestran una tasa de proliferación más alta que los MEC/SEC y su recuento alcanza de 0,5 a 1 * 104 en unas 2 semanas. Se requiere un recuento de células de 0,5 a 1 * 104 para establecer la confluencia en un pocillo de una placa de 96 pocillos.
En la figura 2D se muestran los resultados obtenidos cuando se indujeron los REC, MEC y SEC a diferenciarse en hueso y tejido adiposo, seguido de PCR cuantitativa para analizar la expresión génica específica de las células óseas y los adipocitos. Se descubrió que los REC tenían una potencia de diferenciación particularmente alta en los adipocitos en comparación con los MEC y los SEC.
La figura 2E es un gráfico que muestra los resultados obtenidos cuando se sembraron de nuevo los REC, MEC y SEC en una placa de 96 pocillos mediante clasificación de clones, y después se contaron y compararon los pocillos que mostraban formación de colonias secundarias. La formación de colonias secundarias sirve como indicador de la potencia de autorreplicación que es indicativa del estado indiferenciado. Aproximadamente el 33 % de los REC muestran formación de colonias secundarias, mientras que solo unas pocas colonias se forman a partir de los MEC/SEC.
En la figura 2F se muestran los resultados obtenidos cuando las siguientes poblaciones celulares, cada una de ellas transformada con un vector de expresión del gen Luc (luciferasa), es decir, WBM (MSC obtenidas de manera convencional; WBM es una abreviatura de Whole Bone Marrow (médula ósea entera)), REC y MEC/SEC, así como WBM no marcadas con luciferasa preparadas como grupo de control negativo (MSC cultivadas con Luc(-)), se administraron a ratones inmunodeficientes por vía intravenosa, seguido de la administración por vía intraperitoneal de luciferina que sirve como sustrato para que Luc observe la luminiscencia de la luciferasa mediante el uso de un sistema de detección (IVIS) in vitro a las 24 horas del trasplante. En el panel superior se muestra un gráfico obtenido de la siguiente manera: La intensidad de la luminiscencia de Luc en cada ratón se expresó numéricamente y, en relación con el grupo trasplantado de MSC WBM que se fijó en el 100 %, la relación de luminiscencia (%) se representó de manera gráfica para los ratones trasplantados con las otras células. En el panel inferior se muestran imágenes de la luminiscencia de Luc en los ratones receptores de los grupos respectivos. Como puede observarse a partir de estos resultados, los ratones trasplantados con REC muestran una intensidad de luminiscencia extremadamente baja en sus pulmones, lo que indica que los REC rara vez quedan atrapados en los capilares de los pulmones, mientras que los MEC/SEC quedan atrapados casi al mismo nivel que las WBM (MSC cultivadas obtenidas de manera convencional) y permanecen en los pulmones.
En vista de todos los resultados anteriores, los REC son una población celular excelente en potencia de proliferación, potencia de diferenciación y potencia de migración, y son particularmente ventajosos porque tienen una potencia de migración comparable a la de las MSC en la médula ósea, en términos de poder administrarse de manera sistémica contra enfermedades intratables como se describe más adelante.
De acuerdo con los experimentos realizados por los inventores, incluidos los que se muestran anteriormente, los REC se caracterizan por lo siguiente, en comparación con las MSC normales:
1. son una población celular morfológicamente muy uniforme;
2. no muestran envejecimiento celular;
3. tienen una elevada tasa de división y pueden cultivarse y multiplicarse mientras retienen la naturaleza indiferenciada;
4. son una población celular fácil de diferenciar en hueso y tejido adiposo debido a la elevada potencia de diferenciación; y
5. conservan la potencia de migración
Los REC son la población celular más indiferenciada entre las MSC humanas y tienen las propiedades más similares a las MSC de la médula ósea. Además, en comparación con los MEC/s Ec o las MSC obtenidas de manera convencional, los REC son una población celular reciente y menos mutada que garantiza el rendimiento celular debido a su mayor potencia de diferenciación, proliferación y migración.
A continuación, haciendo referencia a la figura 3, se hará una explicación sobre la identificación de los genes específicos de MSC (REC) indiferenciados Ror2 y Fzd5.
Los niveles de expresión de genes expresados en REC, MEC y SEC se compararon mediante el método de matriz de ADN, confirmando así que Fzd5, que es uno de los receptores Wnt, y su correceptor Ror2 eran específicos de los REC.
En la figura 3A se muestra una comparación de la expresión de ARNm de Ror2 en REC, MEC y SEC, medida mediante PCR cuantitativa.
En la figura 3B se muestra una comparación de la expresión de ARNm de Fzd5 en REC, MEC y SEC, medida mediante PCR cuantitativa.
