JP2007275060A - 緑色蛍光タンパク質を用いる腫瘍モデル - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の目的は、腫瘍が転移するかどうかを評価する方法、腫瘍転移の抑制について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法、腫瘍の処置について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法、および特定の組織へ転移する細胞系の性向を増強する方法、ならびに新しいLOX-GFP-LM細胞系を提供することである。
【解決手段】本発明は、腫瘍が転移するかどうかを評価する方法、腫瘍転移の抑制について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法、腫瘍の処置について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法、および特定の組織へ転移する細胞系の性向を増強する方法に関する。本発明はまた、新しいLOX-GFP-LM細胞系に関する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、腫瘍が転移するかどうかを評価する方法、腫瘍転移の抑制について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法、腫瘍の処置について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法、および特定の組織へ転移する細胞系の性向を増強する方法に関する。本発明はまた、新しいLOX-GFP-LM細胞系に関する。
【選択図】なし
Description
本発明は、腫瘍が転移するかどうかを評価する方法、腫瘍転移の抑制について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法、腫瘍の処置について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法、および特定の組織へ転移する細胞系の性向を増強する方法に関する。本発明はまた、新しいLOX-GFP-LM細胞系に関する。
化学療法剤の活性を評価するための腹膜(腹水)腫瘍増殖を利用するいくつかの例が、LOX黒色腫細胞を利用したものを含め、文献に報告されている。例えば、非特許文献1は、LOX黒色腫細胞が腹水を形成しうること、およびモデルが、約20日目に生存指標(survival endpoint)を用いることにより癌治療用物質を評価するために用いられうることを報告した。2003年において、非特許文献2は、GFPでタグ付けされた胃癌細胞を利用する腹膜モデルを報告した。このモデルは、腹膜細胞増殖の抗癌剤に対する化学感受性を研究するために用いられた。腫瘍負荷量は、腹膜腔からGFP細胞を収集し、細胞をホモジナイズし、10000 gで細胞を遠心分離し、その後、蛍光カウンターを用いて上清の蛍光を測定することにより、測定された。蛍光を生じた細胞の数を推定するために、検量線は、GFP細胞の標準数で用いられた。このモデルにおいて、>1ヶ月が腹膜における腹水産生に必要とされた。
化学療法剤の活性を評価するための転移性腫瘍増殖を利用するいくつかの例は、文献に報告されている。LOX実験転移モデルが、非特許文献3により、1991におけるR.H. Shoemaker et al.により、および非特許文献4により、GFPタグ付き細胞と共に報告された。
例えば、Fodstad et al.は、免疫無防備状態のマウスの尾静脈へ注射されたLOX細胞が、ほとんど100%の頻度で肺へ転移することができることを報告した。しかしながら、コロニーのサイズおよび数は、動物によって異なっており、それに従って、著者らは、注射された細胞数と結果として生じるコロニー数との間の正確な関連を確立することが不可能であることを見出した。このため、彼らは、肺における転移性コロニーを計数よりむしろ、指標として動物の生存を用いた。
R.H. Shoemaker et al. 1991による報告において、LOX-L細胞は、皮下(sc)腫瘍移植の16サイクル、続く、インビトロの増殖のための肺転移の除去により作製された。親細胞系LOXと違って、LOX-L細胞系はsc腫瘍移植から肺へ転移することができたが、LOX細胞は、静脈内(iv)移植からのみ転移することができた。LOX-L sc腫瘍は、化学療法の転移への効果を研究するために利用されたが、著者らは、肺転移の評価のために転移性肺を新しいマウスへ移植するという非常に骨の折れる手順を経た。その後の研究において(非特許文献5)、LOX-Lモデルは、iv移植されたが、転移は、単に、コロニーを計数し、生存指標を利用することだけで評価された。
非特許文献6による報告において、転移モデルは、GFPタグ付きLOXまたはB16黒色腫細胞を利用して確立された。LOX-GFPモデルについて、腫瘍は、同所性に(経皮的に)移植されたが、B16 GFPモデルについて、細胞はivに移植された。GFPは、肺転移を同定するために用いられたが、著者らは、肺転移性腫瘍負荷量を定量化することができず、その代わりとして、主観的(定性的)指標を用いた。彼らは、単に、転移の存在または非存在を確立するために蛍光顕微鏡を利用することにより、生きている動物においてまたは剖検において転移を可視化しただけだった。
R.H. Shoemaker et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 26:330 (1985)
H. Nakanishi et al., Cancer Sci., 94:112-118 (2003)
O. Fodstad et al., Int. J. Cancer, 41:442-449 (1988)
M. Yeng et al., Clin. Cancer Res., 5:3549-3559, (1999)
Wang X et al., Int. J. Cancer, 112:994-1002, 2004
M. Yeng et al., Clin. Cancer Res., 5:3549-4559 (1999)
本発明の目的は、腫瘍が転移するかどうかを評価する方法、腫瘍転移の抑制について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法、腫瘍の処置について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法、および特定の組織へ転移する細胞系の性向を増強する方法、ならびに新しいLOX-GFP-LM細胞系を提供することである。
それゆえに、本発明は、GFP発現腫瘍細胞をヌードまたはSCIDマウスのような胸腺欠損マウスへ注射する段階、続いて、マウスを屠殺する段階、および評価されるべき1つまたは複数の組織を取り出す段階を含む、腫瘍が転移するかどうかを評価する方法を提供する。取り出された組織はホモジナイズされ、ホモジナイズ化試料におけるGFPのレベルは、レーザースキャニング蛍光透視、例えば、Acumen Explorerを用いて定量化された。
本発明（１）は、以下の段階を含む、腫瘍が転移するかどうかを評価する方法である：
(a)GFP発現腫瘍細胞を胸腺欠損マウスへ注射する段階；
(b)マウスを屠殺する段階；
(c)評価されるべき1つまたは複数の組織を取り出す段階；
(d)取り出された組織をホモジナイズする段階；および
(e)レーザースキャニング蛍光透視を用いてホモジナイズされた組織の試料においてGFPのレベルを定量化する段階。
本発明（２）は、腫瘍細胞が黒色腫、乳房、前立腺、肺、膵臓または結腸直腸細胞である、本発明(1)の方法である。
本発明（３）は、腫瘍細胞がLOX、MDA-MB-435、MDA-MB-231、PC-3、DU-145、H460a、A549、MIAPaCa2、HCT116、またはHT-29である、本発明(2)の方法である。
本発明（４）は、腫瘍細胞がLOX細胞である、本発明(3)の方法である。
本発明（５）は、マウスがヌードマウスである、本発明(1)〜(4)のいずれか一発明の方法である。
本発明（６）は、マウスがSCIDマウスである、本発明(1)〜(4)のいずれか一発明の方法である。
本発明（７）は、取り出された組織が肺、肝臓、骨、骨髄、脾臓、リンパ節、腎臓、卵巣または脳である、本発明(1)〜(6)のいずれか一発明の方法である。
本発明（８）は、取り出された組織が肺組織である、本発明(7)の方法である。
本発明（９）は、GFP発現腫瘍細胞がネオマイシン耐性遺伝子を含む、本発明(1)〜(8)のいずれか一発明の方法である。
本発明（１０）は、GFP発現腫瘍細胞が以下の段階により調製される、本発明(1)〜(9)のいずれか一発明の方法である：
(a)GFPタンパク質をコードする核酸を含むベクターを調製する段階；
(b)該ベクターを腫瘍細胞にトランスフェクションする段階。
本発明（１１）は、ベクターがG418選択のためのネオマイシン耐性遺伝子(Neo遺伝子)をさらに含む、本発明(10)の方法である。
本発明（１２）は、GFPがレニラ・ミューレリ(Renilla muelleri)由来である、本発明(1)〜(11)のいずれか一発明の方法である。
本発明（１３）は、以下の段階を含む、腫瘍の転移の抑制について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法である：
(a)胸腺欠損マウスにGFP発現腫瘍細胞を注射する段階；
(b)候補薬物またはプロトコールを該マウスに施す段階；
(c)マウスを屠殺する段階；
(d)転移抑制の評価のための1つまたは複数の組織を取り出す段階；
(e)組織をホモジナイズする段階；
(f)レーザースキャニング蛍光透視を用いて組織のホモジナイズされた試料においてGFPのレベルを定量化する段階；および
(g)ホモジナイズされた試料におけるGFPのレベルを、該候補薬物またはプロトコールで処置されていない対照動物からのレベルと比較する段階であって、処置された試料におけるGFPのレベルの減少が転移の抑制を示す、段階。
本発明（１４）は、腫瘍細胞が黒色腫、乳房、前立腺、肺、膵臓または結腸直腸細胞である、本発明(13)の方法である。
本発明（１５）は、腫瘍細胞がLOX、MDA-MB-435、MDA-MB-231、PC-3、DU-145、H460a、A549、MIAPaCa2、HCT116、またはHT-29である、本発明(14)の方法である。
本発明（１６）は、腫瘍細胞がLOX細胞である、本発明(15)の方法である。
本発明（１７）は、マウスがヌードマウスである、本発明(13)〜(16)のいずれか一発明の方法である。
本発明（１８）は、マウスがSCIDマウスである、本発明(13)〜(16)のいずれか一発明の方法である。
本発明（１９）は、取り出された組織が肺、肝臓、骨、骨髄、脾臓、リンパ節、腎臓、卵巣または脳である、本発明(13)〜(18)のいずれか一発明の方法である。
本発明（２０）は、取り出された組織が肺組織である、本発明(19)の方法である。
本発明（２１）は、GFP発現腫瘍細胞がネオマイシン耐性遺伝子を含む、本発明(13)〜(20)のいずれか一発明の方法である。
本発明（２２）は、GFP発現腫瘍細胞が以下の段階により調製される、本発明(13)〜(21)のいずれか一発明の方法である：
(a)GFPタンパク質をコードする核酸を含むベクターを調製する段階；
(b)該ベクターを腫瘍細胞にトランスフェクションする段階。
本発明（２３）は、ベクターがG418選択のためのNeo遺伝子をさらに含む、本発明(22)の方法である。
本発明（２４）は、GFPがレニラ・ミューレリ由来である、本発明(13)〜(23)のいずれか一発明の方法である。
本発明（２５）は、以下の段階を含む、腫瘍の処置について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法である：
(a)胸腺欠損マウスへGFP発現腫瘍細胞を腹腔内に注射する段階；
(b)候補薬物またはプロトコールを該マウスに施す段階；
(c)評価のための腫瘍を含む腹水または器官を取り出す段階：
(d)レーザースキャニング蛍光透視を用いて腹水またはホモジナイズされた組織の試料においてGFPのレベルを定量化する段階；および
(e)腹水またはホモジナイズされた試料におけるGFPのレベルを、該候補薬物またはプロトコールで処置されていない対照動物からのレベルと比較する段階であって、処置された試料におけるGFPのレベルの減少が候補薬物またはプロトコールが該腫瘍の処置に有用であることを示す、段階。
本発明（２６）は、腫瘍細胞が黒色腫、乳房、前立腺、肺、膵臓または結腸直腸細胞である、本発明(25)の方法である。
