CN101046471A - 利用绿色荧光蛋白的肿瘤模型 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及评估肿瘤是否转移的方法，评估用于抑制肿瘤转移的候选药物或方案的方法，评估用于治疗肿瘤的候选药物或方案的方法和增加细胞系转移至特定组织的倾向的方法。本发明还涉及新的LOX－GFP－LM细胞系。

Description

利用绿色荧光蛋白的肿瘤模型
背景技术
在文献中已经报道了利用腹膜(腹水)肿瘤生长来评估化学疗法活性的几个实例，包括利用LOX黑素瘤细胞的实例。例如，R.H.Shoemaker等，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.，26：330(1985)报道LOX黑素瘤细胞可以形成腹水，并且通过使用第20天左右的存活终点，该模型可以用于评估癌症治疗。在2003年，H.Nakanishi等，Cancer Sci.，94：112-118(2003)报道了利用胃癌细胞的腹膜模型，该胃癌细胞用GFP标记。该模型被用于研究腹膜细胞生长对抗癌剂的化学敏感性。通过从腹腔中回收GFP细胞、均化所述细胞、在10000g下离心细胞和然后使用荧光计数器测量上清液的荧光来测量肿瘤负荷。为了推断产生荧光的细胞数量，使用用标准数目的GFP细胞的校准曲线。在该模型中，需要＞1月来在腹膜中产生腹水。
在文献中已经报道了利用转移性肿瘤生长来评估化学疗法的活性的几个实例。LOX实验转移模型的报道如下：O.Fodstad等，Int.J.Cancer，41：442-449(1988)，R.H.Shoemaker等，1991，和M.Yeng等，Clin.CancerRes.，5：3549-3559，(1999)，具有GFP标记的细胞。
例如，Fodstad等报道注射到无免疫应答的小鼠尾静脉中的LOX细胞能够以几乎100％的频率转移到肺中。然而克隆的尺寸和数目在动物中彼此不同，因此作者发现不可能在注射的细胞数目和获得的克隆数目之间建立准确关系。由于这个原因，他们使用动物存活作为终点而不对肺上的转移克隆计数。
在R.H.Shoemaker等1991的报道中，通过16个循环的自发(sc)肿瘤移植，接着取出肺转移用于体外生长，产生LOX-L细胞。不同于亲代细胞系LOX，LOX-L细胞系能够由sc肿瘤移植转移到肺中，而LOX细胞仅能够由静脉内(iv)移植转移。将LOX-L sc肿瘤用于研究化学疗法对转移的影响，然而作者经过非常费力的将转移肺移植到新小鼠中的方法来评估肺转移。在随后研究(Wang X等，Int.J.Cancer，112：994-1002，2004)中，将LOX-L模型iv植入，然而仅仅通过对克隆计数和利用存活终点来评估转移。
在M.Yeng等，Clin.Cancer Res.，5：3549-4559(1999)的报道中，利用GFP标记的LOX或B16黑素瘤细胞建立转移模型。对于LOX-GFP模型，将肿瘤同位移植(透皮)，而对于B16GFP模型，将细胞iv植入。将GFP用来鉴定肺转移，然而作者未能定量肺转移性肿瘤负荷，而是使用主观(定性)终点。他们简单地目测活体动物中的转移，或者在尸体剖检后通过使用荧光显微镜观察来确定转移的存在或不存在。
发明内容
因此，本发明提供一种评估肿瘤是否转移的方法，该方法包括将表达GFP的肿瘤细胞注射到无胸腺小鼠、如裸鼠或SCID小鼠中，接着处死所述小鼠和摘除待评估的一个或多个组织。将所述摘除的组织均化，和使用激光扫描荧光屏检查(laser-scanning fluoroscopy)、例如Acumen Explorer，将所述均化组织的样品中的GFP水平定量。
优选地，将所述表达GFP的肿瘤细胞静脉内注射到无胸腺小鼠中。优选地，所述无胸腺小鼠是裸鼠或SCID小鼠。
绿色荧光蛋白(GFP)是由软珊瑚物种产生的荧光蛋白。GFP可以获自各种各样的不同来源，包括Renilla muelleri，Renilla reniformis，Renillakollikeri Aeruorea victoria。尽管任何GFP分子可以用于本发明，优选的GFP是来自Renilla muelleri。
优选地，用于本发明方法中的肿瘤细胞是黑素瘤、乳腺、前列腺、肺、胰腺、或结肠直肠细胞。更优选地，所述肿瘤细胞是LOX，MDA-MB-435，MDA-MB-231，PC-3，DU-145，H460a，A549，MIAPaCa2，HCT116，或HT-29。最优选地，所述肿瘤细胞是LOX细胞。
优选的表达GFP的肿瘤细胞是LOX-GFP细胞。更优选地，表达GFP的肿瘤细胞是LOX-GFP-LM细胞。
LOX-GFP细胞系是通过用如下所述的双顺反子GFP构建体转染获自国立癌症研究所(National Cancer Institute(NCI))的LOX黑素瘤细胞而产生的细胞系。
LOX-GFP-LM细胞系是通过用LOX-GFP细胞腹膜内注射无胸腺小鼠、从所述小鼠中摘除含有LOX-GFP细胞的腹水、将所述腹水静脉内注射到小鼠、从所述小鼠收集获得的转移肺、和体外培养从所述转移肺组织回收的表达GFP的肿瘤细胞的克隆而产生的细胞系。
人类黑素瘤细胞系LOX可以在将肿瘤细胞腹膜内植入时诱导腹水，或者当静脉内接种时诱导肺转移。该腹水模型可以用作快速的药物筛选模型，而肺转移模型可以用于评估抗转移剂。在两种模型中，由于评估肿瘤负荷的困难，肿瘤生长和功效的定量分析是个挑战。为了解决该问题，本发明提供了用GFP转染的LOX细胞(称为LOX-GFP)，并且该标记被用于分析腹水或肺中的肿瘤负荷。
对于腹水模型，将10×106LOX-GFP细胞腹膜内接种到Nu/Nu小鼠中，在7天后收获腹水。在荧光显微镜下目测腹水，利用Acumen Explorer将相对荧光定量。使用细胞毒性试剂Taxol以及一些开发的化合物来验证该模型中的抗增殖功效。
对于肺转移模型，建立称为LOX-GFP-LM的新细胞系；从通过静脉内接种LOX-GFP细胞诱导的小鼠肺转移克隆中分离该细胞系。在IV接种2×106细胞后25-30天，LOX-GFP-LM细胞系可复制地建群。收获肺，在荧光显微镜下观测，利用Acumen Explorer评估均化肺悬浮液的相对荧光。在该模型中利用两种开发化合物证实抗转移功效，所述化合物先前证明在常规皮下异种移植研究中具有广泛和有效的抗肿瘤活性。为了将两种新细胞系(LOX-GFP和LOX-GFP-LM)与亲代细胞系(LOX)比较，表征基因阵列分析和肿瘤组织病理学。
在一个实施方案中，本发明提供将GFP应用于小鼠中的两种人黑素瘤LOX模型，获得更好的定量肿瘤负荷评估和改善的功效评价。这些改进的模型应当为新癌症疗法的腹水或实验转移评估提供可行的备选方案。
在一个优选实施方案中，所述表达GFP的肿瘤细胞包含新霉素抗性基因。
表达GFP的肿瘤细胞可以如下制备：a)制备包含编码GFP蛋白的核酸的载体和b)用所述载体转染所述肿瘤细胞。优选地，所述载体另外包含用于G418选择的新霉素抗性基因(Neo基因)。优选的GFP是来自Renillamuelleri的GFP。
在一个优选实施方案中，所述载体是双顺反子GFP构建体。双顺反子构建体表示含有两个插入到表达载体的基因的哺乳动物表达载体。双顺反子GFP构建体是其中两个基因之一编码GFP分子的双顺反子构建体。优选地，所述GFP是来自Renilla muelleri的GFP。优选地，另一个基因编码用于G418选择的Neo(新霉素抗性基因)。优选的哺乳动物表达载体是pCMV-tag 5A(Stratagene，Genbank登记号AF076312)。
从所述小鼠摘除的组织优选是来自肺、肝、骨、骨髓、脾、淋巴结、肾、卵巢或脑的组织。更优选地，所述摘除的组织是肺组织。
本发明还提供一种评估用于抑制肿瘤转移的候选药物或方案的方法，该方法包括用表达GFP的肿瘤细胞注射无胸腺小鼠和向所述小鼠施用候选药物或方案。然后处死所述小鼠和摘除一个或多个组织用于评估转移抑制。均化所述摘除的组织，使用激光扫描荧光屏检查，将所述组织的均化样品中的GFP水平定量。将所述GFP水平与来自对照动物的均化样品中的GFP水平比较，所述对照动物没有用所述候选药物或方案处理。与对照样品相比，在所述处理的样品中降低的GFP水平表示转移的抑制。优选地，将所述表达GFP的肿瘤细胞静脉内注射到无胸腺小鼠中。
可以使用任何GFP。优选地，使用来自Renilla muelleri的GFP。
优选地，所述无胸腺小鼠是裸鼠或SCID小鼠。
从所述小鼠摘除的组织优选是来自肺、肝、骨、骨髓、脾、淋巴结、肾、卵巢或脑的组织。更优选地，所述摘除的组织是肺组织。
优选地，用于本发明方法中的肿瘤细胞是黑素瘤、乳腺、前列腺、肺、胰腺、或结肠直肠细胞。更优选地，所述肿瘤细胞是LOX，MDA-MB-435，MDA-MB-231，PC-3，DU-145，H460a，A549，MIAPaCa2，HCT116，或HT-29。最优选地，所述肿瘤细胞是LOX细胞。
优选的表达GFP的肿瘤细胞是LOX-GFP细胞。更优选地，表达GFP的肿瘤细胞是LOX-GFP-LM细胞。
在一个优选实施方案中，所述表达GFP的肿瘤细胞包含新霉素抗性基因。
表达GFP的肿瘤细胞可以如下制备：a)制备包含编码GFP蛋白的核酸的载体和b)用所述载体转染所述肿瘤细胞。优选地，所述载体另外包含用于G418选择的新霉素抗性基因(Neo基因)。优选的GFP是来自Renillamuelleri的GFP。
