CN1173039C - 突变型loxP序列及其应用 - Google Patents

突变型loxP序列及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN1173039C
CN1173039C CNB988127237A CN98812723A CN1173039C CN 1173039 C CN1173039 C CN 1173039C CN B988127237 A CNB988127237 A CN B988127237A CN 98812723 A CN98812723 A CN 98812723A CN 1173039 C CN1173039 C CN 1173039C
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
sequence
gene
loxp sequence
mutant loxp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CNB988127237A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1283233A (zh
Inventor
ի����
斋藤泉
田中启二
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Pharma Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Chemical Co Ltd filed Critical Sumitomo Chemical Co Ltd
Publication of CN1283233A publication Critical patent/CN1283233A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1173039C publication Critical patent/CN1173039C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Abstract

通过使用本发明中的具有以下(a)～(c)性质的突变型loxP序列，在以动物细胞为首的高等真核细胞中可以高效地进行基因插入或基因置换。(a)由在来自大肠杆菌P1噬菌体的下述的野生型loxP序列中，中央部分的8个碱基(间隔区)的第2个(T)、第3个(G)、第4个(T)或第5个(A)碱基中至少有一个碱基以及第6个(T)或第7个(G)碱基中至少有一个碱基被置换为不同的碱基，而间隔区以外的区域即便被任意碱基置换也允许的序列构成的序列，(b)即使在重组酶Cre存在下与野生型loxP序列之间也不发生特异性DNA重组反应，(c)在重组酶Cre存在下，与具有同一序列的另一突变型loxP序列之间能发生特异性DNA重组反应。(见右式)

Description

突变型loxP序列及其应用
技术领域
本发明是有关突变型loxP序列及其应用的发明。详细地讲是关于与野生型loxP序列不会发生特异的重组反应，但在突变型之间会发生特异重组反应的突变型loxP序列以及用该突变型loxP序列进行的基因的置换方法的发明。
背景技术
在动物病毒或高等真核细胞的动物细胞染色体的特定部位插入任意的基因、或者是使特定的基因缺失并不容易。例如作为在动物细胞的染色体的特定部位插入基因的方法一般使用的方法是：用将与希望插入目的基因的染色体的部位有相同序列的DNA结合在目的基因两侧的质粒DNA等转化细胞，通过同源重组获得插入了目的基因的细胞。然而同源重组的频率非常低，由于需要与目的基因一起同时整合抗药性基因等，通过药物进行筛选，到获得目的细胞为止需要数个月的时间。而插入了目的基因的重组动物病毒的制备比上述细胞染色体的情况多少简便些，即使这样例如制备腺病毒时，需要使用插入了目的基因的质粒等进行同源重组，然后使重组的病毒克隆以及筛选和使其增殖(Bett等，国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.)，Vol.91，8802-8806(1994)；Miyake等，Proc.Natl.Acad.Sci.Vol.93，1320-1324(1996))。
象上述那样在动物细胞的染色体的特定部位的基因操作或重组病毒制备的困难的原因之一是使用了频率低的同源重组。与此相反如果象在质粒或噬菌体制备中使用的限制酶那样能够使用特异识别DNA序列的酶，有指望提高效率，例如来自噬菌体P1的重组酶Cre就是那样的酶。
Cre是识别特定碱基序列(loxP序列)、在该序列之间切断DNA链、进行链的交换和重结整个过程的特异的DNA重组酶(Sternberg等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，Vol.150，467-486(1981)、Abremski等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，Vol.259，1509-1514(1984)、Hoess等，Proc.Natl.Acsd.Sci.，Vol.81，1026-1029(1984))。就是说在同一DNA分子上存在同方向的2个loxP序列时，夹在两个序列之间的DNA序列被切除变成环状分子(切除反应)，与此相反在不同的DNA分子上存在2个loxP序列，其中一个序列是环状DNA时，借助于loxP序列，环状DNA被插入到另一个DNA分子上(插入反应)。Cre以及loxP序列虽然是在噬菌体中被发现的，但特异的DNA重组反应不仅在原核细胞，即使在作为真核细胞的动物细胞或动物病毒也能发挥作用。作为切除反应的例子可举出动物培养细胞(Sauer等，核酸研究(NucleicAcids Res.)，Vol.17，147-161(1989)、Kanegae等，基因(Gene)，Vol.181，207-212(1996))、动物病毒(Sauer等，Proc.Natl.Acsd.Sci.，Vol.85，5166-5170(1988)、Anton等，病毒学杂志(J.Virol).，Vol.69，4600-4606(1995)、Kanegae等，Nucleic AcidsRes.，Vol.23，3816-3821(1995))、转基因小鼠(Lakso等，Proc.Natl.Acsd.Sci.，Vol.89，6232-6236(1992)、Orban等，Proc.Natl.Acsd.Sci.，Vol.89，6861-6865(1992)、Gu等，细胞(Cell)，Vol.73，1155-1164(1993)、Gu等，科学(Science)，Vil.265，103-106(1994))等例子。
另外如果利用插入反应，在已经存在loxP序列的动物细胞的染色体或病毒基因组中插入任意的基因虽是可能的，但其频率非常低(Fukushige等，Proc.Natl.Acsd.Sci.，Vol.89，7905-7909(1992)、Sauer等，Proc、Natl Acad Sci.Vol.84，9108-9112(1987))，不能实际应用。原因是插入反应和切除反应是可逆的，如果由于插入反应在同一DNA分子上存在2个loxP序列的话，也会立即发生切除反应，而且反应的平衡明显地偏向切除反应一侧。
为了提高该插入反应的频率，尝试使用序列与原来的loxP序列(野生型)的碱基序列不同的loxP序列(突变型)。loxP序列是由34个碱基的DNA序列构成的，夹在两个13个碱基的反向重复序列(invertedrepeat)之间的8碱基序列称之间隔区域，已知DNA的重组在间隔区内进行(Hoess等，J.Mol，Biol.，Vol，181，351-362(1985))。
                  loxP序列(34bp)
Figure C9881272300081
                  12345678
5’-ATAACTTCGTATA    ATGTATGC   TATACGAAGTTAT-3’
3’- TATTGAAGCATAT  TACATACG  ATATGCTTCAATA-5’
反向重复序列(13bp)间隔区域(8bp)反向重复序列(13bp)
该间隔区的第7个碱基由G(鸟嘌呤)置换为A(腺嘌呤)的loxP序列(突变型loxP序列)与野生型loxP序列之间不会发生特异的DNA重组反应，但在两个突变型loxP序列之间能发生特异的DNA重组反应(Hoess等，Nucleic Acids Res.，Vol.14，2287-2300(1986))。
另外还进行了将存在于某一DNA分子的突变型loxP序列和野生型loxP序列之间的基因插入到存在于其它DNA分子上的突变型loxP序列和野生型loxP序列之间或进行置换的尝试。例如质粒载体上的基因与噬菌体上的基因的置换(Waterhouse等，Nucleic AcidsRes.，Vol.21，2265-2266(1993))、噬菌体载体上的基因插入质粒载体(Tsurushita等，Gene，Vol.172，59-63(1996)、质粒载体上的基因与动物细胞染色体上的基因的置换(Bethke等，Nucleic AcidsRes.，Vol.25，2828-2834(1997))等。
但是这些尝试中只有一种突变型loxP序列、即间隔区的第7个碱基由G(鸟嘌呤)置换为A(腺嘌呤)的loxP序列(突变型loxP序列)可使用，由于该序列的突变型loxP序列与野生型loxP序列不会发生重组反应，但是否合适还不太清楚。而上述3种尝试由于都使用了插入抗药性基因，或与目的基因一起插入抗药性基因，而且只有具有产生目的的重组DNA分子的重组体才能获得抗药性并能被扩增的实验体系，由于loxP序列的变异不充分时，会与野生型loxP序列发生反应，即使实际的基因插入(基因置换)的效率低下，但由于药物选择的倾向性，直观上反应效率显示高的可能性是存在的。
实际上如果使用本发明者设计的直接的且定量的测定方法可以确认第7个碱基由G置换为A的突变型loxP序列与野生型loxP序列之间发生的重组反应的频率大约为5％，loxP序列的变异是不充分的。
因此若用以前的技术使用突变型loxP序列和野生型loxP序列，虽然对存在于动物细胞染色体上的基因进行基因置换的技术设计了各种方案并实施，但其效率并不那么高。
发明的公开
本发明的目的是提供突变型loxP序列，在重组酶Cre存在下，其与野生型loxP序列不发生重组反应，但会使同一序列的2个突变型loxP序列间的重组反应会以与2个野生型loxP序列间的反应同等程度的效率发生。而且本发明的目的还在于提供通过野生型loxP序列和突变型loxP序列、或不同序列的突变型loxP序列的组合，能够在以动物细胞为首的高等真核细胞中高效地进行基因插入或置换的方法，该方法可应用于向动植物细胞导入基因、重组病毒的制备、动植物个体中的基因操作等。
本发明制备了就loxP序列的间隔区的所有8个碱基中可能置换了1个碱基的突变型loxP序列，通过使用非常灵敏的测定方法对反应性进行试验，研究在2个loxP序列间的依赖于重组酶Cre的重组反应机制，找出了反应必需的碱基序列。依据这种认识，发现了虽然在同一序列的2个突变型loxP序列间能够以与2个野生型loxP序列间同等程度的效率发生重组反应，但与野生型loxP序列或不同序列的突变型loxP序列不发生重组反应的突变型loxP序列。而通过使这些loxP序列组合在动物细胞的染色体中非常高效率地插入基因方面获得了成功。依据这种认识进一步开展研究直至完成本发明。
就是说本发明的主要内容有如下(1)～(21)点；
(1)具有以下性质的突变型loxP序列。
(a)由在来自大肠杆菌P1噬菌体的下述的野生型loxP序列中，中央部分的8个碱基(间隔区)的第2个(T)、第3个(G)、第4个(T)或第5个(A)碱基中至少有一个碱基以及第6个(T)或第7个(G)碱基中至少有一个碱基被置换为不同碱基的，而间隔区以外的区域即便被任意碱基置换也允许的序列构成的序列。
                  12345678
5’-ATAACTTCGTATA  ATGTATGC TATACGAAGTTAT-3’
                  间隔区域
(b)即使在重组酶Cre存在下，与野生型loxP序列之间也不发生特异DNA重组反应，
(c)在重组酶Cre存在下，与具有同一序列的另一突变型loxP序列之间能发生重组反应；
(2)具有以下性质的突变型loxP序列。
(a)由在来自大肠杆菌P1噬菌体的下述的野生型loxP序列中，中央部分的8个碱基(间隔区)的第2个(T)、第3个(G)、第4个(T)碱基中选出一个碱基被置换为不同的碱基的，而间隔区以外的区域即便被任意碱基置换也允许的的序列构成的序列，
                  12345678
5’-ATAACTTCGTATA  ATGTATGC TATACGAAGTTAT-3’
                  间隔区
(b)即使在重组酶Cre存在下，与野生型loxP序列之间也不发生特异性DNA重组反应，
(c)在重组酶Cre存在下，与具有同一序列的另一突变型loxP序列之间能发生重组反应；
(3)上述(1)或(2)记载的突变型loxP序列，即使在重组酶Cre存在下，与具有不同序列的另一突变型loxP序列之间也不发生特异重组反应；
(4)上述(1)记载的突变型loxP序列，是以序列编号：26、29、30、35、39、42或49表示的序列；
