CN1628169A - 含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体 - Google Patents

含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体 Download PDF

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Abstract

一种可高效转移至后代(下一代)的人类人工染色体及其使用方法。即这样一种人类人工染色体：其中含人第22号染色体来源的抗体λ轻链基因的约3.5Mb至约1Mb区域连接至另一个人类染色体来源的染色体片段，其可通过非人动物生殖系统传递至后代；具有该人工人类染色体的非人动物及其后代；构建所述非人动物的方法；使用所述非人动物或其后代构建人抗体的方法；以及具有上述人类人工染色体的生产人抗体的小鼠。

Description

含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体
技术领域
本发明涉及一种通过修饰染色体或其片段可高效遗传传递至下一代的人类人工染色体、将所述人类人工染色体高效遗传传递至下一代的非人动物及其后代、由所述非人动物或其后代生产抗体的方法和生产人抗体的小鼠。
技术背景
业已开发出一种由含染色体片段的微细胞和多能细胞融合所获得的杂交细胞生产嵌合体动物的技术(WO 97/07671)。该技术使得能够生产具有非常长外源基因的非人动物，而在此之前这是不可能的。
对引入到非人动物中的染色体片段进行修饰是有用的，因为其实现了(1)去除不必要的基因，(2)加入目的基因，(3)稳定染色体片段等。WO 98/37757概述了一种用于修饰引入到非人动物中的染色体片段的方法，而且通过将端粒序列靶向保持在小鸡源DT40细胞中的人染色体而高效获得缺失型目的染色体。该公告还描述了一种稳定保持在小鼠ES细胞和小鼠个体中并具有高遗传传递效率的人染色体片段。WO 00/10383描述了一种生产更稳定人类人工染色体(下文可将其缩写为“HAC”)的方法，在该方法中人类染色体中的目的区域易位至稳定的染色体片段(染色体载体)。
近来，Kuroiwa等人(Nature Biotech.18：1086，2000)在世界上首次成功生产出保有百万碱基(Mb)大小的特定人类染色体区域作为插入片段的人类人工染色体(HAC)。该HAC(λHAC)为一种人工染色体，其获得方法是：使用稳定且可遗传传递的源自人染色体14的SC20片段作为染色体载体，并将人染色体22上的含人抗体λ轻链基因的10Mb染色体区作为插入片段易位并克隆至该载体。他们证实：该λHAC的稳定性基本等同于用作载体的SC20片段，而各种不稳定染色体来源的区域也可通过易位和克隆至SC20获得稳定。而且，他们将该λHAC引入到小鼠中，由此成功产生一种稳定携带λHAC的嵌合体小鼠。
对于非人动物来说，将引入的人类染色体遗传传递至下一代不仅对通过杂交大量生产同种转染色体动物(即其中异源染色体片段已通过种系遗传传递的非人动物)很重要，而且对通过引入人类染色体的种系分析结构和功能很重要。此前已将若干类人类染色体引入到小鼠中，其遗传传递能力据认为取决于引入的人类染色体的结构。为进行遗传传递，开始时必须获得其中ES细胞高效生成生殖细胞且嵌合程度高的嵌合体小鼠。此嵌合程度据认为与所导入人类染色体的结构相关，即在导入的染色体上存在哪种类型的人基因。例如，当引入人染色体2或14的片段时，获得的嵌合体小鼠嵌合程度接近100％且遗传传递效率高(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：722-727，2000)。相反，当引入人染色体22的片段时，大多数情况下所获得的嵌合体小鼠嵌合程度低(即50％或以下)。这可能是因为在人染色体22上存在对小鼠发育有不利影响的有害人基因。实际上，据报道，引起基因表达水平依赖性遗传病(例如猫眼综合症、DiGeorge综合症和der22综合症)的区域存在于人染色体22上的22q11区中，在该区中存在人抗体Igλ基因(例如A.Puech等，PNAS 97：10090，2000)。如上所述，去除这些引起遗传病的区域，仅将人染色体22上由HCF2基因座至LIF基因座的10Mb区域易位并克隆至SC20染色体载体来构建λHAC，然后将λHAC引入小鼠中。结果，据报道，与引入全长人染色体22的情况相比，由保持λHAC的ES细胞产生的嵌合体小鼠的嵌合程度增加。
在上述形势下，本发明人尝试进一步改进所述人类人工染色体，以获得比常规λHAC更有效的遗传传递，并研究遗传传递效率。
更具体地说，本发明的一个目的在于提供一种通过修饰人染色体22或其片段而高效遗传传递至下一代的人类人工染色体，并提供携带所述人类人工染色体的非人动物及其后代。
本发明的另一个目的是提供一种使用所述非人动物或其后代生产人抗体的方法。
本发明人为达到上述目的已进行了专门研究。结果，他们修饰人染色体22，选择两种含抗体λ轻链基因(Igλ)区的结构明了的区域，并构建一种其中每种所选区域都易位至人染色体14片段的人类人工染色体，由此产生一种携带所述人类人工染色体的高嵌合程度小鼠。结果，本发明人发现所述人类人工染色体通过在嵌合体小鼠中减数分裂高效遗传传递至下一代的后代，由此完成本发明。
本发明公开
本发明主题如下。
本发明一方面提供一种人类人工染色体，其中含人类染色体22的抗体λ轻链基因的约3.5Mb至约1Mb的区域结合至通过非人动物种系可传递给后代的染色体片段，所述染色体片段来源于另一个人类染色体。
按照一个实施方案，得自另一个人类染色体的染色体片段可为任何人类染色体片段，只要其稳定且可遗传传递。例如，染色体片段可以为人染色体14片段、人染色体21或其片段或者含人染色体1的lp22区的小副染色体(SAC)(Genomes Res.，11：124-136，2001)，其优选可为人染色体14的片段，例如来源于人染色体14的SC20染色体载体(Kuroiwa等，如上所述)。SC20染色体载体可用于克隆目标染色体片段，方法是例如通过同源重组将loxP序列插入位于14p12位的RNR2基因座(Kuroiwa等，如上所述)。保持SC20染色体载体的小鸡DT-40细胞(SC20)于2001年5月9日保藏于国际专利微生物保藏单位国立高级工业科学与技术研究所(Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)，保藏号为FERM BP-7583。还可以按照WO 97/07671公开的方法获得另一个人类染色体的染色体片段，优选生产携带长度约20Mb或更小的各种人染色体片段的嵌合体非人动物，并选择所述嵌合体非人动物后代稳定保持的片段。通过位点特异性重组序列(如loxP序列)介导的易位或插入，使含人染色体22的抗体λ轻链基因的区域结合至可遗传传递的人染色体片段。当用端粒序列和loxP序列作为两个末端切出含抗体λ轻链基因的区域时，如以下实施例所述，则经易位产生结合。相反，当在两个末端通过插入loxP序列切出含抗体λ轻链基因的区域时，则在可遗传传递的人染色体片段上的loxP序列位点发生插入。
按照另一个实施方案，含人染色体22的抗体λ轻链基因的区域的长度约为2.5Mb至约1.5Mb。
按照再另一个实施方案，含人染色体22的抗体λ轻链基因的区域的长度约为2.5Mb或约1.5Mb。所述长度区域的具体实例为分别含小鸡DT-40细胞(ΔHAC)(保藏号FERM-BP-7582)保持的ΔHAC和小鸡DT-40细胞(ΔΔHAC)(保藏号FERM-BP-7581)保持的ΔΔHAC的人类人工染色体(参见以下的实施例)。
本发明的另一方面提供一种携带本发明人类人工染色体的非人动物。在本说明书中，术语“非人动物”是指非人类的脊椎动物，优选指哺乳动物。
按照一个实施方案，所述非人动物或者具有ΔHAC人类人工染色体，或者具有ΔΔHAC人类人工染色体。
按照另一个实施方案，所述非人动物为哺乳动物。哺乳动物优选为小鼠。
本发明再一方面提供一种生产非人动物的方法，包括：通过微细胞法将本发明的人类人工染色体引入非人动物的胚胎干细胞(ES细胞)中；将获得的ES细胞注射入非人动物的胚胎中；将产生的注射胚胎移植入代孕母亲；由代孕母亲分娩获得嵌合体非人动物；以及筛选具有所述人类人工染色体的嵌合体非人动物。
为引入到ES细胞中，可生产保持人类人工染色体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，从而通过CHO细胞将所述人类人工染色体引入ES细胞中。
按照一个实施方案，上述方法还包括生产所筛选嵌合体非人动物的后代，并筛选具有所述人类染色体的后代。
按照另一个实施方案，由上述方法获得的非人动物能够表达人抗体免疫球蛋白重链和λ链蛋白。
按照再一个实施方案，所述非人动物为哺乳动物，优选为小鼠。
本发明再一方面提供具有本发明人类人工染色体的非人动物，其可通过本发明的方法获得。
本发明再一方面提供本发明非人动物的后代动物。所述后代动物具有本发明的人类人工染色体。
按照一个实施方案，所述后代动物能够表达人抗体免疫球蛋白重链和λ轻链蛋白。
按照另一个实施方案，所述后代动物能够表达人抗体免疫球蛋白重链、κ轻链和λ轻链蛋白。
按照再一个实施方案，所述后代动物为小鼠。
本发明再一方面提供一种生产抗体的方法，包括：用目标抗原免疫接种本发明的非人动物或本发明的后代动物；并由所述动物获得抗所述抗原的人多克隆抗体。
按照一个实施方案，所述人多克隆抗体由所述动物的血获得。
本发明再一方面提供一种生产抗体的方法，包括：用目标抗原免疫接种本发明的小鼠或本发明的后代小鼠；通过将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤；以及生产由人免疫球蛋白重链和轻链组成的抗所述抗原的人单克隆抗体。
本发明再一方面提供一种生产抗体的方法，包括：用目标抗原免疫接种本发明的小鼠或本发明的后代小鼠；通过将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤；由所述杂交瘤分离人抗体基因；将人抗体基因导入动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞；在能够表达人抗体基因的条件下培养所述细胞；以及生产由人免疫球蛋白重链和轻链组成的抗所述抗原的人单克隆抗体。
本发明再一方面提供一种生产抗体的方法，包括：用目标抗原免疫接种本发明的小鼠或本发明的后代小鼠；通过噬菌体展示方法选择小鼠B细胞抗体基因；将选定的人抗体基因导入动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞；在能够表达人抗体基因的条件下培养所述细胞；以及生产由人免疫球蛋白重链和轻链组成的抗所述抗原的人单克隆抗体。
