CN1860232A

CN1860232A - 鉴别基因功能的方法和组合物

Info

Publication number: CN1860232A
Application number: CNA2004800282661A
Authority: CN
Inventors: G·汉森; A·阿武因; B·赞布罗维奇; C·J·弗里德勒; W·P·登普西
Original assignee: Lexicon Genetics Inc
Current assignee: Lexicon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2003-09-30
Filing date: 2004-09-30
Publication date: 2006-11-08
Also published as: AU2004278685A1; CA2540244A1; MXPA06003572A; RU2006114432A; EP1678307A1; JP2007507224A; IL174437A0; KR20060092244A; US20050118710A1; WO2005033315A1

Abstract

提供了一种产生并分析被插入突变的细胞克隆的方法。提供了结合插入突变的细胞。还提供了一组插入突变的细胞克隆。

Description

鉴别基因功能的方法和组合物

本申请要求提交于2003年9月30日的美国临时申请号60/507,437的优先权，该申请在此引入作为用于任何目的的参考。

1.0领域

提供了产生和表征细胞中的插入突变的方法。还提供了稳定结合插入突变的细胞。

2.0背景

许多人类治疗(有某些例外，包括，例如，直接靶向病原体的抗体)直接或间接地与基因组序列信息的有限集所编码的产物或元件相互作用。因此，科学考查转向对那些可能提出清楚的医疗介入途径的编码序列信息部分进行鉴别。许多治疗性产物通过调节生理起作用。在成千上万种生物化学和构建体相关的人类基因组编码产物中，科学团体仅清楚鉴别了这些产物中一部分的生理功能。出于多种原因，在某些情况下，小鼠成为代理表征(characterizing-by-proxy)人类生物序列生理意义的模式生物。作为一种哺乳动物，小鼠拥有许多人类的主要器官系统并经常利用直向同源产物(orthologous products)调节这些器官系统的功能。此外，在某些情况下，小鼠还允许其自身基因组的基因工程操作。

在某些情况下，小鼠胚胎干细胞(ES)技术提供了染色体工程的方法并，因此，提供了假定基因组(genomic hypotheses)的直接检测。

3.0概述

在某些实施方案中，提供了产生一组单独表征的被插入突变的哺乳动物细胞克隆的方法。在某些实施方案中，该方法包括用逆转录基因诱捕构建体感染哺乳动物细胞。在某些实施方案中，该方法进一步包括选择稳定结合所述逆转录基因诱捕构建体的整合前病毒形式的哺乳动物细胞克隆。在某些实施方案中，该方法进一步包括体外鉴别所述逆转录基因诱捕构建体的整合前病毒形式附近的基因组DNA区域。

在某些实施方案中，用逆转录病毒基因诱捕构建体以小于5的感染复数(M.O.I)感染哺乳动物细胞。在某些实施方案中，感染复数小于1。在某些实施方案中，感染复数小于0.5。

在某些实施方案中，鉴别包含反向聚合酶链式反应(IPCR)。在某些实施方案中，反向聚合酶链式反应包含至少一种选自Pfu、Taq、Isis、Vent、Pwo、Phusion和Tth的聚合酶。在某些实施方案中，通过测序来鉴别所述逆转录病毒基因诱捕构建体的整合前病毒形式附近的基因组DNA的至少50个碱基。在某些实施方案中，鉴别不涉及逆转录酶反应。

在某些实施方案中，选择了至少10,000个不同的哺乳动物细胞克隆的集群。在某些实施方案中，选择了至少10,000个不同的哺乳动物细胞克隆的集群，其包含至少10,000个不同的哺乳动物细胞克隆，每个克隆都在不同的基因中含有所述逆转录病毒基因诱捕构建体的整合的前病毒形式。

在某些实施方案中，提供了一组单独表征的被插入突变的哺乳动物细胞克隆。

4.0附图简述

图1显示了反向聚合酶链式反应(IPCR)的示意图。

图2显示了VICTR48的示意图。“LTR”是逆转录病毒的长末端重复。“SA”是剪接受体位点。“NEO”是新霉素抗性基因。“PA”是多腺苷酸化位点。“SV40tpA”是SV40的三重多腺苷酸化序列。“PGK”是PGK启动子。“BTK”和“SD”是小鼠BTK基因第一外显子和剪接供体位点。剪接供体之后是BTK基因第一内含子的一部分。标出了限制性位点。限制性位点名称后面的星号(*)表示其是在构建体上的独特位点。

图3显示了来自数个被基因诱捕的ES细胞克隆的IPCR分析的示例产物，如实施例6.2所讨论。

图4显示了莫洛尼鼠类白血病病毒长末端重复(LTR)的序列，缺少至少一部分的增强子区(SEQ ID NO：5)。

图5显示了被修饰的LTR，其缺少至少一部分的增强子区还缺少LTR内的隐蔽剪接供体(SEQ ID NO：6)。

图6A-C显示了VICTR 48的序列(SEQ ID NO：7)。

5.0详细说明

本文所用的本节标题仅用于组织目的而不能被解释为限制所述对象的内容。本申请引用的所有参考在此特别引入作为用于任何目的的参考。

在本申请中，除非特别声明，单数的使用包含了复数。在本申请中，除非特别声明，“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包含”，还有其它形式，如“包括”，的使用，不具限制意义。在多个实施方案中，可以用标准技术进行重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养、转化和转染。在多个实施方案中，可依据制造商说明书或依据本领域内的常规成熟技术或依据本文所述技术进行酶促反应和纯化技术。在多个实施方案中，通常可以按照本领域内已知的常规方法，也可以按照本说明书各处引用和讨论的各种一般性的和较具体的参考文献所述，和/或按照本领域内技术人员所知的方法实施技术和程序。见，例如，Sambrook等.Molecular Cloning：ALaboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989).

在某些实施方案中，提供了在哺乳动物生物学意义上鉴别遗传编码的生物序列(包括，但不限于，蛋白质、多肽、氨基酸序列，多核苷酸和核苷酸序列)的生理作用的方法。在某些实施方案中，提供了培养和处理真核细胞的方法以产生具有确定的基因组插入/突变的遗传改造的真核细胞克隆。本方法所用的真核细胞，在多个实施方案中，包括但不限于昆虫细胞(包括但不限于黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)细胞)，线虫(C.elegans)细胞，啮齿类动物细胞(包括但不限于小鼠细胞、大鼠细胞和仓鼠细胞)，鸡细胞，灵长类细胞，(包括但不限于猴细胞和人细胞)。在某些实施方案中，用非特异性插入突变对细胞进行遗传改造。在某些实施方案中，提供了培养和处理小鼠ES细胞的方法以产生具有确定的基因组插入/突变的遗传改造的ES细胞克隆。