(5)具有上述(1)至(4)任一项记载的突变型loxP序列的DNA；
(6)至少具有一个野生型loxP序列以及上述(1)或(2)记载的突变型loxP序列至少一个的DNA；
(7)上述(6)记载的DNA，是在野生型loxP序列和突变型loxP序列之间插入了所希望的基因的DNA；
(8)至少具有2个序列互不相同的上述(3)记载的突变型loxP序列的DNA；
(9)上述(8)记载的DNA，是在2个序列互不相同的突变型loxP序列之间插入了所希望的基因的DNA；
(10)通过上述(6)至(9)中任一项记载的DNA转化的细胞；
(11)由在重组酶Cre存在下，使下面的DNA(a)和DNA(b)反应，得到下面DNA(c)过程构成的基因置换方法。
(a)依次含有野生型loxP序列、基因A和上述(1)或(2)记载的突变型loxP序列的DNA。
(b)依次含有野生型loxP序列、基因B和与DNA(a)相同的突变型loxP序列的环状DNA。
(c)在DNA(a)中基因A被基因B置换的DNA；
这里基因A和基因B是互不相同的任意的基因；
(12)由在重组酶Cre存在下，使下面的DNA(a)和DNA(b)反应，得到下面DNA(c)的过程构成的基因置换方法。
(a)含有2个序列互不相同的上述(3)记载的突变型loxP序列(突变型loxP序列1和突变型loxP序列2)以及基因A的DNA，具有突变型loxP序列1/基因A/突变型loxP序列2的顺序。
(b)依次含有突变型loxP序列1、基因B和突变型loxP序列2的环状DNA。
(c)在DNA(a)中基因A被基因B置换的DNA；
这里基因A和基因B是互不相同的任意的基因；
(13)上述(11)或(12)记载的方法，其特征是：基因B不是功能性的基因；
(14)上述(11)或(12)记载的方法，其特征是：基因A不是功能性的基因；
(15)上述(11)至(14)中任一项记载的方法，其特征是：DNA(a)是细胞染色体DNA、DNA(b)是质粒DNA或双链环状DNA病毒；
(16)上述(11)至(14)中任一项记载的方法，其特征是：DNA(a)是细胞染色体DNA、DNA(b)具有通过在细胞内转变，变成双链环状DNA的性质；
(17)上述(11)至(14)中任一项记载的方法，其特征是：DNA(a)是双链DNA病毒的染色体DNA、DNA(b)是质粒DNA或双链环状DNA病毒；
(18)上述(11)至(14)中任一项记载的方法，其特征是：DNA(a)是双链DNA病毒的染色体DNA、DNA(b)具有通过在细胞内变换，变成双链环状DNA的性质；
(19)上述(17)或(18)记载的方法，其特征是：DNA(a)的双链DNA病毒是腺病毒；
(20)在染色体上含有上述(6)至(9)中任一项记载的DNA的转基因动物；
(21)由上述(6)至(9)中任一项记载的DNA作成的医药。
附图的简单说明
图1是表示野生型loxP序列的合成DNA的构造。(s)表示有意义链、(a)表示反意义链。
图2表示合成的1个碱基置换的突变型loxP序列的间隔区的序列(有意义链)。
图3表示合成的1个碱基置换的突变型loxP序列的间隔区的序列(反意义链)。
图4表示合成的2个碱基置换的突变型loxP序列的间隔区的序列(有意义链)。
图5表示合成的2个碱基置换的突变型loxP序列的间隔区的序列(反意义链)。
图6是表示以直链DNA为底物时的在突变型loxP序列间的依赖于重组酶Cre的重组反应的模式图。[M]表示突变型loxP序列，文字上的箭头表示loxP序列的方向。数字表示BsaHI消化时的片段的长度(bp)。
图7是表示质粒pBRwt的构造的模式图。[L]表示野生型loxP序列，文字上的箭头表示loxP序列的方向。ApR表示氨苄青霉素抗性基因、ori表示大肠杆菌的复制起点。
图8是表示一端结合了一个野生型loxP序列，另一端结合了一个突变型loxP序列的直链DNA的模式图。[M]表示突变型loxP序列，[L]表示野生型loxP序列，文字上的箭头表示loxP序列的方向(以下图中也同样表示)。而向下的箭头表示BsaHI部位，数字表示BsaHI消化时的片段的长度(bp)。
图9是表示质粒pBLAmutant的构造的模式图。粗线部分来自pBR322，细线部分来自腺病毒。
图10是表示以直链DNA为底物时的在野生型loxP序列和突变型loxP序列间的依赖于重组酶Cre的重组反应的模式图。细的箭头表示DraI部位。
图11是表示质粒puLwL(A)、puLwM(B)、puMwL(C)的构造的模式图。
图12表示在质粒puLwM的构建中用的突变型合成DNA的序列的模式图。中央的下划线部分是loxP序列(34bp)、双划线部分是间隔区(8bp)、导入的变异的碱基用粗体字母表示。
图13是表示在质粒puMwL的构建中用的突变型合成DNA的序列的模式图。中央的下划线部分是loxP序列(34bp)、双划线部分是间隔区(8bp)、导入的变异的碱基用粗体字母表示。
图14是表示质粒pCALwL(D)和质粒pCALwM(E)的构造的模式图。CAPro表示CAG启动子、GpA表示β-珠蛋白聚A序列。
图15是表示质粒puLZM(F)和质粒puMOL(G)的构造的模式图。SpA表示SV40的ori和聚A序列。
图16是表示质粒puLZMOL(H)和质粒puALZMOL(I)的构造的模式图。TpA表示胸苷激酶的聚A序列。
图17表示通过野生型loxP序列和突变型loxP序列的组合可以将存在于质粒DNA(环状DNA)上的lacZ基因插入到腺病毒基因组上的实验模式图。
图18是表示质粒pCALwMds(A)和质粒pCALhmBMds(B)和质粒pCALGFBMds(C)的构造的模式图。hmB代表潮霉素抗性基因、GFB代表GFP和博莱霉素抗性基因的融合基因。
图19是表示腺病毒基因组上的基因置换实验结果的图。使Cre表达重组腺病毒以moi＝15，靶用重组腺病毒以moi＝9感染CV-1细胞。若施主腺病毒以moi＝60感染，大约有60％的细胞被染成蓝色，若以moi＝100感染大约90％的细胞被染成蓝色。
图20表示通过野生型loxP序列和突变型loxP序列的组合可以将存在于质粒DNA(环状DNA)上的lacZ基因插入到细胞染色体上基因的实验模式图。
图21是表示细胞染色体上的基因的置换实验的结果的图。对潮霉素B抗性的任意的6株靶细胞(C3、C7、C8、C11、C19、C28)分别用Cre表达重组腺病毒AxCANCre以moi＝5，施主用重组腺病毒AxALZMOL以moi＝10、30、100、300同时感染1个小时。虽然因细胞株的不同频率也不同，但使用施主用重组腺病毒以moi＝100感染时，有10％(C19)至30％(C8)的细胞被染成蓝色。
实施本发明的最佳方式
以下对本发明详细地进行说明。
所谓本发明中的突变型loxP序列指的是将野生型loxP序列的间隔区的特定碱基置换成与原来不同的碱基，通过这一置换使依赖于重组酶Cre的特异的DNA重组反应中的底物特异性发生变化的序列，在不影响底物特异性时含有其它碱基的置换也可以。这里所说的底物特异性是指例如存在野生型loxP序列、突变型loxP1序列和突变型loxP2序列的3种loxP序列时，若是野生型loxP序列和突变型loxP序列1、野生型loxP序列和突变型loxP序列2、突变型loxP1序列和突变型loxP2序列各自组合都不会实质性地发生依赖于Cre的特异的DNA重组反应。该底物特异性的程度在实施下面叙述的基因置换方法上只要足够高就可以。
将该突变型loxP序列和野生型loxP序列预先整合到细胞的染色体内，通过将相同组合的两个loxP序列间存在任意的基因的环状DNA与重组酶Cre一起导入细胞，首先通过突变型loxP序列之间、或者野生型loxP序列之间发生的插入反应生成存在4个loxP序列的中间体，其次通过在与插入反应不同组合的loxP序列间(如果插入反应发生在野生型loxP序列之间，在突变型loxP序列之间)发生的切除反应，环状DNA的突变型loxP序列和野生型loxP序列之间的任意基因可被插入到细胞染色体的突变型loxP序列和野生型loxP序列之间。而当在细胞染色体的突变型loxP序列和野生型loxP序列之间存在别的基因时，通过上述反应可以从染色体切去该基因，被插入到环状DNA的基因置换。因此如果细胞染色体存在突变型loxP序列和野生型loxP序列，在该部位有效地导入任意的基因是有可能的。另外，可以使用不发生特异的DNA重组反应的两个突变型loxP序列代替突变型loxP序列和野生型loxP序列的组合。
本发明的突变型loxP序列通过以下那样的操作被发现的。
作为loxP序列底物特异性变化了的突变型loxP序列已知有间隔区碱基的第7个碱基由G置换为A的序列(Hoess等，Nucleic AcidsRes.，Vol.14，2287-2300(1986))。使用该分析方法，在含有氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的质粒的卡那霉素抗性基因的两侧插入野生型loxP序列和突变型loxP序列，用得到的质粒转化Cre表达大肠杆菌。然后在对获得的氨苄青霉素抗性的大肠杆菌进行筛选后，通过卡那霉素抗性的有无(如果在两个loxP序列间发生重组则丧失卡那霉素抗性)判断野生型loxP序列和突变型loxP序列间的重组反应的程度。就是说由于可将在1分子的质粒中依赖于Cre的重组反应的结果扩增到上亿倍，而且要通过药物进行筛选，所以多大程度反映实际的重组反应并不清楚。
在此本发明人确立了更直接的定量的分析方法，鉴定了依赖于Cre的重组反应中必需的loxP序列内的碱基。首先对该分析方法进行简单地说明。运用常规的方法合成含有将8碱基的间隔区的所有碱基一个碱基一个碱基地置换为所有可能的碱基的突变型loxP序列(总计24种)和野生型loxP序列的DNA，将在适当长度的DNA片段、例如对质粒pBR322进行限制酶消化变成直链型DNA片段的两端结合了野生型loxP序列以及突变型loxP序列的DNA片段用作底物。将该底物在体外(in vitro)的无细胞体系中与Cre蛋白反应，进行重组，用适当的限制酶消化后通过电泳定量地测定突变型loxP序列与野生型loxP序列的重组反应的效率。通过测定得到了如下所示的结果：
(1)即使将间隔区的第1或第8个碱基进行置换，也可与野生型loxP序列反应；
(2)如果置换第2、第3、第4或第5个碱基，大部分反应停止在中间体，几乎不能进行到最终阶段。反应的程度因置换地点不同存在若干差别，若是第5个碱基置换则只有极少一部分反应进行到最终阶段；
(3)如果置换第6个碱基，虽然几乎不会形成中间体，但有一部分反应进行到最终阶段。进行到最终阶段的反应的比例比置换第5或第7个碱基时多。而置换的碱基的种类不同反应进行的程度也不同，如果将原来的碱基T置换为A，则比置换为C或G时进行到最终阶段的反应比例高；
(4)如果置换第7个碱基，虽然几乎不会形成中间体，但只有很少一部分反应进行到最终阶段。以前报道的是将第7个碱基G置换为A，即便进行这一置换，进行到最终阶段的反应的频率大约为5％。该频率对于进行作为本发明的目的的基因置换是个过高的值。原因是如果野生型loxP序列和突变型loxP序列间以5％的频率发生重组反应，那么通过依赖于Cre的切除反应，存在于2个loxP序列(野生型及突变型)间的基因有彻底缺失的可能性。
这里所说的中间体是指两条链中有一条链进行了重组，但另一条链没有重组，处于所谓的霍利迪结构(Holliday structure、Hoess等，Proc.Natl.Acsd.Sci.，Vol.84，6840-6844(1987))状态。已经清楚地了解到2个loxP序列间的重组反应首先是通过间隔区的下侧链的第7个和第8个碱基之间发生断裂、重接后，然后通过上侧链的第1和第2个碱基之间断裂、重接完成的(Guo等，自然(Nature)，Vol.389，40-46(1997))。因此从第2个到第5个碱基的置换和第6个第7个碱基的置换有本质上的不同，前者置换虽然能引起下侧链的重组，但不会引起上侧链的重组，反应停止在中间体，后者置换虽然下侧链的重组频率低，但其一部分发生了重组反应，反应可进行到最终阶段。
其次用同样的分析方法研究了具有相同序列的两个突变型loxP序列间的重组反应。虽然由于置换地点以及置换的碱基的种类不同导致反应性有些差别，但能够确认在第2到第7个碱基中有一个碱基被置换了的两个突变型loxP序列之间发生了依赖于Cre的特异的重组反应。该反应程度的差别比起置换地点来更依赖于置换的碱基的种类。例如第3个碱基(G)置换为C，以及第7个碱基(G)置换为T，与置换为其它两种碱基的情形相比，反应性明显恶化。
因此在野生型loxP序列中，从中央的8个碱基(间隔区)的第2(T)、第3(G)和第4个(T)碱基中选出的一个碱基被不同碱基置换的突变型loxP序列和含有该突变型loxP序列的DNA都包含在本发明中。
由以上认识可预料到，通过将本质上不同的碱基置换地点、即从第2个到第5个中的任意地点与第6或第7个碱基进行两个以上的组合，可以得到与只置换一个碱基不同的，具有极高特异性的、在相同突变型loxP序列之间具有可与置换一个碱基相匹敌的重组效率的突变型loxP序列。