En la figura 3C se muestra una comparación de la expresión de la proteína Fzd5, medida mediante transferencia Western.
En la figura 3D se muestran fotografías comparadas para la localización intracelular de la proteína Fzd5, como se observa mediante tinción inmunofluorescente.
Como resultado de la evaluación por los varios métodos de análisis anteriores, se puede confirmar que la expresión de Fzd5 y Ror2 es específica de los REC. Por lo tanto, la expresión respectiva de Fzd5 y Ror2, cuando se detecta y cuantifica, sería eficaz como indicador para la evaluación de la calidad celular de los REC. Además, el anticuerpo monoclonal anti-Fzd5 y el anticuerpo monoclonal anti-Ror2 recién preparados pueden detectar y cuantificar sus antígenos proteicos diana en cualquier técnica seleccionada a partir de citometría de flujo, transferencia Western y tinción inmunofluorescente.
A continuación, haciendo referencia a la figura 4, se hará un examen de inducción de envejecimiento celular por pérdida de la función de Fzd5.
El método de interferencia de ARN es una técnica para examinar la función de un gen diana mediante la introducción de un ARN corto (ARNhc) que tiene una secuencia complementaria al ARNm diana en las células para interrumpir así el ARNm diana. En la figura 4 se muestran los resultados obtenidos de una serie de experimentos sobre las propiedades celulares en los REC cuando el ARNm de Fzd5 se interrumpió mediante ARNhc que tenía una secuencia complementaria a Fzd5 (FZD5hc), en comparación con el grupo de control (CTRLhc; el ARNhc que tiene una secuencia aleatoria no complementaria a Fzd5).
La figura 4A es un gráfico que muestra el nivel de ARNm de Fzd5, según lo cuantificado mediante PCR cuantitativa, después de la introducción de FZD5hc o CTRLhc en los REC. Cuando el nivel de ARNm de Fzd5 en el grupo de control (CTRLhc, control de horquilla corta) se estableció en 100, el nivel de ARNm de Fzd5 se redujo a aproximadamente un 40 % en los REC forzados a expresar FZD5hc.
La figura 4B es un gráfico cuyo eje vertical representa los recuentos de células en el grupo obligado a expresar FZD5hc después de la introducción de FZD5hc o CTRLhc en los REC, en relación con los recuentos de células en el grupo de control que se establecen en 1, y cuyo eje horizontal representa el número de días después de la introducción del ARNhc. Los REC obligados a expresar FZD5hc mostraron una reducción repentina en su recuento celular en comparación con el grupo de control, lo que sugiere que la inhibición de Rzd5 induciría una reducción en la potencia de proliferación.
En la figura 4C se muestran imágenes de gotas de tejido adiposo teñidas con Oil-Red-O a los 14 días de cultivo, después de la introducción de FZD5hc o CTRLhc en los REC y la posterior inducción de su diferenciación en adipocitos. Se descubrió que la inhibición de Fzd5 induce una reducción en la potencia de diferenciación en adipocitos, cuando se compara con el grupo de control.
La actividad de SA-p-gal que sirve como indicador del envejecimiento celular se puede detectar mediante tinción azul tras la adición de su sustrato X-gal. En la figura 4D se muestran imágenes teñidas con x-gal después de la introducción de FZD5hc o CTRLhc en los REC, junto con un gráfico que representa la frecuencia de las células que tienen actividad SA-p-gal en cada población celular.
La figura 4E es un gráfico que muestra el nivel de ARNm de p16(INK4a) que sirve como indicador del envejecimiento celular, según lo cuantificado mediante PCR cuantitativa. Cuando el grupo de control se fijó en 100, el nivel de ARNm de p16 en los REC que recibieron FZD5hc fue de aproximadamente 300, indicando así que la inhibición de la expresión de Fzd5 indujo envejecimiento celular.
En la figura 4F se muestran imágenes observadas para la formación de fibras de tensión mediante tinción intracelular con anticuerpo anti-F-actina en cada población celular después de la introducción de FZD5hc o CTRLhc en los REC, junto con un gráfico que representa el área promediada (tamaño de la célula) de las células individuales en estas poblaciones de células respectivas.
En vista de los resultados anteriores, la inhibición de la función Fzd5 en los REC induce una reducción en la potencia de proliferación, una reducción en la potencia de diferenciación, el envejecimiento celular, así como una reducción en la potencia de migración y un aumento en el tamaño celular debido a la formación de fibras de tensión, lo que da lugar a las mismas propiedades que en los MEC/SEC. Esto sugiere que Fzd5 sería una molécula funcional que garantizaría el mantenimiento del rendimiento celular en los REC, pero no es un mero biomarcador.