在某些实施案方中，方法不包括某些昂贵的和/或费时的处理步骤。在某些实施方案中，方法可以适用于突变的真核细胞，包括但不限于，突变的小鼠ES细胞的工业化生产。

某些实施方案涉及培养、产生和鉴别突变的真核细胞，包括但不限于小鼠ES细胞的方法。在某些实施方案中，突变的真核细胞可以被用于产生能进行插入的突变等位基因的种系传递的生物。在某些实施方案中，突变的小鼠ES细胞被用于产生能进行插入的突变等位基因的种系传递的小鼠。

在某些实施方案中，基因诱捕是使用DNA作为诱变剂的随机插入诱变方法。在某些实施方案中，DNA最初被作为逆转录病毒引入，其在细胞内被逆转录以生成起诱变剂作用的DNA前病毒。在某些实施方案中，DNA的一部分编码可选择标记。在某些实施方案中，基因诱捕构建体整合入一个基因的内含子或外显子中。在某些实施方案中，基因诱捕构建体被设计为优选整合入内含子和/或外显子中。在多个实施方案中，整合入内含子或外显子后，细胞的剪接器将构建体编码序列剪接成一个或多个共转录在相同mRNA上的内源序列。在某些实施方案中，基因诱捕构建体包含编码可选择标记的序列。在某些实施方案中，剪接受体序列处于编码可选择标记的序列之前。在某些实施方案中，启动子不处于编码可选择标记的序列之前。在某些实施方案中，细胞的剪接器将内源序列从被诱捕的基因剪接到编码可选择标记的序列的5’端。在某些实施方案中，可选择标记只在编码可选择标记的基因诱捕构建体整合入内含子时才被表达。在某些实施方案中，可选择标记只在编码可选择标记的基因诱捕构建体整合入外显子时才被表达。在某些实施方案中，例如，当可选择标记基因编码抗生素抗性时，可以在培养物中选择以表达可选择标记的方式将基因诱捕构建体整合到它们基因组内的细胞。

示范性的真核细胞插入突变述于，例如，Friedrich和Soriano，1991，Genes Dev.5(9)：1513-23；Friedrich和Soriano，1993，Methods Enzymol.1993；225：681-701；PCT公开号WO98/14614；WO 99/07389；WO99/50426；和WO 00/31236；和美国专利号5,364,783；6,303,327；6,080,567；6,136,566；6,207,371；6,228,639；6,436,707；6,776,988；WO 00/31236；和6,139,833；每一个均以其完整内容结合于此作为用于任何目的的参考。描述于引用的出版物和的某些构建体可以适用于实施本文所述方法的某些实施方案。在某些实施方案中，一个或多个描述于PCT公开号WO98/14614；WO 99/07389；WO99/50426；和WO 00/31236；和美国专利号5,364,783；6,303,327；6,080,567；6,136,566；6,207,371；6,228,639；6,436,707；6,776,988；WO 00/31236；和6,139,833的构建体被用于本文所述的方法。

在某些情况下，可以在用于本文所述的某些方法之前修饰构建体。因此，在某些实施方案中，构建体的一个或多个结构特征在构建体用于本文所述的方法的某些实施方案之前可被删除或修饰。在某些实施方案中，本领域内的技术人员可以修饰一个特定的构建体以用于本文所述的某些方法。

已知多种方法利用遗传改造的小鼠ES细胞来产生能进行遗传改造的等位基因的种系传递的嵌合小鼠(见，例如，尤其是，美国专利号6,204,061；5,789,215和6,087,555；每一个以其全部内容结合于此作为用于任何目的的参考)。在某些实施方案中，小鼠ES细胞与已经改造以表达白细胞抑制因子(LIF)的饲养细胞共同培养。在某些实施方案中，通过与这样的饲养细胞共同培养，可以避免因制备和/或购买加入到培养基中的外源LIF而产生的额外费用。

在某些实施方案中，可操作地位于基因诱捕构建体的可选择标记上游的内部核糖体进入位点(IRES)序列的存在增加了选择突变的细胞克隆的机会，所述突变的细胞克隆在基因的编码区中不具有整合的基因诱捕构建体。在某些实施方案中，整合进入基因的编码区(即，整合入位于起始密码子下游和终止子上游的内含子或外显子中)是改变或破坏该基因功能的基因诱捕事件的特性。因此，在某些实施方案中，功能性地位于基因诱捕构建体编码的可选择标记上游的IRES元件的存在是不理想的。

如本文所用，可选择标记是一种标记，该标记提供鉴别含有该标记编码基因的细胞的方法。可选择标记包括，但不限于，抗生素抗性标记、发光标记、和荧光标记。在某些实施方案中，该构建体将缺少可操作地位于可选择标记上游的IRES。

在某些情况下，在逆转录病毒长末端重复(LTR)中反向存在的环状剪接供体(SD)位点可以增加选择突变的细胞克隆的可能性，所述突变的细胞克隆已在基因的蛋白编码区外整合了前病毒基因诱捕构建体。在某些情况下，来自莫洛尼鼠类白血病毒(MLV)的某些载体可以增加选择突变的细胞克隆的可能性，所述突变的细胞克隆已在基因的蛋白编码区外整合了前病毒基因诱捕构建体。在某些情况下，该反向SD位点可被细胞剪接器剪接成剪接受体(SA)位点，该位点可操作地位于基因诱捕构建体中可选择标记的上游。相应地，在某些实施方案中，基因诱捕构建体被改造成缺少可操作性地位于SA位点上游的SD位点，该SA位点可操作性地位于可选择标记上游。

在某些情况中，用来自3’-或5’-快速cDNA末端扩增(RACE)的产物鉴别和编目(catalogue)被基因诱捕的ES细胞克隆。在某些情况下，从ES细胞样品(在某些情况下，存在于96孔微量滴定板的“会合”孔中的很多ES细胞)中分离并逆转录多腺苷酸化的mRNA，在聚合酶链式反应中使用一个嵌套引物组以产生随后被测序的模板。在某些情况下，由于操作小RNA样品所固有的困难，这些操作可以在处于或接近于检测的实际水平下进行。因此，在某些情况下，当RACE-类型的程序被用于机器人式的“高通量”处理时，为了更高的通量而牺牲了更高的灵敏度。

在某些实施方案中，提供了鉴别已被基因诱捕构建体插入突变的基因的方法。在某些实施方案中，已经用改造的逆转录病毒使基因发生了插入突变。在某些实施方案中，已经用DNA基因诱捕构建体使基因发生了插入突变。在某些实施方案中，通过使用了基因组DNA作为反向PCR扩增的模板，而没有使用RNA“捕获”(例如，RNA的富集或分离)和/或逆转录。例如，自动化的3’RACE反应可以涉及固相RNA捕获方法，该方法利用被寡聚dT部分衍生的(以“捕获”polyA RNA)的96孔微滴定板。这种“定制”的微滴定板可能昂贵且易腐。另外，在某些情况下，逆转录酶也可能是昂贵和易腐的，因此不适于高通量检测。相应地，在某些实施方案中，本文所述方法包括用于高通量分析一组被基因诱捕的真核细胞克隆或其文库的方法，包括但不限于被基因诱捕的ES细胞克隆。在某些实施方案中，方法不包括从真核细胞克隆中选择性富集或“捕获”RNA(例如，使用RNA“分离”，包括RNA富集的方法，例如，使用寡聚-dT以结合多腺苷酸化的mRNA)。在某些实施方案中，方法不包括使用逆转录酶来制备模板以测序和/或鉴别与整合的基因诱捕构建体侧面相接(flank)的内源性外显子序列。