以下就通过第2到第5个碱基中的任意一个碱基的置换与第7个碱基的置换的组合形成的突变型loxP序列，研究其与野生型loxP序列间的重组反应效率，以及相同序列的两个突变型loxP序列间的重组反应的效率。几乎所有置换了两个碱基的突变型loxP序列，在与野生型loxP序列的组合中，重组反应完全不能进行到最终阶段，与只置换一个碱基相比底物的特异性明显上升。然而相同序列的两个突变型loxP序列间的重组反应的效率因序列不同有很大差别，虽然也存在着完全不能进行反应的序列，但以下给出的突变型loxP序列表现出实用上很高的重组效率。T2C/G7A(#2171、序列号：26)、T2A/G7A(#2271、序列号：29)、 T2A/G7C(#2272、序列号：30)、G3A/G7A(#3171、序列号：35)、 G3T/G7A(#3371、序列号：39)、T4C/G7A(#4171、序列号：42)、 A5G/G7A(#5171、序列号：49)。其中T2A/G7C(#2272)和A5G/G7A(#5171)的反应效率非常高。数字表示进行置换的地点、数字前的碱基表示置换前的碱基、数字后的碱基表示置换后的碱基。例如T2C/G7A代表第2个碱基由T置换为C，第7个碱基由G置换为A的序列。而括号内的编号以及序列号的关系表示在下面的表2中。
如上所述，将野生型loxP序列的间隔区的两个碱基同时置换的突变型loxP序列与野生型loxP序列间不发生重组反应，但两个突变型loxP序列之间能够发生高效率的重组反应，从这一事实看与只置换一个碱基的loxP序列相比，显然其底物特异性进一步增加了。
所以在野生型loxP序列中，中央部分的8碱基(间隔区)的第2(T)、第3(G)、第4(T)或第5(A)的碱基中至少有一个碱基以及第6(T)或第7(G)个碱基中至少有一个碱基被置换为不同的碱基的突变型loxP序列以及具有该突变型loxP序列的DNA包括在本发明中。
本发明人还研究了在不同序列的突变型loxP序列之间能否发生重组反应的问题。例如T2C/G7A(#2171)和T2A/G7C(#2272)，但这两种突变型loxP序列之间完全不能进行重组反应。这意味着至少发现了野生型loxP序列、突变型loxP序列1、突变型loxP序列2三种底物特异性不同的loxP序列，在进行后述的基因置换上是有用的。
以下就利用本发明的突变型loxP序列进行的基因置换的方法及其应用进行说明。
本发明的基因置换方法是由使序列中依次含有野生型loxP序列、基因A和突变型loxP序列的DNA(a)和依次含有野生型loxP序列、突变型loxP序列的环状DNA(b)在重组酶Cre的存在下反应，把DNA(a)中的基因A置换为基因B的反应组成的。这里野生型loxP序列和突变型loxP序列不会发生依赖于Cre的重组反应，基因A和基因B是互不相同的任意的基因。
另外本发明的基因置换方法是由使在突变型loxP序列1/基因A/突变型loxP序列2的序列中含有的序列互不相同的两个突变型loxP序列(突变型loxP序列1和突变型loxP序列2)以及基因A的DNA(a)与依次具有突变型loxP序列1、基因B和突变型loxP序列2的环状DNA(b)在重组酶Cre存在下进行反应，把DNA(a)中的基因A置换为基因B组成的。这里突变型loxP序列1与突变型loxP序列2不会发生依赖于Cre的重组反应，基因A和基因B是互不相同的任意的基因。
基因置换的方法基本上按下面那样的过程进行。虽然作为例子就利用野生型loxP序列和突变型loxP序列的方法进行了说明，但利用突变型loxP序列1和突变型loxP序列2的情形也同样。另外虽然以置换动物细胞染色体的基因的情形作为例子进行说明，但本方法不限于动物细胞的染色体，也适用于动物病毒的基因组、植物细胞、酵母或细菌等微生物的染色体以及噬菌体等。
首先在动物细胞的染色体中预先插入野生型loxP序列和突变型loxP序列。在野生型loxP序列和突变型loxP序列间可存在任意的基因A，这种情形变成了基因置换，不存在基因A时就成了基因插入。
在插入了野生型loxP序列和突变型loxP序列的环状DNA分子的两个loxP序列间先插入想导入的基因B。该环状DNA分子例如可以用象质粒DNA或双链环状DNA病毒那样预先变成环状分子的DNA分子，也可以用通过某种操作导入细胞内后变成环状分子的DNA分子。通过众所周知的方法将存在该基因B和野生型以及突变型loxP序列的环状DNA分子导入上述的细胞内，同时通过众所周知的方法使Cre蛋白在细胞内表达，使环状DNA分子上的基因B插入到细胞染色体上的野生型loxP序列和突变型loxP序列之间。此时细胞染色体上的两个loxP序列之间存在基因A时，就变成了该基因A被切除而基因B被插入的基因置换。染色体上的两个loxP序列之间不存在基因时，就变成了基因插入。另外环状DNA的两个loxP序列之间不存在基因时，可以除去染色体上的基因A。而且即便除去基因A，由于染色体上存在两个loxP序列，所以通过利用在两个loxP序列之间含有任意基因C的其它的环状DNA分子也可以再次在该染色体上的两个loxP序列间导入基因。
向动物细胞导入环状DNA方法可以采用一般使用的方法。例如电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、DEAE-dextran法、脂(质)转染法、基因枪等物理化学的方法以及环状DNA病毒等。环状DNA病毒例如乳头瘤病毒、SV40等。另外导入细胞后，作成环状分子的方法的例子有使用重组酶的方法、该重组酶可以是来自酵母的2ml质粒的FLP和来自チゴサツカロマイセス·ル-イイ的pSR1质粒的R，以及Cre等。
在动物细胞的染色体中预先插入两个loxP序列时，例如，可以用存在两个loxP序列的质粒DNA等转化细胞。转化时导入基因的方法，可以采用上述的物理化学方法。另外，它可以采用逆转量病毒或腺伴随病毒HIV等具有将病毒基因组插入细胞染色体性质的病毒。
在动物细胞内使Cre表达的方法可以使用将编码Cre基因的DNA或RNA导入细胞后，在细胞内使Cre蛋白表达的方法或者将Cre蛋白本身导入细胞内的方法。作为前者的例子可以举出使用上述物理化学的方法将编码Cre基因的DNA或RNA导入细胞的方法和利用病毒载体的方法。作为病毒载体有腺病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、EB病毒等，从导入基因的效率的高低看腺病毒是最合适的病毒载体。
利用本发明的突变型loxP序列的在动物细胞染色体上进行的基因置换法的优点是其效率高和能够在染色体的特定部位插入基因。特别是后者在获得转化细胞上是非常重要的。为什么这样说呢，如果利用DNA的通常的转化法(同源重组以外)或利用逆转录病毒或腺伴随病毒等病毒载体的方法的话，目的基因在染色体上的插入部位是随机的，由于插入部位不同目的基因的表达量及其在该染色体中的稳定性都存在很大的差别。因此，例如为了获得使目的基因稳定(长期)、而且进行高表达的转化细胞株，必须对非常多的细胞株进行筛选。然而对每一个基因，就是说对每转化一次就必须反复进行筛选。与此相比，若用本发明的方法将夹在两个loxP序列的基因的表达作为指标，如果一旦获得表达量高且稳定的细胞株，即便导入任意的基因都能够很容易地获得基因表达高且稳定的细胞株。而且由于其效率非常高，通常必要的药物选择的操作就没有必要了，只是通过细胞的克隆就能够在短期内获得目的细胞株。对于作为转化对象的细胞株没有特别限制，但对于在转基因动物的制备中采用的ES细胞等的转化是特别有效的。
由本发明提出的动物细胞染色体的基因置换方法不仅适用于培养细胞而且也适用于动物个体。作为使特定的外来基因在动物个体中表达的方法，虽然存在转基因动物的技术，但在使目的基因表达的转基因动物的制备上非常花费时间。原因是在用通常的方法制备转基因动物时，首先制备表达基因的ES细胞等，然后使该ES细胞等在代理父母的腹中发育，以目的基因的表达作为指标筛选出生的子代，再使表达目的基因的动物个体进行交配，能够得到很多转基因动物的复杂操作都是必需的。通常进行这些操作需要半年到1年的时间。如果用本发明的方法，一旦制备了导入基因用的转基因动物，对应于各个基因的转基因动物的制备就不需要了。所谓导入基因用的转基因动物是在染色体中插入了突变型loxP序列和野生型loxP序列的动物，其制备方法与以往的转基因动物制备方法一样，为了能利用药物进行筛选，最好预先在两个loxP序列之间插入新霉素抗性基因等抗药性基因。通过向该导入基因用动物(a)导入在野生型loxP序列和突变型loxP序列之间插入了目的基因的环状DNA分子以及(b)Cre蛋白，在导入了(a)(b)两者的组织和细胞中，目的基因被插入到染色体，可以使该基因表达。向动物个体的导入(a)(b)可以利用脂质体法、或病毒载体、基因枪等已有的方法有效地进行。如果运用本发明方法，即使导入不同的基因，仅用对应于基因的环状DNA分子(a)就可以，没有必要花很多时间制备转基因动物。再者若只是局部地导入(a)(b)，也可以将目的基因只插入目的脏器或组织。
本发明也可以用于重组病毒的制备。作为病毒如DNA病毒，例如有腺病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒等疱疹病毒，牛痘病毒、金丝雀痘病毒等痘病毒，昆虫的杆状病毒等。而作为病毒还可举出RNA病毒，特别是逆转录病毒最好。为什么这样说呢，原因是在制备逆转录病毒载体时，对每个产生各自基因的逆转录病毒载体都要进行产生高效价病毒的细胞选择，如果运用本发明方法，可以认为只要预先建立高产出表达标记基因的病毒的细胞株的话，通过将该细胞株染色体上的标记基因置换为目的基因，可以很容易得到高产出的细胞株。
以重组腺病毒的制备为例说明运用本发明方法制备重组病毒的具体方法。采用以往技术制备重组腺病毒的方法是用插入了腺病毒基因组和目的基因的质粒载体或粘粒载体等转化293细胞等，对通过同源重组产生的重组病毒进行克隆，选择目的病毒使其增殖的方法，运用这样的方法需要长期间的作业。如果运用本发明的方法，由于不通过效率低的同源重组过程，所以短期间内就可以制备目的重组病毒。就是说首先制备导入基因用的腺病毒，该基因是插入了突变型loxP序列和野生型loxP序列的基因，然后用制备的腺病毒感染适合制备293细胞等重组腺病毒的细胞，将在野生型loxP序列和突变型loxP序列之间插入了目的基因的质粒DNA导入该细胞的同时，通过使Cre蛋白表达，可以高频率地获得在突变型loxP序列和野生型loxP序列之间插入了目的基因的重组病毒。这时导入基因用的腺病毒可以通过依赖于Cre的重组以除去夹在loxP序列间的包装序列之类方式制备，通过来自质粒DNA的目的基因和同时添加的包装序列进行置换，只要能够选择性地获得目的病毒即可。Cre蛋白既可以以质粒DNA的形式导入，也可以事先转化细胞，通过平常的培养或某些诱导使Cre蛋白进行表达。
以下进一步详细地说明上述方法。就有关制备外来基因A被外来基因B置换的重组腺病毒的情形进行说明。作为导入基因用的重组腺病毒构造的例子有在腺病毒左端反向重复序列(inverted terminalrepeat：ITR)/野生型loxP序列/包装序列/野生型loxP序列/基因A/突变型loxP序列的顺序中插入了loxP序列的腺病毒。这里野生型loxP序列/基因A的片段被插入到了E1缺失部位。作为插入外来基因B用的质粒DNA的例子可以举出含有野生型loxP序列/包装序列/基因B/突变型loxP序列构造的质粒。如果将这些导入基因用的腺病毒和插入外来基因B用的质粒DNA同时或依次导入可使Cre蛋白表达的那样的293细胞，在导入基因用的腺病毒中，随着夹在两个野生型loxP序列的包装序列被去除的同时可生成野生型loxP序列/基因A/突变型loxP序列部分被来自质粒的野生型loxP序列/包装序列/基因B/突变型loxP序列置换的重组腺病毒。没有进行基因置换的导入基因用的腺病毒由于能够通过通常的[切除反应](发生在两个野生型loxP序列间，反应效率高)除去包装序列，虽然病毒DNA进行了复制，但DNA没有被包装在病毒粒子(virion)内，所以作为病毒没有进行复制。而基因被置换的腺病毒由于含有包装序列，作为病毒能够复制，所以能够高频率地获得被[基因B]置换的重组腺病毒。
导入基因用的腺病毒的突变型loxP序列的插入位置可以紧靠着外来基因A，也可以位于离开基因A的腺病毒基因组内。作为后者插入位置的例子，如L3基因和E2A基因之间的非翻译区、E3基因的缺失部位、E4基因的上游区和右侧的ITR之间等。在这些位置插入loxP序列进行基因置换时，为了使生成的腺病毒DNA能有效地被包装在病毒粒子(virion)内，虽然有必要对插入目的基因用质粒的野生型loxP序列/突变型loxP序列间的DNA的大小进行调节，但由于基因被置换的重组腺病毒缺失了病毒复制所必需的基因，所以用作基因治疗载体时，可以认为能减轻在现在的腺病毒载体中成为问题的副作用。
具有本发明的突变型loxP序列的DNA也可作为医药用于基因治疗。以下对该方法进行说明。
首先在人细胞的染色体中预先插入突变型loxP序列和野生型loxP序列。由于这个原因，含有突变型loxP序列和野生型loxP序列的DNA可以用为药品使用。例如该DNA可以以被包含在逆转录病毒或腺伴随病毒(AAV)等病毒载体内的形式被给药。其中使用AAV更理想。原因是通过逆转录病毒进行的基因导入是被随机地插入到染色体中的，而通过AAV被插入到染色体的特定部位(第19号染色体的AAV-S1区域)的机率高。在向该染色体的特定部位导入基因过程中必需要AAV编码的病毒基因(Rep)，但若是采用目前用的AAV载体，由于AAV基因的大部分被除去，所以向染色体的特异整合机制就丧失了。然而即使将突变型loxP序列和野生型loxP序列合起来也不足100个碱基，所以可以制备保持原有AAV整个病毒基因的、插入了两个loxP序列的病毒。希望该插入位置位于存在于AAV基因两端的反向重复序列的各个内侧。通过将这个插入了两个loxP序列的AAV投给人，可以在染色体中插入两个loxP序列。