A continuación, haciendo referencia a la figura 5, se hará un análisis sobre el mantenimiento a largo plazo de la potencia de proliferación mediante la ganancia de la función de Fzd5.
El ADNc de longitud completa de Fzd5 se obligó a expresarse en los REC para provocar la expresión constitutiva del ARNm de Fzd5 y se confirmó su efecto sobre las funciones celulares. Para este fin, se construye un vector de expresión para transportar ADNc de Fzd5 y una proteína fluorescente GFP (Green Fluorescent Protein, proteína fluorescente verde) en tándem para permitir así la expresión conjunta de la GFP en las células receptoras del gen Fzd5, de modo que la expresión del gen introducido se pueda confirmar en un microscopio de fluorescencia.
En la figura 5A se muestran fotografías observadas para la morfología de las células que expresan GFP en un microscopio de fluorescencia. Estas imágenes muestran la morfología celular 28 días después de la transferencia génica en la población celular transformada con ADNc de Fzd5 y GFP (Fzd5), así como el grupo de control transformado con el gen GFP solo (CTRL).
En el grupo de control, aparecen muchas células multipolares de gran tamaño que son características del envejecimiento celular, como se indica con las flechas en la figura, mientras que casi todos los REC que expresan Fzd5 conservan su morfología bipolar con citoplasma pequeño.
La figura 5B es un gráfico cuyo eje vertical representa recuentos de células de los REC que expresan Fzd5, en relación con los recuentos de células en el grupo de control que se establecen en 1, y cuyo eje horizontal representa el número de días después de la transferencia génica. Se descubrió que los REC obligados a expresar Fzd5 conservan su potencia de proliferación durante un largo período de tiempo, cuando se compara con el grupo de control.
En vista de los resultados anteriores, cabría esperar que la estimulación mediada por Fzd5 de la señalización de Wnt permitiera la multiplicación del cultivo a largo plazo en un estado que mantuviera la naturaleza indiferenciada.
Posteriormente, haciendo referencia a la figura 6, se hará una explicación de la preparación de un nuevo anticuerpo monoclonal contra Fzd5 humano.
Se utilizó la región extracelular de un antígeno Fzd5 humano como inmunógeno para inmunizar ratones hospedadores y después se prepararon hibridomas de acuerdo con procedimientos convencionales, seguido de la detección con células Ba/F3 genomanipuladas para expresar el gen Fzd5, obteniendo así un nuevo anticuerpo monoclonal anti-Fzd5 (nombre del clon: 6F5).
Este anticuerpo se utilizó para confirmar si la proteína Fzd5 podía detectarse o no mediante diversas técnicas.
Las células Ba/F3 forzadas a expresar la región extracelular de Fzd5 se tiñeron con anticuerpo 6F5 marcado con biotina y después se marcaron de manera fluorescente con estreptavidina (SAV)-PE, seguido de análisis de citometría de flujo. En la figura 6A se muestra un histograma cuyo eje horizontal representa la intensidad de fluorescencia de PE. El histograma sombreado en la figura representa un control negativo donde se añadió un control de isotipo como anticuerpo primario, mientras que el histograma abierto representa la intensidad de fluorescencia de PE en la muestra teñida con 6F5. El intervalo indicado con la barra horizontal en la figura representa el intervalo de células Fzd5+, mientras que el valor numérico representa la tasa positiva (%).
En la figura 6B se muestran los resultados de la transferencia Western obtenidos cuando se prepararon proteínas intracelulares a partir de tres clones diferentes de REC y la proteína Fzd5 se detectó utilizando 6F5 como anticuerpo primario. Para utilizarlo como control negativo, se prepararon proteínas intracelulares a partir de la estirpe celular COS7 procedente de riñón de mono.
En la figura 6C se muestran las imágenes obtenidas cuando las células REC se tiñeron con 6F5-biotina como anticuerpo primario y después se marcaron mediante fluorescencia con estreptavidina (SAV)-Alexa 555, seguido de observación en un microscopio de fluorescencia. Se encontró que el anticuerpo anti-Fzd5 (6F5) está disponible para su uso en todas las citometrías de flujo, transferencia Western y tinción inmunofluorescente.
A continuación, haciendo referencia a la figura 7, se hará una explicación sobre la preparación de un nuevo anticuerpo monoclonal contra un antígeno Ror2 humano.
Se utilizó un antígeno Ror2 humano como inmunógeno para preparar de nuevo un anticuerpo anti-Ror2 (nombre del clon: 7C9).