本発明（２７）は、腫瘍細胞がLOX、MDA-MB-435、MDA-MB-231、PC-3、DU-145、H460a、A549、MIAPaCa2、HCT116、またはHT-29である、本発明(26)の方法である。
本発明（２８）は、腫瘍細胞がLOX細胞である、本発明(27)の方法である。
本発明（２９）は、マウスがヌードマウスである、本発明(25)〜(28)のいずれか一発明の方法である。
本発明（３０）は、マウスがSCIDマウスである、本発明(25)〜(28)のいずれか一発明の方法である。
本発明（３１）は、取り出された組織が腹水である、本発明(25)〜(30)のいずれか一発明の方法である。
本発明（３２）は、GFP発現腫瘍細胞がネオマイシン耐性遺伝子を含む、本発明(25)〜(31)のいずれか一発明の方法である。
本発明（３３）は、GFP発現腫瘍細胞が以下の段階により調製される、本発明(25)〜(32)のいずれか一発明の方法である：
(a)GFPタンパク質をコードする核酸を含むベクターを調製する段階；
(b)該ベクターを腫瘍細胞にトランスフェクションする段階。
本発明（３４）は、ベクターがG418選択のためのNeo遺伝子をさらに含む、本発明(33)の方法である。
本発明（３５）は、GFPがレニラ・ミューレリ由来である、本発明(25)〜(34)のいずれか一発明の方法である。
本発明（３６）は、腹水が取り出されて、評価される、本発明(25)〜(35)のいずれか一発明の方法である。
本発明（３７）は、器官が取り出されて、評価される、本発明(25)〜(36)のいずれか一発明の方法である。
本発明（３８）は、以下の段階を含む、特定の組織へ転移する細胞系の性向を増強する方法である：
(a)胸腺欠損マウスへGFP発現腫瘍細胞を腹腔内に注射する段階；
(b)マウスを屠殺する段階；
(c)マウスから生じる腹水を取り出す段階；
(d)腹水を胸腺欠損マウスへ静脈内に注射する段階；
(e)マウスを屠殺する段階；
(f)転移が増強される組織を取り出す段階；
(g)取り出された組織からGFP発現腫瘍細胞を回収する段階；
(h)回収された細胞をインビトロで培養する段階；
(i)段階(h)からの培養された細胞を胸腺欠損マウスへ注射する段階であって、培養された腫瘍細胞が、最初のGFP発現腫瘍細胞より大きい程度で、段階(f)で取り出された組織へ転移する、段階。
本発明（３９）は、腫瘍細胞が黒色腫、乳房、前立腺、肺、膵臓または結腸直腸細胞である、本発明(38)の方法である。
本発明（４０）は、腫瘍細胞がLOX、MDA-MB-435、MDA-MB-231、PC-3、DU-145、H460a、A549、MIAPaCa2、HCT116、またはHT-29である、本発明(39)の方法である。
本発明（４１）は、腫瘍細胞がLOX細胞である、本発明(40)の方法である。
本発明（４２）は、マウスがヌードマウスである、本発明(38)〜(41)のいずれか一発明の方法である。
本発明（４３）は、マウスがSCIDマウスである、本発明(38)〜(41)のいずれか一発明の方法である。
本発明（４４）は、取り出された組織が肺、肝臓、骨、骨髄、脾臓、リンパ節、腎臓、卵巣または脳である、本発明(38)〜(43)のいずれか一発明の方法である。
本発明（４５）は、取り出された組織が肺である、本発明(44)の方法である。
本発明（４６）は、GFP発現腫瘍細胞がネオマイシン耐性遺伝子を含む、本発明(38)の方法である。
本発明（４７）は、GFP発現腫瘍細胞が以下の段階により調製される、本発明(38)〜(46)のいずれか一発明の方法である：
(a)GFPタンパク質をコードする核酸を含むベクターを調製する段階；
(b)該ベクターを腫瘍細胞にトランスフェクションする段階。
本発明（４８）は、ベクターがG418選択のためのNeo遺伝子をさらに含む、本発明(47)の方法である。
本発明（４９）は、GFPがレニラ・ミューレリ由来である、本発明(38)〜(48)のいずれか一発明の方法である。
本発明（５０）は、LOX-GFP-LM細胞系である。
(a)GFP発現腫瘍細胞を胸腺欠損マウスへ注射する段階；
(b)マウスを屠殺する段階；
(c)評価されるべき1つまたは複数の組織を取り出す段階；
(d)取り出された組織をホモジナイズする段階；および
(e)レーザースキャニング蛍光透視を用いてホモジナイズされた組織の試料においてGFPのレベルを定量化する段階。
本発明（２）は、腫瘍細胞が黒色腫、乳房、前立腺、肺、膵臓または結腸直腸細胞である、本発明(1)の方法である。
本発明（３）は、腫瘍細胞がLOX、MDA-MB-435、MDA-MB-231、PC-3、DU-145、H460a、A549、MIAPaCa2、HCT116、またはHT-29である、本発明(2)の方法である。
本発明（４）は、腫瘍細胞がLOX細胞である、本発明(3)の方法である。
本発明（５）は、マウスがヌードマウスである、本発明(1)〜(4)のいずれか一発明の方法である。
本発明（６）は、マウスがSCIDマウスである、本発明(1)〜(4)のいずれか一発明の方法である。
本発明（７）は、取り出された組織が肺、肝臓、骨、骨髄、脾臓、リンパ節、腎臓、卵巣または脳である、本発明(1)〜(6)のいずれか一発明の方法である。
本発明（８）は、取り出された組織が肺組織である、本発明(7)の方法である。
本発明（９）は、GFP発現腫瘍細胞がネオマイシン耐性遺伝子を含む、本発明(1)〜(8)のいずれか一発明の方法である。
本発明（１０）は、GFP発現腫瘍細胞が以下の段階により調製される、本発明(1)〜(9)のいずれか一発明の方法である：
(a)GFPタンパク質をコードする核酸を含むベクターを調製する段階；
(b)該ベクターを腫瘍細胞にトランスフェクションする段階。
本発明（１１）は、ベクターがG418選択のためのネオマイシン耐性遺伝子(Neo遺伝子)をさらに含む、本発明(10)の方法である。
本発明（１２）は、GFPがレニラ・ミューレリ(Renilla muelleri)由来である、本発明(1)〜(11)のいずれか一発明の方法である。
本発明（１３）は、以下の段階を含む、腫瘍の転移の抑制について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法である：
(a)胸腺欠損マウスにGFP発現腫瘍細胞を注射する段階；
(b)候補薬物またはプロトコールを該マウスに施す段階；
(c)マウスを屠殺する段階；
(d)転移抑制の評価のための1つまたは複数の組織を取り出す段階；
(e)組織をホモジナイズする段階；
(f)レーザースキャニング蛍光透視を用いて組織のホモジナイズされた試料においてGFPのレベルを定量化する段階；および
(g)ホモジナイズされた試料におけるGFPのレベルを、該候補薬物またはプロトコールで処置されていない対照動物からのレベルと比較する段階であって、処置された試料におけるGFPのレベルの減少が転移の抑制を示す、段階。
本発明（１４）は、腫瘍細胞が黒色腫、乳房、前立腺、肺、膵臓または結腸直腸細胞である、本発明(13)の方法である。
本発明（１５）は、腫瘍細胞がLOX、MDA-MB-435、MDA-MB-231、PC-3、DU-145、H460a、A549、MIAPaCa2、HCT116、またはHT-29である、本発明(14)の方法である。
本発明（１６）は、腫瘍細胞がLOX細胞である、本発明(15)の方法である。
本発明（１７）は、マウスがヌードマウスである、本発明(13)〜(16)のいずれか一発明の方法である。
本発明（１８）は、マウスがSCIDマウスである、本発明(13)〜(16)のいずれか一発明の方法である。
本発明（１９）は、取り出された組織が肺、肝臓、骨、骨髄、脾臓、リンパ節、腎臓、卵巣または脳である、本発明(13)〜(18)のいずれか一発明の方法である。
本発明（２０）は、取り出された組織が肺組織である、本発明(19)の方法である。
本発明（２１）は、GFP発現腫瘍細胞がネオマイシン耐性遺伝子を含む、本発明(13)〜(20)のいずれか一発明の方法である。
本発明（２２）は、GFP発現腫瘍細胞が以下の段階により調製される、本発明(13)〜(21)のいずれか一発明の方法である：
(a)GFPタンパク質をコードする核酸を含むベクターを調製する段階；
(b)該ベクターを腫瘍細胞にトランスフェクションする段階。
本発明（２３）は、ベクターがG418選択のためのNeo遺伝子をさらに含む、本発明(22)の方法である。
本発明（２４）は、GFPがレニラ・ミューレリ由来である、本発明(13)〜(23)のいずれか一発明の方法である。
本発明（２５）は、以下の段階を含む、腫瘍の処置について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法である：
(a)胸腺欠損マウスへGFP発現腫瘍細胞を腹腔内に注射する段階；
(b)候補薬物またはプロトコールを該マウスに施す段階；
(c)評価のための腫瘍を含む腹水または器官を取り出す段階：
(d)レーザースキャニング蛍光透視を用いて腹水またはホモジナイズされた組織の試料においてGFPのレベルを定量化する段階；および
(e)腹水またはホモジナイズされた試料におけるGFPのレベルを、該候補薬物またはプロトコールで処置されていない対照動物からのレベルと比較する段階であって、処置された試料におけるGFPのレベルの減少が候補薬物またはプロトコールが該腫瘍の処置に有用であることを示す、段階。
本発明（２６）は、腫瘍細胞が黒色腫、乳房、前立腺、肺、膵臓または結腸直腸細胞である、本発明(25)の方法である。
本発明（２７）は、腫瘍細胞がLOX、MDA-MB-435、MDA-MB-231、PC-3、DU-145、H460a、A549、MIAPaCa2、HCT116、またはHT-29である、本発明(26)の方法である。
本発明（２８）は、腫瘍細胞がLOX細胞である、本発明(27)の方法である。
本発明（２９）は、マウスがヌードマウスである、本発明(25)〜(28)のいずれか一発明の方法である。
本発明（３０）は、マウスがSCIDマウスである、本発明(25)〜(28)のいずれか一発明の方法である。
本発明（３１）は、取り出された組織が腹水である、本発明(25)〜(30)のいずれか一発明の方法である。
本発明（３２）は、GFP発現腫瘍細胞がネオマイシン耐性遺伝子を含む、本発明(25)〜(31)のいずれか一発明の方法である。
本発明（３３）は、GFP発現腫瘍細胞が以下の段階により調製される、本発明(25)〜(32)のいずれか一発明の方法である：
(a)GFPタンパク質をコードする核酸を含むベクターを調製する段階；
(b)該ベクターを腫瘍細胞にトランスフェクションする段階。
本発明（３４）は、ベクターがG418選択のためのNeo遺伝子をさらに含む、本発明(33)の方法である。
本発明（３５）は、GFPがレニラ・ミューレリ由来である、本発明(25)〜(34)のいずれか一発明の方法である。
本発明（３６）は、腹水が取り出されて、評価される、本発明(25)〜(35)のいずれか一発明の方法である。
本発明（３７）は、器官が取り出されて、評価される、本発明(25)〜(36)のいずれか一発明の方法である。
本発明（３８）は、以下の段階を含む、特定の組織へ転移する細胞系の性向を増強する方法である：
(a)胸腺欠損マウスへGFP発現腫瘍細胞を腹腔内に注射する段階；
(b)マウスを屠殺する段階；
(c)マウスから生じる腹水を取り出す段階；
(d)腹水を胸腺欠損マウスへ静脈内に注射する段階；
(e)マウスを屠殺する段階；
(f)転移が増強される組織を取り出す段階；
(g)取り出された組織からGFP発現腫瘍細胞を回収する段階；
(h)回収された細胞をインビトロで培養する段階；
(i)段階(h)からの培養された細胞を胸腺欠損マウスへ注射する段階であって、培養された腫瘍細胞が、最初のGFP発現腫瘍細胞より大きい程度で、段階(f)で取り出された組織へ転移する、段階。
本発明（３９）は、腫瘍細胞が黒色腫、乳房、前立腺、肺、膵臓または結腸直腸細胞である、本発明(38)の方法である。
本発明（４０）は、腫瘍細胞がLOX、MDA-MB-435、MDA-MB-231、PC-3、DU-145、H460a、A549、MIAPaCa2、HCT116、またはHT-29である、本発明(39)の方法である。
本発明（４１）は、腫瘍細胞がLOX細胞である、本発明(40)の方法である。
本発明（４２）は、マウスがヌードマウスである、本発明(38)〜(41)のいずれか一発明の方法である。
本発明（４３）は、マウスがSCIDマウスである、本発明(38)〜(41)のいずれか一発明の方法である。
本発明（４４）は、取り出された組織が肺、肝臓、骨、骨髄、脾臓、リンパ節、腎臓、卵巣または脳である、本発明(38)〜(43)のいずれか一発明の方法である。