表达方法可按照常规方法进行(例如Sambrook，J.等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)，Cold Spring Harbor Press描述的方法)。作为宿主的动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、肝癌细胞、骨髓瘤细胞、面包酵母细胞和SF9细胞。
本发明再一方面提供一种生产人抗体的小鼠，其在血清中表达含人抗体Igγ同种型的人抗体重链、人抗体κ轻链和人抗体λ轻链。所述生产人抗体的小鼠具有未重排的人抗体重链基因座、人抗体κ轻链基因座和人抗体λ轻链基因座，并且至少内源抗体重链和κ轻链的两种等位基因都破坏或失活。
在上述生产人抗体的小鼠中，通过在B细胞分化时重排人抗体基因，使特定可变区的节段发生连接(重链中的V-D-J，轻链中的V-J)。优选在B细胞成熟时对抗体基因可变区进行的体细胞诱变后，在血清中产生作为基因产物的人抗体。
具体地说，术语“未重排”是指在B细胞分化时抗体基因座能够在重链中进行V-D-J重组和在轻链中进行V-J重组的状态，而重链中的V-D-J重组或轻链中的V-J重组尚未出现时，所述抗体基因座保持在小鼠未分化B细胞中。
在一个实施方案中，生产人抗体的小鼠具有至少40％的人抗体κ轻链可变区。
在另一个实施方案中，生产人抗体的小鼠具有人抗体重链、人抗体κ轻链和人抗体λ轻链的所有可变区。
在再一个实施方案中，人抗体重链基因座、人抗体κ轻链基因座和人抗体λ轻链基因座保持在人源染色体片段上。
在再一个实施方案中，人抗体重链基因座和人抗体λ轻链基因座保持在ΔHAC或ΔΔHAC人类人工染色体上。
在再一个实施方案中，人抗体κ轻链基因座保持在人源染色体片段上。
在再一个实施方案中，人抗体κ轻链基因座插入到小鼠染色体中。
在再一个实施方案中，所述生产人抗体的小鼠不是嵌合体小鼠。生产人抗体的小鼠优选能够遗传传递人抗体重链基因座、人抗体κ轻链基因座和人抗体λ轻链基因座。
1.人类人工染色体(HAC)和转染色体非人动物的生产及用途
本发明涉及：构建一种新的人类人工染色体，其制备方法是将含人染色体22上的Igλ基因的片段易位和克隆至人染色体14来源的染色体片段；将所述人类人工染色体遗传传递至小鼠；以及生产具有人类人工染色体的转染色体非人动物(例如哺乳动物，如小鼠)。
在本说明书中，所述人类人工染色体(HAC)是指通过将人染色体上的目标区域易位至稳定的染色体片段(染色体载体)而生产的人工染色体。所述术语“转染色体非人动物”是指不同物种的染色体片段通过种系遗传传递的非人动物。
生产人类人工染色体，该染色体仅保持目标基因区域外周，其作为插入片段(染色体插入片段)，生产方法是例如通过同源重组将loxP序列和人端粒序列插入人染色体上的目标基因区域周围，并仅将夹在两个序列中间的目标基因区域外周特定易位至另一个染色体片段上的对应loxP序列插入位点(染色体片段最好稳定且可遗传传递；例如来自人染色体14的SC20染色体载体)(Kuroiwa等，NatureBiotech.，18：1086，2000)。
在生产人类人工染色体时，本发明人认为：推测对染色体导入动物发育有不利影响的染色体区最好尽可能地由染色体插入片段中去除，以便不对染色体导入动物(如小鼠)的发育产生副作用，但是，因为此前对于人染色体结构(例如详细的序列)几乎没有或没有信息，所以有时难以在目标基因附近插入例如loxP序列和人端粒序列。在此情况下，因为两种序列所夹的区域包含有目标基因以外的许多基因，所以，当这些外部基因导入小鼠等中时，担心它们可能对发育有不利影响。而且，含目标基因的染色体插入片段的长度与染色体导入动物的嵌合程度及遗传传递效率之间的关系并不清晰。
本发明人现在发现，根据其中存在Igλ基因的人染色体22的结构信息(例如I.Dunham等，Nature 402：489，1999)，对于给定长度范围的含Igλ基因的染色体插入片段，染色体导入动物的嵌合程度和遗传传递效率显著增加。因此，由人类人工染色体中去除额外基因能够生产出保持Igλ基因区域的特定外周作为插入片段的新人类人工染色体。在本说明书中，术语“额外基因”是指对染色体导入动物的发育有不利影响的有害基因，其实例包括引起基因表达水平依赖性遗传病的区域。与保持Igλ基因区外周(10Mb)作为插入片段的常规λHAC相比，本发明的人类人工染色体总体上长度减小，遗传传递效率较高。
因此，修饰人染色体22能够产生仅保持特定的目标Igλ基因区作为插入片段而去除了对小鼠等发育有不利影响的有害基因的人类人工染色体。修饰的结果是：导入的人类人工染色体总体上长度减小，并且还可避免减数分裂时不正常染色体(在本例中为导入的人类人工染色体)的消除机制(例如P.Hunt等，Hum.Mol.Genet.，4：2007.1995)。而且，与常规λHAC(Kuroiwa等，如上所述)相比，导入的人类人工染色体更易于传递至人类人工染色体导入动物(例如小鼠)的后代，可以更有效生产具有完整人抗体重链区和λ轻链区的转染色体非人动物。
可使用由此获得的转染色体非人动物表达外源染色体上的基因或其片段，收集其产物，由此产生生物活性物质。更具体地说，在可表达外源染色体上的基因或其片段的条件下，繁殖个体转染色体非人动物，然后可由所述动物的血液、腹水等收集表达产物。
在可表达外源染色体上的基因或其片段的条件下培养转染色体非人动物的组织、细胞或固定化细胞(例如通过与骨髓瘤细胞融合固定化的杂交瘤)等，然后由培养物收集表达产物。
或者，将由这些转染色体非人动物的组织、细胞或固定化细胞提取的外源染色体或其片段、构建外源染色体或其片段的DNA或衍生自保持在转染色体非人动物的组织、细胞或固定化细胞中的外源染色体或其片段的cDNA导入动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞(例如CHO细胞、BHK细胞、肝癌细胞、骨髓瘤细胞、面包酵母细胞或SF9细胞)中，在可表达外源染色体上的基因或其片段的条件下培养所述细胞，然后由培养物收集表达产物(例如特定抗原特异性的抗体蛋白)。按照常规方法(如离心)收集表达产物。此外，可按照常规方法(例如硫酸铵分级分离、分配层析、凝胶过滤层析、吸附层析或制备型薄层层析)对其进行纯化。生物活性物质包括所有在外源染色体上编码的物质，其实例包括抗体，特别是人抗体。例如，可由得自转染色体非人动物的脾细胞或其固定化细胞(例如骨髓瘤)克隆染色体上的人抗体基因，并将其导入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或骨髓瘤细胞中，由此产生人抗体(Lynette等，Biotechnology，10：1121，1992；Bebbington等，Biotechnology，10：169，1992；Babcook等，PNAS，93：7843，1996)。
除了通过选择杂交瘤选择产生目标抗体的细胞的常规方法之外，还可以通过最近开发的噬菌体展示法(Winter等，Annu.Rev.Immunol.，12：433，1994)选择目标抗体。为了获得在其表面表达各种特异性人抗体的噬菌体文库，可以使用得自本发明转染色体非人动物(还没有对任何抗原敏化或已经对特定抗原敏化)的脾或淋巴组织的人免疫球蛋白重链和轻链可变区的cDNA。
下文更详细地描述生产高遗传传递效率的人类人工染色体的方法。
为了生产包含、稳定携带并遗传传递目标人染色体区的非人动物，需要一种有目的地加工染色体的技术来取代使用偶然产生的染色体片段。例如，在目标位点切割人染色体以去除有害基因，或仅使目标染色体片段连接至另一个稳定且可遗传传递的染色体。这种技术称为“染色体工程”。迄今为止，此技术主要是以位点特异性方式切割小鼠ES细胞(WO 98/54348)中的内源小鼠染色体，或同源染色体之间的重组(易位)引起特定基因区的缺失、反转或增加。因此，已经生产了具有这种修饰染色体的变异小鼠(R.Ramirez-Solis等，Nature 378：720，1995)。该技术也可应用于本发明。
当获得其中保持人染色体或其片段的ES细胞生成生殖细胞的高嵌合程度非人动物(例如小鼠之类的哺乳动物)时，下一个考虑的问题就是如果减数分裂时没有去除导入的人染色体，则是否可形成保持导入的人染色体的精子或卵子。如上所述，一般认为在减数分裂时去除了不正常的染色体。因此，保持导入的人染色体的细胞有可能在减数分裂时去除，结果这些细胞不能分化成精子或卵子。这是因为虽然减数分裂时需要同源染色体之间配对，但仅有一个导入的人染色体。因此，配对基本上是不可能的。因此，导入的人染色体可能因为减数分裂排除。实际上，Tomizuka等（Nature Genet.，16：133，1997)报道，导入大约50Mb或更大的人染色体14片段导致嵌合体雄性小鼠不育。相反，在遗传传递估计约10-20Mb长的人染色体2或14(SC20)片段时，认为导入染色体的大小对通过减数分裂来说是一个重要因素(Tomizuka等，Nature Genet.，16：133，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)。SC20染色体载体(10-20Mb)可遗传传递，在小鼠ES细胞和小鼠个体中还高度稳定(Shinohara等，Chromosome Res.，8：713-725，2000)。可通过WO 97/07671和WO98/37757描述的方法获得和选择可遗传传递并在小鼠个体中稳定的天然染色体片段。Voet等(Genome Res.，11：124-136，2001)的报告也描述了可遗传传递并在小鼠个体中稳定的天然人染色体片段。此外，使用嵌合体小鼠稳定携带的人染色体14(约100Mb，Tomizuka等，Nature Genet.，16：133，1997)或染色体21(约50Mb，Shinohara等，第45届日本人类遗传协会年会，2000年8月)作为原料，可通过染色体工程技术将其减至20Mb或更小(Kuroiwa等，Nature Biotech.18：1086，2000)。按照本发明，通过使用上述技术将导入染色体的大小减至特定长度范围，可获得在小鼠个体中稳定并具有高遗传传递效率的人工染色体。
例如，通过仅将特定长度范围的目标基因区易位和克隆至可遗传传递的SC20载体构建HAC，通过SC20片段载体的作用使HAC可遗传传递。在此情况下，可通过易位改变SC20的稳定结构，或者HAC总体长度可变得比原先的SC20载体大。因此，要易位的染色体插入片段(含人染色体22上的免疫球蛋白λ基因)的长度可小于λHAC(10Mb)，即一般约3.5Mb至约1Mb，优选约3Mb至约1.2Mb，更优选约2.5Mb至约1.5Mb。要易位的染色体插入片段的着丝粒侧末端优选为HCF2基因座，更优选为AP000553区(I.Dunham等，Nature 402：489，1999)。拟修饰染色体(例如人染色体22)全部序列的阐明明显有助于精确修饰如上所述的染色体。因此，如果阐明了完整人染色体的序列，则通过仅将含人染色体22以及各种人染色体上的目标基因外周区精确易位和克隆至SC20染色体载体，可有效进行遗传传递。