在一个优选实施方案中，所述载体是双顺反子GFP构建体。双顺反子构建体表示含有两个插入到表达载体的基因的哺乳动物表达载体。双顺反子GFP构建体是其中两个基因之一编码GFP分子的双顺反子构建体。优选地，所述GFP是来自Renilla muelleri的GFP。优选地，另一个基因编码用于G418选择的Neo(新霉素抗性基因)。优选的哺乳动物表达载体是pCMV-tag 5A(Stratagene，Genbank登记号AF076312)。
本发明进一步提供一种评估用于治疗肿瘤的候选药物或方案的方法，所述方法包括用表达GFP的肿瘤细胞腹膜内注射无胸腺小鼠和向所述小鼠施用候选药物或方案。摘除包含肿瘤的腹水或器官用于评估，使用激光扫描荧光屏检查，将所述腹水或均化组织的样品中的GFP水平定量。然后将所述腹水或均化样品中的GFP水平与来自对照动物的GFP水平比较，所述对照动物没有用所述候选药物或方案处理。在所述处理的样品中与对照样品相比降低的GFP水平表示所述候选药物或方案有效用于治疗所述肿瘤。
可以使用任何GFP。优选地，使用来自Renilla muelleri的GFP。
优选地，所述无胸腺小鼠是裸鼠或SCID小鼠。
所述从小鼠摘除的组织优选是腹水。
优选地，用于本发明方法中的肿瘤细胞是黑素瘤、乳腺、前列腺、肺、胰腺、或结肠直肠细胞。更优选地，所述肿瘤细胞是LOX，MDA-MB-435，MDA-MB-231，PC-3，DU-145，H460a，A549，MIAPaCa2，HCT116，或HT-29。最优选地，所述肿瘤细胞是LOX细胞。
优选的表达GFP的肿瘤细胞是LOX-GFP细胞。
在一个优选实施方案中，所述表达GFP的肿瘤细胞包含新霉素抗性基因。
表达GFP的肿瘤细胞可以如下制备：a)制备包含编码GFP蛋白的核酸的载体和b)用所述载体转染所述肿瘤细胞。优选地，所述载体另外包含用于G418选择的新霉素抗性基因(Neo基因)。优选的GFP蛋白是来自Renilla muelleri的GFP。
在一个优选实施方案中，所述载体是双顺反子GFP构建体。双顺反子构建体表示含有两个插入到表达载体的基因的哺乳动物表达载体。双顺反子GFP构建体是其中两个基因之一编码GFP分子的双顺反子构建体。优选地，所述GFP是来自Renilla muelleri的GFP。优选地，另一个基因编码用于G418选择的Neo(新霉素抗性基因)。优选的哺乳动物表达载体是pCMV-tag 5A(Stratagene，Genbank登记号AF076312)。
本发明提供一种增加肿瘤细胞系转移至特定组织的倾向的方法，该方法包括用表达GFP的肿瘤细胞腹膜内注射无胸腺小鼠，摘除在所述小鼠中形成的腹水，将其静脉内注射到另一只无胸腺小鼠中。处死所述小鼠，摘除欲增加向其转移的组织。然后从所述摘除的组织中回收表达GFP的肿瘤细胞，体外培养，并注射到无胸腺小鼠中，其中所述培养的肿瘤细胞转移到回收所述细胞的所述组织中，其程度要大于原始的表达GFP的肿瘤细胞。
可以使用任何GFP。优选地，使用来自Renilla muelleri的GFP。
优选地，所述无胸腺小鼠是裸鼠或SCID小鼠。
从所述小鼠摘除的组织优选是来自肺、肝、骨、骨髓、脾、淋巴结、肾、卵巢或脑的组织。更优选地，所述摘除的组织是肺组织。
优选地，用于本发明方法中的肿瘤细胞是黑素瘤、乳腺、前列腺、肺、胰腺、或结肠直肠细胞。更优选地，所述肿瘤细胞是LOX，MDA-MB-435，MDA-MB-231，PC-3，DU-145，H460a，A549，MIAPaCa2，HCT116，或HT-29。最优选地，所述肿瘤细胞是LOX细胞。
优选的表达GFP的肿瘤细胞是LOX-GFP细胞。
在一个优选实施方案中，所述表达GFP的肿瘤细胞包含新霉素抗性基因。
表达GFP的肿瘤细胞可以如下制备：a)制备包含编码GFP蛋白的核酸的载体和b)用所述载体转染所述肿瘤细胞。优选地，所述载体另外包含用于G418选择的新霉素抗性基因(Neo基因)。
在一个优选实施方案中，所述载体是双顺反子GFP构建体。双顺反子构建体表示含有两个插入到表达载体的基因的哺乳动物表达载体。双顺反子GFP构建体是其中两个基因之一编码GFP分子的双顺反子构建体。优选地，所述GFP是来自Renilla muelleri的GFP。优选地，另一个基因编码用于G418选择的Neo(新霉素抗性基因)。优选的哺乳动物表达载体是pCMV-tag 5A(Stratagene，Genbank登记号AF076312)。
本发明另外提供LOX-GFP-LM细胞系，其转移到肺的程度要大于亲代LOX-GFP细胞系。该细胞系提供本文所述的测定中的优势。
本发明提供对先前使用的LOX腹膜(腹水)模型的几个关键改进，获得具有比先前使用的那些短得多的持续时间的模型。本模型允许快速定量作为终点的细胞数目。尽管先前研究的持续时间仅20天相当短，但是本模型不依赖于存活作为唯一终点，并且可以在少至7天内完成。
本模型利用用GFP标记的细胞，然而腹水定量的方法已经通过消除均化和离心步骤而加以改进。本发明的方法使用激光扫描荧光屏检查，例如使用Acumen Explorer，直接测量来自腹水的细胞数目。
本发明通过将GFP稳定地转染到细胞中，以至可以摘除肺并且转移性肿瘤负荷可以通过测量荧光而准确定量，提供了对先前描述的LOX实验转移模型的重大改进。该方法减小了对存活作为终点的依赖(尽管当科学相关时它可以有时被监测)。本发明的模型利用实验转移模型，该模型使用LOX细胞的iv植入而不使用LOX-L细胞。另外，使用GFP-标记的细胞而不依赖于克隆计数和存活来定量转移，因为那些方法不够准确来鉴别转移性肿瘤负荷的小差异。
在本发明的模型中，将转移性肿瘤负荷定量以便准确评估使用各种治疗方案的实验疗法的抗转移能力。因此，省略了体内显现转移的步骤而赞成摘除肺，均化它们，和测量来自赋形剂处理的小鼠对比治疗剂处理的小鼠的肺的相对荧光。
一方面，本发明提供表达绿色荧光蛋白(GFP)的LOX黑素瘤细胞系的稳定克隆和用于评估潜在临床候选疗法(即药物和方案)的体内抗肿瘤功效的测定。具体地，本发明提供两种不同的体内模型；1)用于快速筛选化合物的功效的短(7-10天)腹膜(腹水)模型，和2)用于评估新的癌疗法的抗转移能力的实验转移模型。
另一方面，本发明提供用于快速筛选潜在癌临床候选疗法的体内抗肿瘤功效的腹膜(腹水)模型。该模型独特之处在于它在少至7天内提供功效数据和提供定量而非定性数据。
在还有另一方面，本发明提供用于评估潜在癌临床候选疗法的体内抗转移功效的实验转移模型。该模型独特之处在于它提供关于转移性肿瘤负荷的定量数据而不依赖于存活作为唯一终点。
自发转移模型是其中在动物中建立原发性肿瘤并且在无任何操作或干预的情况下允许生长和扩散到第二部位的模型。该方法要求来自原发性肿瘤的细胞通过它们天然能力获得进入循环系统，然后在远处部位接种和生长。
实验转移模型是其中没有建立原发性肿瘤的模型。将细胞直接注射到小鼠的循环系统中以模拟转移至远处部位的接种和生长过程。
稳定表达绿色荧光蛋白的肿瘤细胞例如可以以下列方式制备：来自建立的肿瘤细胞系的肿瘤细胞可以以常规方式用双顺反子GFP构建体转染。双顺反子GFP构建体的制备在实施例1中描述。例如，Fugene，一种多组分、基于脂质(非脂质体)的转染试剂(Roche Molecular Diagnostics)可以加入到无血清培养基如RPMI1640中，接着加入双顺反子GFP构建体。尽管Fugene与构建体的比率可以变化，该比率有利地为3∶1。例如在室温下将样品温育约30分钟的时间，将混合物转移到肿瘤细胞烧瓶中。该肿瘤细胞以约80％的比例存在于培养物中。将该细胞温育约6小时的时间，接着去除温育培养基和加入含有1％遗传霉素(G418)的选择培养基。
对G418抗性的选择将花费数周，例如3至6周，之后分选显示最大GFP表达的那些细胞。然后将最高的5％表达GFP的细胞群体选择、分离、培养和进一步分选而获得具有100％GFP表达的细胞。
转移至特定组织比相应的亲代肿瘤细胞系更具侵略性的肿瘤细胞可以例如以下列方式制备：用约10至20百万表达GFP的肿瘤细胞各自优选腹膜内(ip)植入无胸腺小鼠。在约10至14天之后，从小鼠收获含有表达GFP的肿瘤细胞的腹水液，并且用PBS稀释腹水。将腹水/PBS溶液过滤通过40μm尼龙细胞滤网，并在约1500rpm下离心。将沉淀的细胞重悬浮在PBS中并计数以获得所需细胞浓度。
然后用分离自腹水(以上)的表达GFP的肿瘤细胞静脉内(iv)、例如经过尾静脉植入无胸腺小鼠。优选以约1×106细胞/小鼠和约2×106细胞/小鼠之间的浓度植入细胞。一旦小鼠垂死或死亡，将目标组织，例如肺或乳房组织分离和在荧光立体显微镜下检查，以观察可能的微转移。
例如通过温和解剖从组织回收表达GFP的肿瘤细胞的克隆，其显示非常强的表达。然后将该克隆在无菌金属纱网(No.40)上研磨，用2-3ml培养基洗涤，在约1500rpm下离心。然后可以将细胞沉淀在无血清培养基中洗涤，所述无血清培养基如RPMI1640培养基，其优选含有约10％青霉素/链霉素和约10％胎牛血清(FBS)。将细胞接种到含有约10％FBS和约2％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基的烧瓶中。将细胞在含有G418的选择培养基中常规传代以去除任何小鼠细胞污染物。在几次、优选2-3次传代后，可以将培养物放大和冷冻下来以便将来使用。所述细胞将转移到分离它们的组织，转移程度要大于原始的表达GFP的肿瘤细胞。这种能力可以通过以下测定显示。下文，这些将被称为增强转移性肿瘤细胞(EMTC)。