在某些实施方案中，反向PCR(IPCR)被用于被基因诱捕细胞的高通量分析。示范性的IPCR描述于，例如，Ochman等，Genetics 120：621-623(1988)；Hui等，Methods Mol.Biol.192：249-274(2002)；Hui等，Cell Mol.Life Sci.54：1403-1411(1998)；Benkel等，Genet.Anal.13：123-127(1996)；Offringa等，Methods Mol.Biol.49：181-195(1995)；和Garces等，MethodsMol.Biol.161：3-8(2001)；以及其中所引用的参考文献；它们结合于此作为用于任何目的的参考。

示范性IPCR的示意图见于图1。分离并用限制性内切酶X消化基因诱捕细胞的基因组DNA。消化之后，连接基因组DNA以形成分子内环。然后在两个引物A和B存在的条件下将连接过的基因组DNA进行PCR反应。将引物A和B与基因诱捕构建体序列退火致使PCR反应扩增分子内环上位于引物A和B退火位点之间的基因组序列。PCR反应的结果是含基因组序列的线性DNA，该序列在细胞基因组DNA中基因诱捕构建体附近，侧接于与引物A和B退火的构建体序列。然后引物A或B之一或两者都可以被用于测序该基因组DNA。或者，除了或代替引物A和B，可以用一个或更多不同的引物，来测序被扩增的DNA中的基因组序列。该基因组DNA序列于是可以被用于BLAST搜索以鉴别基因诱捕细胞内整合了基因诱捕靶点的基因。

在某些实施方案中，IPCR反应包括至少一种聚合酶。在某些实施方案中，IPCR反应包含至少两种聚合酶。在某些实施方案中，IPCR反应包含至少三种聚合酶。在某些实施方案中，至少一种存在于IPCR反应中的聚合酶是热稳定聚合酶。在多个实施方案中，可以用于IPCR的聚可酶包括，但不限于，Pfu、Taq、Isis、Vent、Pwo、Phusion和Tth。在某些实施方案中，0.005到1单位/μl的聚合酶被用于IPCR反应。在某些实施方案中，0.01到0.5单位/μl的聚合酶被用于IPCR反应。在某些实施方案中，0.01到0.1单位/μl的聚合酶被用于IPCR反应。在某些实施方案中，依聚合酶厂商的规定确定单位数。

在某些实施方案中，为IPCR选择与基因诱捕构建体序列退火的引物。在某些实施方案中，选择一条引物以与所选限制性内切酶酶切位点附近的基因诱捕构建体序列退火。在某些实施方案中，选择第二条引物以与基因诱捕构建体的末端退火，使得因此可以预计它与整合有基因诱捕构建体的基因组DNA附近退火。在某些实施方案中，选择引物，以使它们都与限制性内切酶消化后的DNA的相同邻接片段退火。此外，在某些实施方案中，选择两条引物以使它们在消化后的DNA连接成分子内环后，引物会沿着环以相反方向延伸。

在某些实施方案中，选择一条引物以使当它退火时，该引物的3’末端在所选限制性内切酶酶切位点的100个碱基以内。在某些实施方案中，选择一条引物以使当它退火时，该引物的3’末端在所选限制性内切酶酶切位点的50个碱基以内。在某些实施方案中，选择一条引物以使当它退火时，该引物的3’末端在所选限制性内切酶酶切位点的20个碱基以内。在某些实施方案中，选择一条引物以使当它退火时，该引物的3’末端在所选限制性内切酶酶切位点的10个碱基以内。在某些实施方案中，选择一条引物以使当它退火时，该引物的3’末端为所选限制性内切酶酶切位点的100个碱基以外。本领域内的技术人员可以为PCR选择合适的引物长度和序列。

在某些实施方案中，选择一条引物以使当它退火时，该引物的3’末端在整合入细胞基因组的基因诱捕构建体末端的100个碱基以内。在某些实施方案中，选择一条引物以使当它退火时，该引物的3’末端在整合入细胞基因组的基因诱捕构建体末端的50个碱基以内。在某些实施方案中，选择一条引物以使当它退火时，该引物的3’末端在整合入细胞基因组的基因诱捕构建体末端的20个碱基以内。在某些实施方案中，选择一条引物以使当它退火时，该引物的3’末端在整合入细胞基因组的基因诱捕构建体末端的10个碱基以内。在某些实施方案中，选择一条引物以使当它退火时，该引物的3’末端在整合入细胞基因组的基因诱捕构建体末端的100个碱基以外。本领域内的技术人员可以为PCR选择合适的引物长度和序列。

在某些实施方案中，利用反向PCR(IPCR)来分析侧翼于基因诱捕构建体整合位点的基因组序列提供了足够的灵敏度以致于该方法所需的起始原料比基于RACE的鉴别一个或多个侧翼外显子的方法更少。例如，在某些实施方案中，少于2％的存在于96孔微量滴定板会合孔内的克隆细胞被用于产生鉴别一个或多个基因组DNA侧翼区的模板。在某些实施方案中，使用少于5％的存在于96孔微量滴定板会合孔内的克隆细胞。在某些实施方案中，使用少于10％的存在于96孔微量滴定板会合孔内的克隆细胞。在某些实施方案中，使用少于20％的存在于96孔微量滴定板会合孔内的克隆细胞。在某些实施方案中，使用少于30％的存在于96孔微量滴定板会合孔内的克隆细胞。在某些实施方案中，使用少于40％的存在于96孔微量滴定板会合孔内的克隆细胞。在某些实施方案中，使用少于50％的存在于96孔微量滴定板会合孔内的克隆细胞。在某些实施方案中，使用少于60％的存在于96孔微量滴定板会合孔内的克隆细胞。在某些实施方案中，使用少于70％的存在于96孔微量滴定板会合孔内的克隆细胞。在某些实施方案中，使用少于80％的存在于96孔微量滴定板会合孔内的克隆细胞。在某些实施方案中，使用少于90％的存在于96孔微量滴定板会合孔内的克隆细胞。在某些实施方案中，鉴别一个或多个基因组DNA侧翼区包括对模板测序并将其序列与已知基因组序列数据比较。