如上所述，要实现导入人染色体在非人动物(如小鼠)中遗传传递存在几个障碍，特别是人们认为人染色体22上的Igλ基因区难以有效遗传传递。但是，本发明解决了该问题。
具体地说，在本发明中，将含人染色体22上的抗体λ轻链基因的2.5Mb和1.5Mb区易位和克隆至SC20染色体载体，以产生人类人工染色体(ΔHAC和ΔΔHAC)，随后，将每个ΔHAC和ΔΔHAC导入小鼠个体，对比嵌合体小鼠的嵌合程度和λHAC(Kuroiwa等，如上所述)，由此证实嵌合程度提升，并实现了所述人类人工染色体的有效遗传传递。嵌合程度代表嵌合体动物中ES细胞的生成比率，一般可通过目测评价嵌合体动物身体表面上由ES细胞产生的毛色比率确定。该具体实施例将更详细描述。
2.ΔHAC、ΔΔHAC和转染色体小鼠的生产与应用
通过已熟知的方法可获得含人抗体λ轻链基因或其片段的人染色体22。更具体地说，可通过微细胞法将人染色体或其片段在小鼠A9细胞中构建成文库(Koi等，Jpn.J.Cancer Res.80：413-418，1989)。可通过PCR等检测所获文库中对人抗体λ轻链基因特异性的序列，以选择保持人染色体22或其片段的克隆。为以后修饰方便起见，更优选可通过微细胞法将人染色体22或其片段转移入小鸡DT-40细胞(RIKEN Cell Bank：RCB 1464，ATCC：CRL-2111)中。
在染色体22上的22q11.2存在人抗体λ轻链基因簇(例如J.E.Collins等，Nature 377：367，1995)。对上述λHAC，将HCF2基因座至LIF基因座的10Mb区作为染色体插入片段易位并克隆。在此10Mb插入片段中，在Igλ基因区的端粒侧包含7Mb的额外染色体区，而在着丝粒侧含1Mb的额外染色体区。为了首先去除7Mb区，通过端粒平截在非常接近于Igλ基因区存在并在端粒侧(约400Kb端粒侧)的AP000344区(I.Dunham等，Nature 402：489，1999)切割染色体22或其修饰片段(HCF2基因座中插入loxP序列并在LIF基因座端粒平截的片段)(例如Kuroiwa等，Nucleic Acid Research，26：3447，1998)。随后，通过同源重组将loxP序列插入非常接近于Igλ基因区并在着丝粒侧(约300Kb着丝粒侧)的AP000553区(I.Dunham等，Nature402：489，1999)。这些修饰能够仅将HCF2-Igλ-AP000344片段(约2.5Mb)或AP000553-Igλ-AP000344片段(约1.5Mb)作为染色体插入片段易位和克隆至SC20染色体载体。通过常规方法将构建的HAC导入小鼠ES细胞，然后生产嵌合体小鼠。在证实嵌合体小鼠中保持HAC后，进行杂交获得后代小鼠。对所获后代小鼠进行HAC保持验证能够判断HAC的遗传传递情况。
按照本发明，通过ΔHAC遗传传递人抗体λ轻链(Igλ)基因的全部区域，可有效生产具有人抗体重链和λ轻链基因的转染色体非人动物(例如小鼠之类的哺乳动物)。据信用非人动物生产可为药物候选物的人抗体是有用的。在人血清中，含λ轻链的抗体占大约40％，Vλ基因片段的数量(70)和Vκ链基因的数量(76)大致相等。因此，有人认为含λ链的抗体明显有利于不同人抗体的构建(Popov，A.V.，J.Exp.Med.，189：1611，1999)。相反，在目前世界上用作药物的大多数人源化抗体或人抗体中，轻链由κ轻链组成。本发明的ΔHAC和ΔΔHAC转染色体小鼠对开发含λ轻链的人抗体药物有用。ΔHAC和ΔΔHAC转染色体小鼠可遗传传递不同物种的染色体片段，因此可通过杂交大量生产同基因性状的转染色体小鼠。而且，具有含人抗体κ轻链基因的染色体片段的小鼠(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.97：722-727，2000)或含人抗体κ轻链基因的转基因小鼠(Fishwild等，NatureBiotechnol.，14：845-851，1996；Mendez等，Nature Genet.，15：146-156，1997)可与ΔHAC和ΔΔHAC转染色体小鼠杂交，生产产生含全部人抗体重链、κ轻链和λ轻链的人抗体的人抗体生产小鼠。Nicholson等(J.Immunol.，163：6898，1999)报导了同时表达人重链、κ链和λ链的小鼠品系。他们通过组合具有酵母人工染色体(YAC，分别包含导入其中的部分人Ig重链、κ链和λ链)的转基因小鼠和内源Ig重链和κ链剔除小鼠，产生了含人重链/κ链和和人重链/λ链分子的小鼠。但是，在该小鼠品系中表达的人免疫球蛋白的多样性和分子组成明显与人不同。例如，(i)人Ig重链YAC仅由μ和δ恒定区组成，而另一个同种型(特别是为最大组分的Igγ同种型)在该小鼠品系中不表达，和(ii)三种类型的YAC中包含的可变区的数量少，推测该小鼠品系表达的人抗体的多样性有限。
在本文公开的同时表达人Ig重链、κ链和λ链的小鼠品系中，人类表达抗体的多样性、分子组成等更忠实地重现。例如，因为(i)表达Igγ同种型(全部4种亚型)和(ii)包含重链、κ链和λ链的所有可变区，可再现类似于人的多样性。
用合适的抗原免疫接种这些生产人抗体的转染色体小鼠，并通过ELISA筛选经脾细胞和小鼠骨髓瘤融合获得的杂交瘤(Ando，Chiba，“Tan-kurohn Koutai Jikken Sousa Nyuumon(单克隆抗体实验和操作指引)，”Kodansha Scientific，1991)。因此，可获得生产由人免疫球蛋白重链和λ轻链组成的完整人单克隆抗体的杂交瘤。这些人单克隆抗体可用作药用抗体。
据认为，多克隆抗体作为治疗性抗体治疗感染性疾病等比单克隆抗体的治疗作用更大。而且，人多克隆抗体还可以开发成所谓的γ球蛋白制剂。已经证明，实际上由本发明产生的保持ΔHAC或ΔΔHAC的ES细胞可获得高嵌合程度(约80％-100％，优选约85％-100％)的嵌合体小鼠，而导入的人类人工染色体高效遗传传递，并在从受精卵态到分娩成后代小鼠的整个发育过程中始终保持。用不同物种抗原接种非人动物(如小鼠)能够大量生产抗原特异性人多克隆抗体(含人λ轻链的抗体)。具有可取代单克隆抗体的抗体药物的希望，因为单克隆抗体难以大量生产。
本发明的人类人工染色体可导入小鼠以及其它非人动物(例如大鼠或猪之类的哺乳动物)中。Iannaccone等，Dev.Biol.，163：288，1994(大鼠)和Wheeler等，Reprod.Fertil.Dev.，6：563，1994(猪)报导了在小鼠以外的动物物种中建立ES细胞或ES样细胞。此外，还尝试使用了小软鳍鱼科、小鸡等(“转基因动物”，蛋白质、核酸、酶，1995年10月，号外，KYORITSU SHUPPAN CO.，LTD.)。使用ES或ES样细胞作为受体细胞的人类人工染色体迁移能够生产具有人类人工染色体或其片段并表达人类人工染色体上的基因的非人动物，如同小鼠的案例一样。而且，可使用这些非人动物生产含人λ轻链的抗体。
附图简述
图1显示了人类人工染色体ΔHAC和ΔΔHAC的生产。
图2显示了表达盒载体pTELhisD。
图3显示了靶向载体pTELhisDλI。
图4显示了靶向载体p553loxPHyg。
本说明书包括在日本专利申请第2001-142371号说明书中公开的部分或全部内容，所述申请是本申请的优先权文件。
实施本发明的最佳方式
参照以下的实施例将更详细地描述本发明，但这些实施例不限制本发明。
以下的实施例1至实施例14描述了人类人工染色体ΔHAC和ΔΔHAC的生产，ΔHAC和ΔΔHAC的制备方法是将人染色体22上的抗体λ轻链基因的2.5Mb和1.5Mb外周区易位和克隆至SC20染色体载体(图1)。此外，描述了将每种所生产的HAC导入小鼠个体中以及将HAC传递至嵌合体小鼠的后代。
[实施例1]生产表达盒载体pTELhisD
用限制酶NotI(Boehringer)切割表达盒载体pTELPuro(Kuroiwa等，Nature Biotech.，18：1086-，2000)，并使用DNA平端试剂盒(ToyoboCo.，Ltd.)于72℃平端5分钟。平端后使用细菌来源的碱性磷酸酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)于65℃去磷酸化1小时。此后，加入限制酶BglII接头(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，使用连接试剂盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.)进行连接。由此产生BglII接头取代pTELPuro质粒中的PGKPuro表达盒的质粒pTELBg。用限制酶BglII切割该质粒，并以相同方式去磷酸化。此后，使用CHROMA SPIN-TE 400(Clontech)经凝胶过滤纯化。随后，用限制酶BamHI从质粒#1-132(由Kyoto大学的Shun-ichiTakeda教授提供)中切出hisD片段，以相同方式加入其进行连接反应。由此产生hisD表达盒取代pTELPuro质粒中的PGKPuro表达盒的表达盒载体pTELhisD(图2)。
[实施例2]生产靶向载体pTELhisDλI
按以下方式生产靶向载体pTELhisDλI，该载体用于将人端粒序列插入到非常接近于人染色体22上的Igλ基因座并在端粒一侧(约400Kb端粒侧)的AP000344区。开始时，使用以下引物通过PCR扩增AP000344基因组区。
1269D1-F；5′-TCGAGGATCCGACAAGTTCTCTTCTCTTTTCCTTCTGCCC-3′(SEQ ID NO：1)
1269D1-R；5′-TCGAGGATCCGCTGCTAAGCTACTGTTCTCTTTTTTCCCC-3′(SEQ ID NO：2)
使用GeneAmp 9600(由Perkin-Elmer生产)作为热循环仪，使用LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)作为Taq聚合酶进行PCR，并按照推荐的条件使用连接缓冲液和dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。对于温度和循环条件，于94℃热变性1分钟后，以98℃10秒和68℃11分钟进行35个循环。用蛋白酶K(Gibco)处理PCR产物，然后用CHROMA SPIN-TE 400(Clontech)进行凝胶过滤。此后，用限制酶BamHI(Boehringer)切割PCR产物，然后用CHROMA SPIN-TE 400(Clontech)进行凝胶过滤。将该PCR产物克隆到质粒pTELhisD的BamHI位点。因为AP000344基因组序列的方向是由着丝粒至端粒，所以测定和人端粒序列相同方向的克隆AP000344基因组片段作为目的靶向载体pTELhisDλI(图3)。