En la figura 7A se muestran los resultados obtenidos cuando los REC se tiñeron con 7C9-biotina como anticuerpo primario y después se marcaron con SAV-PE, seguido de citometría de flujo para detectar la fluorescencia de PE. Se utiliza una muestra preparada mediante la adición de un anticuerpo de control de isotipo como anticuerpo primario como control negativo. La figura 7A es un diagrama de puntos bidimensional cuyo eje vertical representa la fluorescencia FITC (todos los REC son negativos porque no están teñidos) y cuyo eje horizontal representa la fluorescencia de PE. En comparación con el área sin células que emiten fluorescencia PE en el grupo de control negativo (es decir, el área dentro del trapezoide en la figura: 0,011 %), se encontró una población de células que expresan Ror2 como fluorescencia de PE en la muestra teñida con el clon 7C9 (69,3 %).
La figura 7B es una imagen obtenida cuando los REC se inmunotiñeron con 7C9-biotina como anticuerpo primario y se marcaron para fluorescencia con estreptavidina-Alexa 488 y después se observó la expresión de la proteína Ror2 en un microscopio de fluorescencia. Se confirmó que la mayoría de estos REC expresaban la proteína Ror2.
En la figura 7C se muestran los resultados obtenidos cuando las células frescas de la médula ósea se tiñeron tres veces con LNGFR-APC, Thy1-FITC y Ror2-PE (anticuerpos monoclonales contra sus respectivos antígenos), seguido de análisis de citometría de flujo. En el panel izquierdo se muestra una figura cuyo eje vertical representa la expresión de LNGFR y cuyo eje horizontal representa la expresión de Thy1, y el área encuadrada representa una población de células LNGFR+ Thy1+ que contiene MSC humanas con elevada frecuencia. En la figura de la derecha se muestra la población de células LNGFR+ Thy1+ extraídas solas. El eje horizontal representa el FSC que sirve como indicador del tamaño celular, mientras que el eje vertical representa la fluorescencia de PE del anticuerpo anti-Ror2-biotina (7C9) marcado con SAV-PE. El área encuadrada representa el área positiva de Ror2 determinada sobre la base del control negativo, y el valor numérico representa la tasa positiva (%). En el caso de utilizar el clon 7C9, el 92,3 % de las células LNGFR+ Thy1+ son Ror2-positivas; y, por lo tanto, el clon 7C9 se puede utilizar como marcador de selección para MSC para reemplazar LNGFR Thy1.
Utilizando el anticuerpo monoclonal anti-Ror2 recién preparado, se puede detectar y cuantificar la proteína Ror2 mediante citometría de flujo y tinción inmunofluorescente (Figuras 7A y 7B).
Además, el anti-Ror2 recién preparado también se puede utilizar como marcador de MSC contenidas en la médula ósea (Figura 7C).
A continuación, haciendo referencia a la figura 8, se hará una explicación sobre los procedimientos para la evaluación de la calidad celular utilizando anticuerpos anti-Ror2 o anticuerpos anti-Fzd5.
Las MSC humanas cultivadas en cultivo de adhesión convencional (o REC subcultivados) se recogen y se tiñen con un anticuerpo monoclonal específico de REC (anticuerpo anti-Ror2 o anticuerpo anti-Fzd5).
La frecuencia (% de contenido) de las células positivas se mide mediante citometría de flujo. Como alternativa, la frecuencia (% de contenido) de las células positivas puede medirse con un microscopio de fluorescencia, en su lugar. Estas mediciones permiten la cuantificación de cuántos REC están contenidos en la población celular, lo que a su vez permite la evaluación de la calidad celular, es decir, evaluación de qué grado de potencia de diferenciación, proliferación y migración poseen las MSC diana. De acuerdo con los experimentos realizados por los inventores, la tasa de REC positivos para Ror2 fue del 72 % ± 8,9 % como promedio de cinco lotes. Por lo tanto, por ejemplo, el valor más bajo, es decir, al menos un 63 % o al menos un 65 % puede utilizarse como valor de referencia para la determinación de la aceptabilidad.
Aplicabilidad industrial
El método descrito permite el aislamiento y el cultivo eficaces de las células madre mesenquimatosas humanas para su uso en el tratamiento de enfermedades sistémicas. El método descrito también permite la evaluación de la calidad para determinar si la población celular resultante es adecuada o no para el trasplante y/o ejerce eficacia.
Entre los anticuerpos monoclonales recién preparados que muestran tinción específica para las células madre mesenquimatosas de elevada pureza, se pueden proporcionar candidatos adecuados para el aislamiento celular como reactivos para el aislamiento de las células madre mesenquimatosas mediante la inmovilización en nanopartículas magnéticas. Además, como reactivos para la evaluación celular para probar la calidad de las células madre mesenquimatosas aisladas, se pueden proporcionar anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes o reactivos de tinción celular para uso práctico.