本発明（４５）は、取り出された組織が肺である、本発明(44)の方法である。
本発明（４６）は、GFP発現腫瘍細胞がネオマイシン耐性遺伝子を含む、本発明(38)の方法である。
本発明（４７）は、GFP発現腫瘍細胞が以下の段階により調製される、本発明(38)〜(46)のいずれか一発明の方法である：
(a)GFPタンパク質をコードする核酸を含むベクターを調製する段階；
(b)該ベクターを腫瘍細胞にトランスフェクションする段階。
本発明（４８）は、ベクターがG418選択のためのNeo遺伝子をさらに含む、本発明(47)の方法である。
本発明（４９）は、GFPがレニラ・ミューレリ由来である、本発明(38)〜(48)のいずれか一発明の方法である。
本発明（５０）は、LOX-GFP-LM細胞系である。
本発明により、腫瘍が転移するかどうかを評価する方法、腫瘍転移の抑制について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法、腫瘍の処置について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法、および特定の組織へ転移する細胞系の性向を増強する方法、ならびに新しいLOX-GFP-LM細胞系が提供された。
好ましくは、GFP発現腫瘍細胞は、胸腺欠損マウスへ静脈内に注射される。好ましくは、胸腺欠損マウスは、ヌードマウスまたはSCIDマウスである。
緑色蛍光タンパク質(GFP)は、ある種のソフトサンゴにより産生される発光タンパク質である。GFPは、レニラ・ミューレリ(Renilla muelleri)、レニラ・レニフォルミス(Renilla reniformis)、レニラ・コリケリ(Renilla kollikeri)、アエルオレア・ビクトリア(Aeruorea victoria)を含む様々な異なる源から得られうる。任意のGFP分子を本発明に用いることができるが、好ましいGFPは、レニラ・ミューレリ由来である。
好ましくは、本発明の方法に用いられる腫瘍細胞は、黒色腫、乳房、前立腺、肺、膵臓、または結腸直腸細胞である。より好ましくは、腫瘍細胞は、LOX、MDA-MB-435、MDA-MB-231、PC-3、DU-145、H460a、A549、MIAPaCa2、HCT116、またはHT-29である。最も好ましくは、腫瘍細胞はLOX細胞である。
好ましいGFP発現腫瘍細胞は、LOX-GFP細胞である。より好ましくは、GFP発現腫瘍細胞は、LOX-GFP-LM細胞である。
LOX-GFP細胞系は、National Cancer Institute (NCI)から得られたLOX黒色腫細胞の、下記のようなバイシストロン性GFP構築物でのトランスフェクションにより作られた細胞系である。
LOX-GFP-LM細胞系は、胸腺欠損マウスにLOX-GFP細胞を腹腔内に注射し、マウスからLOX-GFP細胞を含む腹水を取り出し、その腹水をマウスへ静脈内に注射し、結果として生じる転移性肺をマウスから収集し、転移性肺組織から回収されたGFP発現腫瘍細胞のコロニーをインビトロで培養することにより作られた細胞系である。
ヒト黒色腫細胞系LOXは、腫瘍細胞が腹腔内に移植された場合の腹水か、または静脈内に接種された場合の肺転移かのいずれかを引き起こすことができる。腹水モデルは、迅速な薬物スクリーニングモデルとして用いることができるのに対し、肺転移モデルは抗転移性薬剤を評価するために有用でありうる。両方のモデルにおいて、腫瘍増殖および効力の定量的分析は、腫瘍負荷量評価の難しさのために難題であった。この問題を解決するために、本発明は、GFPでトランスフェクションされたLOX細胞(LOX-GFPと呼ばれる)を提供し、このマーカーは、腹水または肺において腫瘍負荷量を分析するために利用された。
腹水モデルについて、10×106個のLOX-GFP細胞が、Nu/Nuマウスにおいて腹腔内に接種され、腹水は、7日間後に採取された。腹水は、蛍光顕微鏡下で可視化され、相対的蛍光は、Acumen Explorerを利用して定量化された。このモデルにおける抗増殖性効力は、細胞傷害性薬剤Taxol、およびいくつかの開発化合物を用いて確証された。
肺転移モデルについて、LOX-GFP-LMと呼ばれる新しい細胞系が確立された；この細胞系は、LOX-GFP細胞の静脈内接種を通して誘導された、マウスにおける肺転移コロニーから単離された。LOX-GFP-LM細胞系は、2×106個の細胞のIV接種から25〜30日後、再現可能的に肺にコロニーを形成した。肺が採取され、蛍光顕微鏡下で可視化され、ホモジナイズ化肺懸濁液の相対的蛍光が、Acumen Explorerを利用して評価された。抗転移性効力は、伝統的な皮下異種移植研究において広くかつ強力な抗腫瘍活性をもつことが以前に示された2つの開発化合物を利用して、このモデルにおいて確証された。2つの新しい細胞系(LOX-GFPおよびLOX-GFP-LM)を親細胞系(LOX)と比較するために、遺伝子アレイ分析および腫瘍組織病理学が特徴づけられた。
一つの態様において、本発明は、結果として、より良好な定量的腫瘍負荷量評価および改善された効力評価をもたらす、マウスにおける2つのヒト黒色腫LOXモデルへのGFPの適用を提供する。これらの改善されたモデルは、新規な癌治療用物質の腹水または実験的転移評価のための実行可能な代替法を提供するはずである。
好ましい態様において、GFP発現腫瘍細胞は、ネオマイシン耐性遺伝子を含む。
GFP発現腫瘍細胞は、(a)GFPタンパク質をコードする核酸を含むベクターの調製、および(b)該ベクターによる腫瘍細胞のトランスフェクションにより調製されうる。好ましくは、ベクターは、G418選択のためにネオマイシン耐性遺伝子(Neo遺伝子)をさらに含む。好ましいGFPは、レニラ・ミューレリ由来のGFPである。
好ましい態様において、ベクターは、バイシストロン性GFP構築物である。バイシストロン性構築物とは、発現ベクターへ挿入された2つの遺伝子を含む哺乳動物発現ベクターを意味する。バイシストロン性GFP構築物は、2つの遺伝子の1つがGFP分子をコードするバイシストロン性構築物である。好ましくは、GFPは、レニラ・ミューレリ由来GFPである。好ましくは、他方の遺伝子は、G418選択のためにNeo(ネオマイシン耐性遺伝子)をコードする。好ましい哺乳動物発現ベクターは、pCMV-tag5A(Stratagene、Genbankアクセッション番号AF076312)である。
マウスから取り出される組織は、好ましくは、肺、肝臓、骨、骨髄、脾臓、リンパ節、腎臓、卵巣、または脳由来の組織である。より好ましくは、取り出される組織は肺組織である。
本発明はまた、胸腺欠損マウスにGFP発現腫瘍細胞を注射する段階、および候補薬物またはプロトコールをマウスに施す段階を含む、腫瘍の転移の抑制について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法を提供する。マウスは、その後屠殺され、1つまたは複数の組織が転移抑制の評価のために取り出される。取り出された組織はホモジナイズされ、組織のホモジナイズ化試料におけるGFPのレベルが、レーザースキャニング蛍光透視を用いて定量化される。GFPレベルは、候補薬物またはプロトコールで処置されなかった対照動物由来のホモジナイズ化試料におけるGFPのレベルと比較される。対照試料と比較した、処置された試料におけるGFPのレベルの減少は、転移の抑制を示す。好ましくは、GFP発現腫瘍細胞は、胸腺欠損マウスへ静脈内に注射される。
任意のGFPを用いてもよい。好ましくは、レニラ・ミューレリ由来のGFPが用いられる。
好ましくは、胸腺欠損マウスは、ヌードマウスまたはSCIDマウスである。
マウスから取り出される組織は、好ましくは、肺、肝臓、骨、骨髄、脾臓、リンパ節、腎臓、卵巣、または脳由来の組織である。より好ましくは、取り出される組織は、肺組織である。
好ましくは、本発明の方法に用いられる腫瘍細胞は、黒色腫、乳房、前立腺、肺、膵臓、または結腸直腸細胞である。より好ましくは、腫瘍細胞は、LOX、MDA-MB-435、MDA-MB-231、PC-3、DU-145、H460a、A549、MIAPaCa2、HCT116、またはHT-29である。最も好ましくは、腫瘍細胞はLOX細胞である。
好ましいGFP発現腫瘍細胞は、LOX-GFP細胞である。より好ましくは、GFP発現腫瘍細胞は、LOX-GFP-LM細胞である。
好ましい態様において、GFP発現腫瘍細胞は、ネオマイシン耐性遺伝子を含む。
GFP発現腫瘍細胞は、(a)GFPタンパク質をコードする核酸を含むベクターの調製、および(b)該ベクターによる腫瘍細胞のトランスフェクションにより調製してもよい。好ましくは、本ベクターは、G418選択のためにネオマイシン耐性遺伝子(Neo遺伝子)をさらに含む。GFPタンパク質は、好ましくは、レニラ・ミューレリ由来のGFPである。
好ましい態様において、ベクターは、バイシストロン性GFP構築物である。バイシストロン性構築物とは、発現ベクターへ挿入された2つの遺伝子を含む哺乳動物発現ベクターを意味する。バイシストロン性GFP構築物は、2つの遺伝子の1つがGFP分子をコードするバイシストロン性構築物である。好ましくは、GFPは、レニラ・ミューレリ由来GFPである。好ましくは、他方の遺伝子は、G418選択のためにNeo(ネオマイシン耐性遺伝子)をコードする。好ましい哺乳動物発現ベクターは、pCMV-tag 5A(Stratagene、Genbankアクセッション番号AF076312)である。
本発明はまた、胸腺欠損マウスにGFP発現腫瘍細胞を腹腔内に注射する段階、および候補薬物またはプロトコールをマウスに施す段階を含む、腫瘍の処置について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法を提供する。腫瘍を含む腹水または器官は評価のために取り出され、腹水またはホモジナイズ化組織の試料におけるGFPのレベルが、レーザースキャニング蛍光透視を用いて定量化される。腹水またはホモジナイズ化試料におけるGFPレベルは、その後、候補薬物またはプロトコールで処置されなかった対照動物由来のレベルと比較される。対照試料と比較した、処置された試料におけるGFPのレベルの減少は、候補薬物またはプロトコールが該腫瘍の処置に有用であることを示す。
任意のGFPを用いてもよい。好ましくは、レニラ・ミューレリ由来のGFPが用いられる。
好ましくは、胸腺欠損マウスは、ヌードマウスまたはSCIDマウスである。
マウスから取り出される組織は、好ましくは腹水である。
好ましくは、本発明の方法に用いられる腫瘍細胞は、黒色腫、乳房、前立腺、肺、膵臓、または結腸直腸細胞である。より好ましくは、腫瘍細胞は、LOX、MDA-MB-435、MDA-MB-231、PC-3、DU-145、H460a、A549、MIAPaCa2、HCT116、またはHT-29である。最も好ましくは、腫瘍細胞はLOX細胞である。
好ましいGFP発現腫瘍細胞は、LOX-GFP細胞である。
好ましい態様において、GFP発現腫瘍細胞はネオマイシン耐性遺伝子を含む。
GFP発現腫瘍細胞は、(a)GFPタンパク質をコードする核酸を含むベクターを調製すること、および(b)該ベクターで腫瘍細胞をトランスフェクションすることにより調製されうる。好ましくは、ベクターは、G418選択のためにネオマイシン耐性遺伝子(Neo遺伝子)をさらに含む。GFPタンパク質は、好ましくはレニラ・ミューレリ由来のGFPである。
好ましい態様において、ベクターは、バイシストロン性GFP構築物である。バイシストロン性構築物とは、発現ベクターへ挿入された2つの遺伝子を含む哺乳動物発現ベクターを意味する。バイシストロン性GFP構築物は、2つの遺伝子の1つがGFP分子をコードするバイシストロン性構築物である。好ましくは、GFPは、レニラ・ミューレリ由来GFPである。好ましくは、他方の遺伝子は、G418選択のためにNeo(ネオマイシン耐性遺伝子)をコードする。好ましい哺乳動物発現ベクターは、pCMV-tag 5A(Stratagene、Genbankアクセッション番号AF076312)である。
本発明は、胸腺欠損マウスに、GFPを発現する腫瘍細胞を腹腔内に注射する段階、マウスにおいて形成された腹水を取り出す段階、およびもう一匹の胸腺欠損マウスへ腹腔内にそれを注射する段階を含む、特定の組織へ転移させる腫瘍細胞系の性向を増強する方法を提供する。マウスは屠殺され、転移が増強される組織が取り出される。GFP発現腫瘍細胞はその後取り出された組織から回収され、インビトロで培養され、胸腺欠損マウスへ注射され、培養された腫瘍細胞は、その細胞が回収された組織へ、最初のGFP発現腫瘍細胞よりも大きい程度で転移する。
任意のGFPが用いてもよい。好ましくは、レニラ・ミューレリ由来のGFPが用いられる。