在某些实施方案中，为了促进基因诱捕构建体整合位点的鉴定，在侧翼于整合位点的区域内的基因组DNA中至少约35个碱基被测序。在某些实施方案中，在侧翼于整合位点的区域内的基因组DNA中至少约40个碱基被测序。在某些实施方案中，在侧翼于整合位点的区域内的基因组DNA中至少约45个碱基被测序。在某些实施方案中，在侧翼于整合位点的区域内的基因组DNA中至少约50个碱基被测序。在某些实施方案中，在侧翼于整合位点的区域内的基因组DNA中至少约70个碱基被测序。在某些实施方案中，在侧翼于整合位点的区域内的基因组DNA中至少约85个碱基被测序。在某些实施方案中，在侧翼于整合位点的区域内的基因组DNA中至少约100个碱基被测序。在某些实施方案中，在侧翼于整合位点的区域内的基因组DNA中至少约150个碱基被测序。在某些实施方案中，在侧翼于整合位点的区域内的基因组DNA中至少约200个碱基被测序。在某些实施方案中，在侧翼于整合位点的区域内的基因组DNA中至少约250个碱基被测序。在某些实施方案中，在侧翼于整合位点的区域内的基因组DNA中至少约350个碱基被测序。在某些实施方案中，在侧翼于整合位点的区域内的基因组DNA中至少约450个碱基被测序。在某些实施方案中，在侧翼于整合位点的区域内的基因组DNA中至少约500个碱基被测序。

在某些情况下，基于RACE的方法富集基因诱捕构建体插入位点上游远处(对于5’RACE)或下游(对于3’RACE)远处的剪接的外显子序列。在某些实施方案中，使用本文所述方法，上游远处或下游远处的外显子序列比某些基于RACE的方法富集得少。

在某些实施方案中，IPCR-介导的基因组侧翼DNA测序提供了增强的测序灵敏度。因此，在某些实施方案中，可以使用更少的细胞以产生足够的基因组DNA用于IPCR，这剩下细胞可用于其它用途和/或一个或多个额外的IPCR反应。在某些实施方案中，96孔板中的一个孔含有足够的细胞用于IPCR和至少一种其它用途，其可以包括一个或多个额外的IPCR反应。在某些实施方案中，96孔板中仅1/3的细胞被用于产生IPCR所需基因组DNA，剩下2/3的细胞用于至少一种其它用途。在某些实施方案中，96孔板中仅1/4的细胞被用于产生IPCR所需基因组DNA，剩下3/4的细胞用于至少一种其它用途。在某些实施方案中，96孔板中仅1/5的细胞被用于产生IPCR所需基因组DNA，剩下4/5的细胞用于至少一种其它用途。在某些实施方案中，96孔板中仅1/10的细胞被用于产生IPCR所需基因组DNA，剩下9/10的细胞用于至少一种其它用途。

在某些实施方案中，利用IPCR扩增基因组侧翼序列提供了适于测序的产物。在某些情况下，产生于RACE反应的模板需要一个“清除”步骤，该步骤包括使模板在测序前通过一个大小排阻层析柱。相反，在某些实施方案中，产生于IPCR的模板不需要在开始测序反应前进行层析。

在某些实施方案中，IPCR方法允许使用更高密度板型，包括，但不限于，384孔板和其它高密度类板型。如本文所用，“高密度板型”包括每板具有比96孔板更多孔的板。在某些实施方案中，提供使用高密度板型，需要更低的反应体积。在某些实施方案中，使用高密度板型增强了自动化的性能，例如，通过增加通量率和/或通过降低每个分析样品所用的试剂量。在多个实施方案中，通过降低培养物体积、减少每个反应所需的试剂量、和/或减少被操作和加工用于确定细胞克隆内基因诱捕构建体的基因组插入位点的板的数量，在分液(splitting)时将一部分基因诱捕的细胞向，例如，384孔板的转移提供了效率。

在某些实施方案中，从生长于96孔板型的基因诱捕细胞克隆中获得基因组DNA。在某些实施方案中，当需要更大量的基因组DNA时，可以使用生长于96孔板型的细胞。在某些实施方案中，一个或多个随后的某些反应，包括，但不限于，限制性消化、连接、PCR扩增、和测序，可在更高密度板型中进行(例如，384孔板或其它高密度板型)。在某些实施方案中，将使用标准板型以使在处理过程中能使用某些标准的自动化/机器人化的板和流体操作装置(这些装置包括，但不限于Beckman Coulter BiomekFX，Packard minitrack等，以及其升级的和相关的变型)。

在某些实施方案中，某些限制性内切酶，和/或某些限制性内切酶的组合提供了增加的IPCR扩增的模板产率。在某些实施方案中，相同的构建体-特异性引物配对可以被用于两个或更多不同的构建体。因此，在某些实施方案中，相同的构建体-特异性引物配对可以被用于引发用第一种构建体基因诱捕的第一批细胞的环化模板的IPCR反应，和引发用第二种构建体基因诱捕的第二批细胞的环化模板的IPCR反应。在某些实施方案中，相同的构建体-特异性引物配对可以用于引发用第一种限制性内切酶或限制性内切酶组合产生的环化模板的IPCR反应，还可以用于引发用第二种限制性内切酶或限制性内切酶组合产生的环化模板的IPCR反应。

在某些实施方案中，用一种限性内切酶消化被基因诱捕的细胞的基因组DNA。在某些实施方案中，用至少两种不同的限性内切酶在同一个反应中消化被基因诱捕的细胞的基因组DNA。在某些实施方案中，用至少三种不同的限性内切酶在同一个反应中消化被基因诱捕的细胞的基因组DNA。在某些实施方案中，用至少四种不同的限性内切酶在同一个反应中消化被基因诱捕的细胞的基因组DNA。在某些实施方案中，用至少五种不同的限性内切酶在同一个反应中消化被基因诱捕的细胞的基因组DNA。在某些实施方案中，用至少六种不同的限性内切酶在同一个反应中消化被基因诱捕的细胞的基因组DNA。

在某些实施方案中，整合入基因组DNA的基因诱捕构建体未在消化反应中被酶切。在某些实施方案中，整合入基因组DNA的基因诱捕构建体在消化反应中被酶切于一个位点。在某些实施方案中，整合入基因组DNA的基因诱捕构建体在消化反应中被酶切于二个位点。在某些实施方案中，整合入基因组DNA的基因诱捕构建体在消化反应中被酶切于三个位点。在某些实施方案中，整合入基因组DNA的基因诱捕构建体在消化反应中被酶切于四个或更多位点。

在某些实施方案中，将基因诱捕的细胞的基因组DNA进行至少两个独立的反应，其中两个反应不含相同的限制性内切酶组合。在某些实施方案中，将基因诱捕的细胞的基因组DNA进行至少三个独立的反应，其中两个反应不含相同的限制性内切酶组合。在某些实施方案中，将基因诱捕的细胞的基因组DNA进行至少四个独立的反应，其中两个反应不含相同的限制性内切酶组合。