[实施例3]生产靶向载体p553loxPHyg
按以下方式生产靶向载体p553loxPHyg，该载体用于将Cre重组酶识别序列loxP序列插入非常接近于人染色体22上的Igλ基因座并在着丝粒一侧(约300Kb着丝粒侧)的AP000553区。开始时，使用以下引物通过PCR扩增AP000553基因组区。
553-F3；5′-TCGAGTCGACTGTAGCTGACTTTAGCCACCCACAAGTAC-3′(SEQID NO：3)
553-R3；5′-TCGAGTCGACCTTGCTGATTATACCTCATCTCCTTCCCTC-3′(SEQID NO：4)
使用GeneAmp 9600(由Perkin-Elmer生产)作为热循环仪，使用LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)作为Taq聚合酶进行PCR，并按照推荐的条件使用连接缓冲液和dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。对于温度和循环条件，于94℃热变性1分钟后，以98℃10秒和68℃15分钟进行35个循环。用蛋白酶K(Gibco)处理PCR产物，然后用CHROMA SPIN-TE 400(Clontech)进行凝胶过滤。此后，用限制酶SalI(Boehringer)切割PCR产物，然后用CHROMA SPIN-TE 1000(Clontech)进行凝胶过滤。将该PCR片段克隆到质粒pBluescriptII(先缺失NotI位点，然后将SrfI接头插入SacII位点)的SalI位点(pBS553)。随后，用限制酶HpaI(Boehringer)切割pBS553并去磷酸化，然后通过连接插入NotI接头(pBS553N)。用限制酶NotI切割pBS553N并去磷酸化后，用限制酶NotI(Boehringer)由表达盒载体ploxPHyg中切出含loxP的DNA片段，然后连接。经测定与克隆的AP000553基因组片段相同方向的含loxP序列的载体作为靶向载体p553loxPHyg(图4)。
[实施例4]位点特异性切割小鸡DT-40细胞中的人染色体22
将实施例2产生的靶向载体pTELhisDλI转染入小鸡DT-40细胞(克隆52-18)和DT-40细胞(克隆HF38)，其中克隆52-18保持有通过WO 98/37757描述的方法生产的全长人染色体22，而克隆HF38保持有已经在LIF基因座切割的人染色体22片段，将人端粒序列插入AP000344基因组区，以尝试在插入位点切割染色体22。
用包含加入其中的10％胎牛血清(Gibco，下文称之为“FBS”)、1％小鸡血清(Gibco)和10-4M 2-巯基乙醇(Sigma)的RPMI 1640培养基(Gibco)培养小鸡DT-40细胞。用无填加物的RPMI 1640培养基清洗约107细胞一次，并悬浮在0.5ml无填加物的RPMI 1640培养基中。加入25-30μg用限制酶SrfI(Toyobo Co.，Ltd.)线性化的靶向载体pTELhisDλI，并将其转移入杯(Bio-Rad)进行电穿孔，使其在室温下静置10分钟。将所述杯置于Gene Pulser(Bio-Rad)中，施加550V、25μF的电压。使杯在室温下静置10分钟后，将其培养24小时。24小时后，用含组氨醇(0.5mg/ml)的培养基更换培养基，将培养液分至10个96孔培养板中，进行约2周的选择性培养。使用Puregene DNA分离试剂盒(CentraSystem)由组氨醇抗性克隆中提取基因组DNA，使用用于检测HCF2(Kuroiwa等，Nature Biotech.，18：1086，2000)、Igλ(Tomizuka等，Nature Genet.，16：133，1997)、D22S1174、D22S315、D22S275(BIOS)和LIF(Kuroiwa等，Nucleic Acid Research，26：3447-3448，1998)的引物通过PCR证实人染色体22在AP000344基因组区切割。
使用GeneAmp 9600(由Perkin-Elmer生产)作为热循环仪，使用LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)作为Taq聚合酶进行PCR，并按照推荐的条件使用连接缓冲液和dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。对于温度和循环条件，于94℃热变性1分钟后，以98℃10秒、56℃30秒和72℃30秒进行35个循环。在转染克隆52-18时，筛选48个克隆，发现1个克隆(T32)为目的克隆。在转染HF38时，筛选96个克隆，发现2个克隆(HT69、HT72)为目的克隆。
此外，通过FISH分析证实染色体22是否在AP000344区切割。
为了目测判断人染色体22在AP000344基因组区切割，使用能够检测靶向载体中的hisD抗性基因的探针进行FISH分析。按照Kuroiwa等(Nucleic Acid Research，26：3447-3448，1998)实施该方法。根据COT1染色(罗丹明标记，红色)，发现相比于全长人染色体22，T32、HT69和HT72中的染色体22片段化。而且，在端粒末端检测到hisD探针产生的信号(FITC标记，黄色)。这表明，插入到靶向载体中的AP000344是染色体22片段的端粒末端。
由以上结果推断，T32、HT69和HT72的人染色体22在AP000344区切割。
[实施例5]在小鸡DT-40细胞的人染色体22上位点特异性插入loxPHyg表达盒
在以上的HT69和72中，loxP序列已经插入到HCF2基因座(Igλ基因座的约1Mb着丝粒侧)中。因此，对于克隆T32，将实施例3产生的靶向载体p553loxPHyg转染入非常接近Igλ基因座并在着丝粒侧(约300Kb的着丝粒侧)的AP000553区，以尝试插入loxP序列。
以上述相同的方式将已用限制酶SrfI(Toyobo Co.，Ltd.)线性化的靶向载体p553loxPHyg转染入克隆T32中，并用含潮霉素B(1mg/ml)的培养基进行约2周的选择性培养。由潮霉素B抗性克隆提取基因组DNA，使用以下2组引物通过PCR鉴定同源重组物。
553-F4；5′-GCTAAGGCACTTCGGTTCTCTTTGTGTTC-3′(SEQ ID NO：5)
553-R4；5′-GGTTGTCTTTAAAAGCAGGGATAAGGATG-3′(SEQ ID NO：6)
553-F5；5′-AGAAGAAAGGAGTGGGTGCTAAACATTCAG-3′(SEQ ID NO：7)
553-R5；5′-GGTTAGATGGCACCAAATGAAAGGAGAAG-3′(SEQ ID NO：8)
使用GeneAmp 9600(由Perkin-Elmer生产)作为热循环仪，使用LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)作为Taq聚合酶进行PCR，并按照推荐的条件使用连接缓冲液和dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。对于温度和循环条件，于94℃热变性1分钟后，以98℃10秒和68℃15分钟进行35个循环。筛选69个克隆，结果鉴定出3个克隆(553-2、6、14)为同源重组物。
[实施例6]通过将2.5Mb的人抗体λ轻链基因区(HCF2-Igλ-AP000344)易位和克隆至SC20染色体载体制备人类人工染色体ΔHAC构建物
开始时，将实施例4获得的克隆HT72和保持有SC20染色体载体的DT-40细胞的克隆R进行细胞融合(Kuroiwa等，Nature Biotech.18：1086，2000)，以产生保有人染色体22片段和染色体14片段(SC20染色体载体)的DT-40杂种细胞。
(1)生产同时保有人染色体22片段和SC20染色体载体的DT-40杂种细胞
用含杀稻瘟素S(10μg/ml)的RPMI 1640培养基培养克隆R，并用含潮霉素B(1mg/ml)的RPMI 1640培养基培养克隆HT72。将两种克隆分别以1-2×107的量互相混合并离心，然后用无血清RPMI1640培养基清洗两次。完全去除残余培养基后，渐渐加入于37℃预加热的0.5ml 50％PEG 1500(Boehringer)，使用吸液管剧烈搅拌混合物2分钟。此后，在1分钟内缓慢加入1ml无血清RPMI 1640培养基，然后在约3分钟内加入9ml无血清RPMI 1640培养基，使混合物在37℃静置10分钟。此后，于1,200rpm离心混合物5分钟，并在含血清的RPMI 1640培养基中培养24-48小时。此后，用含杀稻瘟素S(10μg/ml)和潮霉素B(1mg/ml)的RPMI 1640培养基更换培养基，将培养液分至5个24孔培养板中，接着培养3-4周。由双抗性克隆提取基因组DNA，使用以下的引物进行PCR，以验证保持有两个片段，即人染色体14片段(SC20染色体载体)和染色体22片段。
检测人染色体14的引物：
VH3-F；5′-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3′(SEQ ID NO：9)
VH3-R；5′-GTTGTGCTACTCCCATCACT-3′(SEQ ID NO：10)
检测人染色体22的引物：
Igλ-F；5′-GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT-3′(SEQ ID NO：11)
Igλ-R；5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′(SEQ ID NO：12)
使用GeneAmp 9600(由Perkin-Elmer生产)作为热循环仪，使用Ex Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)作为Taq聚合酶进行PCR，并按照推荐的条件使用连接缓冲液和dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。对于温度和循环条件，于94℃热变性1分钟后，以98℃10秒、56℃30秒和72℃30秒进行35个循环。PCR后发现6个克隆(56HT2、3、4、5、6、7)为阳性。此外，使用人COT1 DNA作为探针的FISH分析结果证实，所有这些克隆都保有互相独立的两种人染色体片段。由以上结果推断，这6个杂种克隆都保有两种片段，即人染色体14片段(SC20染色体载体)和染色体22片段。
(2)将人染色体22的2.5Mb区(HCF2-Igλ-AP000344)位点特异性易位至DT-40杂种克隆(56HT2)的SC20染色体载体