其次通过投给由在野生型loxP序列和突变型loxP序列间插入了目的基因的环状DNA分子组成的医药和Cre蛋白或编码Cre基因的DNA分子，夹在存在于染色体上的两个loxP序列之间的AAV基因被除去，置换成目的基因。将作为医药的环状DNA分子和Cre蛋白或编码Cre基因的DNA分子导入人细胞的方法有使用病毒载体和脂质体载体等已有的基因治疗中采用的载体方法。
这样一来在染色体中插入了基因的人细胞中，在目的基因的两端存在突变型loxP序列和野生型loxP序列，而且在其外侧只存在AAV的ITR，完全不存在AAV的结构基因，所以来自AAV的蛋白不能进行表达变成抗原，目的基因有望长时间稳定地持续表达。而当不需要插入的基因时，通过给予在野生型loxP序列和突变型loxP序列之间没有基因存在的环状DNA分子，可以从染色体中将插入的基因去除。而当以后需要再次向染色体插入基因时，由于两个loxP序列仍留在染色体上，所以利用上述方法可以插入任意的基因。这样一来具有本发明的突变型loxP序列的DNA可以作为能够自由地向染色体插入或切除基因的基因治疗药物使用。
用具有本发明的突变型loxP序列的DNA作为药物时，该DNA向细胞内导入的方法大致分为依赖于病毒载体的方法以及其它的方法(日经サイエンス、1994年4月、20-45页，月刊药事、36(1)，23-48(1994)、以及它们的引用文献等)。无论那种方法都适用于本发明的医药。
作为依赖于病毒载体导入的方法，例如有在逆转录病毒、腺病毒、腺病毒群、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、シンビス及其它的RNA病毒等整合了具有本发明的突变型loxP序列或对应的RNA后进行导入的方法。其中使用逆转录病毒、腺病毒、腺病毒群等病毒的方法特别理想。
其它的导入方法还有脂质体法、脂(质)转染法、微注射法、磷酸钙法、电穿孔法、基因枪法等，脂质体法特别理想。
而为了使本发明的突变型loxP序列的DNA实际作为药物使用，有将该DNA直接导入体内的in vivo(体内)法、以及从人采取某种细胞，然后在体外将该DNA导入该细胞，再将该细胞送回体内的Ex Vivo法(日经サイエンス、1994年4月号、20-45页，月刊药事、36(1)，23-48(1994)、以及它们的引用文献等)。本发明的药物依据治疗的疾病、靶脏器等选择适宜的任一个方法都可以。
本发明的药物，通过in vivo法给药时，可以根据治疗的疾病、靶脏器等不同通过适当的给药途径给药。例如注射到静脉、动脉、皮下、肌肉内等，或直接给到肾脏、肝脏、肺、脑、神经等疾病的病灶部位。
而通过Ex Vivo法给药时，按照常规方法采取人的细胞(例如淋巴细胞、造血的干细胞等)，然后用本发明的药物使细胞致敏，导入基因后，再将该细胞送回人体内。
通过in vivo法给药时，可以采取各种剂型(例如液剂)，但一般都作成含有作为有效成分的突变型loxP序列的DNA的注射剂等。根据需要也可以添加常用的担体。该注射剂等可以通过常规方法制备，例如可以通过将含有突变型loxP序列的DNA溶解于适当的溶剂(例如灭菌水、缓冲液、生理盐水等)后，用膜过滤进行灭菌，然后充填到无菌的容器内来制备，也可以将整合了含有突变型loxP序列的DNA的病毒载体作成制剂来代替含有突变型loxP序列的DNA。另外可以将包埋了含有突变型loxP序列的DNA的脂质体(或HJV-脂质体)作成悬浊剂、冻干剂、离心分离浓缩冻干剂等脂质体制剂的形态。
制剂中含有突变型loxP序列的DNA的量可以根据治疗的疾病、靶脏器、患者的年龄、体重等不同适当地调整，通常含有突变型loxP序列的DNA为0.0001mg～100mg、理想的是0.001mg～10mg，数日至数月给药一次是合适的。
以上是利用野生型loxP序列和突变型loxP序列的组合、或突变型loxP序列1和突变型loxP序列2的组合的两个loxP序列的基因置换方法的说明，通过使用底物特异性不同的3个以上的loxP序列，有可能进一步扩展基因置换方法的应用范围。作为底物特异性不同的3个loxP序列的组合例如有野生型loxP序列和两个突变型loxP序列、3个突变型loxP序列等的组合。本方法通过将在同一DNA上存在野生型loxP序列、突变型loxP序列1、突变型loxP序列2的情形作为例子进行说明。如果使含有野生型loxP序列/基因C/突变型loxP序列1的环状DNA(b)在重组酶Cre的存在下与依次含有野生型loxP序列/基因A/突变型loxP序列1/基因B/突变型loxP序列2的DNA(a)反应，可以将DNA(a)中的基因A置换为基因C。如果用突变型loxP序列1/基因D/突变型loxP序列2取代环状DNA(b)进行上述反应，可以将DNA(a)中的基因B置换为基因D。就是说仅利用不同的环状DNA就可以将存在于DNA(a)的多基因中的目的基因置换为任意的基因。
以下就利用本发明的突变型loxP序列进行基因置换的具体例子进行说明。在以下的例子中，突变型loxP序列用的都是将间隔区的第2个碱基由T置换为C，第7个碱基由G置换为A的置换了的序列(序列号：26)。
(1)存在于腺病毒基因组中的基因的置换
作为进行置换的基因的例子用大肠杆菌lacZ基因，通过将环状DNA分子上的lacZ基因插入到腺病毒基因组的野生型loxP序列和突变型loxP序列之间的体系确认了本发明的突变型loxP序列的有效性。
首先作为基因被置换一方的腺病毒、即靶用腺病毒，是在E1基因和E3基因缺失的腺病毒5型中的E1基因缺失部位插入了CAG启动子/野生型loxP序列/突变型loxP序列/聚A序列(使该序列转录方向向左那样插入，与E1基因的转录方向相反)的重组腺病毒(AxCALwM)而制备的。而这里所说的CAG启动子是作为高表达载体于特开平3-168087号公报公开的启动子。
在野生型loxP序列和突变型loxP序列之间插入了lacZ基因的环状DNA分子可以作成含有野生型loxP序列/lacZ基因/突变型loxP序列构造的质粒通过转染直接导入细胞。然而由于通过转染向细胞导入基因的效率停留在10％左右，不能将目的DNA导入全部的细胞，而通过采用腺病毒载体后依赖于Cre在细胞内作成环状DNA分子的方法，可将环状DNA分子几乎导入所有的细胞。由此制备了在缺失了E1基因以及E3基因的腺病毒5型中的E1基因缺失部位插入了单纯疱疹病毒的胸苷激酶(TK)基因的聚A序列/野生型loxP序列/lacZ基因/突变型loxP序列/SV40的ori以及聚A序列/野生型loxP序列(使其转录方向向左那样插入)的重组腺病毒(AxALZMOL)。该重组病毒AxALZMOL称之用作施主的腺病毒。如果使Cre作用于AxALZMOL就会在两个野生型loxP序列间发生重组反应，生成野生型loxP序列/lacZ基因/突变型loxP序列/SV40的ori以及聚A序列构造的环状DNA分子。为了使来自未鉴定的腺病毒的启动子不引起lacZ基因的转录插入了TK基因的聚A序列。而Cre蛋白是通过Cre表达重组腺病毒AxCANCre(钟ケ江等、Nucleic Acids Res.，Vol.23，3816-3821(1995))供给的。
以下利用这三类重组腺病毒进行存在于腺病毒基因组中的基因的置换(插入)实验。使施主用腺病毒AxALZMOL、靶用腺病毒AxCALwM以及Cre表达重组腺病毒AxCANCre同时感染培养的动物细胞(CV-1细胞或COS-1细胞)。虽然施主用腺病毒AxALZMOL以及生成的环状DNA分子含有lacZ基因，但由于不存在启动子，所以没有进行lacZ基因表达。环状DNA分子上的lacZ基因被插入到靶用腺病毒AxCALwM的CAG启动子的下游，即野生型loxP序列和突变型loxP序列之间后，lacZ基因才开始进行表达。因此lacZ基因的表达成了实际上发生基因置换(这种情况为插入)的明确证据。
如果用上述三种病毒单独、或其中的两种病毒的组合进行感染，lacZ基因进行表达的细胞完全不存在，但通过使三种病毒同时感染，能明确地证实lacZ基因的表达，而且表达lacZ基因的细胞的比例随着施主用腺病毒的量的增加而增加，最大可在大约90％的细胞中证实lacZ基因的表达。从以上结果可很清楚地看到施主用腺病毒上的lacZ基因借助于环状DNA分子可非常有效地插入到靶用腺病毒的野生型loxP序列和突变型loxP序列之间，就是说发生了基因置换。
(2)存在于动物细胞染色体上的基因的置换
为了表示不只是存在于腺病毒基因组上的基因，就是存在于动物细胞染色体上的基因也能有效进行置换，进行了以下实验。实验系统的原理虽然与(1)相同，但为了获得基因被置换的细胞株(靶细胞)，用含有CAG启动子/野生型loxP序列/潮霉素B抗性基因/突变型loxP序列/聚A序列结构的DNA的质粒转化CV-1细胞，制备出多个含有潮霉素B抗性基因而且平均每个细胞只插入了一个拷贝具有上述结构的DNA的细胞株。
对于这些细胞株同时用施主用腺病毒AxALZMOL以及Cre表达腺病毒AxCANCre进行感染。结果虽然单独用施主用腺病毒AxALZMOL或Cre表达腺病毒AxCANCre进行感染，能进行lacZ基因表达的细胞完全不存在，但用两个病毒同时感染，能够确认lacZ基因表达的细胞有很多，其比例虽然因所用的细胞株不同而不同，最多大约有30％的细胞能进行lacZ基因表达。在实验体系中，都没有进行细胞的克隆，所以能进行lacZ基因表达的细胞的比例直接表现出发生在染色体上的基因置换的比例。因此以上的结果正是表现了通过利用本发明的突变型loxP序列能够非常有效地进行染色体上的基因置换的事实。
以下通过作为本发明一部分的实施例对本发明作更详细地说明，但本发明并不限于这些实施例，不用说在本发明的技术领域内可以进行通常的变更。而对实施例中的噬菌体、质粒、DNA、各种酶、大肠杆菌、培养细胞等进行的诸操作没有特别限制，可依据[分子克隆(MolecularCloning)，实验室手册.T.Maniatis等编、第2版(1989)、冷泉港实验室]记载的方法进行。
实施例1
两个突变型loxP序列间的依赖于Cre的重组反应
(1)含有重组酶Cre的细胞提取液的制备
进行如下操作目的是为了获得含有依赖于重组酶Cre的重组反应中用的Cre。使大约1×109PFU的Cre表达重组腺病毒载体AxCANCre(钟ケ江等、Nucleic Acids Res.，Vol.23，3816-3821(1995))感染(37℃、1小时)一个225cm2烧瓶的293细胞(来自人胎儿肾脏的细胞株)，添加培养基(含5％FCS的DMEM培养基)后再培养24小时。培养结束后，用低速离心机于1000转速下进行5分钟离心，舍去上清，收集细胞。加细胞保存用的缓冲液(50％甘油/20mM Tris盐酸(pH7.5)/300mM氯化钠/1mM EDTA(pH7.5))5ml将细胞悬浮，用密闭型的超声仪破碎细胞(200W，2分钟(30秒×4次))，使细胞内存在的Cre蛋白释放出来。用微型离心机将得到的细胞破碎液于15000转速下离心10分钟，将上清冷冻保存(-80℃)。
(2)含有突变型loxP序列的合成DNA的制备
制备将野生型loxP序列中的8碱基的间隔部分中的1个或2个碱基同时置换成了其它碱基的含有52个碱基的合成DNA。合成的DNA的种类中，一个碱基变异的有24种，2个碱基同时变异的有29种，分别合成了有意义链和反意义链。图1给出了野生型loxP序列的合成DNA的构造(有意义链序列号：55、反意义链的序列号：56)。图2～5给出了突变型loxP序列(有意义链和反意义链)。野生型有意义链和反意义链的所有碱基并不都互补，而是设计成当对各个链进行退火成为双链DNA时，5′端各有4个碱基突出，两末端变成限制酶XbaI和XhoI消化片段那样的末端。因此这样的双链DNA中的XbaI片段一侧可以与限制酶XbaI和NheI消化片段结合，而XhoI片段一侧可以与限制酶XhoI和SalI消化片段结合。
整个的一条合成DNA链其5′端用T4聚核苷酸激酶磷酸化，分别对应于各个变异的有意义链和反意义链进行了退火。以后该双链合成DNA称之突变型loxP合成DNA。
(3)含有2个突变型loxP序列的底物DNA的制备
以下操作目的是为了获得在直链DNA的两端含有相同序列的loxP序列的底物DNA。
用限制酶NheI和SalI同时消化质粒pBR322，对24种突变型loxP合成DNA(只有一个碱基被置换的)分别用T4DNA连接酶进行连接反应(质粒：合成DNA的摩尔比为1∶6)后，用限制酶XbaI和XhoI同时进行消化。通过该限制酶处理，pBR322两端结合的多个突变型loxP合成DNA被除掉，生成了在pBR322 DNA两端的每一端都结合了同样序列的突变型loxP合成DNA的大约4.1kb的直链型的DNA。然后未反应的以及被限制酶消化的突变型loxP合成DNA通过GEANCLEAN II(フナコシ社制)除去，两端结合了突变型loxP序列的直链DNA(约4.1kb)用作以下所示反应的底物DNA。
(4)两个突变型loxP序列间的依赖于Cre的重组反应
通过以下所示的分析方法研究在两个突变型loxP序列间能否发生依赖于Cre的重组反应。
向含有终浓度为50mM Tris盐酸(pH7.5)/10mM MgCl2/1mg/ml牛血清白蛋白/1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)/5μg/ml抑肽酶的缓冲液中加入含有在(3)中制备的底物DNA(1μg)和(1)中制备的Cre的细胞提取液10μl(反应溶液量50μl)，于37℃下反应30分钟。反应结束后，向反应液中加入45μl的TE缓冲液(pH8.0)和5μl的EDTA溶液(pH8.0)，进行酚/氯仿以及氯仿萃取，再进行乙醇沉淀，将得到的DNA溶解于含有RnaseA(20μg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)30μl中。然后对其中一半量进行限制酶BsaHI消化，琼脂糖电泳后，解析经溴乙锭(EtBr)染色检测出的DNA带。