在某些实施方案中，将一个多克隆位点(MCS)整合入基因诱捕构建体中。在某些实施方案中，一个特定的限制性内切酶将酶切该构建体的一个或多个位置。在某些实施方案中，一个特定的限制性内切酶将在MSC内和至少一个MCS外的位置酶切该构建体。在某些实施方案中，消化后保持充足的基因诱捕构建体序列以允许由寡聚物引发IPCR。在某些实施方案中，两个或更多限制性内切酶可以在相互接近的位置酶切基因诱捕构建体。在某些实施方案中，相同的构建体-特异性引物配对可以被用于引发环化模板的IPCR反应，该模板来自用不同酶消化的基因组DNA。

在某些实施方案中，基因诱捕构建体包括一个或多个酶切后留下一个“粘”端的第一限制性内切酶的位点，该粘端与也在一个或多个位点酶切基因诱捕构建体的第二限制性内切酶留下的粘端相容。在某些实施方案中，三个或更多限制性内切酶留下相同的可相容的粘端。如本文所用，粘端是指用限制性内切酶酶切DNA后留下至少一个核苷酸的悬突。该悬突可以是5’悬突或3’悬突。在某些实施方案中，酶切后留下二核苷酸的悬突。在某些实施方案中，酶切后留下三核苷酸的悬突。在某些实施方案中，酶切后留下四核苷酸的悬突。在某些实施方案中，酶切后留下含多于四个核苷酸的悬突。留下相容性粘端的限制性内切酶的某些组的例子为本领域所公知(见，例如，the New England Biolabs 2003 catalog，Beverly，MA)。留下相容性粘端的限制性内切酶组的示例包括，但不限于，BglII、BamHI、BclI和BstYI；EcoRI、MfeI和ApoI；PstI、NsiI和SbfI；ApaLI和SfcI；NcoI、BspHI、RcaI和PciI；SpeI、NheI、XbaI和AvrII；Acc65I、BsiWI和BsrGI；AclI、ClaI、BstBI、HinPlI、HpaII和NarI；AgeI、XmaI、BsaWI和BspEI；MluI、AscI和BssHI；AscI、NdeI、MseI和BfaI；PvuI、PacI和AsiSI；EaeI、EagI和NotI；XhoI、PspXI和SalI。本领域内的技术人员可以鉴别示例组的其它成员和/或其它留下相容性粘端的限制性内切酶组。在某些实施方案中，在反应中使用一组中少于全部的成员。

在某些实施方案中，基因诱捕构建体包括一个或多个留下平端的限制性内切酶(即，不留下悬突的限制性内切酶)位点。在某些实施方案中，基因诱捕构建体包括至少一个位点，其中每个位点都是至少两个不同的留下平端的限制性内切酶的位点。在某些实施方案中，在反应中使用一个或多个不同的留下平端的限制性内切酶。示例性的留下平端的限制性内切酶包括，但不限于，FspI、HincII、EcoRV、HpaI、MscI、NaeI、NruI、PvuII、ScaI、SfoI、SmaI、SnaBi和StuI。

在某些实施方案中，基因诱捕构建体的单拷贝被整合入细胞的基因组。在这种方式下，在某些通过插入基因诱捕构建体所致突变具显性负效应的实施方案中，所观察到的表型可以和基因诱捕的等位基因相关联。类似地，在某些实施方案中，当插入基因诱捕构建体所致突变处于纯合状态时(例如，性染色体被突变和/或细胞被进一步处理以产生基因诱捕的等位基因的纯合细胞)，所观察到的表型可以和基因诱捕的等位基因相关联。在某些实施方案中，为了富集只有一个基因诱捕构建体整合入它们基因组的基因诱捕的细胞克隆，降低了感染复数(m.o.i)。在某些实施方案中，预计(以约95％的确定度)0.3的m.o.i(病毒：细胞)，在选择只有一个基因诱捕构建体整合入它们基因组的细胞之后，产生约95％的包含单基因诱捕事件的细胞。在某些实施方案中，检测逆转录病毒基因诱捕构建体的成套制备物赋予在ES细胞内表达构建体编码的可选择标记的能力并测定病毒滴度。在某些实施方案中，病毒滴度被用于估计给定的包装病毒制备物将产生的稳定转导的ES细胞的数量。在某些实施方案中，病毒也感染在培养物中的饲养细胞种群。

在某些实施方案中，感染复数(m.o.i)小于约100。在某些实施方案中，感染复数(m.o.i)小于约50。在某些实施方案中，感染复数(m.o.i)小于约25。在某些实施方案中，感染复数(m.o.i)小于约10。在某些实施方案中，感染复数(m.o.i)小于约5。在某些实施方案中，感染复数(m.o.i)小于约1。在某些实施方案中，感染复数(m.o.i)小于约0.5。在某些实施方案中，感染复数(m.o.i)小于约0.3。在某些实施方案中，感染复数(m.o.i)小于约0.2。在某些实施方案中，感染复数(m.o.i)小于约0.1。在某些实施方案中，感染复数(m.o.i)小于约.05。

某些利用逆转录病毒生产细胞系来产生承载遗传构建体的逆转录病毒的某些方法为本领域所公知。见，例如，Cone等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6349-6353；和Miller等(1986)Mol.Cell.Biol.，6：2895-2902。在某些实施方案中，活跃培养了少于约三个月的逆转录病毒生产细胞系被用于产生承载基因诱捕构建体的逆转录病毒。在某些实施方案中，当活跃培养了多于约三个月的逆转录病毒生产细胞系被用于产生承载基因诱捕构建体的逆转录病毒时，获得侧翼基因组序列的突变细胞克隆(通过用该逆转录病毒感染而制备)的产量降低。在某些实施方案中，逆转录病毒基因诱捕构建体与小鼠基因组内源性逆转录病毒序列发生重组。因此，在某些情况下，在延长的培养和传代中重组事件可以积累。在某些实施方案中，当使用小鼠包装细胞系GP+E时发生这种重组事件。在某些实施方案中，这种重组事件发生到相当的程度以致干扰了被所需逆转录病毒载体所突变的基因诱捕的细胞克隆的有效产生。

在某些实施方案中，改造的逆转录病毒原种获自己被保持于活性培养中少于约六个月的逆转录病毒生产细胞。在某些实施方案中，所用逆转录病毒生产细胞已被保持于活性培养中少于约四个月。在某些实施方案中，所用逆转录病毒生产细胞已被保持于活性培养中少于约三个月。在某些实施方案中，所用逆转录病毒生产细胞已被保持于活性培养中少于约二个月。在某些实施方案中，所用逆转录病毒生产细胞已被保持于活性培养中少于约1.5个月。在某些实施方案中，所用逆转录病毒生产细胞已被保持于活性培养中少于约一个月。在某些实施方案中，所用逆转录病毒生产细胞已被保持于活性培养中少于约21天。在某些实施方案中，所用逆转录病毒生产细胞已被保持于活性培养中少于约14天。在某些实施方案中，所用逆转录病毒生产细胞已被保持于活性培养中少于约10天。在某些实施方案中，所用逆转录病毒生产细胞已被保持于活性培养中少于约5天。在某些实施方案中，所用逆转录病毒生产细胞已被保持于活性培养中少于约3天。在某些实施方案中，所用逆转录病毒生产细胞已被保持于活性培养中少于约2天。逆转录病毒生产细胞被保持于活性培养中的时间长度从该逆转录病毒生产细胞被分离的时间测量，或从该逆转录病毒生产细胞从冰冻原种中复苏和培养的时间测量。