用约1×106至约5×106EMTC在尾静脉中iv植入无胸腺小鼠。在植入后约25-30天，评估垂死率或死亡率，将小鼠实施安乐死。分离期望细胞转移到的组织和在PBS中均化。将一个样品、例如0.1ml均化组织转移到96孔平板并通过激光扫描荧光屏检查、例如使用Acumen Explorer测量荧光。
通过上述方法制备和评估的细胞系对于评价候选疗法、特别是临床候选药物和方案在治疗癌症和/或抑制转移方面是有价值的。为了评估针对肿瘤的候选疗法，将PBS中的表达GFP的肿瘤细胞腹膜内(ip)注射到无胸腺小鼠中。优选地注射在约500μl体积PBS中的约1千万细胞。将小鼠分成对照和治疗组，并且用候选药物或方案处理治疗组。应当理解，可以将表达GFP的肿瘤细胞首先注射到小鼠中，接着用候选药物或方案处理，或者可以施用候选药物或方案，接着用表达GFP的肿瘤细胞注射小鼠。
通过将小鼠实施安乐死和从腹腔中吸取腹水液来收获腹水。用盐水漂洗腹腔，然后将其回收。将腹水和回收的盐水转移到管中，过滤通过40μm尼龙滤器以获得单细胞悬浮液，在约1500rpm下离心约10分钟的时间。去除上清液，将细胞沉淀重悬浮在新鲜盐水中。将来自每只小鼠的样品，例如0.1ml，转移至96孔平板以利用激光扫描荧光屏检查、例如AcumenExplorer来评估细胞数目(报道为相对荧光单位)。如果处理的小鼠显示比对照组较低的相对荧光，那么候选疗法有效用于治疗该类型的肿瘤。
为了在抑制转移方面评估候选疗法，将增强转移性肿瘤细胞保持在加有10％FBS和1％遗传霉素(G418)的RPMI 1640培养基中，经由尾静脉静脉注射到无胸腺小鼠中。优选地利用在约200μl体积的无血清RPMI1640中的约2百万细胞。将小鼠随机分成对照和治疗组，治疗组用候选药物或方案处理。应当理解，EMTC可以首先注射到小鼠中，接着用候选药物或方案处理，或者可以施用候选药物或方案，接着用EMTC注射小鼠。当对照小鼠垂死或当它们死亡时，评估它们的转移性肿瘤负荷。
除了存活，使用本发明通过测量组织匀浆的荧光强度可以进行抗转移功效的定量评估。将活小鼠实施安乐死，摘除待评估的组织并在盐水中均化。将来自每只小鼠的组织匀浆样品，例如0.2ml，转移到96孔平板，然后使用激光扫描荧光屏检查、例如Acumen Explorer读取荧光。使用该方法，可以测定与对照组相比的转移的量。如果处理的小鼠显示较低的转移性肿瘤负荷，候选药物抑制转移。
现在已经一般地描述了本发明，通过参考具体实施例结合下列附图将更好地理解本发明，本文包括所述具体实施例仅仅是为了举例说明而不是意欲是限制性的，除非另有说明。
附图简述
图1图解在SCID米色小鼠中LOX，LOX-GFP，和LOX-GFP-LM肿瘤的形态学。
图2A至2M显示从LOX，LOX-GFP，和LOX-GFP-LM细胞分离的Affymetrix微阵列数据，证明了这些细胞对所示基因的作用。
图3显示了关于在Acumen Explorer上运行的[4-氨基-2-(1-甲磺酰基-哌啶-4-基氨基)-嘧啶-5-基]-(2，3-二氟-6-甲氧基-苯基)-甲酮(化合物A)的腹水样品的相对荧光单位(RFU)。
图4描述了关于在Acumen Explorer上运行的4-[4，5-双-(4-氯-苯基)-2-(2-异丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4，5-二氢-咪唑-1-羰基]-哌嗪-2-酮(化合物B)和5-(4-乙氧基-喹啉-6-基meth-(Z)-ylidine)-2-(2-羟基-1-(R)-苯基-乙基氨基)-噻唑-4-酮(化合物C)的腹水样品的相对荧光单位(RFU)。
图5描述了关于在Acumen Explorer上运行的4-[(4S，5R)-4，5-双-(4-氯-苯基)-2-(2-异丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4，5-二氢-咪唑-1-羰基]-哌嗪-2-酮(化合物D)和Taxol与化合物D的组合的腹水样品的相对荧光单位(RFU)。
图6举例说明了与赋形剂对照组相比，来自用[4-氨基-2-(1-甲磺酰基-哌啶-4-基氨基)-嘧啶-5-基]-(2，3-二氟-6-甲氧基-苯基)-甲酮(化合物A)处理的Nu/Nu小鼠的腹水样品的百分比荧光强度。
图7举例说明了与赋形剂对照组相比，来自用4-[4，5-双-(4-氯-苯基)-2-(2-异丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4，5-二氢-咪唑-1-羰基]-哌嗪-2-酮(化合物B)或5-(4-乙氧基-喹啉-6-基meth-(Z)-ylidine)-2-(2-羟基-1-(R)-苯基-乙基氨基)-噻唑-4-酮(化合物C)处理的Nu/Nu小鼠的腹水样品的百分比荧光强度。
图8举例说明了与赋形剂对照组相比，来自用4-[(4S，5R)-4，5-双-(4-氯-苯基)-2-(2-异丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4，5-二氢-咪唑-1-羰基]-哌嗪-2-酮(化合物D)或Taxol与化合物D的组合处理的Nu/Nu小鼠的腹水样品的百分比荧光强度。
图9显示用3-甲基-5-(2-氯苯基)-7-氨基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮杂(化合物E)处理的小鼠的肺匀浆样品孔的照片。在植入后第25天收获肺(2×106细胞/小鼠iv)并均化和在Acumen Explorer上运行测定。
1：赋形剂，2：化合物E-5mg/kg，第-1-23天，7+/4-；3：化合物E-5mg/kg，第-1-7天；4：：化合物E-5mg/kg，第3-23天，4+/3-
图10提供用4-[(4S，5R)-4，5-双-(4-氯-苯基)-2-(2-异丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4，5-二氢-咪唑-1-羰基]-哌嗪-2-酮(化合物D)处理的小鼠的肺匀浆样品孔的照片。在植入后第26天收获肺(2×106细胞/小鼠iv)并均化和在AcumenExplorer上运行测定。
1：赋形剂；2：化合物D-200mg/kg Bid，第1天至第21天；3：化合物D-200mg/kg Bid，第-1天至第7天；4：化合物D-200mg/kg Bid，第3天至第21天
图11描述了与赋形剂组相比，来自用3-甲基-5-(2-氯苯基)-7-氨基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮杂(化合物E)处理的SCID米色小鼠的转移肺组织的相对荧光单位(RFU)。
图12描述了与赋形剂组相比，来自用4-[(4S，5R)-4，5-双-(4-氯-苯基)-2-(2-异丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4，5-二氢-咪唑-1-羰基]-哌嗪-2-酮(化合物D)处理的SCID米色小鼠的转移肺组织的相对荧光单位(RFU)。
图13提供了植入LOX-GFP-LM细胞的、用3-甲基-5-(2-氯苯基)-7-氨基-吡唑并[3，4][1，4]苯并二氮杂(化合物E)处理的SCID米色小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。
1：Cum.存活(赋形剂)，2：Cum.存活(化合物E-5mg/kg，第-1-23天)；3：Cum.存活(化合物E-5mg/kg，第-1-7天)；4：：Cum.存活(化合物E-5mg/kg，第3-23天)
图14提供了植入LOX-GFP-LM细胞的、用4-[(4S，5R)-4，5-双-(4-氯-苯基)-2-(2-异丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4，5-二氢-咪唑-1-羰基]-哌嗪-2-酮(化合物D)处理的SCID米色小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。
1：赋形剂；2：化合物D-200mg/kg，po，bid，第-1天至第21天；3：化合物D-200mg/kg，po，bid，第-1天至第7天；4：化合物D-200mg/kg，po，bid，第3天至第21天
图15是含有GFP和Neo的pCMV-tag 5A质粒的关键部分的简单图示。
图16(a-i)描述了GFP表达载体的限制图谱。序列从CMV-启动子(核苷酸位点1-600)开始。GFP ORF位于位置670-1395之间，毗邻SfiI位点。NotI-AscI接头位于位置1400-1410，接着IRES-NEO-模块。BstBI位点位于位置2910，接着HSV-TK poly A位点。
图17提供小鼠的肺匀浆样品孔的照片，所述小鼠注射有LOX-GFP或LOX-GFP-LM肿瘤系。在注射后第14，21，和28天收获肺。
图18显示在SCID小鼠中LOX-GFP-LM和LOX-GFP-诱导的实验肺转移的比较。将样品在96孔平板上用Acumen Explorer测量。
图19提供SCID米色小鼠中LOX-GFP和LOX-GFP-LM肿瘤系两者的Kaplan-Meier存活曲线。