如果用限制酶BsaHI消化进行依赖于Cre的重组反应前的底物DNA(约4.1kb)，生成2.7kb、610bp、380bp、360bp 4条带。另外如果底物DNA通过Cre引起重组反应，由于生成含有一个突变型loxP的约4.0kb的环状DNA和只由突变型loxP组成的约50bp的直链DNA，如果用限制酶BsaHI消化这两种DNA，生成2.7kb、920bp、380bp、50bp 4条带(参照图6)。因此由于920bp带显示出能引起依赖于Cre的重组反应，610bp和360bp的带不能引起依赖于Cre的重组反应，所以通过这些带的量比可知重组反应的效率。结果如表1所示。
表1.野生型loxP序列和突变型loxP序列间的依赖于Cre的重组反应
(1个碱基置换)
序列号     合成DNA号       突变型loxP序列—突变型loxP序列     野生型loxP序列—突变型loxP序列
  中间体(970bp) 最终反应体(920bp)   中间体(970bp) 最终反应体(920bp)
    1     wild     1     9     1     9
    2     #11     4     2     3     5
    3     #12     6     3     4     7
    4     #13     4     3     3     7
    5     #21     4     5     5     0
    6     #22     4     5     7     0
    7     #23     6     5     9     0
    8     #31     5     7     9     0
    9     #32     6     3     9     0
    10     #33     6     6     9     0
    11     #41     1     7     9     0
    12     #42     5     6     9     0
    13     #43     5     6     9     0
    14     #51     1     9     7     1
    15     #52     1     9     7     2
    16     #53     1     8     7     1
    17     #61     1     8     1     3
    18     #62     1     8     1     6
    19     #63     1     9     1     2
    20     #71     1     7     1     1
    21     #72     3     7     1     1
    22     #73     3     1     1     1
    23     #81     3     3     4     7
    24     #82     8     5     5     9
    25     #83     2     9     2     8
(表中，反应中间体以及最终反应体的量用0～9的10个阶段表示。数字越大生成量越多。两个野生型loxP序列间进行反应时的最终反应体的量(DNA带的浓度)定为最大的[9]，DNA的带几乎不能检出时(不到[9]的5％)定为[0])。有关反应的中间体在实施例2-(2)中进行说明。)
#11、#73的突变型loxP序列反应效率不好，但其它的突变型loxP序列虽然因序列不同而反应效率多少存在差别，但可确认相同序列的突变型loxP序列之间能发生依赖于Cre的重组反应。
实施例2
野生型loxP序列和突变型loxP序列间的依赖于Cre的重组反应(之一)
(1)含有野生型loxP序列和突变型loxP序列的底物DNA的制备
[1]含有一个野生型loxP序列的质粒(pBRwt)的构建
为了构建在质粒pBR322插入了一个野生型loxP序列的质粒(pBRwt)，进行以下(a)和(b)的操作。
(a)用限制酶EcoNI消化pBR322，再通过Klenow酶使两端补平，进行酚/氯仿提取，使EcoNI和Klenow酶失活后，利用凝胶过滤将反应液置换为TE缓冲液。然后连接XhoI接头(5′-pCCTCGAGG-3′)，用限制酶XhoI和PstI同时消化后，进行琼脂糖电泳，切出大约2.9kb的带。该带用GEANCLEAN II(フナコシ社制)纯化，得到一端是XhoI消化片段，另一端是PstI消化的片段的大约2.9kb的DNA片段。
(b)用限制酶NheI消化pBR322，对含有野生型loxP序列的合成DNA(52bp)进行连接后，用限制酶XhoI和PstI同时消化，反应液进行琼脂糖电泳。切出含有一个野生型loxP序列的大约1.4kb的带。该带用GEANCLEAN II(フナコシ社制)纯化。这个大约1.4kb的DNA片段也是一端是XhoI消化片段，另一端是PstI消化的片段。
将(a)(b)中制备的两个DNA连接后，转化大肠杆菌，得到在pBR322的NheI位点和EcoNI位点之间插入了一个野生型loxP序列的质粒pBRwt(4.4kb、图7。)
[2]含有野生型loxP序列和突变型loxP序列的底物DNA的制备
为了制备在直链DNA的一端含有野生型loxP序列，而另一端含有突变型loxP序列的底物DNA，进行了以下操作。
由于在离开质粒pBRwt的野生型loxP序列大约30bp的位置存在SalI位点，所以用限制酶SalI消化该质粒，使之成为直链后，与实施例1-(3)相同的突变型loxP合成DNA(52bp、24种)进行连接(质粒∶合成DNA的摩尔比为1∶6)。通过这一操作，突变型loxP合成DNA的XhoI消化片段一侧连接在pBRwt的SalI消化位点处。然后反应液同时用限制酶XbaI和XhoI同时进行消化，除去pBRwt的两端结合的多个突变型loxP合成DNA后，然后未反应的以及被限制酶消化的突变型loxP合成DNA通过GEANCLEAN II(フナコシ社制)从反应液中除去，得到一端结合了一个野生型loxP序列，另一端结合了一个突变型loxP序列的直链DNA(约4.4kb、图8)。该DNA作为底物DNA用于以下给出的反应。
(2)野生型loxP序列和突变型loxP序列间的依赖于Cre的重组反应
反应以及解析方法与实施例1-(4)一样，但底物DNA用实施例2-(1)给出的DNA代替实施例1-(3)给出的DNA。
已知在下面给出的野生型loxP序列的碱基序列中，两个loxP序列间的重组首先是通过8碱基的间隔区的上侧的DNA链的第1和第2个碱基之间发生切断和再结合，然后通过8个碱基的间隔区的下侧的DNA链的第7和第8个碱基之间的切断和再结合完成反应的(Guo等，Nature，Vol.389，40-46(1997))。
loxP序列(34bp)
                  12345678
5’-ATAACTTCGTATA    ATGTATGC   TATACGAAGTTAT-3’
3’- TATTGAAGCATAT  TACATACG  ATATGCTTCAATA-5’
          重复序列    间隔区域    重复序列
           (13bp)      (8bp)      (13bp)
因此在下侧的DNA链的重组发生，而上侧的DNA链的重组没有发生时，能够检测到反应的中间体。若是用本发明人用的分析系统，检测到的该中间体为大约970bp附近的带。
在实施例1-(4)给出了，920bp的带是来自上侧和下侧的两部分DNA重组反应结束产生的，而970bp带是中间体，来自于反应中止。对这两条带的有无给予特别关注，表1给出了解析的结果。以下给出了表1结果的概要(#的后面数字为突变型loxP序列号)。
#11，12，13(序列号：2，3，4)：反应进行到最终阶段；
#21，22，23(序列号：5，6，7)：反应停止在中间体，不能进行到最终阶段；
#31，32，33(序列号：8，9，10)：反应停止在中间体，不能进行到最终阶段；
#41，42，43(序列号：11，12，13)：反应停止在中间体，不能进行到最终阶段；
#51，52，53(序列号：14，15，16)：反应大部分停止在中间体，但有很少一部分进行到最终阶段(大约5％)；
#61，63(序列号：17，19)：几乎没有中间体生成，但反应有很少一部分进行到最终阶段(5～10％)；
#62(序列号：18)：几乎没有中间体生成，但反应有一部分进行到最终阶段(最终反应体比#61，63多)；
#71，72，73(序列号：20，21，22)：几乎没有中间体生成，但反应有很少一部分进行到最终阶段(约5％，最终反应体比#61，63少)；
#81，82，83(序列号：23，24，25)：反应进行到最终阶段；
如果按每个置换部位归纳以上的结果，即从第1到第8个碱基的置换效果，可清楚看到(1)即使置换第1或第8个碱基，也可与野生型loxP序列进行反应，(2)如果置换第2、第3或第4个碱基，几乎不能与野生型loxP序列反应，(3)如果置换第5、第6或第7个碱基，虽然与野生型loxP序列反应变得困难了，但仍可进行部分反应。另外从这些结果能清楚看到第2个到第5个碱基的置换，与第6和第7个碱基的置换有本质上的不同，前者停止在中间体，而后者反应的最初步骤明显受到抑制。
另外如果用本发明人的测定方法可以清楚地看到报道(Hoess等，Nucleic Acids Res.，Vol.14，2287-2300(1986))的与野生型loxP序列之间不能发生特异的DNA重组反应的突变型loxP序列(相当于#71)与野生型loxP序列的反应性并没有完全丧失，而以大约5％的频率发生重组反应。
实施例3
野生型loxP序列和突变型loxP序列间的依赖于Cre的重组反应(之 二)
(1)含有野生型loxP序列和突变型loxP序列的底物DNA的制备
为了得到用比实施例1和2中使用的分析系统灵敏度更高的分析系统检测的野生型loxP序列和突变型loxP序列间的依赖于Cre的重组反应用的底物DNA，进行了以下操作。
[1]含有野生型loxP序列和突变型loxP序列的质粒(pBLAmutant)的构建
为了构建在pBR322的两端各结合了一个野生型loxP序列和突变型loxP序列的约4.4kb的直链型DNA上结合了来自腺病毒5型的DNA片段的质粒，进行了以下操作。
用限制酶XbaI和XhoI同时消化插入了腺病毒5型的除E1和E3基因以外的几乎全长基因的质粒pAxcw(特开平8-308585号公报15页)，反应液进行琼脂糖电泳后，切出大约3.8kb的带，用GEANCLEAN II(フナコシ社制)进行纯化。将该3.8kb的DNA片段与实施例2-(1)-[2]制备的一端结合了一个野生型loxP序列，另一端结合了一个突变型loxP序列的直链DNA(约4.4kb)连接后，转化大肠杆菌，得到质粒pBLAmutant(8.2kb，图9)。该质粒pBLAmutant是进行了上述操作的质粒的总称，实际上制备了各含有一个相应于表1#11，#21，#22，#22，#31，#41，#51，#61，#71，#72，#73，#81的突变型loxP序列和一个野生型loxP序列的各个质粒。
[2]含有野生型loxP序列和突变型loxP序列的底物DNA的制备
为了从质粒pBLAmutant制备在依赖于Cre重组反应中作底物用的含有野生型loxP序列和突变型loxP序列的直链型DNA，进行了以下操作。
由于在质粒pBLAmutant中的插入了腺病毒基因组部分存在一个NcoI位点，所以用限制酶NcoI消化该质粒，使之成为直链型DNA后，反应液进行琼脂糖电泳，切出大约8.2kb的带，用GEANCLEAN II(フナコシ社制)进行了纯化。该8.2kb的直链型DNA用作以下反应的底物。
(2)野生型loxP序列和突变型loxP序列间的依赖于Cre的重组反应
将上述的底物DNA加到实施例1-(4)中给出的反应液中，于37℃下进行30分钟依赖于Cre的重组反应。反应结束后，向反应液中加入45μl的TE缓冲液(pH8.0)和5μl的EDTA溶液(pH8.0)，进行酚/氯仿以及氯仿萃取，再进行乙醇沉淀，将得到的DNA溶解于含有RnaseA(20μg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)30μl中。然后对其中一半量进行限制酶DraI消化，琼脂糖电泳后，解析经溴乙锭(EtBr)染色检测出的DNA带。
由于用作底物的直链型DNA中在野生型loxP序列和突变型loxP序列之间存在两个DraI位点，所以当不发生依赖于Cre的重组时，通过DraI消化生成5.9kb、1.3kb、0.7kb 3条带(图10)。另外如果底物DNA通过Cre引起重组反应，由于生成含有两个DraI位点和一个loxP序列的约4kb的环状DNA以及含有一个loxP序列、而不存在DraI位点的约3.8kb的直链DNA，所以通过DraI消化，生成3.8kb、3.3kb、0.7kb 3条带。因此由于3.8kb以及3.3kb带的存在显示出能引起依赖于Cre的重组反应，而5.9kb和1.3kb带的存在表明不能引起依赖于Cre的重组反应，所以通过这些带的量比可知重组反应的效率。另外若是用该分析方法可在10数kb的位置检测出在实施例2-(2)说明的反应的中间体。结果归纳如下。