(2)-1构建Cre重组酶的稳定表达载体pBS185Puro
按照Kuroiwa等(如上所述)的方法，使用Cre-loxP系统在人染色体之间进行位点特异性易位。因为预期非同源染色体之间的重组效率即使在该系统中也非常低，所以相信Cre酶应当稳定表达，而不是瞬时表达。因此，构建以下类型的表达载体。
用EcoRI由质粒(其将质粒PGKPuro(由WIHTEHEAD研究所的Peter W.Laird教授提供)中的NotI位点替换为EcoRI位点)中切出PGKPuro片段，将其克隆入Cre重组酶表达载体pBS185(Gibco)的EcoRI位点中(pBS185Puro)。
(2)-2使用Cre-loxP系统将人染色体22的2.5Mb区(HCF2-Igλ-AP000344)位点特异性易位至DT-40杂种克隆的SC20染色体载体
以上述相同的方式，将已用限制酶KprI(Boehringer)线性化的稳定Cre重组酶表达载体pBS185Puro转染入56HT2杂种克隆中，将培养液分至24孔板中，在嘌呤霉素(3μg/ml)存在下进行约2周的选择性培养。由每个孔提取基因组，使用以下两组引物进行嵌套式PCR，以确定SC20染色体载体和人染色体22片段之间是否已发生易位。
PGK-1；5′-ATAGCAGCTTTGCTCCTTCG-3′(SEQ ID NO：13)
GFP-1；5′-TTCTCTCCTGCACATAGCCC-3′(SEQ ID NO：14)
PGK-2；5′-TGTTCTCCTCTTCCTACTCTCC-3′(SEQ ID NO：15)
GFP-2；5′-TGAAGGTAGTGACCAGTGTTGG-3′(SEQ ID NO：16)
使用GeneAmp 9600(由Perkin-Elmer生产)作为热循环仪，使用Ex Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)作为Taq聚合酶进行PCR，并按照推荐的条件使用连接缓冲液和dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。作为首个PCR，于94℃热变性1分钟后，使用PGK-1和GFP-1作为引物，以98℃10秒、61℃30秒和72℃1分钟进行35个循环。使用该反应溶液的一部分作为模板，然后使用PGK-2和GFP-2作为引物，以98℃10秒、59℃30秒和72℃30秒进行35个循环。培养通过PCR发现易位的孔中的细胞混合物，直至细胞数达到107，将混合物悬浮在4ml含加入其中的5％FBS和1μg/ml碘化丙锭(PI)的PBS(磷酸缓冲盐溶液)中，并通过FACS Vantage(Becton Dickinson)进行分析。如Kuroiwa等(如上所述)所报导，当loxP之间发生重组或易位时，GFP基因重构并表达。因此，可通过FACS检测易位细胞。重复两次分选据认为是GFP阳性的细胞组分。每次分选操作后都用含潮霉素B(1mg/ml)的RPMI 1640培养基进行培养。结果将GFP阳性细胞富集至98-99％的纯度。
随后，使用PGK-2和GFP-2作为引物通过PCR验证FACS克隆的GFP阳性克隆(ΔH21)中的loxP之间是否如预期一样发生重组。此外，使用人染色体14特异性探针(罗丹明标记)和人染色体22特异性探针(FITC标记)，对克隆ΔH21进行FISH分析(Kuroiwa等，如上所述)。结果，证实存在其中人染色体22区明显易位至SC20染色体载体(人染色体14片段)的人工染色体。
根据以上结果推断，克隆ΔH21中构建的人类人工染色体ΔHAC其人抗体λ轻链基因区(HCF2-Igλ-AP000344)的2.5Mb外周区域易位并克隆至SC20染色体载体。
保有ΔHAC的小鸡DF-40细胞(ΔHAC)于2001年5月9日保藏于国际专利微生物保藏单位国立高级工业科学与技术研究所(TsukubaCentral 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)，保藏号为FERM BP-7582。
[实施例7]通过将人抗体λ轻链基因区的1.5Mb外周区(AP000553-Igλ-AP000344)易位并克隆至SC20染色体载体制备人类人工染色体ΔΔHAC构建物
在以上的ΔHAC中，在Igλ和HCF2之间仍保留约1Mb的额外区。为了精确去除外染色体区并仅易位和克隆Igλ基因区的外周区域，尝试构建其中1.5Mb的AP000553-Igλ-AP000344区易位和克隆至SC20染色体载体的人类人工染色体ΔΔHAC。
开始时，将实施例5获得的克隆553-2和克隆R进行细胞融合，以产生同时保有人染色体22片段和染色体14片段(SC20染色体载体)的DT-40杂种。
(1)生产同时保有人染色体22片段和SC20染色体载体的DT-40杂种细胞
用含杀稻瘟素S(10μg/ml)的RPMI 1640培养基培养克隆R，并用含潮霉素B(1mg/ml)的RPMI 1640培养基培养克隆553-2。将两种克隆分别以1-2×107的量互相混合并离心，然后用无血清RPMI1640培养基清洗两次。完全去除残余培养基后，渐渐加入于37℃预加热的0.5ml 50％PEG 1500(Boehringer)，使用吸液管剧烈搅拌混合物约2分钟。此后，在1分钟内缓慢加入1ml无血清RPMI 1640培养基，然后在约3分钟内加入9ml无血清RPMI 1640培养基，使混合物在37℃静置10分钟。此后，于1,200rpm离心混合物5分钟，并在含血清的RPMI 1640培养基中培养24-48小时。此后，用含杀稻瘟素S(10μg/ml)和潮霉素B(1mg/ml)的RPMI 1640培养基更换培养基，将培养液分至5个24孔培养板中，接着培养3-4周。由获得的杂种克隆(如克隆553R1)提取基因组DNA，使用和实施例6所用相同的引物进行PCR，以验证保有两种片段，即人染色体14片段和染色体22片段。此外，使用人COT1 DNA作为探针进行FISH分析，结果证实存在互相独立的两种人染色体片段。由以上实验推断，杂种克隆553R1保有两种片段，即人染色体14片段(SC20染色体载体)和染色体22片段。
(2)将人染色体22的1.5Mb区(AP000553-Igλ-AP000344)位点特异性易位至DT-40杂种克隆(553R1)的SC20染色体载体
以和上述相同的方式，将已用限制酶KpnI(Boehringer)线性化的稳定Cre重组酶表达载体pBS185Puro转染入杂种克隆553R1中，将培养液分至12孔板中，在嘌呤霉素(3μg/ml)存在下进行约2周的选择性培养。由每个孔提取基因组，使用以下两组引物进行嵌套式PCR，以确定SC20染色体载体和人染色体22片段之间是否已发生易位。
PGK-1；5′-ATAGCAGCTTTGCTCCTTCG-3′(SEQ ID NO：13)
GFP-1；5′-TTCTCTCCTGCACATAGCCC-3′(SEQ ID NO：14)
PGK-2；5′-TGTTCTCCTCTTCCTACTCTCC-3′(SEQ ID NO：15)
GFP-2；5′-TGAAGGTAGTGACCAGTGTTGG-3′(SEQ ID NO：16)
使用GeneAmp 9600(Perkin-Elmer生产)作为热循环仪，使用ExTaq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)作为Taq聚合酶进行PCR，并按照推荐的条件使用连接缓冲液和dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。作为首个PCR，于94℃热变性1分钟后，使用PGK-1和GFP-1作为引物，以98℃10秒、61℃30秒和72℃1分钟进行35个循环。使用该反应溶液的一部分作为模板，使用PGK-2和GFP-2作为引物，以98℃10秒、59℃30秒和72℃30秒进行35个循环。扩增通过PCR发现易位的孔中的细胞混合物(2种混合物：DDH5、6)，直至细胞数达到107，将混合物悬浮在4ml含加入其中的5％FBS和1μg/ml碘化丙锭(PI)的PBS(磷酸缓冲盐溶液)中，并通过FACS Vantage(Becton Dickinson)进行分析。重复两次分选据认为是GFP阳性的细胞组分。每次分选操作后用含潮霉素B(1mg/ml)的RPMI 1640培养基进行培养。结果将GFP阳性细胞富集至98-99％的纯度。
随后，使用PGK-2和GFP-2作为引物通过PCR验证FACS克隆的GFP阳性克隆(ΔΔH5、6)中的loxP之间是否如预期一样发生重组。此外，使用人染色体14特异性探针(罗丹明标记)和人染色体22特异性探针(FITC标记)，对克隆ΔΔH5、6进行FISH分析(Kuroiwa等，如上所述)。结果，证实两种克隆中都存在其中人染色体22区明显易位至SC20染色体载体(人染色体14片段)的人工染色体。
根据以上结果推断，两种克隆ΔΔH5、6中构建的人类人工染色体ΔΔHAC其人抗体λ轻链基因区(AP000553-Igλ-AP000344)的1.5Mb外周区易位并克隆至SC20染色体载体。
保有ΔΔHAC的小鸡DF-40细胞(ΔΔHAC)于2001年5月9日保藏于国际专利微生物保藏单位国立高级工业科学与技术研究所(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)，保藏号为FERM BP-7581。
[实施例8]含ΔHAC的DT-40杂种细胞和中国仓鼠CHO细胞之间的细胞融合
如Kuroiwa等(如上所述)所报导，首先尝试将构建的HAC导入CHO细胞中，以将构建的HAC导入小鼠ES细胞。但是，含ΔHAC的DT-40杂种细胞ΔH21形成微细胞的能力低，因此通过微细胞法将ΔHAC导入CHO细胞中并不成功(WO 00/10383)。因此，最近尝试通过含ΔHAC的DT-40杂种细胞ΔH21和CHO细胞之间的细胞融合将ΔHAC导入CHO细胞中。
将1-2×107的ΔH21克隆和1×107的CHO细胞混合并离心，然后用无血清DMEM培养基清洗混合物两次。完全去除残余培养基后，渐渐加入于37℃预加热的0.5ml 50％PEG 1500(Boehringer)，使用吸液管剧烈搅拌混合物2分钟。此后，在1分钟内缓慢加入1ml无血清DMEM培养基，然后在约3分钟内加入9ml无血清DMEM培养基，使混合物在37℃静置10分钟。此后，于1,200rpm离心混合物5分钟，并在含血清的F12培养基(Gibco)中培养24小时。此后，用含G418(1mg/ml)和潮霉素B(0.6mg/ml)的f12培养基更换培养基，将培养液分至3个24孔培养板中，接着培养3-4周。