Las células madre mesenquimatosas no solo se utilizan como materiales para biomateriales, como ya se sabe, sino que también cabe esperar que tengan diversas aplicaciones aprovechando su pluripotencia, como se ejemplifica en la administración para la miastenia gravis, el reumatismo crónico y otras enfermedades, así como el trasplante conjunto como células de apoyo para proporcionar un andamiaje de tejido (nicho) para la terapia celular necesaria para el tratamiento de enfermedades graves, incluida la lesión de la médula espinal, la insuficiencia cardíaca y vascular, la insuficiencia hepática crónica, etc. En particular, se esperaría que el uso de los REC que conservan su potencia de migración proporcione un efecto terapéutico nunca antes visto cuando se aplica a enfermedades metabólicas tales como enfermedades sistémicas de huesos y cartílagos, incluida la hipofosfatasia, para la que no se ha encontrado ninguna terapia, así como la EICH y todas las demás enfermedades cuyo tratamiento requiera la administración por vía intravenosa.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la evaluación de la calidad de células madre mesenquimatosas humanas, que comprende:
una etapa donde, a partir de una población celular, que contiene células madre mesenquimatosas humanas, se aíslan, se seleccionan y se cultivan células madre mesenquimatosas humanas que proliferan rápidamente, en donde dicha etapa comprende:
- una etapa donde la población celular que contiene células madre mesenquimatosas humanas se analiza mediante citometría de flujo (FCM) en busca de células teñidas con el anticuerpo monoclonal anti-Ror2 para efectuar así la clasificación celular de células Ror2+;
- una etapa donde las células positivas se siembran en los pocillos de una placa de cultivo y después se aíslan y se seleccionan las células de cada pocillo que alcanzan la confluencia en el cultivo; y
una etapa donde la relación de abundancia de las células que expresan Ror2 en la población celular así aislada, seleccionada y cultivada se cuantifica para determinar si cada población de células es aceptable o no.
2. El método para la evaluación de la calidad de células madre mesenquimatosas humanas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la relación de abundancia de las células que expresan Ror2 se cuantifica mediante el uso de un anticuerpo monoclonal anti-Ror2.
3. El método para la evaluación de la calidad de células madre mesenquimatosas humanas de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la relación de abundancia de las células que expresan ARNm de Ror2 se cuantifica mediante PCR cuantitativa.
4. El método para la evaluación de la calidad de células madre mesenquimatosas humanas de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la relación de abundancia de las células que expresan Ror2 se cuantifica mediante inmunotinción.
5. Un método para el aislamiento, la selección y el cultivo de células madre mesenquimatosas humanas, que comprende:
una etapa donde, a partir de una población celular, que contiene células madre mesenquimatosas humanas, se aíslan, se seleccionan y se cultivan células madre mesenquimatosas humanas que proliferan rápidamente, en donde dicha etapa comprende:
- una etapa donde la población celular que contiene células madre mesenquimatosas humanas se analiza mediante citometría de flujo (FCM) en busca de células teñidas con el anticuerpo monoclonal anti-Ror2 para efectuar así la clasificación celular de células Ror2+;
- una etapa donde las células positivas se siembran en los pocillos de una placa de cultivo y después se aíslan y se seleccionan las células de cada pocillo que alcanzan la confluencia en el cultivo; y
una etapa donde la relación de abundancia de las células que expresan Ror2 en la población celular así aislada, seleccionada y cultivada se cuantifica para determinar si cada población de células es aceptable o no, seleccionando así solo la población o poblaciones celulares que se hayan determinado como aceptables.
6. El método de aislamiento, selección y cultivo de células madre mesenquimatosas humanas de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la relación de abundancia de las células que expresan Ror2 se cuantifica mediante el uso de un anticuerpo monoclonal anti-Ror2.
7. El método de aislamiento, selección y cultivo de células madre mesenquimatosas humanas de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la relación de abundancia de las células que expresan ARNm de Ror2 se cuantifica mediante PCR cuantitativa.
8. El método de aislamiento, selección y cultivo de células madre mesenquimatosas humanas de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende una etapa donde la población celular se prepara directamente a partir de células procedentes de la médula ósea u otros tejidos.
9. El método de aislamiento, selección y cultivo de células madre mesenquimatosas humanas de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende una etapa donde la población celular se prepara mediante cultivo de adhesión de células procedentes de la médula ósea u otros tejidos.
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