#11，81：反应进行到最终阶段；
#21，22，23，31，41：反应停止在中间体，不能进行到最终阶段；
#51：虽然反应大部分停止在中间体，但有极少一部分能进行到最终阶段；
#61：几乎没有中间体生成，但有一部分进行到最终阶段；
#71：几乎没有中间体生成，但有一部分进行到最终阶段(最终产物比#72，73多)；
#72，73：几乎没有中间体生成，但有很少一部分进行到最终阶段；
从以上结果再度确认，即使用比实施例2灵敏度更高的方法进行分析倾向相同，即便在已报道(Hoess等，Nucleic Acids Res.，Vol.14，2287-2300(1986))的与野生型loxP序列之间不能发生特异的DNA重组反应的突变型loxP序列(相当于#71)也仍保留一部分与野生型loxP序列的反应性，其反应程度(最终反应物的量)比同样部位置换的#72和#73还高，而#71的置换由于丧失与野生型loxP序列的反应性，所以反应是不充分的。
实施例4
2个碱基被置换了的突变型loxP序列和野生型loxP序列间的依赖于 Cre的重组反应
(1)野生型loxP序列和突变型loxP序列间的依赖于Cre的重组反应
[1]含有野生型loxP序列和突变型loxP序列的底物DNA的制备
按照实施例2-(1)-[2]给出的方法制备在直链DNA的一端含有野生型loxP序列，而另一端含有突变型loxP序列的底物DNA。即将已经在质粒pBR322中插入了一个野生型loxP序列的质粒pBRwt(实施例2-(1)-[1])的限制酶SalI位点处连接了分别进行了2个碱基置换的突变型loxP合成DNA(参照图4和图5)的直链型DNA作为底物DNA而制备。
[2]依赖于Cre的重组反应(之一)
利用[1]中制备的底物DNA，用实施例1-(4)给出的方法进行依赖于Cre的重组反应并进行解析。在表2(右栏)给出了其结果。
表2.野生型loxP序列和突变型loxP序列间的依赖于Cre的重组反应(2个碱基置换)
序列号   合成DNA号     突变型loxP序列—突变型loxP序列     野生型loxP序列—突变型loxP序列
  中间体(970bp) 最终反应体(920bp)   中间体(970bp) 最终反应体(920bp)
    1   wild     1     9     1     9
    20   #71     1     6     0     1
    26   #2171     3     3     0     0
    27   #2172     4     2
    28   #2173     6     0
    29   #2271     2     6
    30   #2272     1     6     0     0
    31   #2273     3     4
    32   #2371     3     2
    33   #2372     2     0
    34   #2373     6     1     0     0
    35   #3171     4     7     0     0
    36   #3172     0     0
    37   #3271     3     4
    38   #3272     6     2     0     0
    39   #3371     5     5
    40   #3372     6     1
    41   #3373     6     2     0     0
    42   #4171     0     4     0     0
    43   #4172     2     4
    44   #4271     4     2
    45   #4272     4     1     0     0
    46   #4371     4     2
    47   #4372     3     2
    48   #4373     7     0     1     0
    49   #5171     0     6     0     0
    50   #5272     1     4     0     0
    51   #5373     1     2     0     0
    52   #6171     0     6     1     1
    53   #6272     1     2     0     0
    54   #6373     1     2     0     0
(表中，反应中间体以及最终反应体的量用0～9的10个阶段表示。数字越大生成量越多。两个野生型loxP序列间进行反应时的最终反应体的量(DNA带的浓度)定为最大的[9]，DNA的带几乎不能检出时(不到[9]的5％)定为[0]。有关反应的中间体的详细情况参照实施例2-(2)中的说明。)
利用#6171的突变型loxP序列时，确认有一部分最终反应体(920bp)，与野生型loxP序列之间发生了重组反应。然而除此以外，其它被解析的突变型loxP序列都不能与野生型loxP序列发生反应，其程度比一个碱基置换的突变型loxP序列的情形要少。
[3]含有野生型loxP序列和突变型loxP序列的质粒的构建
用#2171、#2272、#2373的突变型loxP合成DNA，采用实施例2-(1)-[2]和3-(1)-[1]给出的方法构建了3种含有野生型loxP序列和突变型loxP序列的质粒pBLAmutant(8.2kb、参照图9)。[4]依赖于Cre的重组反应(之二)
用限制酶NheI消化[3]中构建的质粒，按照实施例3-(1)-[2]给出的方法制备在直链上含有野生型loxP序列和突变型loxP序列的底物DNA(8.2kb)。利用该底物DNA，采用实施例3-(2)给出的方法进行依赖于Cre的重组反应，并进行解析。结果无论与3种突变型loxP序列中那一个几乎都不能生成反应的中间体和最终的反应体。就是说，置换了2个碱基的突变型loxP序列几乎不能与野生型loxP序列进行重组反应，表明反应的特异性比置换1个碱基的突变型loxP序列更高。
(2)2个相同序列的突变型loxP序列间的依赖于Cre的重组反应
[1]含有2个突变型loxP序列的底物DNA的制备
就29种突变型loxP序列(参照图4和图5)用实施例1-(3)给出的方法制备直链型DNA的两端含有相同序列的突变型loxP序列的底物DNA。即将上述突变型loxP合成DNA分别连接在用限制酶NheI和SalI同时消化的质粒pBR322上，制备在pBR322 DNA两端的两端都结合了同样序列的突变型loxP合成DNA的大约4.1kb的直链型的DNA。
[2]依赖于Cre的重组反应(之一)
利用[1]中制备的底物DNA，用实施例1-(4)给出的方法进行依赖于Cre的重组反应并进行解析。在表2(左栏)给出了其结果。虽然存在着象#2173和#2372那样的完全不能进行重组反应的突变型loxP序列，但可确认#2271、#2272、#3171、#3371、#4171、#6171、#6171能发生与置换一个碱基的突变型loxP序列大致同等程度的重组反应，#2171、#2273、#3271、#4172能以置换一个碱基的突变型loxP序列的一半程度的效率进行重组反应。
[3]含有一个突变型loxP序列的质粒的构建
用#2171、#2272、#2373的突变型loxP合成DNA，采用实施例2-(1)-[1]给出的方法构建了在质粒pBR322的NheI位点和EcoNI位点间分别插入了一个突变型loxP的3种质粒(pBR2171、pBR2272、pBR2373、各4.4kb、参照图7)。
[4]含有两个相同序列的突变型loxP序列的质粒的构建
分别用限制酶SalI消化[3]中构建的3种质粒(pBR2171、pBR2272、pBR2373)，分别与插入到质粒的序列相同的突变型loxP合成DNA(#2171、#2272、#2373)连接后，用实施例2-(1)-[2]以及实施例3-(1)-[1]给出的方法构建含有两个相同序列的突变型loxP序列的3种质粒(pBLA2171x2、pBLA2272x2、pBLA2373x2、各8.2kb、参照图9)。
[5]依赖于Cre的重组反应(之二)
用限制酶NheI分别消化[4]中构建的3种质粒，按照实施例3-(1)-[2]给出的方法制备在直链上含有两个相同序列的突变型loxP序列的底物DNA(8.2kb)。利用该底物DNA，采用实施例3-(2)给出的方法进行依赖于Cre的重组反应，并进行解析。结果表明突变型loxP序列#2272间的重组反应大致具有与野生型loxP序列间的重组反应同等程度的非常高的效率。突变型loxP序列#2171虽然一部分以中间体形式中止了反应，但反应能进行到最终阶段。另外突变型loxP序列#2373反应几乎都停止在中间体，不能进行到最终阶段。
(3)不同序列的突变型loxP序列间的依赖于Cre的重组反应的研究
[1]含有不同序列的突变型loxP序列的质粒的构建
分别用限制酶SalI消化(2)-[3]中构建的质粒pBR2171和pBR2272，与插入到质粒中的突变型loxP序列不同的突变型loxP合成DNA(pBR2171与#2272或#2273、、pBR2272与#2373)连接后，用实施例2-(1)-[2]以及实施例3-(1)-[1]给出的方法构建含有两个不同序列的突变型loxP序列的3种质粒(pBLA2171-2272、pBLApBLA2171-2373、pBLA 2272-2373、各8.2kb、参照图4)。
[2]依赖于Cre的重组反应
用限制酶NheI分别消化[1]中构建的质粒，按照实施例3-(1)-[2]给出的方法制备在直链上含有两个不同序列的突变型loxP序列的底物DNA(8.2kb)。利用该底物DNA，采用实施例3-(2)给出的方法进行依赖于Cre的重组反应，并进行解析。结果无论与3种不同序列(#2171、#2272、#2373)的突变型loxP序列间的那个组合都不能发生依赖于Cre的重组反应。即每个突变型loxP序列与其它的loxP序列都不能发生交叉反应。
以上(1)至(3)的结果表明同时置换了两个碱基的突变型loxP序列与只置换一个碱基的突变型loxP序列相比，识别特异性更高。就是说，同时置换了两个碱基的突变型loxP序列不能与野生型loxP序列以及不同的突变型loxP序列反应，而相同序列的突变型loxP序列之间的反应程度与野生型loxP序列之间的反应程度相同。另外作为变异的部位理想的是在loxP序列的间隔区域的第2、第3、第4、第5个碱基中的一个和第7个碱基的组合，而即使是相同的碱基部位由于置换的碱基的种类的不同，反应性以及反应的特异性也不同。从以上结果可以看出，作为本发明目的的突变型loxP序列具体的有#2171(序列号：26)、#2271(序列号：29)、#2272(序列号30)、#3171(序列号：35)、#3371(序列号：39)、#4171(序列号：42)、#5171(序列号：49)等。
实施例5
插入在野生型loxP序列和突变型loxP序列之间的基因的置换中所需 要的质粒和粘粒载体的构建
(1)基因置换的靶用质粒和粘粒载体的构建
[1]在两个野生型loxP序列间具有克隆位点(SwaI位点)的质粒(puLwL)的构建
为了使在质粒pUC119的限制酶Ec1136II位点处同方向插入了两个野生型loxP序列的质粒puLL(钟ケ江等、Nucleic AcidsRes.，Vol.23，3816-3821(1995))中存在于两个loxP序列间的克隆部位由限制酶NruI位点变为SwaI位点进行了以下操作。
用限制酶NruI消化puLL，连接SwaI接头(5′-pGATTTAAATC-3′、序列号：61)后，再度用NruI消化。通过NruI的再度消化为的是除去没有结合SwaI接头而再生了NruI位点的质粒。用反应液转化大肠杆菌，得到在两个野生型loxP序列间克隆位点含有SwaI位点的质粒puLwL(3.3kb、图11中的A)。
[2]在野生型loxP序列和突变型loxP序列间含有克隆位点(SwaI位点)的质粒(puLwM和puMwL)的构建
为了构建将质粒puLwL的两个野生型loxP序列中的一个置换成突变型loxP序列的两种质粒，进行了以下(A)、(B)各个操作。质粒puLwM(图11中的B)和质粒puMwL(图11中的C)是同图所示puLwL的左侧以及右侧的野生型loxP序列分别置换为突变型loxP序列的产物。而这里作为突变型loxP序列用的是使野生型loxP序列的间隔部分的第2和第7个碱基同时变异的#2171(序列号：26)的序列。以下实施例中所说的突变型loxP序列都是指该序列。
(A)puLwM的构建
puLwL用限制酶XhoI消化，连接含有突变型loxP序列的60bp的合成DNA(图12、上侧链的序列号：57，下侧链的序列号：58)后，转化大肠杆菌，得到在野生型loxP序列和突变型loxP序列间含有SwaI位点的质粒puLwM(3.3kb)。再对该质粒puLwM的合成DNA部分的碱基序列进行解码，确认象所希望的那样插入了野生型loxP序列和突变型loxP序列。而由于将所用的合成DNA一端设计为XhoI消化片段，另一端设计为SalI消化片段，所以质粒puLwM的野生型loxP序列内的XhoI位点消失了。
(B)puMwL的构建