好ましくは、胸腺欠損マウスはヌードマウスまたはSCIDマウスである。
マウスから取り出される組織は、好ましくは、肺、肝臓、骨、骨髄、脾臓、リンパ節、腎臓、卵巣、または脳由来の組織である。より好ましくは、取り出される組織は肺組織である。
好ましくは、本発明の方法に用いられる腫瘍細胞は、黒色腫、乳房、前立腺、肺、膵臓、または結腸直腸細胞である。より好ましくは、腫瘍細胞は、LOX、MDA-MB-435、MDA-MB-231、PC-3、DU-145、H460a、A549、MIAPaCa2、HCT116、またはHT-29である。最も好ましくは、腫瘍細胞はLOX細胞である。
好ましいGFP発現腫瘍細胞は、LOX-GFP細胞である。
好ましい態様において、GFP発現腫瘍細胞はネオマイシン耐性遺伝子を含む。
GFP発現腫瘍細胞は、(a)FPGタンパク質をコードする核酸を含むベクターを調製すること、および(b)該ベクターで腫瘍細胞をトランスフェクションすることにより調製されうる。好ましくは、本ベクターは、G418選択のためにネオマイシン耐性遺伝子(Neo遺伝子)をさらに含む。
好ましい態様において、ベクターはバイシストロン性GFP構築物である。バイシストロン性構築物とは、発現ベクターへ挿入された2つの遺伝子を含む哺乳動物発現ベクターを意味する。バイシストロン性GFP構築物は、2つの遺伝子の1つがGFP分子をコードするバイシストロン性構築物である。好ましくは、GFPは、レニラ・ミューレリ由来GFPである。好ましくは、他方の遺伝子は、G418選択のためにNeo(ネオマイシン耐性遺伝子)をコードする。好ましい哺乳動物発現ベクターは、pCMV-tag 5A(Stratagene、Genbankアクセッション番号AF076312)である。
本発明はさらに、親のLOX-GFP細胞系より大きい程度で、肺へ転移するLOX-GFP-LM細胞系を提供する。この細胞系は、本明細書に記載されたアッセイ法における利点をもたらす。
本発明は、以前に用いられたモデルよりも非常に短い期間をもつモデルを作製するために、以前に用いられたLOX腹膜(腹水)モデルにいくつかの主要な改変を提供する。本モデルは、指標としての、細胞数の迅速な定量化を可能にする。以前の研究についての期間はたった20日間で非常に短かったが、本モデルは、単独指標としての生存に頼らず、7日間ほどで完了されうる。
本モデルは、GFPでタグ付けされた細胞を利用するが、腹水定量化の方法は、ホモジナイゼーションおよび遠心分離段階を除去することにより改善されている。本発明のプロセスは、レーザースキャニング蛍光透視を用いて、例えば、Acumen Explorerを用いて、腹水から細胞数を直接的に測定する。
本発明は、肺を取り出し、転移性腫瘍負荷量が蛍光を測定することにより正確に定量化できるように、GFPを細胞へ安定的にトランスフェクションすることにより、以前に記載されたLOX実験転移モデルに対し重要な改善を提供する。この方法は、(たとえ、科学的に関連性がある場合に何度かモニターしたとしても)指標としての生存への依存を低減する。本発明のモデルは、LOX-L細胞を用いるよりむしろ、LOX細胞のiv移植を用いる実験転移モデルを利用する。加えて、転移は、コロニーの計数および生存に頼るよりむしろ、それらの方法が転移性腫瘍負荷量における小さな差を識別するのに十分なほど正確ではないため、GFPタグ付き細胞を用いて定量化される。
本発明のモデルにおいて、転移性腫瘍負荷量は、様々な処置スケジュールを用いる実験的治療法の抗転移能力を正確に評価するために定量化される。それゆえに、肺を取り出し、それらをホモジナイズし、媒体処置マウス 対 治療処置マウスからの肺の相対的蛍光を測定することに有利なように、インビボで転移を可視化する段階は省かれた。
一つの局面において、本発明は、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現させるLOX黒色腫細胞系の安定なクローン、およびインビボでの可能性のある臨床的候補治療法、すなわち薬物およびプロトコールの抗腫瘍効力を評価するためのアッセイ法を提供する。特に、本発明は2つの異なるインビボモデルを提供する；(1)効力についての化合物の迅速なスクリーニングのための短い(7〜10日)腹膜(腹水)モデル、および(2)新規な癌治療用物質の抗転移能力の評価のための実験的転移モデル。
もう一つの局面において、本発明は、可能性のある、インビボでの癌の臨床的候補治療法の、抗腫瘍効力の迅速なスクリーニングのための腹膜(腹水)モデルを提供する。本モデルは、それが7日間ほどで効力データを提供し、かつ定性的よりむしろ定量的データを提供する点において独特である。
さらにもう一つの局面において、本発明は、可能性のある、インビボでの癌の臨床的候補治療法の抗腫瘍効力を評価するための実験的転移モデルを提供する。本モデルは、それが単独指標としての生存に頼るよりむしろ転移性腫瘍負荷量に関する定量化データを提供する点において独特である。
自発性転移モデルは、原発腫瘍が動物において確立され、いかなる操作または介入もなしに増殖しかつ二次部位へ広がるのを可能にされているモデルである。このプロセスは、原発腫瘍由来の細胞が、それらの自然の能力を通して循環系への侵入し、その後、遠位部位において播種および増殖することを必要とする。
実験的転移モデルは、原発腫瘍が確立されていないモデルである。細胞は、遠位部位への転移の播種および増殖プロセスを模倣するように循環系へ直接的に注入される。
緑色蛍光タンパク質を安定的に発現させる腫瘍細胞は、例えば、以下の様式で調製してもよい：確立された腫瘍細胞系由来の腫瘍細胞は、バイシストロン性GFP構築物で通常の様式でトランスフェクションされうる。バイシストロン性GFP構築物の調製は、実施例1に記載されている。例えば、Fugene、多成分の脂質に基づいた(非リポソームの)トランスフェクション試薬(Roche Molecular Diagnostics)は、RPMI 1640のような無血清培地へ添加され、続いて、バイシストロン性GFP構築物が添加されうる。Fugene 対 構築物の比は変わりうるが、比は、有利には、3:1である。試料は、例えば室温で約30分間インキュベートされ、混合物は、腫瘍細胞のフラスコへ移される。腫瘍細胞は、培養中約80%の割当てで存在する。細胞は、約6時間インキュベートされ、その後、インキュベーション培地が除去され、1%ジェネテシン(Geneticin)(G418)を含む選択培地が添加される。
G418耐性についての選択は、数週間、例えば3〜6週間かかり、その後、細胞は、最も多いGFP発現を示すものについて選別される。上位5%のGFP発現細胞集団が、その後、選択、単離、増殖、および100%のGFP発現を有する細胞を得るようにさらに選別される。
対応する親の腫瘍細胞系よりも積極的に特定の組織へ転移する腫瘍細胞は、例えば以下の様式で調製されうる：胸腺欠損マウスは、約1〜2千万個のGFP発現腫瘍細胞を、それぞれ、好ましくは腹腔内に(ip)移植される。約10〜14日後、GFP発現腫瘍細胞を含む腹水がマウスから採取され、腹水は、PBSで希釈される。腹水/PBS溶液は、40μmナイロン細胞ストレーナーを通して濾過され、約1500rpmで遠心分離される。ペレット化された細胞はPBSに再懸濁され、所望の細胞濃度に達するように計数される。
胸腺欠損マウスは、その後、腹水から単離されたGFP発現腫瘍細胞(上記)を、静脈内(iv)、例えば尾静脈経由で移植される。細胞は、好ましくは、約1×106細胞/マウスと約2×106細胞/マウスの間の濃度で移植される。マウスが瀕死であるかまたは死ぬとすぐに、対象となる組織、例えば肺または乳房組織が単離され、可能性のある微小転移を見るために蛍光立体顕微鏡下で調べられる。
非常に強い発現を示すGFP発現腫瘍細胞のコロニーは、例えば穏やかな切開により、組織から回収される。コロニーは、その後、滅菌金網(No. 40)上ですりつぶされ、2〜3mlの培地で洗浄され、約1500rpmで遠心分離されうる。細胞ペレットは、その後、好ましくは約10%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび約10%ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI 1640培地などの無血清培地中で洗浄されうる。細胞は、約10%FBSおよび約2%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地のフラスコへ接種される。細胞は、いかなるマウス細胞混入物も除去するために、G418を含む選択培地において日常的に継代される。いくつかの、好ましくは2〜3継代後の培養物はスケールアップされ、将来的な使用のために凍結されうる。細胞は、それらが単離された組織へ、最初のGFP発現腫瘍細胞よりも大きい程度で、転移するものと思われる。この能力は、以下のアッセイ法により示されうる。以下、これらを、増強転移性腫瘍細胞(EMTC)と呼ぶものとする。
胸腺欠損マウスには、約1×106個〜約5×106個のEMTCが尾静脈へiv移植される。移植後約25〜30日目に瀕死率または死亡率が評価され、マウスは安楽死させられる。細胞が転移したと予想される組織が単離され、PBS中にホモジナイズされる。試料、例えば、ホモジナイズされた組織の0.1mlが96ウェルプレートへ移され、蛍光が、レーザースキャニング蛍光透視により、例えば、Acumen Explorerを用いて測定される。
上記手順により調製および評価された細胞系は、癌の処置および/または転移の抑制についての、候補治療法、特に臨床的薬物候補およびプロトコールの評価にとって価値がある。腫瘍に対する候補治療の評価のために、PBS中のGFP発現腫瘍細胞が、胸腺欠損マウスへ腹腔内(ip)注射される。好ましくは、約500μlのPBSの容量における約1千万個の細胞が注射される。マウスは対照および処置群に分けられ、処置群は、候補薬物またはプロトコールで処置される。GFP発現腫瘍細胞が、最初マウスへ注射され、続いて候補薬物もしくはプロトコールでの処置が行われうるか、または候補薬物もしくはプロトコールが施され、続いてGFP発現腫瘍細胞でのマウスの注射が行われうることが、理解されるべきである。
腹水は、マウスを安楽死させ、腹膜から腹水を吸引することにより採取される。腹腔は、生理食塩水ですすがれ、その生理食塩水は、その後回収される。腹水および回収された生理食塩水はチューブへ移され、単一細胞懸濁液を得るために40μmナイロンフィルターを通して濾過され、約1500rpmで約10分間遠心分離される。上清は除去され、細胞ペレットは、新鮮な生理食塩水に再懸濁される。各マウスからの試料、例えば0.1mlはレーザースキャニング蛍光透視、例えばAcumen Explorerを利用して細胞数(相対的蛍光単位として報告される)を評価するために96ウェルプレートへ移される。処置されたマウスが対照群よりも低い相対的蛍光を示す場合には、候補治療がその種の腫瘍の処置に有用である。
転移を抑制するための候補治療の評価について、10%FBSおよび1%ジェネテシン(G418)を加えたRPMI 1640培地に維持された増強転移性腫瘍細胞が、胸腺欠損マウスに尾静脈を経由して静脈内に注射される。好ましくは、約200μl無血清RPMI 1640の容量における約2百万個の細胞が用いられる。マウスは、対照群および処置群へランダム化され、処置群は、候補薬物またはプロトコールで処置される。EMTCが最初マウスへ注射され、続いて候補薬物もしくはプロトコールでの処置が行われうるか、または候補薬物もしくはプロトコールが施され、続いてEMTCでのマウスの注射が行われうることが、理解されるべきである。対照マウスが瀕死である時、またはそれらが死んだ時、それらの転移性腫瘍負荷量が評価される。
生存に加えて、抗転移性効力の定量的評価は、組織ホモジネートの蛍光強度を測定することにより本発明を用いてなされうる。生きているマウスは安楽死させられ、評価されるべき組織は、回収されて生理食塩水にホモジナイズされる。各マウスからの組織ホモジネート試料、例えば0.2mlは96ウェルプレートへ移され、蛍光がその後、レーザースキャニング蛍光透視、例えばAcumen Explorerを用いて読み取られる。この方法を用いて、対照群と比較した転移の量が測定されうる。処置されたマウスがより低い転移性腫瘍負荷量を示す場合、候補薬物は転移を抑制する。
ここで、本発明を一般的に記載してきたが、その同じことが、特定の実施例を参照することによりより十分に理解されるようになるものと考えられ、これらは、以下の図と共に、例証のみを目的として本明細書に含まれ、かつ他に特定されない限り限定することを意図しない。
実施例1：バイシストロン性GFP構築物の調製