具体实施方式
实施例
实施例1：制备双顺反子GFP构建体
双顺反子GFP构建体由Anne Chua和Ueli Gubler制备和提供，并且含有关于Renilla muelleri GFP(Prolume Ltd.，Pinetop，AZ)和用于G418选择的新霉素磷酸转移酶(新霉素抗性标记)两者的基因。将R.mulleri GFP序列如下工程化到哺乳动物表达载体中。首先通过去除单一NotI和BstBI位点之间的序列片段来改变载体“pCMV-tag 5A”(Stratagene，Genbank登记号AF076312)。这留下了由ColE1复制起点、HSV-TK polyA序列和CMV启动子组成的质粒骨架。然后用编码[IRES-新霉素磷酸转移酶抗性标记]的片段替换缺失的片段。基于例如通过参考结合于此的Rees等，Biotechniques 20：102，1996描述的原理将IRES-序列禁用。选择禁用片段来表示细菌β-内酰胺酶(“bla”)启动子；该策略允许使用新霉素-磷酸转移酶标记用于在大肠杆菌中进行质粒选择(卡那霉素)。在第三步中，将R.mulleriGFP的ORF插入两个SfiI位点之间的IRES序列上游。位于NEO-抗性基因下游的HSV-TK序列用作用于在哺乳动物细胞中表达的polyA信号序列。该质粒的关键部分的简单示意图在图15中显示。
实施例2：制备双顺反子GFP构建体
使用特别设计的模块载体，将R.mulleri GFP的序列改造用于在哺乳动物细胞中稳定表达。该构建体由Ann Chua和Ueli Gubler制备和提供，并且含有关于Renilla muelleri GFP(Prolume Ltd.，Pinetop，AZ)和用于G418选择的新霉素磷酸转移酶(新霉素抗性标记)两者的基因。将R.mulleri GFP序列如下工程化到哺乳动物表达载体中。
步骤1
首先通过去除单一NotI和BstBI位点之间的序列片段来改变载体“pCMV-tag 5A”(Stratagene，Genbank登记号AF076312)。这留下了由ColE1复制起点、HSV-TK polyA序列和CMV启动子组成的质粒骨架。
步骤2
通过重叠序列-PCR，产生具有一般组成5’-AscI-IRES-新霉素磷酸转移酶-BstB1-3’的模块。在该模块中，基于例如通过参考结合于此的Rees等，Biotechniques 20：102，1996描述的原理将IRES-序列禁用。选择禁用片段来表示细菌β-内酰胺酶(“bla”)启动子(Seq ID No.1)；该策略允许使用新霉素-磷酸转移酶标记用于在大肠杆菌中(卡那霉素)以及在哺乳动物细胞中在G418中进行质粒选择。它消除了对用于在大肠杆菌进行质粒选择的额外转录单元的需要，使得最终质粒较小。
步骤3
将来自步骤1的质粒-衍生的NotI/BstbI模块和来自步骤2的AscI-IRES-Neo-BstbI模块随后通过加入合成的短AscI至NotI-接头连接并环化。转化DNA并检查单一分离物的三个片段的正确组装。选择正确组装的质粒克隆用于最后的修饰。
步骤4
将目的基因(GFP)的克隆位点随后通过短的结构为EcoRV-SfiIa-stuffer-SfiIb-NotI的合成接头导入质粒。经过在OliI-NotI位点之间连接，将该接头克隆到在步骤3中衍生的质粒中，由此将它放置在IRES-NEO模块的上游。OliI和EcoRV两者都是平端切割酶，使得它们适合在不再产生位点的情况下连接。使用SfiI位点用于克隆目的基因之后的基本原理是双重的：SfiI是8-碱基切割酶并因此作为选择用于在该载体中表达的ORF中的内部位点极少出现。该位点具有识别序列ggccnnnnnggcc(Seq ID No.2)，允许在ORF的任何一端设计两个不同位点用于定向克隆。选择序列5’-ggccattatggcc-3’(Seq ID No.3)作为SfiI-a(上游)位点，而SfiI-b(下游)位点具有序列5’-ggccgcctcggcc-3’(Seq ID No.4)。
步骤5
将改造为具有适当SfiI位点的R.mulleri GFP的ORF插入IRES序列上游两个SfiI位点之间，获得长度为4196bp的质粒(Seq ID No.5)。在图16中提供了关于GFP表达载体的限制图谱。
实施例3：确立LOX-GFP细胞
细胞转染
将来自人黑素瘤细胞系LOX(国立癌症研究所)的细胞培养在RPMI1640培养基中，RPMI1640培养基含有10％胎牛血清(FBS)。所有的培养基和相关试剂购自Gibco(Invitrogen Corporation，Carlsbad，California)。使用Fugene(Roche Molecular Diagnostics)转染试剂以3∶1(Fugene∶DNA)的比率转染细胞。该顺反子GFP构建体由Ann Chua和Ueli Gubler友好地按照实施例1制备和提供。该构建体含有关于Renilla muelleri GFP(Prolume Ltd.，Pinetop，AZ)和用于G418选择的Neo(新霉素抗性基因)两者的基因。
将100μl不含血清的RPMI1640培养基加入无菌小管，然后加入9μl预温热的Fugene。最后，将3μl GFP DNA构建体加入管底部，混和，室温下温育30分钟。将整个Fugene/DNA混合物加入80％汇合LOX细胞的一个T-25烧瓶中，将细胞温育6小时。在温育后，将烧瓶中的培养基去除并用含有1％遗传霉素(G418)的选择培养基替换。
G418抗性选择花费约4周，之后约30％的细胞以不同水平表达GFP。为了进一步选择GFP表达最高的细胞，将细胞在Department of Pathologyand Pediatrics，UMDNJ进行分选。分选细胞，收集最高5％表达GFP的细胞群体。从第一次分选分离细胞并培养，数周后接着分选，以便获得的细胞获得100％GFP表达。然后将这些LOX-GFP细胞冷冻用于将来体内使用。
实施例4：确立LOX-GFP-LM细胞
将五只雌性Nu/Nu小鼠(Charles River)各自腹膜内(ip)植入1千万LOX-GFP细胞。在13天后，从小鼠中收获含有LOX-GFP细胞的腹水液，用PBS 1∶4稀释腹水。然后将腹水/PBS溶液过滤通过40μm尼龙细胞滤网并在1500rpm下离心。将沉淀的细胞重悬浮在PBS中并计数获得所需的细胞浓度。
将20只雌性Nu/Nu小鼠(10只小鼠/组)通过尾静脉静脉内(iv)以2×106细胞/小鼠或1×106细胞/小鼠植入分离自腹水(以上)的LOX-GFP肿瘤细胞。在发现组中的一些小鼠垂死或死亡后，将组中剩余的小鼠实施安乐死。将肺分离和在荧光立体显微镜下检查以发现可能的微转移。获得的ivLOX-GFP肺转移在表1中列出。
表1.LOX-GFP腹水移植到Nu/Nu小鼠中。
  移植后天数  2×106细胞/小鼠   1×106细胞/小鼠
第36天  5只小鼠死亡2只小鼠具有肺转移，中等GFP表达。3只小鼠没有转移迹象
第59天   2只小鼠死亡2只小鼠具有肺转移，无GFP表达。1只小鼠(No.10)具有肺转移，具有强GFP表达5只小鼠没有转移迹象
似乎转移到肺中的比率没有文献中报道的高，这可能导致定量分析困难。一些转移克隆失去了GFP表达，提示细胞系在体内不稳定。来自1×106细胞组的一只小鼠(No.10)在肺转移克隆中具有极强的GFP表达。
通过轻微解剖，从No.10小鼠的肺中回收LOX-GFP细胞(约2×3mm)的四个克隆。每个克隆分别在无菌金属滤网(No.40)上研磨，用2-3ml培养基洗涤并在1500rpm下离心。将细胞沉淀在含有10％青霉素/链霉素和10％FBS的RPMI1640培养基中洗涤并接种到含有10ml含有10％FBS和2％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基的T-25烧瓶中。将细胞在含有G418的选择培养基中常规传代，以去除任何小鼠细胞污染物。在2-3次传代后，由于弱GFP表达和差的生长，丢弃来自1和2号克隆的培养物。将来自3和4号克隆的培养物放大并冷冻备将来使用。来自4号克隆的细胞被认为在GFP和生长方面优秀并命名为LOX-GFP-LM(LM表示肺转移)。
实施例5：LOX-GFP-LM细胞的体内转移
将30只雌性SCID米色小鼠(Charles River)iv植入1、2或5百万LOX-GFP-LM细胞到尾静脉中。在植入后第29天，记录到达那点的每组的垂死率或死亡率，将其余小鼠实施安乐死。分离肺并且每个样品在3mlPBS中均化。将0.1ml/样品的肺匀浆转移到96孔平板中并且使用AcumenExplorer测量荧光。在植入后29天后，发病或死亡的发生率与植入的细胞数目直接相关，在植入5百万细胞的小鼠中观察到最高的发病率和死亡率(表2)。所有小鼠具有GFP表达肺转移克隆，然而肺转移的数目和密度变化很大。
表2：在SCID米色小鼠中LOX-GFP-LM诱导的实验肺转移。
组   发病率/死亡率第29天 存在的肺转移 在肺转移中观察到的GFP表达   肺匀浆的相对荧光单位(平均值±SD)
  5×106细胞/小鼠 7/10 3/3 3/3 未评估
  2×106细胞/小鼠 4/10 6/6 6/6   58457423±52009858
  1×106细胞/小鼠 2/10 8/8 8/8   45712175±30253653
实施例6：表征LOX-GFP-LM，LOX-GFP，和LOX细胞