在某些实施方案中，在使逆转录病毒生产细胞生长至会合后收获用于基因诱捕的逆转录病毒原种。在某些实施方案中，在使逆转录病毒生产细胞生长至会合后，改变培养基，约4到约8小时后收获逆转录病毒原种。在某些实施方案中，在改变培养基约8到约36小时后收获逆转录病毒原种。在某些实施方案中，在改变培养基约12到约24小时后收获逆转录病毒原种。

在某些实施方案中，逆转录病毒生产细胞可以被遗传改造的逆转录病毒基因组稳定地或瞬时地转染。在某些实施方案中，被瞬时转染的逆转录病毒生产细胞中含有至少部分游离地存在的遗传改造的病毒基因组。

在某些实施方案中，方法允许有效产生一组整个基因组内都含有突变的基因诱捕的细胞克隆。在某些实施方案中，提供一组突变细胞克隆，通过鉴别一个或多个侧翼于基因诱捕构建体整合位点的基因组DNA序列区，已表征了其中至少约5,000个不同基因中的突变。在某些实施方案中，提供一组突变的细胞克隆，已表征了其中至少约7,000个不同基因中的突变。在某些实施方案中，提供一组突变的细胞克隆，已表征了其中至少约10,000个不同基因中的突变。在某些实施方案中，提供一组突变的细胞克隆，已表征了其中至少约15,000个不同基因中的突变。在某些实施方案中，提供一组突变的细胞克隆，已表征了其中至少约20,000个不同基因中的突变。在某些实施方案中，提供一组突变的细胞克隆，已表征了其中至少约25,000个不同基因中的突变。在某些实施方案中，提供一组突变的细胞克隆，已表征了其中至少约30,000个不同基因中的突变。在某些实施方案中，该组突变的细胞克隆是突变的ES细胞克隆。

下列实施例只被供于举例说明目的，不得以任何方式解释为限制本发明。

6.0实施例

6.1产生某类基因诱捕的ES细胞

通过逆转录病毒基因诱捕构建体VICTR48转染来诱变胚胎干细胞(来自小鼠A129-Sv/Ev株的Lex-1细胞)，转染按Zambrowicz et al.(1998)Nature，392：608-11中所述方法以约0.3的感染复数进行。VICTR48的示意图示于图2。图6A-C显示了VICTR48的序列(SEQ ID NO：7)。预计大约95％已稳定整合了前病毒形式的该构建体的ES克隆中含有单整合事件。用G418选择选出稳定整合了该构建体的ES克隆之后，将被选出的细胞接种于受辐照的饲养细胞(SNL细胞，其稳定表达LIF)上并培养至会合。随后将会合孔以1到3的方式分液至3个96孔板并再次使之生长到会合。将结果板中的两块低温保存，对第三块进行下面的处理。

6.2分析基因诱捕的ES细胞

除去培养基并用100μl PBS漂洗细胞两次。向每个孔加入50μl裂解液(50mM Tris pH 7.5，50mM EDTA pH 8.0，100mM NaCl，1％SDS和2mg/ml蛋白酶K)，封板，将板在65℃下孵育过夜。向每个孔中加入150μl 95％乙醇并置于室温下2小时。吸取上清并用150μl 70％乙醇洗涤，吸取70％乙醇洗涤液并使孔在室温下干燥约两小时。向每个孔加入200μl TE(10mM Tris pH 8.0，1mM EDTA)并于室温下放置过夜以温和地再水合基因组DNA。转移10μl每孔基因组DNA至六个新96孔板的每一个中以用于内切酶消化。

制备六份消化混合液，每份用于六个不同的限制性内切酶或限制性内切酶组合，它们是BamHI、EcoRI、HindIII、NcoI、BamHI/BglII、和EcoRI/MfeI。每种消化混合液在制造商推荐的1X反应缓冲液中含有0.125单位/μl的限制性内切酶和1X BSA。对于每种消化混合液，向消化板的每个孔中加入30μl消化混合液。密封消化板并在37℃下孵育4小时到过夜。含不能被加热失活的限制性内切酶的消化反应被孵育过夜。然后将消化板在65℃孵育20分钟。

向每个消化板的每个孔中加入110μl连接混合液(2.7单位/μl(每个反应中的终浓度)T4DNA连接酶，溶于制造商所推荐的1X反应缓冲液)。封板并于15℃下孵育过夜。然后将大约10μl每个连接产物加入到一个新的96孔板的孔中用作PCR模板

向每个孔加入40μl第一轮PCR混合液以产生测序模板。第一轮PCR混合液含有0.05单位/μl(每个反应中的终浓度)Taq DNA聚合酶溶于制造商所推荐的1X PCR缓冲液，1.5mM MgCl₂，200nM每种dNTP，1M甜菜碱和0.1pmol/μl每个第一轮引物。第一轮引物是：

正向：5′TGAGTCAAAACTAGAGCCTGGACC3′(SEQ ID NO：1)，

反向：5′AGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCG 3′(SEQ ID NO：2)。

封板并将其在MJ thermocycler上循环。第一轮PCR如下：DNA在95℃下变性2分钟并在80℃下预退火3分钟。然后将板进行15个循环，94℃30秒，之后是3分种的退火。在第一个循环中退火温度是70℃，然后在每个后续的循环中退火温度降低0.5℃。然后将板进行20个循环，94℃30秒，之后是62℃下退火。第一个循环的退火时间是3分钟，然后每个循环增加1秒钟退火时间。

向一个新板中转移大约2μl第一轮PCR反应的产物，并用作第2轮PCR的模板。对于第二轮PCR，向每个孔中加入23μl第2轮的PCR混合液。第2轮PCR混合液含有0.05单位/μl(每个反应中的终浓度)Taq DNA聚合酶，其溶于制造商所推荐的1X PCR缓冲液，1.5mM MgCl₂，200nM每种dNTP，1M甜菜碱和0.1pmol/μl每个第二轮引物。第二轮引物是：

正向：5′AAATTGGACTAATCGATACCGTCG 3′(SEQ ID NO：3)，

反向：5′GAGTGATTGACTACCCGTCAGCG 3′(SEQ ID NO：4)

封板，然后如上述第一轮那样在MJ thermocyclers上循环。图3显示了利用六种上述讨论的限制性内切酶得到的5个基因诱捕的ES细胞克隆的示例性IPCR产物。在该实验中，BamHI和Bgl II的组合产生了5个克隆中4个的PCR产物。