バイシストロン性GFP構築物が調製され、およびAnne Chua and Ueli Gublerにより提供され、かつレニラ・ミューレリGFP(Prolume Ltd., Pinetop, AZ)およびG418選択のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(ネオマイシン耐性マーカー)の両方についての遺伝子を含んだ。R. ミューレリGFPの配列は、以下のように哺乳動物発現ベクターへと操作された。ベクター「pCMV-tag 5A」(Stratagene, Genbankアクセッション番号AF076312)が、最初、単一のNotI部位とBstBI部位の間の配列断片を除去することにより改変された。これは、ColE1複製起点、HSV-TKポリA配列、およびCMVプロモーターからなるプラスミドバックボーンを残す。除去される断片は、その後、[IRES-ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性マーカー]をコードする断片に置換された。IRES-配列は、例えば、参照により本明細書に組み入れられている、Rees et al., Biotechniques 20:102, 1996により記載された原理に基づいて無能化された。無能断片は、細菌β-ラクタマーゼ(「bla」)プロモーターを表すように選択された；このストラテジーは、大腸菌(E. coli)(カナマイシン)におけるプラスミド選択のためのネオマイシン-ホスホトランスフェラーゼマーカーの使用を可能にした。第三段階において、R. ミューレリGFPについてのORFは、2つのSfiI部位の間でIRES配列の上流に挿入された。NEO耐性遺伝子の下流に位置しているHSV-TK配列は、哺乳動物細胞における発現のためのポリAシグナル配列として働く。このプラスミドの重大な部分の簡単な概略図は、図15に示されている。
バイシストロン性GFP構築物が調製され、およびAnne Chua and Ueli Gublerにより提供され、かつレニラ・ミューレリGFP(Prolume Ltd., Pinetop, AZ)およびG418選択のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(ネオマイシン耐性マーカー)の両方についての遺伝子を含んだ。R. ミューレリGFPの配列は、以下のように哺乳動物発現ベクターへと操作された。ベクター「pCMV-tag 5A」(Stratagene, Genbankアクセッション番号AF076312)が、最初、単一のNotI部位とBstBI部位の間の配列断片を除去することにより改変された。これは、ColE1複製起点、HSV-TKポリA配列、およびCMVプロモーターからなるプラスミドバックボーンを残す。除去される断片は、その後、[IRES-ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性マーカー]をコードする断片に置換された。IRES-配列は、例えば、参照により本明細書に組み入れられている、Rees et al., Biotechniques 20:102, 1996により記載された原理に基づいて無能化された。無能断片は、細菌β-ラクタマーゼ(「bla」)プロモーターを表すように選択された；このストラテジーは、大腸菌(E. coli)(カナマイシン)におけるプラスミド選択のためのネオマイシン-ホスホトランスフェラーゼマーカーの使用を可能にした。第三段階において、R. ミューレリGFPについてのORFは、2つのSfiI部位の間でIRES配列の上流に挿入された。NEO耐性遺伝子の下流に位置しているHSV-TK配列は、哺乳動物細胞における発現のためのポリAシグナル配列として働く。このプラスミドの重大な部分の簡単な概略図は、図15に示されている。
実施例2：バイシストロン性GFP構築物の調製
R. ミューレリGFPの配列は、特別に設計されたモジュラーベクターを用いて哺乳動物細胞における安定な発現のために操作された。構築物が調製され、およびAnn Chua and Ueli Gublerにより提供され、かつレニラ・ミューレリGFP(Prolume Ltd., Pinetop, AZ)およびG418選択のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(ネオマイシン耐性マーカー)の両方についての遺伝子を含んだ。R. ミューレリGFPの配列は、以下のように、哺乳動物発現ベクターへと操作された。
R. ミューレリGFPの配列は、特別に設計されたモジュラーベクターを用いて哺乳動物細胞における安定な発現のために操作された。構築物が調製され、およびAnn Chua and Ueli Gublerにより提供され、かつレニラ・ミューレリGFP(Prolume Ltd., Pinetop, AZ)およびG418選択のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(ネオマイシン耐性マーカー)の両方についての遺伝子を含んだ。R. ミューレリGFPの配列は、以下のように、哺乳動物発現ベクターへと操作された。
段階1
ベクター「pCMV-tag 5A」(Stratagene, Genbankアクセッション番号AF076312)は、最初、単一のNotI部位とBstBI部位の間の配列断片を除去することにより改変された。これは、ColE1複製起点、HSV-TKポリA配列、およびCMVプロモーターからなるプラスミドバックボーンを残す。
ベクター「pCMV-tag 5A」(Stratagene, Genbankアクセッション番号AF076312)は、最初、単一のNotI部位とBstBI部位の間の配列断片を除去することにより改変された。これは、ColE1複製起点、HSV-TKポリA配列、およびCMVプロモーターからなるプラスミドバックボーンを残す。
段階2
オーバーラップPCRにより、一般的な構造を有するモジュール、5'−AscI-IRES−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ−BstB1−3'が作製された。このモジュール内において、IRES-配列は、例えば、参照により本明細書に組み入れられている、Rees et al., Biotechniques 20:102, 1996により記載された原理に基づいて無能化された。無能断片は、細菌β-ラクタマーゼ(「bla」)プロモーター(Seq ID No. 1)を表すように選択され；このストラテジーは、大腸菌(カナマイシン)におけるプラスミド選択およびG418における哺乳動物細胞の選択のためのネオマイシン-ホスホトランスフェラーゼマーカーの使用を可能にした。これはまた、大腸菌におけるプラスミド選択のための余分な転写ユニットの必要性を排除し、最終プラスミドをより縮小した。
オーバーラップPCRにより、一般的な構造を有するモジュール、5'−AscI-IRES−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ−BstB1−3'が作製された。このモジュール内において、IRES-配列は、例えば、参照により本明細書に組み入れられている、Rees et al., Biotechniques 20:102, 1996により記載された原理に基づいて無能化された。無能断片は、細菌β-ラクタマーゼ(「bla」)プロモーター(Seq ID No. 1)を表すように選択され；このストラテジーは、大腸菌(カナマイシン)におけるプラスミド選択およびG418における哺乳動物細胞の選択のためのネオマイシン-ホスホトランスフェラーゼマーカーの使用を可能にした。これはまた、大腸菌におけるプラスミド選択のための余分な転写ユニットの必要性を排除し、最終プラスミドをより縮小した。
段階3
段階1からのプラスミド由来NotI/BstbIモジュール、および段階2からのAscI-IRES-Neo-BstbIモジュールがその後ライゲーションされ、合成の短いAscIのNotIリンカーへの付加により環化された。DNAは、形質転換され、単一の単離物は、3つの断片の適切な構築について調べられた。適切に構築されたプラスミドクローンが、最後の改変のために選択された。
段階1からのプラスミド由来NotI/BstbIモジュール、および段階2からのAscI-IRES-Neo-BstbIモジュールがその後ライゲーションされ、合成の短いAscIのNotIリンカーへの付加により環化された。DNAは、形質転換され、単一の単離物は、3つの断片の適切な構築について調べられた。適切に構築されたプラスミドクローンが、最後の改変のために選択された。
段階4
対象となる遺伝子(GFP)のクローニング部位は、その後、EcoRV−SfiIa−スタッファー−SfiIb−NotIという構造の短い合成リンカーを介してプラスミドへ導入された。このリンカーは、OliI−NotI部位間のライゲーションを介して段階3に由来するプラスミドへクローニングされ、従って、これはIRES-NEOモジュールの上流に配置された。OliIおよびEcoRVは、両方とも平滑末端カッターであり、部位を再度作製することなしにそれらをライゲーションに適合させる。対象となる遺伝子をクローニングするためにSfiI部位を用いることの理論的根拠は、2つの面を有した：SfiIは8塩基カッターであり、従って、このベクターにおける発現について選択されたORFにおける内部部位として非常にまれにしか起こらない。本部位は、認識配列ggccnnnnnggcc(Seq ID No. 2)を有し、方向性クローニング(directional cloning)のためにORFのいずれかの末端での2つの異なる部位の設計を可能にする。配列5'-ggccattatggcc-3'(Seq ID No. 3)は、SfiI-a(上流)部位として選択され、SfiI-b(下流)部位は、配列5'-ggccgcctcggcc-3'(Seq ID No. 4)を有する。
対象となる遺伝子(GFP)のクローニング部位は、その後、EcoRV−SfiIa−スタッファー−SfiIb−NotIという構造の短い合成リンカーを介してプラスミドへ導入された。このリンカーは、OliI−NotI部位間のライゲーションを介して段階3に由来するプラスミドへクローニングされ、従って、これはIRES-NEOモジュールの上流に配置された。OliIおよびEcoRVは、両方とも平滑末端カッターであり、部位を再度作製することなしにそれらをライゲーションに適合させる。対象となる遺伝子をクローニングするためにSfiI部位を用いることの理論的根拠は、2つの面を有した：SfiIは8塩基カッターであり、従って、このベクターにおける発現について選択されたORFにおける内部部位として非常にまれにしか起こらない。本部位は、認識配列ggccnnnnnggcc(Seq ID No. 2)を有し、方向性クローニング(directional cloning)のためにORFのいずれかの末端での2つの異なる部位の設計を可能にする。配列5'-ggccattatggcc-3'(Seq ID No. 3)は、SfiI-a(上流)部位として選択され、SfiI-b(下流)部位は、配列5'-ggccgcctcggcc-3'(Seq ID No. 4)を有する。
段階5
適切なSfiI部位を有するように操作されたR. ミューレリGFPについてのORFは、2つのSfiI部位の間でIRES配列の上流に挿入され、結果として、4196bp長のプラスミド(Seq ID No. 5)を生じた。GFP発現ベクターについての制限地図は、図16に提供されている。
適切なSfiI部位を有するように操作されたR. ミューレリGFPについてのORFは、2つのSfiI部位の間でIRES配列の上流に挿入され、結果として、4196bp長のプラスミド(Seq ID No. 5)を生じた。GFP発現ベクターについての制限地図は、図16に提供されている。
実施例3：LOX-GFP細胞の確立
細胞トランスフェクション
ヒト黒色腫細胞系LOX(National Cancer Institute)由来の細胞が、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI 1640培地で培養された。すべての培地および関連試薬は、Gibco(Invitrogen Corporation, Carlsbad, California)から購入された。細胞は、Fugene(Roche Molecular Diagnostics)トランスフェクション試薬を用いて3:1(Fugene：DNA)の比でトランスフェクションされた。バイシストロン性GFP構築物は、Ann Chua and Ueli Gublerの厚意により、実施例1に従って、調製および提供された。本構築物は、レニラ・ミューレリ(Prolume Ltd., Pinetop, AZ)およびG418選択のためのNeo(ネオマイシン耐性遺伝子)の両方の遺伝子を含んだ。