LOX，LOX-GFP，和LOX-GFP-LM肿瘤体内形态学：
将9只雌性SCID米色小鼠(Charles River)皮下(sc)植入LOX或LOX-GFP细胞，或者iv植入LOX-GFP-LM细胞。使得LOX和LOX-GFP肿瘤生长直至它们达到～300-400mm3的体积(植入后约10-14天)，然后收集并固定在10％福尔马林中。使得LOX-GFP-LM细胞在29天内发展肺转移，然后收集肺部分并固定在10％福尔马林中。将肿瘤和肺样品用H&E染色并评估形态学。在来自三种不同LOX肿瘤细胞系(LOX，LOX-GFP和LOX-GFP-LM)的肿瘤之间在形态学方面没有观察到差异(图1)。
实施例7：LOX，LOX-GFP，和LOX-GFP-LM细胞系的基因微阵列分析
将细胞铺平板在具有RPMI-1640，10％FBS和1％青霉素/链霉素(对于LOX-GFP和LOX-GFP-LM细胞加上0.5％G418)的6孔培养板中并温育48小时。在去除培养基后，用PBS洗涤细胞一次，每孔加入0.8ml的RLT缓冲液，室温下振荡平板2分钟。将来自每孔的细胞悬浮液转移到分开的管中并在-80℃下冷冻用于将来微阵列分析。来自每个肿瘤系的四个分开样品在微阵列中使用Affymetrix U133plus2芯片运行。对于LOX-GFP和LOX-GFP-LM细胞两者显示与LOX亲代细胞系相比较的独特基因标记。(图2)在LOX-GFP-LM细胞中，发现124个基因完全改变，与LOX-GFP细胞相比，67个基因上调和其余57个基因下调。在至少4倍上调的基因之中，一系列基因(至少7个基因，以粗体标记)被认为与黏着，基质降解或血管发生相关。另一类基因(下划线标记)被认为与生长因子或分化相关。两个系列的基因都包含可能期望在具有更大侵略性和侵袭性表型的细胞群体中富含的基因类型。
实施例8：LOX-GFP腹膜(腹水)模型
将按照实施例3的方法制备的人黑素瘤LOX-GFP细胞保持在RPMI1640培养基加10％FBS和1％遗传霉素(G418)中。将雌性Nu/Nu小鼠腹膜内(ip)注射在500μl PBS体积中的1千万LOX-GFP细胞，随机分为多组，如表3、4和5所示用各种剂量和/或剂量给药方案处理。
测试的化合物
Figure A20071009215900251
表3.关于LOX-GFP腹水模型的治疗组。
  组   iv细胞注射第0天   处理   小鼠数目   剂量给药之日(在细胞注射后)  腹水收获之日
  1 10×106细胞/小鼠   Taxol的赋形剂   2   第4，5，&6天  第7天
  2   Taxol 10mg/kg iv，0.2ml，3剂量   2   第4，5，&6天  第7天
  3   Taxol 10mg/kg iv，0.2ml，2剂量   2   第5&6天  第7天
  4   Taxol 10mg/kg iv，0.2ml，单一剂量   2   第6天  第7天
  5   化合物A的赋形剂   2   第4，5，&6天  第7天
  6   化合物A 40mg/kgpo，0.2ml，3剂量   2   第4，5，&6天  第7天
  7   化合物A 40mg/kgpo，0.2ml，2剂量   2   第5&6天  第7天
  8   化合物A 40mg/kgpo，0.2ml，单一剂量   2   6第6天  第7天
表4.关于LOX-GFP腹水模型的治疗组。
  组   植入的肿瘤细胞(第0天)   处理   小鼠数目   剂量给药之日(在细胞注射后)   腹水收获之日
  1   10×106细胞/小鼠   化合物B的赋形剂   5   第2，3，4.5，6&7天   第8天
  2   化合物B 40mg/kg sc，0.2ml，6剂量   5   第2，3，4.5，6&7天   第8天
  3   化合物B的赋形剂   5   第2，3，4.5，6&7天   第8天
  4   化合物C 200mg/kgpo bid，0.2ml，12剂量   5   第2，3，4.5，6&7天   第8天
  5   Taxol的赋形剂   5   第5，6&7天   第8天
  6   Taxol 15mg/kg iv，0.2ml，3剂量   5   第5，6&7天   第8天
表5.关于LOX-GFP腹水模型的治疗组。
  组   植入的肿瘤细胞(第0天)   处理   小鼠的数量  剂量给药之日(在细胞注射后)   腹水收获之日
  10×106细胞/小鼠   化合物D的赋形剂   4   第4，5&6天   第7天
  1   化合物D 100mg/kgpo bid，0.2ml，6剂量   4   第4，5&6天   第7天
  2   化合物D 50mg/kgpo bid，0.2ml，6剂量   4   第4，5&6天   第7天
  3   化合物D 25mg/kgpo bid，0.2ml，6剂量   4   第4，5&6天   第7天
  4   Taxol 15mg/kg iv，0.2ml，2剂量   4   第5&6天   第7天
  5   Taxol 15mg/kg iv，0.2ml，2剂量+化合物D 100mg/kg pobid，0.2ml，6剂量   4   第5&6天(Taxol)第4，5&6天(化合物D)   第7天
  6   Taxol 15mg/kg iv，0.2ml，2剂量+化合物D 50mg/kg pobid，0.2ml，6剂量   4   第5&6天(Taxol)第4，5&6天(化合物D)   第7天
  7   Taxol 15mg/kg iv，0.2ml，2剂量+化合物D 25mg/kg pobid，0.2ml，6剂量   4   第5&6天(Taxol)第4，5&6天(化合物D)   第7天
腹水收获方法(在植入后第7天或第8天)：
将小鼠实施安乐死，然后沿着腹部中线透过皮肤和腹膜做一个小切口。利用玻璃巴斯德管从腹膜中吸取和取出腹水液，将腹水转移到15ml管中。使用3ml盐水漂洗腹腔，回收所有盐水和转移到含有腹水液的15ml管中。将腹水细胞悬浮液过滤通过40μm尼龙滤器以获得单细胞悬浮液，并在1500rpm下离心10分钟。去除上清液，将细胞沉淀重悬浮在2ml新鲜盐水中。将来自每个样品的0.1ml转移到96孔平板，利用AcumenExplorer评估细胞数目(报道为相对荧光单位)。
结果
7或8天是在ip植入LOX-GFP细胞的小鼠中形成充足腹水的足够持续时间，并且另外足以测量系统施用的癌症疗法的生长抑制性质。Taxol和化合物A都显示对LOX-GFP腹水生长的抑制效果，所述LOX-GFP腹水生长直接依赖于治疗的数目。单一剂量没有抑制细胞生长，而两个剂量减少细胞生长，三个剂量最大地减少细胞生长(图3和6)。化合物B和化合物C显示对LOX-GFP腹水生长的抑制作用(图4和7)。化合物D在几个剂量下抑制LOX-GFP腹水生长，然而效果并不是依赖于剂量的。关于腹水生长抑制，相比于单独Taxol，将化合物D和Taxol组合并没有附加益处，然而组合并不是有对抗作用的。(图5和8)。
实施例9：LOX-GFP-LM转移模型
将按照实施例4的方法制备的人黑素瘤LOX-GFP-LM细胞保持在RPMI 1640培养基加上10％FBS和1％遗传霉素(G418)中。将雌性SCID米色小鼠经由尾静脉iv注射在200μl体积的无血清RPMI1640中的2百万细胞，随机分成多组，并且如表6和7所示用各种剂量和/或剂量方案处理。当发现在赋形剂处理组中＞3只小鼠垂死时，每个治疗组取出5只小鼠评估转移肺肿瘤负荷。监视每个组的其余小鼠的存活益处直至它们垂死。
测试的化合物
Figure A20071009215900301
表6.关于LOX-GFP-LM实验转移模型的治疗组(化合物E研究)
  组   注射的肿瘤细胞(第0天)   治疗   小鼠数目   细胞注射后剂量给药之日   肺收获之日(5只小鼠/组)
  1 2×106细胞/小鼠   赋形剂   20   第-1天至第21天   25
  2 化合物E5mg/kg po，bid   15   第-1至21天(7+/4-方案)   25
  3   15   第-1至7天   25
  4   15   第3至21天(4+/3-方案)   25
表7.关于LOX-GFP-LM实验转移模型的治疗组(化合物D研究)
  组   植入的肿瘤细胞(第0天)   药物   小鼠数目   在细胞注射之后剂量给药之日   肺收获之日(5只小鼠/组)
  1   2×106细胞/小鼠   赋形剂   20   第-1至21天   26
  2   化合物D200mg/kgpo，bid   15   第-1至21天   26
  3   15   第-1至7天   26
  4   15   第3至21天   26
对于抗转移功效的定量评估，评价两个参数：1)肺匀浆的荧光强度和2)存活。
肺匀浆的荧光强度：
在第25或26天从研究中取出每个治疗组5只小鼠用于评估肺转移性肿瘤负荷。将小鼠实施安乐死，摘除肺，放置在3ml盐水中，并匀化。将0.2ml肺匀浆转移到96孔平板，使用Acumen Explorer读取荧光。(图9和10)。荧光报道为相对荧光单位(RFU)。(表8和9，图11和12)。通过Student-检验或Mann-Whitney U检验确定统计学分析，当概率值(p)≤0.05时，组之间的统计学差异被认为是显著的。