由抗性克隆中提取基因组，以和实施例6相同的方式使用检测VH3和Igλ的引物进行PCR。结果发现2个克隆(D15、ΔC30)为PCR阳性。此外，以和实施例6相同的方式，使用人染色体14特异性探针和人染色体22特异性探针，通过双染色对这两个克隆进行FISH分析，以验证ΔHAC的存在。关于DT40和CHO之间的细胞融合，DT40的大部分染色体丢失，核型和野生型CHO细胞大致相同。这使通过DT40细胞和CHO细胞之间的细胞融合生产保有ΔHAC的CHO细胞最终成为可能。这表明，对于DT40克隆微细胞形成能力低的情况，细胞融合作为一种替代性方法可能有效。
[实施例9]将ΔΔHAC由含ΔΔHAC的DT-40杂种细胞导入CHO细胞
含ΔΔHAC的DT-40杂种克隆ΔΔH5、6的微细胞形成能力并非不足，因此如Kuroiwa等(如上所述)报导使用微细胞法。
用8个T225摇瓶(Sumiron)分别培养DT-40杂种克隆ΔΔH5、6，当摇瓶内容物铺满时，用含加入其中的20％FBS、1％小鸡血清、10-4M2-巯基乙醇和0.05μg/ml秋水仙酰胺的RPMI 1640培养基更换培养基。再培养细胞24小时，以形成微细胞。将细胞悬浮在24ml血清RPMI 1640培养基中，以每份2ml的量分至12个预先用100μg/ml L-细胞溶素包被的25cm2摇瓶中进行离心(Corning)，并于37℃培养1小时。然后使细胞粘附在摇瓶底部。取出培养液，将于37℃预加热的松胞菌素B(10μg/ml，Sigma)溶液注入摇瓶进行离心，以34℃、8000rpm离心1小时。将微细胞悬浮在无血清DMEM培养基中，通过8μm、5μm和3μm滤膜进行纯化。纯化后，以1,700rpm离心微细胞10分钟，并将其悬浮在5ml无血清DMEM培养基中。分别通过胰蛋白酶处理对约107CHO细胞揭皮，用无血清DMEM培养基清洗两次，并悬浮在5ml无血清DMEM培养基中。再以1,700rpm离心微细胞10分钟，将5ml以上的CHO悬浮液轻轻放于其上，不用取出上清液。离心后，取出培养液，加入0.5ml PEG 1500溶液(Boehringer)，并使用吸液管剧烈搅拌混合物2分钟。此后，在约3分钟内缓慢加入10ml无血清DMEM培养基，使混合物在37℃静置10分钟。离心后，将细胞悬浮在含10％FBS(Gibco)的F12培养基中，将其分至5-6个24孔培养板中，接着于37℃培养24小时。此后，用含800μg/mlG418的F12培养基更换培养基，并进行3-4周的选择性培养。
由G418抗性克隆提取基因组DNA，在与上述相同的条件下，使用检测Igλ和VH3的引物和PGK-2及GFP-2引物进行PCR，以鉴定保持ΔΔHAC的CHO克隆(例如ΔΔC10、13)。此外，使用人染色体14特异性探针和人染色体22特异性探针，对通过PCR发现阳性的克隆进行FISH分析，以目测验证ΔΔHAC的存在。根据这些结果推断，获得了保持ΔΔHAC的CHO细胞克隆。
[实施例10]将ΔHAC或ΔΔHAC由CHO细胞导入小鼠ES细胞
为了生产具有ΔHAC或ΔΔHAC的嵌合体小鼠，通过微细胞法将ΔHAC或ΔΔHAC由实施例8或9获得的保有ΔHAC或ΔΔHAC的CHO细胞转导入小鼠ES细胞(野生型TT2F)。
按照Tomizuka等(Nature Genet.16：133，1997)的方法，由保有约108ΔHAC或ΔΔHAC的CHO细胞(D15、ΔΔC10、ΔΔC13等)纯化微细胞，并悬浮在5ml DMEM中。通过胰蛋白酶处理使约107小鼠ES细胞TT2F揭皮，用DMEM清洗三次，并悬浮在5ml DMEM中，将其加入到离心的微细胞中，以1,250rpm离心10分钟。然后彻底去除上清液。通过轻敲使沉淀彻底松软，加入0.5ml 1∶1.4 PEG溶液[5g PEG 1000(Wako Pure Chemicals Industries Ltd.)和1ml DMSO(Sigma)的6ml DMEM溶液]，将混合物彻底搅拌约1.5分钟。此后，缓慢加入10ml DMEM，将混合物于1,250rpm离心10分钟，并悬浮在30ml ES培养基中，将其分至预先装有饲养细胞的3个培养皿(Corning，直径100mm)中，然后进行培养。24小时后用含300μg/mlG418的培养基更换培养基，并进行约1周的选择性培养。
结果，使用检测Igλ和VH3的引物通过PCR从D15克隆(保有ΔHAC)中发现14个阳性克隆，从ΔΔC10(保有ΔΔHAC)中发现8个阳性克隆，从ΔΔC13(保有ΔΔHAC)中发现8个阳性克隆。此外，由使用人COT1 DNA探针(Tomizuka等，Nature Genet.16：133，1997)的FISH分析结果证实，存在可用COT1探针特异性检测的ΔHAC和ΔΔHAC。
根据以上结果推断，由保有ΔHAC的TT2F细胞中获得14个克隆，而从保有ΔΔHAC的TT2F细胞中获得16个克隆。
[实施例11]生产具有人类人工染色体ΔHAC和ΔΔHAC的嵌合体小鼠
按照Tomizuka等(Nature Genet.，16：133，1997)的方法，使用实施例10获得的ES细胞克隆生产嵌合体小鼠。使用MCH(ICR)(白色，购自CLEA Japan，Inc.)或通过抗体重链剔除小鼠雌雄杂交获得的8细胞期胚胎(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)作为宿主。根据其毛色可确定通过将注射胚胎移植入代孕母亲获得的后代小鼠是否为嵌合体。将野生型TT2F/ΔHAC克隆(实施例10获得的TΔ#6)注射入400个胚胎中，并将注射胚胎移植入代孕母亲。结果生育了7只嵌合体小鼠(按毛色的咖啡色部分识别)。更具体地说，其显示了保有人类人工染色体ΔHAC的ES细胞株(TT2F)具有形成嵌合体的能力，即具有分化为小鼠个体正常组织的能力。
以和上述相同的方式，将实施例10获得的野生型TT2F/ΔΔHAC克隆(TΔΔ#21)注射入180个胚胎中，并将注射胚胎移植入代孕母亲。结果生育了2只嵌合体小鼠(按毛色的咖啡色部分识别)。其中一只为嵌合程度约100％的个体，即基本观察不到白色部分。更具体地说，其显示了保有人类人工染色体ΔΔHAC的ES细胞株(TT2F)具有形成嵌合体的能力，即具有分化为小鼠个体正常组织的能力。
[实施例12]在由保有人类人工染色体ΔHAC和ΔΔHAC的ES细胞生产的嵌合体小鼠体细胞中保持人工染色体
通过Tomizuka等(Nature Genet.，16：133，1997)报导的方法由TT2F/ΔHAC克隆(TΔ#6)(嵌合程度约85％)在实施例11生产的嵌合体小鼠，由其尾部制备基因组DNA，并以和上述相同的方式，使用检测Igλ和VH3的引物进行PCR，以检查ΔHAC的保持情况。结果发现对两种引物都呈阳性，证实嵌合体小鼠体细胞保持ΔHAC。收集嵌合体小鼠(嵌合程度约85％)和另一只由TΔ#6生产的嵌合体小鼠(嵌合程度约90％)的血清，通过ELISA检测人μ链和人λ链蛋白的表达(Tomizuka等，Nature Genet.，16：133，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)。结果两只嵌合体小鼠的人μ链和λ链都是阳性。
同样，发现得自由保有ΔΔHAC的ES细胞克隆(TΔΔ#21)生产的嵌合体小鼠(嵌合程度约100％，实施例11)尾部的DNA对以上两种引物都呈阳性，证实保持ΔΔHAC。此外，和以上类似的ELISA分析表明，具有ΔΔHAC的嵌合体小鼠血清中人μ链和λ链都为阳性。
得自保有λHAC的ES细胞的具有λHAC的嵌合体小鼠的嵌合程度最大约为80％，但是，由ΔHAC获得嵌合程度约85％和90％的嵌合体小鼠，由ΔΔHAC获得嵌合程度约100％的嵌合体小鼠。使用高嵌合程度小鼠可导致保有导入染色体的ES细胞高效分化为生殖细胞并遗传传递导入的染色体。即预期使用ΔHAC和ΔΔHAC可增强小鼠中含抗体免疫球蛋白λ链基因的人染色体22片段的遗传传递效率。
[实施例13]由具有人类人工染色体ΔHAC和ΔΔHAC的嵌合体小鼠遗传传递人工染色体
使实施例11由TT2F/ΔHAC克隆(TΔ#6)生产的嵌合体雌性小鼠(嵌合程度约85％)与雄性小鼠MCH(ICR)(白色，购自CLEA Japan，Inc.)杂交。在由所述嵌合体小鼠生育的10只后代小鼠中，4只毛色为咖啡色，表明保持了来自ES细胞的显性基因型。即发现ES细胞株和保有ΔHAC的TΔ#6在嵌合体雌性小鼠中分化为功能性卵细胞。将4只咖啡色后代小鼠的尾部切除一部分，由样品制备基因组DNA。以和上述相同的方式使用检测Igλ和VH3的引物对获得的DNA进行PCR。由对ΔHAC保持的检查结果可知，发现全部4只小鼠对两种引物都呈阳性，证实嵌合体小鼠后代保持ΔHAC。此外，收集4只小鼠中3只的血清，通过ELISA检测人μ链和人λ链的表达情况(Tomizuka等，Nature Genet.，16：133，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)。结果发现所检测的全部3只小鼠人μ链和λ链都呈阳性。以相同方式表明实施例11的克隆TT2F/ΔΔHAC生产的嵌合体小鼠遗传传递ΔΔHAC。
在分别具有并遗传传递ΔHAC或ΔΔHAC的小鼠品系中，通过对尾部制备的成纤维细胞进行ELISA分析等检测每种HAC的稳定保持情况。结果显示所述小鼠品系体细胞稳定保持每种HAC。
在具有并遗传传递ΔHAC或ΔΔHAC的小鼠品系中，通过ELISA等证实由人Igλ链/重链组成的全人抗体分子的表达情况。此外，使分别具有并遗传传递ΔHAC或ΔΔHAC的小鼠品系与缺失内源抗体重链和轻链κ基因的小鼠品系反复杂交，由此获得具有每种HAC并根据内源抗体重链和κ链基因缺失为同源的小鼠品系。这些小鼠品系主要生产含人Ig重链和λ链的全人抗体。
[实施例14]构建同时表达人免疫球蛋白重链、轻链λ和轻链κ的小鼠品系
通过以下品系(A)和品系(B)之间的杂交可生产一种小鼠品系，其同时生产人Ig重链、κ轻链和λ轻链，并生产主要由含人Ig重链和κ轻链或λ轻链的分子组成的抗体。
(A)TC(ΔHAC)，一种具有并遗传传递ΔHAC的小鼠品系，或TC(ΔΔHAC)，一种具有并遗传传递ΔΔHAC的小鼠品系(参见实施例13)。
(B)TC(W23)/ΔH/Δκ，一种内源抗体重链和κ链基因缺失的纯合子小鼠品系，其携带并遗传传递染色体2的W23片段(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)。
通过实施例13描述的方法和Tomizuka等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)的报导分析品系(A)和品系(B)之间杂交获得的后代小鼠。该杂交获得的全部后代小鼠都是内源抗体重链缺失和κ链缺失的杂合子，由其中选择具有ΔHAC(或ΔΔHAC)的个体和具有W23片段的个体，使其与其它所获后代杂交。最后选择为内源抗体重链缺失和κ链缺失的纯合子并同时具有ΔHAC(或ΔΔHAC)和片段W23的个体(品系(D))。