細胞トランスフェクション
ヒト黒色腫細胞系LOX(National Cancer Institute)由来の細胞が、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI 1640培地で培養された。すべての培地および関連試薬は、Gibco(Invitrogen Corporation, Carlsbad, California)から購入された。細胞は、Fugene(Roche Molecular Diagnostics)トランスフェクション試薬を用いて3:1(Fugene：DNA)の比でトランスフェクションされた。バイシストロン性GFP構築物は、Ann Chua and Ueli Gublerの厚意により、実施例1に従って、調製および提供された。本構築物は、レニラ・ミューレリ(Prolume Ltd., Pinetop, AZ)およびG418選択のためのNeo(ネオマイシン耐性遺伝子)の両方の遺伝子を含んだ。
100μlのRPMI 1640無血清培地が小さな滅菌チューブへ添加され、その後、9μlの予め温められたFugeneが添加された。最後に、3μlのGFP DNA構築物がチューブの底へ添加され、混合され、室温で30分間インキュベートされた。Fugene/DNA混合物全体は、80%集密LOX細胞の1つのT-25フラスコへ添加され、細胞は6時間インキュベートされた。インキュベーション後、フラスコ中の培地は除去され、1%ジェネテシン(G418)を含む選択培地と交換された。
G418耐性についての選択は約4週間かかり、その後、細胞の約30%が様々なレベルでGFPを発現させた。最も高くGFPを発現させる細胞についてさらに選択するために、細胞は、Department of Pathology and Pediatrics, UMDNJで選別された。細胞は、上位5%のGFP発現細胞集団を収集するように選別された。最初の選別から単離され培養された細胞は、その後数週間後、結果として生じる細胞が100%GFP発現を達成するように選別された。これらのLOX-GFP細胞はその後、将来のインビボ使用のために凍結された。
実施例4：LOX-GFP-LM細胞の確立
5匹の雌Nu/Nuマウス(Charles River)が、それぞれ1千万個のLOX-GFP細胞を腹腔内(ip)移植された。13日間後、LOX-GFP細胞を含む腹水がマウスから採取され、腹水はPBSで1:4希釈された。腹水/PBS溶液は、その後、40μmナイロン細胞ストレーナーを通して濾過され、1500rpmで遠心分離された。ペレット化された細胞はPBSに再懸濁され、所望の細胞濃度に達するように計数された。
5匹の雌Nu/Nuマウス(Charles River)が、それぞれ1千万個のLOX-GFP細胞を腹腔内(ip)移植された。13日間後、LOX-GFP細胞を含む腹水がマウスから採取され、腹水はPBSで1:4希釈された。腹水/PBS溶液は、その後、40μmナイロン細胞ストレーナーを通して濾過され、1500rpmで遠心分離された。ペレット化された細胞はPBSに再懸濁され、所望の細胞濃度に達するように計数された。
20匹の雌Nu/Nuマウス(10マウス/群)が、腹水(上記)から単離されたLOX-GFP腫瘍細胞を、2×106細胞/マウスかまたは1×106細胞/マウスのいずれかで、尾静脈を経由して静脈内(iv)移植された。群中の数匹のマウスが瀕死であるかまたは死んでいるのを見出された後、群の残りのマウスは安楽死させられた。肺が単離され、可能性のある微小転移を見るために蛍光立体顕微鏡下で調べられた。結果として生じたiv LOX-GFP肺転移は、表1に列挙されている。
（表１）LOX-GFP腹水のNu/Nuマウスへの移植
肺への転移率は文献に報告されているほど高くはなかったが、定量的分析に関する難点を生じている可能性があると思われた。いくつかの転移性コロニーはGFP発現を喪失したが、これは細胞系がインビボで安定ではなかったことを示唆した。1×106細胞群からの1匹のマウス(No. 10)は、肺転移性コロニーにおいて非常に強いGFP発現があった。
LOX-GFP細胞の4つのコロニー(約2×3mm)が、穏やかな切開により、マウスNo. 10(上記参照)の肺から回収された。コロニーのそれぞれは、滅菌金網(No. 40)上で別々にすりつぶされ、2〜3ml培地で洗浄され、1500rpmで遠心分離された。細胞ペレットは、10%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10%FBSを含むRPMI 1640培地中で洗浄され、10%FBSおよび2%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地の10mlを含むT-25フラスコへ播種された。細胞は、いかなるマウス細胞混入物も除去するために、G418を含む選択培地において日常的に継代された。2〜3継代後、コロニー番号1および2からの培養物は、弱いGFP発現および乏しい増殖のために廃棄された。コロニー番号3および4からの培養物は、スケールアップされ、将来的使用のために凍結された。コロニー番号4由来の細胞は、GFP発現および増殖に関して優れていると考えられ、LOX-GFP-LM(LMは肺転移(Lung Metastasis)としてLM)と名付けられた。
実施例5：インビボでのLOX-GFP-LM細胞の転移
30匹の雌SCIDベージュ・マウス(Charles River)が、百万個、2百万個、または5百万個のLOX-GFP-LM細胞を尾静脈を経由してiv移植された。移植後29日目において、その時点までの各群からの瀕死率または死亡率が記録され、残りのマウスは安楽死させられた。肺は単離され、試料あたり3mlのPBS中にホモジナイズされた。肺ホモジネートの試料あたり0.1mlは96ウェルプレートへ移され、蛍光はAcumen Explorerを用いて測定された。移植から29日後、罹病率または死亡率は、移植された細胞数に直接的に関連しており、最も高い罹病率および死亡率は、5百万個の細胞を移植されたマウスで観察された(表2)。すべてのマウスは、GFP発現肺転移性コロニーを有したが、肺転移の数および密度は大きく異なった。
30匹の雌SCIDベージュ・マウス(Charles River)が、百万個、2百万個、または5百万個のLOX-GFP-LM細胞を尾静脈を経由してiv移植された。移植後29日目において、その時点までの各群からの瀕死率または死亡率が記録され、残りのマウスは安楽死させられた。肺は単離され、試料あたり3mlのPBS中にホモジナイズされた。肺ホモジネートの試料あたり0.1mlは96ウェルプレートへ移され、蛍光はAcumen Explorerを用いて測定された。移植から29日後、罹病率または死亡率は、移植された細胞数に直接的に関連しており、最も高い罹病率および死亡率は、5百万個の細胞を移植されたマウスで観察された(表2)。すべてのマウスは、GFP発現肺転移性コロニーを有したが、肺転移の数および密度は大きく異なった。
（表２）SCIDベージュ・マウスにおけるLOX-GFP-LM誘導実験的肺転移
実施例6：LOX-GFP-LM、LOX-GFP、およびLOX細胞の特徴づけ
インビボでのLOX、LOX-GFP、およびLOX-GFP-LM腫瘍の形態
9匹の雌SCIDベージュ・マウス(Charles River)が、LOX細胞かもしくはLOX-GFP細胞のいずれかを皮下(sc)移植されたか、またはLOX-GFP-LM細胞をiv移植された。LOXおよびLOX-GFP腫瘍を、それらが300-400mm3までの体積に達するまで(移植から約10〜14日後)増殖させ、その後収集し、10%ホルマリンに固定した。LOX-GFP-LM細胞を、29日間に渡って肺転移させ、その後肺の部分を採取し、10%ホルマリンに固定した。腫瘍および肺試料の両方はH＆Eで染色され、形態が評価された。3つの異なるLOX腫瘍細胞系(LOX、LOX-GFP、およびLOX-GFP-LM)由来の腫瘍間での形態における違いは観察されなかった(図1)。
インビボでのLOX、LOX-GFP、およびLOX-GFP-LM腫瘍の形態
9匹の雌SCIDベージュ・マウス(Charles River)が、LOX細胞かもしくはLOX-GFP細胞のいずれかを皮下(sc)移植されたか、またはLOX-GFP-LM細胞をiv移植された。LOXおよびLOX-GFP腫瘍を、それらが300-400mm3までの体積に達するまで(移植から約10〜14日後)増殖させ、その後収集し、10%ホルマリンに固定した。LOX-GFP-LM細胞を、29日間に渡って肺転移させ、その後肺の部分を採取し、10%ホルマリンに固定した。腫瘍および肺試料の両方はH＆Eで染色され、形態が評価された。3つの異なるLOX腫瘍細胞系(LOX、LOX-GFP、およびLOX-GFP-LM)由来の腫瘍間での形態における違いは観察されなかった(図1)。
実施例7：LOX、LOX-GFP、およびLOX-GFP-LM細胞系の遺伝子マイクロアレイ分析
細胞は、RPMI-1640、10%FBS、および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(LOX-GFPおよびLOX-GFP-LM細胞について、0.5%G418を添加)を含む6ウェル培養プレートに蒔かれ、48時間インキュベートされた。培地を除去した後、細胞はPBSで1回洗浄され、0.8mlのRLT緩衝液がウェルごとに添加され、プレートは、室温で2分間振盪された。各ウェルからの細胞懸濁液は別々のチューブへ移され、将来のマイクロアレイ分析のために-80℃で凍結された。各腫瘍系統からの4つの別々の試料が、Affymetrix U133plus2チップを用いるマイクロアレイアッセイにおいて実行された。固有の遺伝子シグネチャーは、LOX親細胞系と比較して、LOX-GFPおよびLOX-GFP-LM細胞の両方について示された(図2)。LOX-GFP-LM細胞において、124個の遺伝子が全体的に変化しているのが見出され、LOX-GFP細胞と比較して、67個の遺伝子が上方制御され、残りの57遺伝子が下方制御された。少なくとも4倍の上方制御をもつ遺伝子の中で、一連の遺伝子(太字で示された、少なくとも7個の遺伝子)が、接着、マトリックス分解、または血管新生に関連していることが認められた。遺伝子のもう一つのカテゴリー(下線で示す)は、増殖因子または分化に関連していると認められた。遺伝子の両方のシリーズは、より攻撃的かつ侵襲的な表現型をもつ細胞集団中に濃縮されていると予想されうる遺伝子の型を含む。
細胞は、RPMI-1640、10%FBS、および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(LOX-GFPおよびLOX-GFP-LM細胞について、0.5%G418を添加)を含む6ウェル培養プレートに蒔かれ、48時間インキュベートされた。培地を除去した後、細胞はPBSで1回洗浄され、0.8mlのRLT緩衝液がウェルごとに添加され、プレートは、室温で2分間振盪された。各ウェルからの細胞懸濁液は別々のチューブへ移され、将来のマイクロアレイ分析のために-80℃で凍結された。各腫瘍系統からの4つの別々の試料が、Affymetrix U133plus2チップを用いるマイクロアレイアッセイにおいて実行された。固有の遺伝子シグネチャーは、LOX親細胞系と比較して、LOX-GFPおよびLOX-GFP-LM細胞の両方について示された(図2)。LOX-GFP-LM細胞において、124個の遺伝子が全体的に変化しているのが見出され、LOX-GFP細胞と比較して、67個の遺伝子が上方制御され、残りの57遺伝子が下方制御された。少なくとも4倍の上方制御をもつ遺伝子の中で、一連の遺伝子(太字で示された、少なくとも7個の遺伝子)が、接着、マトリックス分解、または血管新生に関連していることが認められた。遺伝子のもう一つのカテゴリー(下線で示す)は、増殖因子または分化に関連していると認められた。遺伝子の両方のシリーズは、より攻撃的かつ侵襲的な表現型をもつ細胞集団中に濃縮されていると予想されうる遺伝子の型を含む。
実施例8：LOX-GFP腹膜(腹水)モデル
実施例3の手順に従って調製されたヒト黒色腫LOX-GFP細胞は、10%FBSおよび1%ジェネテシン(G418)を加えたRPMI 1640培地中に維持された。雌Nu/Nuマウスは、500μl容量のPBSにおける1千万個のLOX-GFP細胞を腹腔内(ip)注射され、群へランダム化され、表3、4、および5に示されているように、様々な用量および/または投与計画で処置された。