puMwL用限制酶MluI消化，连接含有突变型loxP序列的60bp的合成DNA(图13、上侧链的序列号：59，下侧链的序列号：60)后，转化大肠杆菌，得到在野生型loxP序列和突变型loxP序列间具有SwaI位点的质粒puLwM(3.3kb)。与质粒puLwM的操作一样，再对该质粒puMwL的合成DNA部分的碱基序列解码，进行确认。而由于将所用的合成DNA一端设计为MluI消化片段，另一端设计为BssH II消化片段，所以质粒puMwL的野生型loxP序列内的MluI位点消失了。
[3]在CAG启动子的克隆部位插入了两个野生型loxP序列的质粒(pCALL)的构建
为了得到CAG启动子的启动子序列与聚A序列之间插入了两个野生型loxP序列的质粒，制备了以下两个DNA。这里所谓的CAG启动子是作为高表达载体于特开平3-168087号公报公开的启动子。
(a)对将含有CAG启动子的质粒pCAGGS(Niwa等，Gene，Vol.108，193-200(1991))的克隆部位EcoRI位点变成SwaI位点的质粒pCAGw(特开平8-84589号公报10页)用限制酶SwaI进行消化的DNA。
(b)用限制酶BamHI和EcoRI同时消化质粒puLL([1]中记载的)，再通过Klenow酶将两端补平后，含有经琼脂糖凝胶电泳回收的含有两个野生型loxP序列的大约100bp的DNA片段。
连接(a)(b)两个DNA片段，用限制酶SwaI消化后，转化大肠杆菌，得到质粒pCALL(4.9kb)。
[4]质粒pCALL的克隆部位变成SwaI位点的质粒(pCALwL)的构建
为了使存在于质粒pCALL的两个loxP序列间的克隆部位由限制酶NruI位点变为SwaI位点进行了以下操作。
用限制酶NruI消化pCALL，连接SwaI接头(5′-pGATTTAAATC-3′、序列号：61)后，再度用NruI消化。利用NruI再度消化的理由与[1]相同。用反应液转化大肠杆菌，得到在CAG启动子内存在两个野生型loxP序列，而且它们之间含有克隆位点的SwaI位点的质粒pCALwL(4.9kb、图14中的D)。
[5]CAG启动子内插入了野生型loxP序列和突变型loxP序列的质粒(pCALwM)的构建
为了构建将质粒pCALwL的两个野生型loxP序列中的一个置换成突变型loxP序列的质粒，进行了以下两步操作。
(a)用限制酶MluI和XhoI同时消化质粒pCALwL后，通过琼脂糖凝胶电泳回收不含有野生型loxP序列的大约4.8kb的DNA片段。
(b)用限制酶MluI和XhoI同时消化质粒puLwL后，进行琼脂糖凝胶电泳，回收含有野生型loxP序列和突变型loxP序列的100bp的DNA片段。
连接(a)(b)制备的两个DNA，转化大肠杆菌，得到质粒pCALwM(4.9kb、图14中的E)。PCALwM是含有启动子/野生型loxP序列/SwaI位点(克隆部位)/突变型loxP序列/聚A序列结构的质粒。
[6]重组腺病毒制备用的粘粒载体(pAxCALwM)的制备
为了制备插入了[5]中制备的质粒PCALwM中从启动子到聚A序列部分的粘粒载体，进行了以下两步操作。而粘粒载体的制备是按照已有的方法(Miyake等，Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.93，1320-1324(1996)和特开平7-298877号公报)进行的。
(a)用限制酶SwaI消化插入了除了腺病毒5型中的E1和E3基因以外的几乎全长序列的盒式粘粒pAxcw(特开平8-308585号公报15页)
(b)用限制酶ApaLI和HindIII以及HincII同时消化质粒pCALwM，再通过Klenow酶使两端补平，对反应液进行琼脂糖凝胶电泳，回收大约2.4kb的片段。
将(a)(b)中制备的两个DNA连接后，用λ·in·vitro·包装试剂盒(Gigapack XL、Stratagene公司制)将反应液的一部分进行包装反应，使反应液感染大肠杆菌，得到盒式粘粒pAxCALwM(44.9kb)。
(2)基因置换的靶侧质粒的构建
[1]在野生型loxP序列和突变型loxP序列间插入了lacZ基因的质粒(puLZM)的构建
为了得到在质粒puLwM((1)-[2]记载的)的野生型loxP序列和突变型loxP序列间插入了大肠杆菌lacZ基因的质粒，进行了以下两步操作。
(a)用限制酶SwaI消化质粒puLwM后，通过琼脂糖凝胶回收直链型的DNA片段。
(b)用限制酶SalI和PstI同时消化质粒pSRlacZ(Miyake等，Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.93，1320-1324(1996))，再通过Klenow酶使两端补平，通过琼脂糖凝胶电泳回收含有lacZ基因的大约3.1kb的DNA片段。
将(a)(b)中制备的两个DNA连接后，限制酶SwaI消化后转化大肠杆菌，得到质粒puLZM(6.4kb、图15中的F)。
[2]在野生型loxP序列和突变型loxP序列间插入了SV40的复制起点(ori)和聚A的质粒(puMOL)的构建
为了得到在质粒puMwL的野生型loxP序列和突变型loxP序列间插入了SV40的ori和聚A的质粒，进行了以下两步操作。
(a)用限制酶SwaI消化质粒puMwL((1)-[2]记载的)后，通过琼脂糖凝胶回收直链型的DNA片段。
(b)用限制酶BamHI消化质粒pCAGGS((1)-[3]记载的)后，再通过Klenow酶补平，通过琼脂糖凝胶电泳回收含有SV40的ori和聚A的大约340bp的DNA片段。
将(a)(b)中制备的两个DNA连接后，限制酶SwaI消化后转化大肠杆菌，得到质粒puMOL(3.6kb、图15中的G)。
[3]插入了野生型loxP序列/lacZ基因/突变型loxP序列/SV40的ori和聚A序列/野生型loxP序列的质粒(puLZMOL)的构建
为了从质粒puLZM除去突变型loxP序列，插入含有质粒puMOL的突变型loxP序列/SV40的ori和聚A序列/野生型loxP序列片段，进行了以下操作。
(a)用限制酶NheI和XhoI同时消化质粒puLZM后，通过琼脂糖凝胶电泳回收含有野生型loxP序列和lacZ基因的大约6.4kb的DNA片段。
(b)用限制酶NheI和XhoI同时消化质粒puMOL后，通过琼脂糖凝胶电泳，回收含有突变型loxP序列/SV40的ori和聚A序列/野生型loxP序列的大约440bp的DNA片段。
连接(a)(b)制备的两个DNA，限制酶SwaI消化后转化大肠杆菌，得到质粒puLZMOL(6.8kb、图16中的H)。
[4]质粒puLZMOL的lacZ基因的5′上游处插入了胸苷激酶基因的聚A的质粒(puALZMOL)的构建
为了构建将单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的胸苷激酶(TK)基因的聚A序列插入到质粒puLZMOL的质粒，进行了以下两步操作。
(a)为了得到在lacZ基因的5′上游侧的野生型loxP序列的5′上游的一个部位切断的质粒puLZMOL的DNA片段，进行了以下操作。用限制酶SmaI消化质粒质粒puLZMOL，然后再用限制酶KpnI消化后，通过琼脂糖凝胶电泳回收大约6.8kb的直链型的DNA片段。
(b)质粒pTK是在pBR322的BamHI位点处插入了含有HSV-1的TK基因的大约3.6kb的BamHI消化片段的质粒(M.Wigler等，Cell，Vol.14.725-731(1978))。如果对pTK用限制酶SmaI和NcoI进行消化，能切出大约320bp的TK基因的聚A序列。而为了使切出的DNA片段的两端成为SmaI和KpnI位点，进行了以下操作。用限制酶NcoI消化质粒pTK，再通过Klenow酶使两端补平。然后连接了KpnI接头(5′-pGGGTACCC-3′)后，用限制酶KpnI消化。再用限制酶SmaI消化后进行琼脂糖凝胶电泳，回收含有TK基因的聚A序列的大约320bp的DNA片段。
将(a)(b)中制备的两个DNA连接后，转化大肠杆菌，得到质粒puALZMOL(7.1kb、图16中的I)。puALZMOL是含有TK基因的聚A序列/野生型loxP序列/lacZ基因/突变型loxP序列/SV40的ori和聚A序列/野生型loxP序列结构的质粒。而在该过程中插入TK基因的聚A序列是为了在制备含有这一系列基因的重组腺病毒时，使位于插入部位的上游的未鉴定的来自腺病毒的启动子不会引起lacZ基因的转录。
[5]重组腺病毒制备用的粘粒载体(pAxALZMOL)的制备
为了制备插入了质粒puALZMOL的插入基因(TK基因的聚A序列/野生型loxP序列/lacZ基因/突变型loxP序列/SV40的ori和聚A序列/野生型loxP序列)的粘粒载体，进行了以下两步操作。
用限制酶XbaI和XhoI以及DraI同时消化质粒puALZMOL，再通过Klenow酶使两端补平，对反应液进行琼脂糖凝胶电泳，回收大约4.5kb的DNA片段。将该片段与限制酶SwaI消化的盒式粘粒pAxcw((1)-[6]中制备)连接后，经限制酶SwaI消化后，用λ·in·vitro·包装试剂盒(Gigapack XL、Stratagene社制)将反应液的一部分进行包装反应，使反应液感染大肠杆菌，得到盒式粘粒pAxALZMOL(46.7kb)。
实施例6
基因置换中所必需的重组腺病毒的制备
(1)基因置换中的靶用重组腺病毒(AxCALwM)的制备
为了制备在非增殖型腺病毒载体(E1和E3基因缺失)的E1基因缺失部位处插入了启动子/野生型loxP序列/SwaI位点(克隆部位)/突变型loxP序列/聚A序列的重组腺病毒，进行了以下操作。而重组腺病毒的制备是按照已有的方法(Miyake等，Proc.Natl.Acad.Sci.，vol.93，1320-1324(1996)以及特开平7-298877号公报)进行的。
用限制酶EcoT22I对来自缺失了E3基因的人腺病毒5型的毒株Ad5-dlX(I.Saito等，J.Virol.，Vol.54，711-719(1985))的病毒DNA-末端蛋白质复合体进行消化。用该病毒DNA-末端蛋白质复合体和实施例5-(1)-[6]中制备的粘粒载体AxCALwM采用磷酸钙共沉淀法转化293细胞。对生成的重组病毒的克隆以及病毒进行筛选，得到目的重组病毒AxCALwM(图17)。对该重组病毒进行继代培养，对高效价的4次病毒或5次病毒通过CsCl超离心法纯化(Y.Kanegae等，Jpn.J.Med.Sci.Biol.，Vol.47，157-166(1994))的病毒液用于以后的实验。
(2)基因置换的施主用重组腺病毒(AxALZMOL)的制备
为了制备在非增殖型腺病毒载体(E1和E3基因缺失)的E1基因缺失部位处插入了TK基因的聚A序列/野生型loxP序列/lacZ基因/突变型loxP序列/SV40的ori和聚A序列/野生型loxP序列的重组腺病毒，进行了以下操作。
采用磷酸钙共沉淀法使Ad5-dlX的病毒DNA-末端蛋白质复合体和实施例5-(2)-[5]中制备的粘粒载体pAxALZMOL转化293细胞。使用与(1)同样的方法，得到目的重组病毒AxALZMOL(图17)。将对该重组病毒的4次病毒液或5次病毒液通过CsCl超离心法纯化的病毒液也用于以后的实验。
实施例7
存在于细胞染色体上的基因的置换中用的细胞株的制备
(1)对潮霉素B抗性基因进行表达的基因置换用细胞株的制备
[1]在野生型loxP序列和突变型loxP序列之间含有克隆部位的报告基因插入用质粒(pCALwMds)的构建
实施例5-(1)-[5]中制备的质粒pCALwM(图14中的E)是在质粒pCAGGS(实施例5-(1)-[3]记载的)的CAG启动子内的克隆部位的EcoRI位点插入了野生型loxP序列/克隆部位(SwaI位点)/突变型loxP序列的质粒。以下进行的操作的目的是从该pCALwM除去SV40的ori和聚A序列。
用限制酶BamHI消化pCALwM，除去SV40的ori和聚A序列，然后自身连接后转化大肠杆菌，得到质粒pCALwMds(4.6kb、图18中的A)。
[2]插入了潮霉素B抗性基因的质粒(pCALhmBMds)的构建
为了构建在质粒pCALwMds的SwaI位点插入了潮霉素B抗性基因的质粒，制备了以下两个DNA。
(a)质粒pCALwMds被限制酶SwaI消化了的DNA片段。
(b)用限制酶AmaI和DraI同时消化质粒pCHD2L(Ikeda等，Gene，Vol.71，19-27(1988))后，通过琼脂糖凝胶电泳回收的含有潮霉素B抗性基因的大约1.1kb的DNA片段。
连接(a)(b)两个DNA，转化大肠杆菌，得到质粒pCALhmBMds(5.7kb、图18中的B)。pCALhmBMds是在CAG启动子内的野生型loxP序列和突变型loxP序列之间插入了潮霉素B抗性基因的质粒。
[3]对潮霉素B抗性基因进行表达的转化细胞株的制备
为了得到在细胞的染色体上含有一个：启动子/野生型loxP序列/潮霉素B抗性基因/突变型loxP序列/聚A序列构成的外来DNA拷贝的转化细胞株，进行了以下操作。而细胞的转化是按照磷酸钙-DNA共沉淀法(Chen-Okayama法)进行的。
(i)将[2]中制备的质粒pCALhmBMds20μg溶解于终浓度为250mM的氯化钙溶液中(溶液量100μl)，加入100μl的2×BBS溶液(50mM N，N-双[2-羟乙基]-2-氨基乙磺酸/280mM NaCl2/1.5mM Na2HPO4(pH6.95))后，添加到在加了5％FCS的DMEM培养基中培养的6cm平皿的CV-1细胞中，在3％CO2存在下于35℃培养大约24小时。