通过Tomizuka等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)的报导和(WO 98/37757)描述的方法证实品系(D)表达人免疫球蛋白重链、κ链和λ链。
[实施例15]构建具有ΔHAC并且内源Ig重链和κ轻链基因等位基因同时破坏的小鼠品系
使实施例13生产的TC(ΔHAC)与Tomizuka等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)的报导所描述的内源Ig重链和κ轻链剔除小鼠品系回交。通过PCR和ELISA分析所获得的小鼠个体的基因型(参见实施例12和Tomizuka等的报告)。
结果，获得具有ΔHAC、为内源Ig重链剔除纯合子和内源Igκ链剔除纯合子的个体(后文称之为“TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ”)。
在两只TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ个体(8周龄)的血清中，通过Tomizuka等(Nature Biotechnol.，18：1086-，2000)的报告所描述的ELISA分析人Ig重链和λ链蛋白的表达情况。结果，每只小鼠的表达水平如下：人Igμ链：430μg/ml、Igγ链：180μg/ml、Igλ链：330μg/ml；以及人Igμ链：720μg/ml、Igγ链：320μg/ml、Igλ链：520μg/ml。
[实施例16]构建具有含ΔHAC和人Igκ链基因的人染色体2片段并且内源Ig重链和κ链基因的等位基因同时破坏的小鼠品系
通过使具有含人Igκ链基因的人染色体2片段(hCF(W23))以及Tomizuka等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)的报告所描述的内源Ig重链和κ链剔除小鼠的遗传背景的小鼠品系(后文称之为“TC(W23)/ΔH/Δκ”)和实施例15生产的TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ品系杂交获得小鼠个体，以和实施例15相同的方式分析其基因型。
结果，获得的个体同时具有ΔHAC和hCF(W23)，并且是内源Ig重链剔除的纯合子和内源Igκ链剔除的纯合子(后文称之为“TC(ΔHAC)/TC(W23)/ΔH/Δκ”)。
此外，可如Tomizuka等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷，722-727，2000)的报告和Kuroiwa等(Nature Biotechnol.，18：1086-，2000)的报告所述，通过ELSIA分析TC(ΔHAC)/TC(W23)/ΔH/Δκ个体的血清。由此分别检测人Igμ链、γ链、λ链和κ链蛋白的表达情况。
[实施例17]构建具有含ΔHAC和人Igκ链基因的酵母人工染色体并且内源Ig重链和κ链基因的等位基因同时破坏的小鼠品系
通过使具有含人Igκ链基因(KCo5：含大约40％的人κ轻链基因可变区)的转基因以及Fishwild等(Nature Biotechnol.，14：845-851，1996)的报告所描述的内源Ig重链和κ链剔除小鼠的遗传背景的小鼠品系[得自Medarex，U.S.A.，后文称之为“Kco5/ΔH/Δκ”]和实施例15生产的TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ品系杂交获得小鼠个体，以和实施例15相同的方式通过PCR和ELISA分析其基因型。
结果，获得的个体同时具有ΔHAC和KCo5，并且是内源Ig重链剔除的纯合子和内源Igκ链剔除的纯合子(后文称之为“TC(ΔHAC)/KCo5/ΔH/Δκ”)。
保有酵母人工染色体或由转基因KCo5组成的质粒的微生物保藏于ATCC(U.S.A.)。保藏号如下。保有酵母人工染色体y17的酵母：ATCC PTA-3842号，保有质粒pKV4的大肠杆菌：ATCC PTA-3843号，保有质粒pKCIB的大肠杆菌：ATCC PTA-3844号。
以和实施例16相同的方式，通过ELISA分析TC(ΔHAC)/KCo5/ΔH/Δκ个体的血清，由此检测人Igμ链、γ链、λ链和κ链蛋白。所测定的3只个体的γ链平均值高于μ链平均值。
[实施例18]以小鼠品系TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ生产抗G-CSF抗体
用人G-CSF免疫接种实施例15生产的2只TC(ΔHAC)/ΔH/Δκ小鼠个体。使用TiterMaxGold(CytRx)作为佐剂。首先，用总共37.5μg人G-CSF在三个不同部位皮下免疫接种。然后，分别在首次免疫接种后第14天和38天，同首次免疫接种一样，以总共10μg在三个不同部位皮下进行第2次和第3次免疫接种。首次免疫接种后第48天，通过静脉注射10μg没有任何佐剂的G-CSF进行最后一次免疫接种。在最后一次免疫接种后3天进行抽血，并如Kuroiwa等(NatureBiotechnol.，18：1086-，2000)的报告所述，通过ELSIA检测血清中抗G-CSF人IgG抗体和人Igλ抗体的效价。结果，在2只个体中都观察到抗人G-CSF人IgG抗体和人Igλ抗体效价高。
此外，通过ELISA筛选经融合免疫个体小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞所获得的杂交瘤(Ando，Chiba，“Tan-kurohn Koutai JikkenSousa Nyuumon(单克隆抗体实验和操作指引)，”Kodansha Scientific，1991)，可获得生产含人Ig重链和轻链λ的全人单克隆抗体的杂交瘤。
[实施例19]以小鼠品系TC(ΔHAC)/TC(W23)/ΔH/Δκ生产抗G-CSF抗体
以和实施例18相同的方式，用人G-CSF免疫接种实施例15生产的TC(ΔHAC)/TC(W23)/ΔH/Δκ小鼠个体。通过ELISA检测该小鼠血清中抗G-CSF人IgG抗体、人Igλ抗体和人Igκ抗体的效价，以证实抗人G-CSF人IgG抗体、人Igλ抗体和人Igκ抗体效价升高。
以和实施例18相同的方式，通过融合免疫个体小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞，可进一步获得生产含人Ig重链和λ轻链或κ轻链的全人单克隆抗体的杂交瘤。
[实施例20]以小鼠品系TC(ΔHAC)/KCo5/ΔH/Δκ生产抗G-CSF抗体
以和实施例18相同的方式，用人G-CSF免疫接种实施例15生产的TC(ΔHAC)/KCo5/ΔH/Δκ小鼠个体，通过ELISA检测血清中抗G-CSF人IgG抗体、人Igλ抗体和人Igκ抗体的效价。结果证实抗人G-CSF人IgG抗体、人Igλ抗体和人Igκ抗体的效价升高。
以和实施例18相同的方式，通过融合免疫个体小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞，进一步获得生产含人Ig重链和λ轻链或κ轻链的全人单克隆抗体的杂交瘤。
本文引用的所有公开出版物、专利和专利申请都在此整体引作参考。
工业适用性
本发明提供一种人类人工染色体，其保有人抗体重链和λ轻链基因的全部区域，并可高效遗传传递至下一代。本发明还提供高效遗传传递所述人类人工染色体至下一代的非人动物及其后代。此外，本发明还能够生产人抗体。
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            序列表
<11O>Kirin Beer Kabushiki Kaisha
<120>含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体和保有可传递给后代的人类人工染色体的非人动物
<130>PH-1574-PCT
<150>JP 2001-142371
<151>2001年5月11日
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权利要求书
(按照条约第19条的修改)
1.一种人类人工染色体，其中含人染色体22来源的抗体λ轻链基因的约3.5Mb至约1Mb区域结合至通过非人动物种系可传递至后代的染色体片段，所述染色体片段得自另一个人染色体。
2.权利要求1的人类人工染色体，其中所述得自另一个人类染色体的染色体片段为人染色体14的片段。
3.权利要求2的人类人工染色体，其中所述人染色体14的片段为SC20染色体载体。
4.权利要求1-3任一项的人类人工染色体，其中含人染色体22来源的抗体λ轻链基因的区域长度为约2.5Mb至约1.5Mb。
5.权利要求1-3任一项的人类人工染色体，其中含人染色体22来源的抗体λ轻链基因的区域长度为约2.5Mb。
6.权利要求5的人类人工染色体，其是保藏号为FERM BP-7582的细胞所保持的ΔHAC。
7.权利要求1-3任一项的人类人工染色体，其中含人染色体22来源的抗体λ轻链基因的区域长度为约1.5Mb。
8.权利要求7的人类人工染色体，其是保藏号为FERM BP-7581的细胞所保持的ΔΔHAC。
9.一种非人动物，其具有权利要求1-8任一项的人类人工染色体。
10.权利要求9的非人动物，其具有ΔHAC或ΔΔHAC。
11.权利要求9或10的非人动物，其为哺乳动物。
12.权利要求11的非人动物，其中所述哺乳动物为小鼠。
13.一种生产权利要求9-12任一项的非人动物的方法，该方法包括：通过微细胞法将权利要求1-8任一项的人类人工染色体引入所述非人动物的胚胎干细胞(ES细胞)中；将获得的ES细胞注射入所述非人动物的胚胎；将产生的注射胚胎移植入代孕母亲；由代孕母亲分娩获得嵌合体非人动物；以及筛选具有所述人类人工染色体的嵌合体非人动物。
14.权利要求13的方法，其还包括生产所筛选的嵌合体非人动物的后代，并筛选具有所述人类人工染色体的后代。
15.权利要求13或14的方法，其中所述非人动物能够表达人抗体免疫球蛋白重链和λ链蛋白。
16.权利要求13-15任一项的方法，其中所述非人动物为哺乳动物。
17.权利要求16的方法，其中所述哺乳动物为小鼠。
18.具有权利要求1-8任一项的人类人工染色体的非人动物，其为通过权利要求13-17任一项的方法获得的非人动物。
19.权利要求9-12和18任一项的非人动物的后代动物，其具有权利要求1-8任一项的人类人工染色体。
20.权利要求19的后代动物，其可表达人抗体免疫球蛋白重链和λ轻链蛋白。
21.权利要求19的后代动物，其可表达人抗体免疫球蛋白重链、κ轻链和λ轻链蛋白。
22.权利要求19-21任一项的后代动物，其为小鼠。
23.一种生产抗体的方法，该方法包括：用目标抗原免疫接种权利要求9-12和18任一项的非人动物或权利要求19-22任一项的后代动物；以及由所述动物获得抗所述抗原的人多克隆抗体。