実施例3の手順に従って調製されたヒト黒色腫LOX-GFP細胞は、10%FBSおよび1%ジェネテシン(G418)を加えたRPMI 1640培地中に維持された。雌Nu/Nuマウスは、500μl容量のPBSにおける1千万個のLOX-GFP細胞を腹腔内(ip)注射され、群へランダム化され、表3、4、および5に示されているように、様々な用量および/または投与計画で処置された。
試験された化合物
（表３）LOX-GFP腹水モデルについての処置群
（表４）LOX-GFP腹水モデルについての処置群
（表５）LOX-GFP腹水モデルについての処置群
腹水採取手順(移植後7日目または8日目)
マウスは安楽死させられ、その後、小さな切開が、腹部の正中に沿って、皮膚および腹膜を貫いてなされた。ガラスパスツールピペットが、腹膜から腹水を吸引して取り出すために利用され、腹水は、15mlチューブへ移された。3ml生理食塩水が腹腔をすすぐために用いられ、生理食塩水の全てが回収され、腹水を入れた15mlチューブへ移された。腹水細胞懸濁液は、単一細胞懸濁液を得るために40μmナイロンフィルターを通して濾過され、1500rpmで10分間遠心分離された。上清は除去され、細胞ペレットは、新鮮な生理食塩水2mlに再懸濁された。各試料からの0.1mlは、Acumen Explorerを利用して細胞数(相対的蛍光単位として報告される)を評価するために96ウェルプレートへ移された。
マウスは安楽死させられ、その後、小さな切開が、腹部の正中に沿って、皮膚および腹膜を貫いてなされた。ガラスパスツールピペットが、腹膜から腹水を吸引して取り出すために利用され、腹水は、15mlチューブへ移された。3ml生理食塩水が腹腔をすすぐために用いられ、生理食塩水の全てが回収され、腹水を入れた15mlチューブへ移された。腹水細胞懸濁液は、単一細胞懸濁液を得るために40μmナイロンフィルターを通して濾過され、1500rpmで10分間遠心分離された。上清は除去され、細胞ペレットは、新鮮な生理食塩水2mlに再懸濁された。各試料からの0.1mlは、Acumen Explorerを利用して細胞数(相対的蛍光単位として報告される)を評価するために96ウェルプレートへ移された。
結果
7日間または8日間は、LOX-GFP細胞をip移植されたマウスにおいて適切な腹水が形成されるのに十分な期間であり、加えて、全身投与された癌治療用物質の増殖抑制性性質を測定するのに十分であった。Taxolおよび化合物Aの両方は、処置の数に直接的に依存している、LOX-GFP腹水増殖への抑制性効果を実証した。単一用量は細胞増殖を抑制しなかったが、2用量は細胞増殖を低下させ、3用量は細胞増殖を最大に低下させた(図3および6)。化合物Bおよび化合物Cの両方は、LOX-GFP腹水増殖への抑制性効果を実証した(図4および7)。化合物Dは、数回用量においてLOX-GFP腹水増殖を抑制したが、効果は用量依存性ではなかった。腹水増殖抑制に関して、Taxol単独と比較した、化合物DをTaxolと組み合わせることに対する付加的な利益はなかったが、その組み合わせは拮抗性ではなかった(図5および8)。
7日間または8日間は、LOX-GFP細胞をip移植されたマウスにおいて適切な腹水が形成されるのに十分な期間であり、加えて、全身投与された癌治療用物質の増殖抑制性性質を測定するのに十分であった。Taxolおよび化合物Aの両方は、処置の数に直接的に依存している、LOX-GFP腹水増殖への抑制性効果を実証した。単一用量は細胞増殖を抑制しなかったが、2用量は細胞増殖を低下させ、3用量は細胞増殖を最大に低下させた(図3および6)。化合物Bおよび化合物Cの両方は、LOX-GFP腹水増殖への抑制性効果を実証した(図4および7)。化合物Dは、数回用量においてLOX-GFP腹水増殖を抑制したが、効果は用量依存性ではなかった。腹水増殖抑制に関して、Taxol単独と比較した、化合物DをTaxolと組み合わせることに対する付加的な利益はなかったが、その組み合わせは拮抗性ではなかった(図5および8)。
実施例9：LOX-GFP-LM転移モデル
実施例4の手順に従って調製された、ヒト黒色腫LOX-GFP-LM細胞は、10%FBSおよび1%ジェネテシン(G418)を加えたRPMI 1640培地中に維持された。雌SCIDベージュ・マウスは、200μl容量の無血清RPMI 1640における2百万個の細胞を尾静脈を経由してiv注射され、群へランダム化され、表6および7に示されているように、様々な用量および/または投与計画で処置された。媒体処置された群における3匹未満のマウスが瀕死であることが見出された時、処置群あたり5匹のマウスが、転移性肺腫瘍負荷量を評価するために取り出された。各群からの残りのマウスは、それらが瀕死であるまで延命効果についてモニターされた。
実施例4の手順に従って調製された、ヒト黒色腫LOX-GFP-LM細胞は、10%FBSおよび1%ジェネテシン(G418)を加えたRPMI 1640培地中に維持された。雌SCIDベージュ・マウスは、200μl容量の無血清RPMI 1640における2百万個の細胞を尾静脈を経由してiv注射され、群へランダム化され、表6および7に示されているように、様々な用量および/または投与計画で処置された。媒体処置された群における3匹未満のマウスが瀕死であることが見出された時、処置群あたり5匹のマウスが、転移性肺腫瘍負荷量を評価するために取り出された。各群からの残りのマウスは、それらが瀕死であるまで延命効果についてモニターされた。
試験された化合物
（表６）LOX-GFP-LM実験的転移モデルについての処置群(化合物Eの研究)
（表７）LOX-GFP-LM実験的転移モデルについての処置群(化合物Dの研究)
2つのパラメーターが、抗転移性効力の定量的評価のために評価された：(1)肺ホモジネートの蛍光強度および(2)生存率。
肺ホモジネートの蛍光強度
処置群あたり5匹のマウスが、肺転移性腫瘍負荷量の評価のために25日目または26日目において研究から取り出された。マウスは安楽死させられ、肺が取り出されて3ml生理食塩水中に置かれ、ホモジナイズされた。0.2mlの肺ホモジネートは、96ウェルプレートへ移され、蛍光は、Acumen Explorerを用いて読み取られた(図9および10)。蛍光は、相対的蛍光単位(RFU)で報告された(表8および9、図11および12)。統計学的解析は、スチューデント検定またはマンホイットニーU検定により決定され、群間の統計学的差は、確率値(p)が≦0.05である場合、有意であるとみなされた。
処置群あたり5匹のマウスが、肺転移性腫瘍負荷量の評価のために25日目または26日目において研究から取り出された。マウスは安楽死させられ、肺が取り出されて3ml生理食塩水中に置かれ、ホモジナイズされた。0.2mlの肺ホモジネートは、96ウェルプレートへ移され、蛍光は、Acumen Explorerを用いて読み取られた(図9および10)。蛍光は、相対的蛍光単位(RFU)で報告された(表8および9、図11および12)。統計学的解析は、スチューデント検定またはマンホイットニーU検定により決定され、群間の統計学的差は、確率値(p)が≦0.05である場合、有意であるとみなされた。
（表８）Acumen Explorer上で実行された肺ホモジネート試料の相対的蛍光単位(RFU)(化合物Eの研究)
*TGI＝媒体対照群に対する腫瘍増殖抑制
（表９）Acumen Explorer上で実行された肺ホモジネート試料の相対的蛍光単位(RFU)(化合物Dの研究)
*TGI＝媒体対照群に対する腫瘍増殖抑制
生存
生存は、肺転移かまたは他の器官への転移のいずれかによる全体的な転移状態を表した。困難な呼吸または後肢麻痺による瀕死率がモニターされ、生存についての代用指標(surrogate endpoint)として記録された。生存評価について、結果は、腫瘍移植後の日数に対する生存率(%)としてプロットされた。寿命(%ILS)の増加は以下のように計算された：ILS%＝100 × [(処置群の生存日中央値−対照群の生存日中央値)/対照群の平均生存日]。生存中央値または(50%生存時間)は、カプラン・マイヤー生存分析を利用して決定された(図13および14)。生存における差は、ログランク検定により解析された。群間の統計学的差は、確率値(p)が≦0.05である場合、有意であるとみなされた。実施例5におけるLOX-GFP-LM転移モデルの最初の特徴づけと同様に、iv注射された場合のマウスの100%において肺へ転移する細胞、および肺転移を観察することについてのタイムフレームもまた、同様であった(前の研究における29日間の40%生存率 対 2つの本研究における24日間または28日間の50%生存率)(表10および11；図13および14)。
生存は、肺転移かまたは他の器官への転移のいずれかによる全体的な転移状態を表した。困難な呼吸または後肢麻痺による瀕死率がモニターされ、生存についての代用指標(surrogate endpoint)として記録された。生存評価について、結果は、腫瘍移植後の日数に対する生存率(%)としてプロットされた。寿命(%ILS)の増加は以下のように計算された：ILS%＝100 × [(処置群の生存日中央値−対照群の生存日中央値)/対照群の平均生存日]。生存中央値または(50%生存時間)は、カプラン・マイヤー生存分析を利用して決定された(図13および14)。生存における差は、ログランク検定により解析された。群間の統計学的差は、確率値(p)が≦0.05である場合、有意であるとみなされた。実施例5におけるLOX-GFP-LM転移モデルの最初の特徴づけと同様に、iv注射された場合のマウスの100%において肺へ転移する細胞、および肺転移を観察することについてのタイムフレームもまた、同様であった(前の研究における29日間の40%生存率 対 2つの本研究における24日間または28日間の50%生存率)(表10および11；図13および14)。
化合物Eは、肺ホモジネートの蛍光強度により評価される場合、後期介入(late intervention)(3日〜23日目に投薬される)または全期間介入(-1日〜23日目)のいずれでも等価な抗転移活性があった。
化合物Dは、肺ホモジネートの蛍光強度により評価される場合、媒体と比較して、後期介入(3日〜23日目に投薬される)で優れた抗転移活性があった。
（表１０）媒体対照群と比較した、化合物Eで処置された群の生存
（表１１）媒体対照群と比較した、化合物Dで処置された群の生存
実施例10：実験的肺転移におけるLOX-GFP-LMおよびLOX-GFPの比較
前もって作製されたヒト黒色腫LOX-GFPおよびLOX-GFP-LM細胞は、10%FBSおよび1%ジェネテシン(G418)を加えたRPMI 1640培地に維持された。雌SCIDベージュ・マウス(各腫瘍系統につき25匹のマウス)が、LOX-GFPかまたはLOX-GFP-LMのいずれかの、200μl容量の無血清RPMI 1640における2百万個の細胞を、尾静脈を経由してiv注射された。肺は、各時点(移植後14日、21日、および28日目、合計15匹、表12参照)について5匹のマウスから採取された。マウスの残りである群あたり10匹のマウスはそれらが瀕死の状態になるまで延命効果についてモニターされた。2つのパラメーターが、腫瘍増殖の定量的評価について評価された：(1)肺ホモジネートの蛍光強度および(2)生存。
前もって作製されたヒト黒色腫LOX-GFPおよびLOX-GFP-LM細胞は、10%FBSおよび1%ジェネテシン(G418)を加えたRPMI 1640培地に維持された。雌SCIDベージュ・マウス(各腫瘍系統につき25匹のマウス)が、LOX-GFPかまたはLOX-GFP-LMのいずれかの、200μl容量の無血清RPMI 1640における2百万個の細胞を、尾静脈を経由してiv注射された。肺は、各時点(移植後14日、21日、および28日目、合計15匹、表12参照)について5匹のマウスから採取された。マウスの残りである群あたり10匹のマウスはそれらが瀕死の状態になるまで延命効果についてモニターされた。2つのパラメーターが、腫瘍増殖の定量的評価について評価された：(1)肺ホモジネートの蛍光強度および(2)生存。
（表１２）LOX-GFPおよびLOX-GFP-LMのSCIDベージュ・マウスへの移植
肺ホモジネートの蛍光強度
5匹のマウスが、肺転移性腫瘍負荷量の評価のために各群から取り出された。マウスは安楽死させられ、それらの肺が取り出されて3ml生理食塩水に置かれ、ホモジナイズされた。肺ホモジネート0.2mlが96ウェルプレートへ移され、蛍光は、Acumen Explorerを用いて読み取られた(図17)。蛍光は、相対的蛍光単位(RFU)で報告された(図18および表13)。統計学的解析は、スチューデント検定またはマンホイットニーU検定により決定され、群間の統計学的差は、確率値(p)が≦0.05である場合、有意であるとみなされた。