表8.在Acumen Explorer上运行的肺匀浆样品的相对荧光单位(RFU)(化合物E研究)
  治疗   RFU(平均值±SD)   CV  *TGI％在第25天               P值
  Vs赋形剂组   Vs第-1-第23天组   Vs第-1-第7天组
  赋形剂   48793363±22922819 47
  化合物E5mg/kg po，bid第-1-23天 12738540±5426672 43 73.9 0.022
  化合物E5mg/kg po，bid第-1-7天 51670506±29321586 57 -5.9 0.87 0.040
  化合物E5mg/kg po，bid第3-23天 8618508±3198528 37 82.3 0.017 0.19 0.030
*TGI＝相对于赋形剂对照组的肿瘤生长抑制。
表9.在Acumen Explorer上运行的肺匀浆样品的相对荧光单位(RFU)(化合物D研究)
  处理   RFU(平均值±SD)   CV  *TGI％第26天   P值
  Vs赋形剂   Vs第-1-第21天   Vs第-1-第7天
  赋形剂   62091178±16262491 26
  化合物D200mg/kg po，bid第-1-21天 13230372±11960417 90 78.7 0.001
  化合物D200mg/kg po，bid第-1-7天 21092887±10460489 50 66.0 0.002 0.301
  化合物D200mg/kg po，   2359191±526586 22 96.2 0.001 0.077 0.004
  bid第3-21天
*TGI＝相对于赋形剂对照组的肿瘤生长抑制。
存活
存活表示由于肺转移或转移到其它器官导致的总的转移状态。将由于呼吸困难或下肢麻痹导致的垂死监视和记录为存活的替代终点。对于存活评估，将结果绘制为相对于在肿瘤植入后天数的百分比存活。将增加的寿命-时期(％ILS)计算为：ILS％＝100×[(治疗组的中值存活日-对照组的中值存活日)/对照组的中值存活日]。利用Kaplan Meier存活分析来测定中值存活或(50％存活时间)。(图13和14)。通过log-秩检验分析存活的差异。当概率值(p)≤0.05时，组之间的统计学差异被认为是显著的。类似于实施例5中LOX-GFP-LM转移模型的初始表征，当iv注射时在100％的小鼠中细胞转移到肺中，并且观察肺转移的时间范围也是类似的(在先前研究中40％存活@29天对比在本发明两个研究中50％存活@24或28天)。(表10和11；图13和14)
如通过肺匀浆的荧光强度评估，化合物E的晚期干预(第3至第23天剂量给药)或全长干预(第-1至第23天)具有相当的抗转移活性。
如通过肺匀浆的荧光强度评估，与赋形剂相比，化合物D的晚期干预(第3至第23天剂量给药)具有优秀的抗转移活性。
表10.与赋形剂对照组相比，使用化合物E治疗的组的存活。
  处理   50％存活日   ILS％                   P值
  Vs赋形剂组   Vs第-1-d23天   Vs第-1-d7天
  赋形剂 24
  化合物E 5mg/kgpo，bid第-1-d23天 28 16.7 ＜0.0001
  化合物E 5mg/kgpo，bid第-1-d7天 25 4.2 0.0001 0.02
  化合物E 5mg/kgpo，bid第3-d23天 28 16.7 ＜0.0001 0.83 0.03
表11.与赋形剂对照组相比，用化合物D处理的组的存活。
  处理   50％存活日   ILS％               P值
  Vs赋形剂组   Vs第-1-d23天   Vs第-1-d7天
  赋形剂 28
  化合物D 200mg/kgpo，bid第-1-d21天 31 10.7 0.0074
  化合物D 200mg/kgpo，bid第-1-d7天 28 0 0.649 0.03
  化合物D 200mg/kgpo，bid第3-d21天 36 29 ＜0.0001 0.15 0.002
实施例10：在实验肺转移上LOX-GFP-LM和LOX-GFP的比较
将先前产生的人黑素瘤LOX-GFP和LOX-GFP-LM细胞保持在RPMI1640培养基加上10％FBS和1％遗传霉素(G418)中。将雌性SCID米色小鼠(每种肿瘤细胞系25只小鼠)经由尾静脉iv注射在200μl体积的无血清RPMI1640中的2百万细胞，LOX-GFP或LOX-GFP-LM。对于每个时间点(植入后第14，21和28天，总共15只小鼠，参见表12)，从5只小鼠收获肺。其余小鼠，每组10只小鼠，监视存活益处直至它们垂死。评价两个参数用于定量评估肿瘤生长：1)肺匀浆的荧光强度和2)存活。
表12：将LOX-GFP和LOX-GFP-LM植入SCID米色小鼠
  组   植入的肿瘤细胞(第0天)   药物   小鼠No.   肺收获之日(5只小鼠/组)
  1   2×106细胞/0.2ml/小鼠，iv   LOX-GFP-LM   25   14，21和28
  2   LOX-GFP   25   14，21和28
  总共   50
肺匀浆的荧光强度：
从每组中取出五只(5)小鼠用于评估肺转移性肿瘤负荷。将小鼠实施安乐死，摘除它们的肺，放置在3ml盐水中并均化。将肺匀浆，0.2ml，转移到96孔平板中，使用Acumen Explorer读取荧光。(图17)。将荧光报道为相对荧光单位(RFU)。(图18和表13)。通过Student-检验或Mann-Whitney U检验确定统计学分析，当概率值(p)≤0.05时，组之间的统计学差异被认为是显著的。
表13.肿瘤系(LOX-GFP-LM和LOX-GFP诱导的实验性转移的总结表
  肿瘤系   肺转移：相对荧光单位(RFU)(平均值±SD)   50％存活日
  第14天   第21天   第28天
  LOX-GFP-LM   1375463±   38173338±   NA   25
  461906   26458094
  LOX-GFP   1323534±465272   1908836±376654   13848195±22888238  31
  P值   0.86   0.037  ＜0.001
存活评估
对于存活评估，将由于呼吸困难或下肢麻痹导致的垂死小鼠作为终点记录，并且将结果绘制为相对于在肿瘤植入后天数的百分比存活。利用Kaplan Meier存活分析来测定中值存活。通过log-秩检验分析存活曲线的差异，当概率值(p)≤0.05时，组之间的统计学差异被认为是显著的。(图19)
结果和讨论：
注射LOX-GFP-LM的SCID米色小鼠，与用LOX-GFP注射的小鼠的相同品系(SCID米色)相比，在第21天显示高得多的肺转移率(100％)和较短的存活时间(所有小鼠在25天内死亡)，体内GFP转染稳定(100％)。在LOX-GFP组中，在第21天，发现五只小鼠中的两个具有肺转移而不显示GFP信号，提示较低的转移率和体内不稳定的GFP转染。在LOX-GFP组中50％存活时间比LOX-GFP-LM组延迟6天(31天对25天)。
两个组在第14天都没有显示任何肺转移。然而，在LOX-GFP-LM组中，从第21天至第25天，小鼠或者显示强烈的肺转移或者是垂死的。对于LOX-GFP组，从第26天至第39天小鼠死亡或者垂死。似乎在肺中肿瘤负荷方面没有平台时期；换句话说，当肺发展广泛的肺转移时，小鼠将在短时期内立即变得垂死或死亡。
结论：
相比于相同品系小鼠中的LOX-GFP，LOX-GFP-LM导致更多的具有稳定GFP信号的肺转移。两种肿瘤系都显示随时间的在肺中的动态的肿瘤负荷生长。
                                 序列表
<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司
<120>利用绿色荧光蛋白的肿瘤模型
<130>23693
<140>
<141>
<150>US 60/788,250
<151>2006-03-31
<160>5
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
<400>1
ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata taggaggtat 60
aaccatg                                                           67
<210>2
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221>修饰的_碱基
<222>(5)..(9)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>2
ggccnnnnng gcc                                                        13
<210>3
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
<400>3
ggccattatg gcc                                                        13