24.权利要求23的方法，其中所述人多克隆抗体得自所述动物的血液。
25.一种生产抗体的方法，该方法包括：用目标抗原免疫接种权利要求12或18的小鼠或权利要求22的后代小鼠；由所述小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤；以及生产由人免疫球蛋白重链和轻链组成的抗所述抗原的人单克隆抗体。
26.一种生产抗体的方法，该方法包括：用目标抗原免疫接种权利要求12或18的小鼠或权利要求22的后代小鼠；由所述小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤；由所述杂交瘤分离人抗体基因；将所述人抗体基因导入动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞；在能够表达人抗体基因的条件下培养所述细胞；以及生产由人免疫球蛋白重链和轻链组成的抗所述抗原的人单克隆抗体。
27.一种生产抗体的方法，该方法包括：用目标抗原免疫接种权利要求12或18的小鼠或权利要求22的后代小鼠；通过噬菌体展示方法选择小鼠B细胞的抗体基因；将选定的人抗体基因导入动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞；在能够表达人抗体基因的条件下培养所述细胞；以及生产由人免疫球蛋白重链和轻链组成的抗所述抗原的人单克隆抗体。
28.一种生产人抗体的小鼠，其具有未重排的人抗体重链基因座、未重排的人抗体κ轻链基因座和未重排的人抗体λ轻链基因座，至少内源抗体重链和κ轻链的两种等位基因都破坏或失活，并在血清中表达含人抗体Igγ同种型的人抗体重链、人抗体κ轻链和人抗体λ轻链。
29.权利要求28的生产人抗体的小鼠，其具有至少40％的人抗体κ轻链可变区。
30.权利要求28的生产人抗体的小鼠，其具有人抗体重链、人抗体κ轻链和人抗体λ轻链的全部可变区。
31.权利要求28的生产人抗体的小鼠，其中人抗体重链基因座、人抗体κ轻链基因座和人抗体λ基因座保持在人源染色体片段上。
32.权利要求28的生产人抗体的小鼠，其中所述人抗体重链基因座和人抗体λ轻链基因座保持在ΔHAC或ΔΔHAC上。
33.权利要求28的生产人抗体的小鼠，其中所述人抗体κ轻链基因座保持在人源染色体片段上。
34.权利要求28的生产人抗体的小鼠，其中所述人抗体κ轻链基因座插入小鼠染色体中。
35.权利要求28的生产人抗体的小鼠，其不是嵌合体小鼠。
36.一种生产人抗体的小鼠，其具有：(a)未重排的人抗体重链基因座；(b)未重排的人抗体κ轻链基因座和(c)未重排的人抗体λ轻链基因座，其中(a)、(b)和(c)中的至少一种保持在人源染色体片段上，(a)、(b)和(c)中的至少一种插入小鼠染色体中，而且其中至少内源重链的两种等位基因和内源κ轻链的两种等位基因失活，并且所述小鼠在其血清中表达人抗体重链、人抗体κ轻链和人抗体λ轻链。
37.权利要求36的生产人抗体的小鼠，其中所述小鼠具有保持在人源染色体片段上的未重排人抗体重链基因座、插入小鼠染色体中的未重排人抗体κ轻链基因座和人源染色体片段上的人抗体λ轻链基因座。
38.权利要求36的生产人抗体的小鼠，其中所述人抗体重链基因座保持在人源染色体片段上。
39.权利要求38的生产人抗体的小鼠，其中所述人抗体重链基因座保持在ΔHAC或ΔΔHAC上。
40.权利要求36的生产人抗体的小鼠，其中所述人抗体λ轻链基因座保持在人源染色体片段上。
41.权利要求40的生产人抗体的小鼠，其中所述人抗体λ轻链基因座保持在ΔHAC或ΔΔHAC上。
42.权利要求36的生产人抗体的小鼠，其中所述人抗体κ轻链基因座插入到小鼠染色体中。
43.权利要求42的生产人抗体的小鼠，其中所述人抗体κ转基因KCo5插入到小鼠染色体中。
44.权利要求36的生产人抗体的小鼠，其中所述人抗体重链基因座和λ轻链基因座保持在ΔHAC或ΔΔHAC上，而人抗体κ转基因KCo5插入到小鼠染色体中。
45.权利要求36的生产人抗体的小鼠，其中所述小鼠不是嵌合体小鼠。
46.一种生产抗体的方法，该方法包括：免疫接种权利要求36-45任一项的小鼠，并由所述小鼠获得多克隆抗体。
47.权利要求46的方法，其中所述多克隆抗体得自所述小鼠的血液。
48.一种生产抗体的方法，该方法包括：用目标抗原免疫接种权利要求36-45任一项的小鼠；通过融合小鼠骨髓瘤细胞和所述小鼠来源的脾细胞产生杂交瘤；以及生产包含人免疫球蛋白重链和轻链的抗所述抗原的单克隆抗体。
49.一种生产抗体的方法，该方法包括：用目标抗原免疫接种权利要求36-45任一项的小鼠；通过融合小鼠骨髓瘤细胞和所述小鼠来源的脾细胞产生杂交瘤；由所获得的杂交瘤分离至少人抗体基因可变区；将所述人抗体基因导入动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞；在能够表达所述人抗体基因的条件下培养所述细胞；以及生产至少包含人免疫球蛋白重链和轻链的可变区的抗所述抗原的单克隆抗体。
50.一种生产抗体的方法，该方法包括：用目标抗原免疫接种权利要求36-45任一项的小鼠；通过噬菌体展示方法至少选择所述小鼠B细胞的人抗体基因可变区；将所述选定的人抗体基因导入动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞；在能够表达所述人抗体基因的条件下培养所述细胞；以及生产至少包含人免疫球蛋白重链和轻链可变区的抗所述抗原的单克隆抗体。

Claims (35)

1.一种人类人工染色体，其中含人染色体22来源的抗体λ轻链基因的约3.5Mb至约1Mb区域结合至通过非人动物种系可传递至后代的染色体片段，所述染色体片段得自另一个人类染色体。
2.权利要求1的人类人工染色体，其中所述得自另一个人类染色体的染色体片段为人染色体14的片段。
3.权利要求2的人类人工染色体，其中所述人染色体14的片段为SC20染色体载体。
4.权利要求1-3任一项的人类人工染色体，其中含人染色体22来源的抗体λ轻链基因的区域长度为约2.5Mb至约1.5Mb。
5.权利要求1-3任一项的人类人工染色体，其中含人染色体22来源的抗体λ轻链基因的区域长度为约2.5Mb。
6.权利要求5的人类人工染色体，其是保藏号为FERM BP-7582的细胞所保持的ΔHAC。
7.权利要求1-3任一项的人类人工染色体，其中含人染色体22来源的抗体λ轻链基因的区域长度为约1.5Mb。
8.权利要求7的人类人工染色体，其是保藏号为FERM BP-7581的细胞所保持的ΔΔHAC。
9.一种非人动物，其具有权利要求1-8任一项的人类人工染色体。
10.权利要求9的非人动物，其具有ΔHAC或ΔΔHAC。
11.权利要求9或10的非人动物，其为哺乳动物。
12.权利要求11的非人动物，其中所述哺乳动物为小鼠。
13.一种生产权利要求9-12任一项的非人动物的方法，该方法包括：通过微细胞法将权利要求1-8任一项的人类人工染色体引入所述非人动物的胚胎干细胞(ES细胞)中；将获得的ES细胞注射入所述非人动物的胚胎；将产生的注射胚胎移植入代孕母亲；由代孕母亲分娩获得嵌合体非人动物；以及筛选具有所述人类人工染色体的嵌合体非人动物。
14.权利要求13的方法，其还包括生产所筛选的嵌合体非人动物的后代，并筛选具有所述人类人工染色体的后代。
15.权利要求13或14的方法，其中所述非人动物能够表达人抗体免疫球蛋白重链和λ链蛋白。
16.权利要求13-15任一项的方法，其中所述非人动物为哺乳动物。
17.权利要求16的方法，其中所述哺乳动物为小鼠。
18.具有权利要求1-8任一项的人类人工染色体的非人动物，其为通过权利要求13-17任一项的方法获得的非人动物。
19.权利要求9-12和18任一项的非人动物的后代动物，其具有权利要求1-8任一项的人类人工染色体。
20.权利要求19的后代动物，其可表达人抗体免疫球蛋白重链和λ轻链蛋白。
21.权利要求19的后代动物，其可表达人抗体免疫球蛋白重链、κ轻链和λ轻链蛋白。
22.权利要求19-21任一项的后代动物，其为小鼠。
23.一种生产抗体的方法，该方法包括：用目标抗原免疫接种权利要求9-12和18任一项的非人动物或权利要求19-22任一项的后代动物；以及由所述动物获得抗所述抗原的人多克隆抗体。
24.权利要求23的方法，其中所述人多克隆抗体得自所述动物的血液。
25.一种生产抗体的方法，该方法包括：用目标抗原免疫接种权利要求12或18的小鼠或权利要求22的后代小鼠；由所述小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤；以及生产由人免疫球蛋白重链和轻链组成的抗所述抗原的人单克隆抗体。
26.一种生产抗体的方法，该方法包括：用目标抗原免疫接种权利要求12或18的小鼠或权利要求22的后代小鼠；由所述小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤；由所述杂交瘤分离人抗体基因；将所述人抗体基因导入动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞；在能够表达人抗体基因的条件下培养所述细胞；以及生产由人免疫球蛋白重链和轻链组成的抗所述抗原的人单克隆抗体。
27.一种生产抗体的方法，该方法包括：用目标抗原免疫接种权利要求12或18的小鼠或权利要求22的后代小鼠；通过噬菌体展示方法选择小鼠B细胞的抗体基因；将选定的人抗体基因导入动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞；在能够表达人抗体基因的条件下培养所述细胞；以及生产由人免疫球蛋白重链和轻链组成的抗所述抗原的人单克隆抗体。
28.一种生产人抗体的小鼠，其具有未重排的人抗体重链基因座、未重排的人抗体κ轻链基因座和未重排的人抗体λ轻链基因座，至少内源抗体重链和κ轻链的两种等位基因都破坏或失活，并在血清中表达含人抗体Igγ同种型的人抗体重链、人抗体κ轻链和人抗体λ轻链。
29.权利要求28的生产人抗体的小鼠，其具有至少40％的人抗体κ轻链可变区。
30.权利要求28的生产人抗体的小鼠，其具有人抗体重链、人抗体κ轻链和人抗体λ轻链的全部可变区。
31.权利要求28的生产人抗体的小鼠，其中人抗体重链基因座、人抗体κ轻链基因座和人抗体λ轻链基因座保持在人源染色体片段上。
32.权利要求28的生产人抗体的小鼠，其中所述人抗体重链基因座和人抗体λ轻链基因座保持在ΔHAC或ΔΔHAC上。
33.权利要求28的生产人抗体的小鼠，其中所述人抗体κ轻链基因座保持在人源染色体片段上。
34.权利要求28的生产人抗体的小鼠，其中所述人抗体κ轻链基因座插入小鼠染色体中。
35.权利要求28的生产人抗体的小鼠，其不是嵌合体小鼠。
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