将大约1μl第2轮PCR产物转移到一个新的96孔板中，并向每孔加入9μl测序混合液(1/8的标准Applied Biosystems Big Dye Version 1.1反应)。用1μM第2轮反向引物(SEQ ID NO：4)测序模板。对于测序，将该板进行25个PCR循环，94℃下45秒，52℃下15秒，和60℃下2分钟。

在用制备的96孔葡聚糖凝胶板(含精制自AmershamBiosciences的水合葡聚糖凝胶G-50的Millipore MultiScreen 96-孔板)电泳之前清理完成了的测序反应，该板在2000rpm下离心5分钟。干燥洗脱的反应，然后重悬于8μl水中。然后用RunModule′MGCore′将重悬液载入ABI Prism3700 DNA分析仪(Applied Biosystems)。

将得到的序列以FASTA格式存入本地可用于进行BLAST搜索的数据库。另外，克隆的序列数据用BLAST进行比较以得到可以用于将每个突变作图于小鼠基因组上的单一共有序列。

6.3用BglII/BamHI和IPCR分析的结果

示范结果显示使用单一内切酶对(BglII/BamHI)在约60％用本方法筛选出来的ES细胞克隆中产生了序列(平均长度大于约250个碱基对)。在示范结果中，其它酶产生的序列如下：NcoI在20％筛选出来的ES细胞克隆中产生了序列；HindIII在23％筛选出来的ES细胞克隆中产生了序列；EcoRI在14％筛选出来的ES细胞克隆中产生了序列。示范结果中获得序列的ES细胞克隆静产率为大约85％(对应多于一种酶和/或酶组合，一些ES细胞克隆产生序列)。

6.4去除LTR隐蔽剪接供体

可以通过删除至少一部分增强子区(图4，SEQ ID NO：5)而修饰莫洛尼鼠类白血病病毒长末端重复(LTR)。除了删除至少一部分增强子区外，还可通过删除LTR内的隐蔽剪接供体(图5，SEQ ID NO：6)而修饰莫洛尼鼠类白血病病毒LTR。在某些情况中，该增强子和/或隐蔽剪接供体可能在正常逆转录病毒转录的相反方向起作用。在某些实施方案中，通过删除隐匿的反向剪接供体，增加了获得基因内基因诱捕事件的保真度。

本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围，这些方案只意欲作为本发明某实施方案的某方面的举例说明，功能相同的方法和组分包含于本发明的范围之内。确实，根据前述，那些已显示和本文所述以外的多种修饰对于本那些领域内技术人员将是显而易见的。这些修饰意在落入所附的权利要求范围之内。所有引用的出版物、专利和专利申请在此完整引入作为用于任何目的的参考。

序列表

<110>G.汉森

A.阿武因

B.赞布罗维奇

C.J.弗里德勒

W.P.登普西

<120>用于鉴定基因功能的方法和组合物

<130>07705.0021-00304

<150>60/507,437

<151>2003-09-30

<160>7

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>非天然存在的合成的序列或遗传改造的序列

<400>1

tgagtcaaaa ctagagcctg gacc 24

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>非天然存在的合成的序列或遗传改造的序列

<400>2

agttcgcttc tcgcttctgt tcg 23

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>非天然存在的合成的序列或遗传改造的序列

<400>3

aaattggact aatcgatacc gtcg 24

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>非天然存在的合成的序列或遗传改造的序列

<400>4

gagtgattga ctacccgtca gcg 23

<210>5

<211>590

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>非天然存在的合成的序列或遗传改造的序列

<400>5

tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat 60

ggaaaaatac ataactgaga atagagaagt tcagatcaag gtcaggaaca gatggaacag 120

ctgaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa 180

gaacagatgg aacagctgaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc 240

ccggctcagg gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc cagccctcag cagtttctag 300

agaaccatca gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg 360

aactaaccaa tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat 420

aaaagagccc acaacccctc actcggcgcg ccagtcctcc gattgactga gtcgcccggg 480

tacccgtgta tccaataaac cctcttgcag ttgcatccga cttgtggtct cgctgttcct 540

tgggagggtc tcctctgagt gattgactac ccgtcagcgg gggtctttca 590

<210>6

<211>194

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>非天然存在的合成的序列或遗传改造的序列

<400>6

tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc tagcacaacc cctcactcgg cgcgccagtc 60

ctccgattga ctgagtcgcc cgggtacccg tgtatccaat aaaccctctt gcagttgcat 120

ccgacttgtg gtctcgctgt tccttgggag ggtctcctct gagtgattga ctacccgtca 180

gcgggggtct ttca 194

<210>7

<211>5174

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>非天然存在的合成的序列或遗传改造的序列

<400>7

tgaaagaccc ccgctgacgg gtagtcaatc actcagagga gaccctccca aggaacagcg 60

agaccacaag tcggatgcaa ctgcaagagg gtttattgga tacacgggta cccgggcgac 120

tcagtcaatc ggaggactgg cgcgccgagt gaggggttgt gggctctttt attgagctcg 180

gggagcagaa gcgcgcgaac agaagcgaga agcgaactga ttggttagtt caaataaggc 240

acagggtcat ttcaggtcct tggggcaccc tggaaacatc tgatggttct ctagaaactg 300

ctgagggctg gaccgcatct ggggaccatc tgttcttggc cctgagccgg ggcaggaact 360

gcttaccaca gatatcctgt ttggcccata ttcagctgtt ccatctgttc ttggccctga 420

gccggggcag gaactgctta ccacagatat cctgtttggc ccatattcag ctgttccatc 480

tgttcctgac cttgatctga acttctctat tctcagttat gtatttttcc atgccttgca 540

aaatggcgtt acttaagcta gcttgccaaa cctacaggtg gggtctttca ttcccccctt 600

tttctggaga ctaaataaaa tcttttattt tatctatggc tcgtactcta taggcttcag 660

ctggtgatat tgttgagtca aaactagagc ctggaccact gatatcctgt ctttaacaaa 720

ttggactaat cgataccgtc gatcgacctc gacagatctt aagccagttt tcgtaccctt 780

gactgcgttt catcgattcg ctactaacat tgccttttcc tccttccctc ccacaggtgg 840

aagagcaagc tttgatgagc cgccaccatg ggatcggcca ttgaacaaga tggattgcac 900

gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca 960

atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 1020

gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg 1080

tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga 1140

agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct 1200

cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg 1260

gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg 1320

gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc 1380

gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat 1440

ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 1500

tgtggccggc tgggtgtggc ggatcgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 1560

gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct 1620

cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg aggggatcaa 1680

ttctctagag ctcgggaggt acttggagcg gccgcaataa aatatcttta ttttcattac 1740

atctgtgtgt tggttttttg tgtgaatcga tagtactaac atacgctctc catcaaaaca 1800

aaacgaaaca aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtgca ggtgccagaa 1860