<210>4
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
<400>4
ggccgcctcg gcc                                                        13
<210>5
<211>4196
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成的核苷酸构建体
<400>5
atgcattagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 60
gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 120
cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 180
acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 240
tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 300
ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 360
tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc 420
acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa 480
tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag 540
gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatccgcta 600
gcgattacgc caagctcgaa attaaccctc actaaaggga acaaaagctg gagctccaca 660
tcggccatta tggccgagca agcagatcct gaagaacacc tgcctgcagg aggtgatgag 720
ctacaaggtg aacctggagg gcatcgttaa caaccacgtg ttcaccatgg agggctgcgg 780
caagggcaac atcctgttcg gcaaccaatt ggtgcagatc cgcgtgacca agggcgcccc 840
cctgcccttc gccttcgaca tcgtgagccc cgccttccag tacggcaacc gtacgttcac 900
caagtacccc aacgacatca gcgactactt catccagagc ttccccgccg gcttcatgta 960
cgagcgcacc ctgcgctacg aggacggcgg cctggtggag atccgcagcg acatcaacct 1020
gatcgaggac aagttcgtgt accgcgtgga gtacaagggc agcaacttcc ccgacgacgg 1080
gcccgtgatg cagaagacca tcctgggcat cgagcccagc ttcgaggcca tgtacatgaa 1140
caacggcgtg ctggtgggcg aggtgatcct ggtgtacaag cttaacagcg gcaagtacta 1200
cagctgccac atgaagaccc tgatgaagag caagggcgtg gtgaaggagt tccccagcta 1260
ccacttcatc cagcaccgcc tcgagaagac ctacgtggag gacggcggct tcgtggagca 1320
gcacgagacc gccatcgccc agatgaccag catcggcaag cccctgggat ccctgcacga 1380
gtgggtgtag gccgcctcgg ccgcggccgc atatggcgcg ccgtcgagca tgcatctagg 1440
gcggccaatt ccgcccctct ccctcccccc cccctaacgt tactggccga agccgcttgg 1500
aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt gattttccac catattgccg tcttttggca 1560
atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc 1620
ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag 1680
cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg 1740
gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac 1800
aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa 1860
gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc 1920
tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaaa cgtctaggcc 1980
ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataatat ggccacaacc 2040
ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aatattgata taggaggtat 2100
aaatatggga tcggccattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt 2160
ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt 2220
gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc 2280
cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc 2340
ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga 2400
agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat 2460
ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca 2520
agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga 2580
tgatctggac gaagaacatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc 2640
gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat 2700
catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga 2760
ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagaacttg gcggcgaatg 2820
ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt 2880
ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgatt cgaagaccga ccaagcgacg cccaacctgc 2940
catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt 3000
tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc 3060
accctagggg gaggctaact gaaacacgga aggagacaat accggaagga acccgcgcta 3120
tgacggcaat aaaaagacag aataaaacgc acggtgttgg gtcgtttgtt cataaacgcg 3180
gggttcggtc ccagggctgg cactctgtcg ataccccacc gagaccccat tggggccaat 3240
acgcccgcgt ttcttccttt tccccacccc accccccaag ttcgggtgaa ggcccagggc 3300
tcgcagccaa cgtcggggcg gcaggccctg ccatagcctc aggttactca tatatacttt 3360
agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 3420
atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 3480
aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 3540
caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 3600
ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 3660
cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 3720
tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 3780
gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 3840
ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 3900
gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 3960
caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 4020
ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 4080
tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 4140
ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcc     4196

Claims (50)

1.一种评估肿瘤是否转移的方法，该方法包括：
(a)将表达GFP的肿瘤细胞注射到无胸腺小鼠中；
(b)处死所述小鼠，
(c)摘除待评估的一个或多个组织，
(d)将所述摘除的组织均化，和
(e)使用激光扫描荧光屏检查，将所述均化组织的样品中的GFP水平定量。
2.权利要求1的方法，其中所述肿瘤细胞是黑素瘤、乳腺、前列腺、肺、胰腺、或结肠直肠细胞。
3.权利要求2的方法，其中所述肿瘤细胞是LOX，MDA-MB-435，MDA-MB-231，PC-3，DU-145，H460a，A549，MIAPaCa2，HCT116，或HT-29。
4.权利要求3的方法，其中所述肿瘤细胞是LOX细胞。
5.根据权利要求1至4中任何一项的方法，其中所述小鼠是裸鼠。
6.根据权利要求1至4中任何一项的方法，其中所述小鼠是SCID小鼠。
7.根据权利要求1至6中任何一项的方法，其中所述摘除的组织是肺、肝、骨、骨髓、脾、淋巴结、肾、卵巢或脑。
8.权利要求7的方法，其中所述摘除的组织是肺组织。
9.根据权利要求1至8中任何一项的方法，其中所述表达GFP的肿瘤细胞包含新霉素抗性基因。
10.根据权利要求1至9中任何一项的方法，其中所述表达GFP的肿瘤细胞是如下制备的：
(a)制备包含编码GFP蛋白的核酸的载体；
(b)用所述载体转染所述肿瘤细胞。
11.权利要求10的方法，其中所述载体另外包含用于G418选择的新霉素抗性基因(Neo基因)。
12.根据权利要求1至11中任何一项的方法，其中所述GFP是来自Renillamuelleri。
13.一种评估用于抑制肿瘤转移的候选药物或方案的方法，该方法包括
(a)用表达GFP的肿瘤细胞注射无胸腺小鼠；
(b)向所述小鼠施用候选药物或方案；
(c)处死所述小鼠；
(d)摘除一个或多个组织用于评估转移抑制；
(e)均化所述组织；
(f)使用激光扫描荧光屏检查，将所述组织的均化样品中的GFP水平定量；和
(g)将所述均化样品中的GFP水平与来自对照动物的GFP水平比较，所述对照动物没有用所述候选药物或方案处理；
其中在所述处理的样品中降低的GFP水平表示转移的抑制。
14.权利要求13的方法，其中所述肿瘤细胞是黑素瘤、乳腺、前列腺、肺、胰腺、或结肠直肠细胞。
15.权利要求14的方法，其中所述肿瘤细胞是LOX，MDA-MB-435，MDA-MB-231，PC-3，DU-145，H460a，A549，MIAPaCa2，HCT116，或HT-29。
16.权利要求15的方法，其中所述肿瘤细胞是LOX细胞。
17.根据权利要求13至16中任何一项的方法，其中所述小鼠是裸鼠。
18.根据权利要求13至16中任何一项的方法，其中所述小鼠是SCID小鼠。
19.根据权利要求13至18中任何一项的方法，其中所述摘除的组织是肺、肝、骨、骨髓、脾、淋巴结、肾、卵巢或脑。
20.权利要求19的方法，其中所述摘除的组织是肺组织。
21.根据权利要求13至20中任何一项的方法，其中所述表达GFP的肿瘤细胞包含新霉素抗性基因。
22.根据权利要求13至21中任何一项的方法，其中所述表达GFP的肿瘤细胞是如下制备的：
(a)制备包含编码GFP蛋白的核酸的载体；
(b)用所述载体转染所述肿瘤细胞。
23.权利要求22的方法，其中所述载体另外包含用于G418选择的Neo基因。
24.根据权利要求13至23中任何一项的方法，其中所述GFP是来自Renillamuelleri。
25.一种评估用于治疗肿瘤的候选药物或方案的方法，所述方法包括
(a)用表达GFP的肿瘤细胞腹膜内注射无胸腺小鼠；
(b)向所述小鼠施用候选药物或方案；
(c)摘除包含肿瘤的腹水或器官用于评估；
(f)使用激光扫描荧光屏检查，将所述腹水或均化组织的样品中的GFP水平定量；
(g)将所述腹水或均化样品中的GFP水平与来自对照动物的GFP水平比较，所述对照动物没有用所述候选药物或方案处理；
其中在所述处理的样品中降低的GFP水平表示所述候选药物或方案有效用于治疗所述肿瘤。
26.权利要求25的方法，其中所述肿瘤细胞是黑素瘤、乳腺、前列腺、肺、胰腺、或结肠直肠细胞。
27.权利要求26的方法，其中所述肿瘤细胞是LOX，MDA-MB-435，MDA-MB-231，PC-3，DU-145，H460a，A549，MIAPaCa2，HCT116，或HT-29。
28.权利要求27的方法，其中所述肿瘤细胞是LOX细胞。
29.根据权利要求25至28中任何一项的方法，其中所述小鼠是裸鼠。
30.根据权利要求25至28中任何一项的方法，其中所述小鼠是SCID小鼠。
31.根据权利要求25至30中任何一项的方法，其中所述摘除的组织是腹水。
32.根据权利要求25至31中任何一项的方法，其中所述表达GFP的肿瘤细胞包含新霉素抗性基因。
33.根据权利要求25至32中任何一项的方法，其中所述表达GFP的肿瘤细胞是如下制备的：
(a)制备包含编码GFP蛋白的核酸的载体；
(b)用所述载体转染所述肿瘤细胞。
34.权利要求33的方法，其中所述载体另外包含用于G418选择的Neo基因。
35.根据权利要求25至34中任何一项的方法，其中所述GFP是来自Renillamuelleri。
36.根据权利要求25至35中任何一项的方法，其中腹水被摘除并被评估。
37.根据权利要求25至36中任何一项的方法，其中器官被摘除并被评估。
38.一种增加细胞系转移至特定组织的倾向的方法，该方法包括
(a)用表达GFP的肿瘤细胞腹膜内注射无胸腺小鼠；
(b)处死所述小鼠；
(c)摘除由所述小鼠形成的腹水；
(d)将所述腹水静脉内注射到无胸腺小鼠中；
(e)处死所述小鼠；
(f)摘除欲增加向其转移的组织；
(g)从所述摘除的器官中回收表达GFP的肿瘤细胞；
(h)体外培养所述回收的细胞；
(i)将来自步骤(h)的培养的细胞注射到无胸腺小鼠中；
其中所述培养的肿瘤细胞转移到在步骤(f)中摘除的组织，其程度要大于原始的表达GFP的肿瘤细胞。
39.权利要求38的方法，其中所述肿瘤细胞是黑素瘤、乳腺、前列腺、肺、胰腺、或结肠直肠细胞。
40.权利要求39的方法，其中所述肿瘤细胞是LOX，MDA-MB-435，MDA-MB-231，PC-3，DU-145，H460a，A549，MIAPaCa2，HCT116，或HT-29。
41.权利要求40的方法，其中所述肿瘤细胞是LOX细胞。
42.根据权利要求38至41中任何一项的方法，其中所述小鼠是裸鼠。
43.根据权利要求38至41中任何一项的方法，其中所述小鼠是SCID小鼠。
44.根据权利要求38至43中任何一项的方法，其中所述摘除的组织是肺、肝、骨、骨髓、脾、淋巴结、肾、卵巢或脑。
45.权利要求44的方法，其中所述摘除的组织是肺。
46.权利要38的方法，其中所述表达GFP的肿瘤细胞包含新霉素抗性基因。
47.根据权利要求38至46中任何一项的方法，其中所述表达GFP的肿瘤细胞是如下制备的：
(a)制备包含编码GFP蛋白的核酸的载体；
(b)用所述载体转染所述肿瘤细胞。
48.权利要求47的方法，其中所述载体另外包含用于G418选择的Neo基因。
49.根据权利要求38至48中任何一项的方法，其中所述GFP是来自Renillamuelleri。
50.LOX-GFP-LM细胞系。
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