5匹のマウスが、肺転移性腫瘍負荷量の評価のために各群から取り出された。マウスは安楽死させられ、それらの肺が取り出されて3ml生理食塩水に置かれ、ホモジナイズされた。肺ホモジネート0.2mlが96ウェルプレートへ移され、蛍光は、Acumen Explorerを用いて読み取られた(図17)。蛍光は、相対的蛍光単位(RFU)で報告された(図18および表13)。統計学的解析は、スチューデント検定またはマンホイットニーU検定により決定され、群間の統計学的差は、確率値(p)が≦0.05である場合、有意であるとみなされた。
（表１３）腫瘍系統(LOX-GFP-LMおよびLOX-GFP)誘導実験的転移の要約表
生存率評価
生存評価について、指標としての呼吸困難または後肢麻痺による瀕死マウスが記録され、結果は、腫瘍移植後の日数に対する生存率(%)としてプロットされる。生存中央値は、カプラン・マイヤー生存率分析を利用して決定された。生存曲線における差はログランク検定により解析され、群間の統計学的差は、確率値(p)が≦0.05である場合、有意であるとみなされた(図19)。
生存評価について、指標としての呼吸困難または後肢麻痺による瀕死マウスが記録され、結果は、腫瘍移植後の日数に対する生存率(%)としてプロットされる。生存中央値は、カプラン・マイヤー生存率分析を利用して決定された。生存曲線における差はログランク検定により解析され、群間の統計学的差は、確率値(p)が≦0.05である場合、有意であるとみなされた(図19)。
結果および考察
LOX-GFPを注射されたマウスの同じ系統(SCIDベージュ)と比較した、LOX-GFP-LMを注射されたSCIDベージュ・マウスは、インビボで安定なGFPトランスフェクションをもって(100%)、21日目での非常に高い肺転移率(100%)、およびより短い生存期間(すべてのマウスは25日間のうちに死んでいた)を示した。LOX-GFP群において、21日目に、5匹のマウスのうちの2匹が、GFPシグナルを示すことなしに肺転移をもつことが見出され、より低い転移率およびインビボでの不安定なGFPトランスフェクションを示唆した。LOX-GFP群における50%生存時間は、LOX-GFP-LM群に対して6日間遅延であった(31日間 対 25日間)。
LOX-GFPを注射されたマウスの同じ系統(SCIDベージュ)と比較した、LOX-GFP-LMを注射されたSCIDベージュ・マウスは、インビボで安定なGFPトランスフェクションをもって(100%)、21日目での非常に高い肺転移率(100%)、およびより短い生存期間(すべてのマウスは25日間のうちに死んでいた)を示した。LOX-GFP群において、21日目に、5匹のマウスのうちの2匹が、GFPシグナルを示すことなしに肺転移をもつことが見出され、より低い転移率およびインビボでの不安定なGFPトランスフェクションを示唆した。LOX-GFP群における50%生存時間は、LOX-GFP-LM群に対して6日間遅延であった(31日間 対 25日間)。
両方の群は、14日目にいかなる肺転移も示さなかった。しかしながら、LOX-GFP-LM群において、21日目から25日目まで、マウスは強い肺転移を示すかまたは瀕死であるかのいずれかであった。LOX-GFP群について、マウスは、26日目から39日目以上にかけて、死んだかまたは瀕死であった。肺においては、腫瘍負荷量に関してプラトー期間がない；換言すれば、肺が広範な肺転移を発生した場合、マウスはすぐに、短期間で瀕死になるかまたは死ぬと思われる。
結論
LOX-GFP-LMは、マウスの同じ系統におけるLOX-GFPと比較して、安定なGFPシグナルをもつより多くの肺転移を引き起こす。両方の腫瘍系統は、時間とともに、肺において動的な腫瘍負荷量増加を示した。
LOX-GFP-LMは、マウスの同じ系統におけるLOX-GFPと比較して、安定なGFPシグナルをもつより多くの肺転移を引き起こす。両方の腫瘍系統は、時間とともに、肺において動的な腫瘍負荷量増加を示した。
Claims (50)
- 以下の段階を含む、腫瘍が転移するかどうかを評価する方法：
(a)GFP発現腫瘍細胞を胸腺欠損マウスへ注射する段階；
(b)マウスを屠殺する段階；
(c)評価されるべき1つまたは複数の組織を取り出す段階；
(d)取り出された組織をホモジナイズする段階；および
(e)レーザースキャニング蛍光透視を用いてホモジナイズされた組織の試料においてGFPのレベルを定量化する段階。 - 腫瘍細胞が黒色腫、乳房、前立腺、肺、膵臓または結腸直腸細胞である、請求項1記載の方法。
- 腫瘍細胞がLOX、MDA-MB-435、MDA-MB-231、PC-3、DU-145、H460a、A549、MIAPaCa2、HCT116、またはHT-29である、請求項2記載の方法。
- 腫瘍細胞がLOX細胞である、請求項3記載の方法。
- マウスがヌードマウスである、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- マウスがSCIDマウスである、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 取り出された組織が肺、肝臓、骨、骨髄、脾臓、リンパ節、腎臓、卵巣または脳である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 取り出された組織が肺組織である、請求項7記載の方法。
- GFP発現腫瘍細胞がネオマイシン耐性遺伝子を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- GFP発現腫瘍細胞が以下の段階により調製される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法：
(a)GFPタンパク質をコードする核酸を含むベクターを調製する段階；
(b)該ベクターを腫瘍細胞にトランスフェクションする段階。 - ベクターがG418選択のためのネオマイシン耐性遺伝子(Neo遺伝子)をさらに含む、請求項10記載の方法。
- GFPがレニラ・ミューレリ(Renilla muelleri)由来である、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- 以下の段階を含む、腫瘍の転移の抑制について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法：
(a)胸腺欠損マウスにGFP発現腫瘍細胞を注射する段階；
(b)候補薬物またはプロトコールを該マウスに施す段階；
(c)マウスを屠殺する段階；
(d)転移抑制の評価のための1つまたは複数の組織を取り出す段階；
(e)組織をホモジナイズする段階；
(f)レーザースキャニング蛍光透視を用いて組織のホモジナイズされた試料においてGFPのレベルを定量化する段階；および
(g)ホモジナイズされた試料におけるGFPのレベルを、該候補薬物またはプロトコールで処置されていない対照動物からのレベルと比較する段階であって、処置された試料におけるGFPのレベルの減少が転移の抑制を示す、段階。 - 腫瘍細胞が黒色腫、乳房、前立腺、肺、膵臓または結腸直腸細胞である、請求項13記載の方法。
- 腫瘍細胞がLOX、MDA-MB-435、MDA-MB-231、PC-3、DU-145、H460a、A549、MIAPaCa2、HCT116、またはHT-29である、請求項14記載の方法。
- 腫瘍細胞がLOX細胞である、請求項15記載の方法。
- マウスがヌードマウスである、請求項13〜16のいずれか一項記載の方法。
- マウスがSCIDマウスである、請求項13〜16のいずれか一項記載の方法。
- 取り出された組織が肺、肝臓、骨、骨髄、脾臓、リンパ節、腎臓、卵巣または脳である、請求項13〜18のいずれか一項記載の方法。
- 取り出された組織が肺組織である、請求項19記載の方法。
- GFP発現腫瘍細胞がネオマイシン耐性遺伝子を含む、請求項13〜20のいずれか一項記載の方法。
- GFP発現腫瘍細胞が以下の段階により調製される、請求項13〜21のいずれか一項記載の方法：
(a)GFPタンパク質をコードする核酸を含むベクターを調製する段階；
(b)該ベクターを腫瘍細胞にトランスフェクションする段階。 - ベクターがG418選択のためのNeo遺伝子をさらに含む、請求項22記載の方法。
- GFPがレニラ・ミューレリ由来である、請求項13〜23のいずれか一項記載の方法。
- 以下の段階を含む、腫瘍の処置について候補薬物またはプロトコールを評価するための方法：
(a)胸腺欠損マウスへGFP発現腫瘍細胞を腹腔内に注射する段階；
(b)候補薬物またはプロトコールを該マウスに施す段階；
(c)評価のための腫瘍を含む腹水または器官を取り出す段階：
(d)レーザースキャニング蛍光透視を用いて腹水またはホモジナイズされた組織の試料においてGFPのレベルを定量化する段階；および
(e)腹水またはホモジナイズされた試料におけるGFPのレベルを、該候補薬物またはプロトコールで処置されていない対照動物からのレベルと比較する段階であって、処置された試料におけるGFPのレベルの減少が候補薬物またはプロトコールが該腫瘍の処置に有用であることを示す、段階。 - 腫瘍細胞が黒色腫、乳房、前立腺、肺、膵臓または結腸直腸細胞である、請求項25記載の方法。
- 腫瘍細胞がLOX、MDA-MB-435、MDA-MB-231、PC-3、DU-145、H460a、A549、MIAPaCa2、HCT116、またはHT-29である、請求項26記載の方法。
- 腫瘍細胞がLOX細胞である、請求項27記載の方法。
- マウスがヌードマウスである、請求項25〜28のいずれか一項記載の方法。
- マウスがSCIDマウスである、請求項25〜28のいずれか一項記載の方法。
- 取り出された組織が腹水である、請求項25〜30のいずれか一項記載の方法。
- GFP発現腫瘍細胞がネオマイシン耐性遺伝子を含む、請求項25〜31のいずれか一項記載の方法。
- GFP発現腫瘍細胞が以下の段階により調製される、請求項25〜32のいずれか一項記載の方法：
(a)GFPタンパク質をコードする核酸を含むベクターを調製する段階；
(b)該ベクターを腫瘍細胞にトランスフェクションする段階。 - ベクターがG418選択のためのNeo遺伝子をさらに含む、請求項33記載の方法。
- GFPがレニラ・ミューレリ由来である、請求項25〜34のいずれか一項記載の方法。
- 腹水が取り出されて、評価される、請求項25〜35のいずれか一項記載の方法。
- 器官が取り出されて、評価される、請求項25〜36のいずれか一項記載の方法。
- 以下の段階を含む、特定の組織へ転移する細胞系の性向を増強する方法：
(a)胸腺欠損マウスへGFP発現腫瘍細胞を腹腔内に注射する段階；
(b)マウスを屠殺する段階；
(c)マウスから生じる腹水を取り出す段階；
(d)腹水を胸腺欠損マウスへ静脈内に注射する段階；
(e)マウスを屠殺する段階；
(f)転移が増強される組織を取り出す段階；
(g)取り出された組織からGFP発現腫瘍細胞を回収する段階；
(h)回収された細胞をインビトロで培養する段階；
(i)段階(h)からの培養された細胞を胸腺欠損マウスへ注射する段階であって、培養された腫瘍細胞が、最初のGFP発現腫瘍細胞より大きい程度で、段階(f)で取り出された組織へ転移する、段階。 - 腫瘍細胞が黒色腫、乳房、前立腺、肺、膵臓または結腸直腸細胞である、請求項38記載の方法。
- 腫瘍細胞がLOX、MDA-MB-435、MDA-MB-231、PC-3、DU-145、H460a、A549、MIAPaCa2、HCT116、またはHT-29である、請求項39記載の方法。
- 腫瘍細胞がLOX細胞である、請求項40記載の方法。
- マウスがヌードマウスである、請求項38〜41のいずれか一項記載の方法。
- マウスがSCIDマウスである、請求項38〜41のいずれか一項記載の方法。
- 取り出された組織が肺、肝臓、骨、骨髄、脾臓、リンパ節、腎臓、卵巣または脳である、請求項38〜43のいずれか一項記載の方法。
- 取り出された組織が肺である、請求項44記載の方法。
- GFP発現腫瘍細胞がネオマイシン耐性遺伝子を含む、請求項38記載の方法。
- GFP発現腫瘍細胞が以下の段階により調製される、請求項38〜46のいずれか一項記載の方法：
(a)GFPタンパク質をコードする核酸を含むベクターを調製する段階；
(b)該ベクターを腫瘍細胞にトランスフェクションする段階。 - ベクターがG418選択のためのNeo遺伝子をさらに含む、請求項47記載の方法。
- GFPがレニラ・ミューレリ由来である、請求項38〜48のいずれか一項記載の方法。
- LOX-GFP-LM細胞系。
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