catttctcta tcgaggccgg ccctgcgact ctagaggatc tgcgactcta gaggatcata 1920

atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc 1980

ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttgt tgcagcttat 2040

aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg 2100

cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gatctgcgac 2160

tctagaggat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc 2220

tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt 2280

ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 2340

catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 2400

tctggatctg cgactctaga ggatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact 2460

tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt 2520

tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 2580

tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 2640

tgtatcttat catgtctgga tccccgggta ccgagctcga aggccggccg tttaaaccaa 2700

tcgaattccc gcggctagac ccagctttcg gaagttccta ttcggaagtt cctattctct 2760

agaaagtata ggaacttctc gatatggtcg atcgacctgc aggaattcta ccgggtaggg 2820

gaggcgcttt tcccaaggca gtctggagca tgcgctttag cagccccgct gggcacttgg 2880

cgctacacaa gtggcctctg gcctcgcaca cattccacat ccaccggtag gcgccaaccg 2940

gctccgttct ttggtggccc cttcgcgcca ccttctactc ctcccctagt caggaagttc 3000

ccccccgccc cgcagctcgc gtcgtgcagg acgtgacaaa tggaagtagc acgtctcact 3060

agtctcgtgc agatggacag caccgctgag caatggaagc gggtaggcct ttggggcagc 3120

ggccaatagc agctttgctc cttcgctttc tgggctcaga ggctgggaag gggtgggtcc 3180

gggggcgggc tcaggggcgg gctcaggggc ggggcgggcg cccgaaggtc ctccggaggc 3240

ccggcattct gcacgcttca aaagcgcacg tctgccgcgc tgttctcctc ttcctcatct 3300

ccgggccttt cgacctgcag gcggccgcga attcactagt gattgcagcg tacggatccg 3360

ccgccgccat ggctccggta ggtccagagt cttcagagat caagtcccac cttccaagtc 3420

ctggcatctc acgacgtctg gggagctacc tgcattaagt cagaactgag gtgggtttgg 3480

gctgaggtag agcctgggca gaggccataa ttacttcttg tggaactctc aaaggtcgga 3540

caggaagcat ggctggttcc atatatctac tgcctcgaat cgatgaattc gagctcggta 3600

cccggggatc gaagttccta ttcggaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttctc 3660

gacctgcagg catgcaagct gggggggtcg acgtcgagaa ggagtgaggg ctggataaag 3720

ggaggatcga ggcggggtcg aacgaggagg ttcaaggggg agagacgggg cggatggagg 3780

aagaggaggc ggaggcttag ggtgtacaaa gggcttgacc cagggagggg ggtcaaaagc 3840

caaggcttcc caggtcacga tgtaggggac ctggtctggg tgtccatgcg ggccaggtga 3900

aaagaccttg atcttaacct gggtgatgag gtctcggtta aaggtgccgt ctcgcggcca 3960

tccgacgtta aaggttggcc attctgcaga gcagaaggta acccaacgtc tcttcttgac 4020

atctaccgac tggttgtgag cgatccgctc gacatctttc cagtgaccta aggtcaaact 4080

taagggagtg gtaacagtct ggcccatatt ttcagacaaa tacagaaaca cagtcagaca 4140

gagacaacac agaacgatgc tgcagcagac aagacgcgcg gcgcggcttc ggtcccaaac 4200

cgaaagcaaa aattcagacg gaggcgggaa ctgttttagg ttctcgtctc ctaccagaac 4260

cacatatccc tcctctaagg ggggtgcacc aaagagtcca aaacgatcgg gatttttgga 4320

ctcaggtcgg gccacaaaaa cggcccccga agtccctggg accgtctccca gggttgcggc 4380

cgggtgttcc gaactcgtca gttccaccac gggtccgcca gatacagagc tagttagcta 4440

actagtaccg acgcaggcgc ataaaatcag tcatagacac tagacaatcg gacagacaca 4500

gataagttgc tggccagctt acctcccggt ggtgggtcgg tggtccctgg gcaggggtct 4560

cccgatcccg gacgagcccc caaatgaaag acccccgctg acgggtagtc aatcactcag 4620

aggagaccct cccaaggaac agcgagacca caagtcggat gcaactgcaa gagggtttat 4680

tggatacacg ggtacccggg cgactcagtc aatcggagga ctggcgcgcc gagtgagggg 4740

ttgtgggctc ttttattgag ctcggggagc agaagcgcgc gaacagaagc gagaagcgaa 4800

ctgattggtt agttcaaata aggcacaggg tcatttcagg tccttggggc accctggaaa 4860

catctgatgg ttctctagaa actgctgagg gctggaccgc atctggggac catctgttct 4920

tggccctgag ccggggcagg aactgcttac cacagatatc ctgtttggcc catattcagc 4980

tgttccatct gttcttggcc ctgagccggg gcaggaactg cttaccacag atatcctgtt 5040

tggcccatat tcagctgttc catctgttcc tgaccttgat ctgaacttct ctattctcag 5100

ttatgtattt ttccatgcct tgcaaaatgg cgttacttaa gctagcttgc caaacctaca 5160

ggtggggtct ttca 5174

Claims

1.一种方法，用于产生一组被单独表征的插入突变的哺乳动物细胞克隆，其包括：

a)以小于5的感染复数用逆转录病毒基因诱捕构建体感染哺乳动物细胞；

b)选择稳定结合所述逆转录病毒基因诱捕构建体的整合的前病毒形式的哺乳动物细胞克隆；

c)体外鉴定所述逆转录病毒基因诱捕构建体的整合的前病毒形式附近的基因组DNA区域，其中所述鉴定不包含逆转录酶反应。

2.按照权利要求1的方法，其中所述感染复数小于1。

3.按照权利要求2的方法，其中所述感染复数小于0.5。

4.按照权利要求3的方法，其中所述鉴定通过测序所述逆转录病毒基因诱捕构建体的整合的前病毒形式附近的至少50个碱基的基因组DNA来进行。

5.按照权利要求3的方法，其中选择至少10,000个不同哺乳动物细胞克隆的集群。

6.按照权利要求5的方法，其所述至少10,000个不同哺乳动物细胞克隆的集群包含至少10,000个不同的哺乳动物细胞克隆，每个克隆都在不同的基因中含有所述逆转录病毒基因诱捕构建体的整合的前病毒形式。

7.按照权利要求1的方法，其中所述鉴定包括反向聚合酶链式反应(IPCR)。

8.按照权利要求7的方法，其中所述反向聚合酶链式反应包含至少一个选自Pfu、Taq、Isis、Vent、Pwo、Phusion和Tth的聚合酶。

9.一组由权利要求1的方法产生的单独表征的插入突变的哺乳动物细胞克隆。

10.按照权利要求7的方法，其中所述反向聚合酶链式反应不包括Phusion聚合酶。