(ii)除去培养液，用PBS(-)洗净细胞后，添加加有10％FCS的DMEM，在5％CO2存在下于37℃培养过夜。
(iii)从6cm平皿上将细胞拨落下来，铺在96孔板中，再培养一个晚上后，向培养液中添加含有终浓度0.4mg/ml的潮霉素B的培养基，继续培养，每隔3到4天更换一次含有潮霉素B的培养基。
(iv)对大约生存了3周后的细胞(潮霉素B抗性细胞株)进行克隆，提取扩大培养后的细胞的基因组DNA。用在转化中使用的质粒pCALhmBMds中不存在识别位点的限制酶PvuII消化该基因组，然后进行电泳，用质粒pCALhmBMds的全长作探针，进行Southern印迹，得到了18株细胞染色体上只有一个目的基因拷贝插入的转化细胞。而只有一个目的基因拷贝插入也可以通过在质粒pCALhmBMds中只存在一个识别位点的限制酶EcoRI消化细胞的基因组DNA后进行的Southern印迹来确认。
(2)对博莱霉素抗性基因进行表达的基因置换用细胞株的制备
[1]插入了博莱霉素抗性基因的质粒(pCALGFBMds)的构建
为了构建在质粒pCALwMds的SwaI位点插入博莱霉素抗性基因的质粒，进行了以下操作。
质粒pTracer-CMV(Invitogen社制)用限制酶PmaCI消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，回收含有绿色荧光蛋白质(green fluorescentprotein：GFP)和博莱霉素抗性基因的融合蛋白基因的大约1.1kb的DNA片段。将该DNA片段与限制酶SwaI消化的质粒pCALwMds进行连接((1)-[2]中制备的)，限制酶SwaI消化后，转化大肠杆菌，得到质粒pCALGFBMds(5.7kb、图18中的C)。质粒pCALGFBMds是在CAG启动子内的野生型loxP序列和突变型loxP序列之间插入了GFP和博莱霉素抗性基因的融合蛋白基因的质粒。
[2]对博莱霉素抗性基因进行表达的转化细胞株的制备
为了得到在细胞的染色体上含有一个启动子/野生型loxP序列/GFP和博莱霉素抗性基因的融合蛋白的基因/突变型loxP序列/聚A序列的外来DNA拷贝的转化细胞株，进行了以下操作。
基本操作与(1)-[3]中给出的潮霉素B抗性细胞株的制备方法相同，以下只给出不同点。CV-1细胞的转化利用[2]中制备的质粒pCALGFBMds。转化细胞株的筛选药物用博莱霉素(终浓度0.4mg/ml)。为了选择只插入一个拷贝的目的基因的转化细胞而进行的Southern印迹使用pCALGFBMds的全长作探针。
为了通过插入基因的表达的强弱对得到的博莱霉素抗性细胞株(都只插入一个目的基因拷贝)进行分类，测定了GFP的表达量。GFP的表达量通过观测通过478nm的激发光发出的507nm的荧光来测定，分为GFP表达强的细胞株(C18，C35)、中等程度的细胞株(C29，C38)、弱的细胞株(C19，C30)(数字代表细胞株的编号)。
实施例8
存在于腺病毒基因组上的基因的置换
为了实际证实通过野生型loxP序列和突变型loxP序列的组合能够在腺病毒基因组上置换质粒DNA(环状DNA)上存在的lacZ基因，进行了以下的实验。本实验的原理如下所示那样(图17)。实施例6中制备的施主用重组腺病毒AxALAMOL插入了TK基因的聚A序列/野生型loxP序列/lacZ基因/突变型loxP序列/SV40的ori和聚A序列/野生型loxP序列。如果用该病毒和实施例1中给出的Cre表达重组腺病毒AxCANCre同时感染培养细胞，在两个野生型loxP序列间会发生特异的重组反应，生成含有TK基因的聚A序列/野生型loxP序列的腺病毒(a)和含有野生型loxP序列/lacZ基因/突变型loxP序列/SV40的ori和聚A序列结构的环状DNA(b)。使用插入了两个野生型loxP序列的重组腺病毒和Cre表达重组腺病毒的该反应的效率非常高(钟ケ江等、Nucleic Acids Res.，Vol.23，3816-3821(1995))，几乎可以预测在100％的细胞中生成腺病毒(a)和环状DNA(b)。环状DNA(b)虽然有SV40ori的启动子，但其转录由于被紧靠它后面的SV40聚A封闭，所以不能进行lacZ基因的表达。如果对生成该环状DNA(b)的细胞进一步用实施例6中制备的靶用重组腺病毒AxCALwM感染，则在环状DNA(b)和AxCALwM间会发生重组反应，经过各有两个野生型loxP序列和突变型loxP序列的中间体，生成含有启动子/野生型loxP序列/lacZ基因/突变型loxP序列/聚A序列结构的腺病毒(c)。若是用腺病毒(c)感染，lacZ基因进行表达，生成被lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶，通过以下给出的染色操作，细胞被染成蓝色。
在实际的实验中，使施主用重组腺病毒AxALAMOL、Cre表达重组腺病毒AxCANCre、靶用重组腺病毒AxCALwM三种病毒同时感染培养细胞(CV-1或COS-1细胞)。各个病毒的moi(重复感染度)如下所示。靶用重组腺病毒：moi＝9；Cre表达重组腺病毒：moi＝5或15；施主用重组腺病毒AxALAMOL：moi＝10、30、60、100、200。病毒感染一小时后，加培养基进行培养。3日后，除去培养液，用PBS(-)洗细胞表面后，加0.25％戊二醛液，于4℃下，固定细胞(10分钟)后，再次用PBS(-)洗，加X-Gal染色液(5mM铁氰化钾/5mM亚铁氰化钾/2mM氯化镁/1mg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-半乳糖苷)/PBS(-))染色过夜。图19给出了染色结果。
图19是使Cre表达重组腺病毒以moi＝15感染CV-1细胞时的结果。若是用施主用重组腺病毒以moi＝60感染大约有60％，若是moi＝100大约有90％的细胞被染成蓝色。另外图19中没有给出，只使施主用重组腺病毒感染，以及即使用施主用重组腺病毒和Cre表达重组腺病毒同时感染都不存在染成蓝色的细胞。使Cre表达重组腺病毒以moi＝5感染时，以及使用COS-1细胞进行同样实验时得到大致与图19相同的结果。
以上的结果表示施主用重组腺病毒的基因组上存在的lacZ基因被插入到靶用重组腺病毒的基因组上，lacZ基因与启动子直接相连，表达β-半乳糖苷酶的结果，即细胞被染成蓝色。就是说明确地给出了施主用重组腺病毒的基因组上存在的介于野生型loxP序列和突变型loxP序列之间的lacZ基因借助于环状DNA的形式以非常高的效率被置换到靶用重组腺病毒的基因组上的野生型loxP序列和突变型loxP序列之间的证据。
实施例9
细胞染色体上存在的基因的置换
实施例8表明，可以将环状DNA上存在的基因置换到腺病毒的基因组，为了实际证实细胞染色体上的基因也能够置换，进行了以下实验。其原理与实施例8相同，代替靶用重组腺病毒，使用在染色体上插入了一个实施例7中制备的启动子/野生型loxP序列/潮霉素B抗性基因/突变型loxP序列/聚A序列的DNA拷贝的转化细胞株(靶细胞)(图20)。
对实施例7中制备的任意的潮霉素B抗性的6株靶细胞(C3、C7、C9、C11、C19、C28)分别用Cre表达重组腺病毒AxCANCre(moi＝5)、施主用重组腺病毒AxALAMOL(moi＝10、30、100、300)同时感染一小时，添加培养基进行培养。3日后进行与实施例8完全相同的操作，对进行了β-半乳糖苷酶表达的细胞进行染色。结果如图21所示。因细胞株不同其频率也不同，用施主用重组腺病毒以moi＝100进行感染时，10％(C19)到30％(C8)的细胞被染成蓝色。如果用施主用重组腺病毒以moi＝300进行感染时，虽然被染成蓝色的细胞的比例进一步增加，但能看到由大量的腺病毒粒子引起的细胞毒性。图中没有给出，只用施主用重组腺病毒以moi＝100进行感染，没有Cre表达重组腺病毒时，完全不存在染成蓝色的细胞。
以上的结果明确地给出了施主用重组腺病毒的基因组上野生型loxP序列和突变型loxP序列之间存在的lacZ基因借助于环状DNA的形式以非常高的效率被置换到靶用细胞染色体上的野生型loxP序列和突变型loxP序列之间的证据。
工业实用性
本发明提供在重组酶Cre存在下，与野生型loxP序列不发生重组反应，而同一序列的两个突变型loxP序列间的重组反应以与两个野生型loxP序列间同等程度效率发生的突变型loxP序列。另外本发明还提供通过野生型loxP序列与突变型loxP序列的组合，或者不同序列的突变型loxP序列的组合，在以动物细胞为首的高等真核细胞中进行高效的基因插入或基因置换的方法。
序列表
序列编号：1的碱基序列是野生型loxP序列。
序列编号：2～54的碱基序列是突变型loxP序列。
序列编号：55的碱基序列是设计成含有野生型loxP序列和限制酶识别部位那样的序列的有意义链。
序列编号：56的碱基序列是设计成含有野生型loxP序列和限制酶识别部位那样的序列的反意义链。
序列编号：57的碱基序列是设计成含有突变型loxP序列和限制酶识别部位那样的序列的有意义链。
序列编号：58的碱基序列是设计成含有突变型loxP序列和限制酶识别部位那样的序列的反意义链。
序列编号：59的碱基序列是设计成含有突变型loxP序列和限制酶识别部位那样的序列的有意义链。
序列编号：60的碱基序列是设计成含有突变型loxP序列和限制酶识别部位那样的序列的反意义链。
序列编号：61的碱基序列是SwaI接头。
                               序列表
<110>住友制药株式会社
<120>突变型loxP序列及其应用
<130>E4317-00
<150>JP 9-331289 and JP 10-273150
<151>1997-11-13 and 1998-9-28
<160>61
<210>1
<211>34
<212>DNA
<213>噬菌体P1
<400>1
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat                                  34
<210>2
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>2
ataacttcgt atagtgtatg ctatacgaag ttat                                  34
<210>3
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>3
ataacttcgt atattgtatg ctatacgaag ttat                                  34
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>4
ataacttcgt atactgtatg ctatacgaag ttat                                  34
<210>5
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>5
ataacttcgt ataacgtatg ctatacgaag ttat                                  34
<210>6
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>6
ataacttcgt ataaagtatg ctatacgaag ttat                                  34
<210>7
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>7
ataacttcgt ataaggtatg ctatacgaag ttat                                  34
<210>8
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>8
ataacttcgt ataatatatg ctatacgaag ttat                                  34
<210>9
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>9
ataacttcgt ataatctatg ctatacgaag ttat                                  34
<210>10
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>10
ataacttcgt ataatttatg ctatacgaag ttat                                  34
<210>11
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>11
ataacttcgt ataatgcatg ctatacgaag ttat                                  34
<210>12
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>12
ataacttcgt ataatgaatg ctatacgaag ttat                                  34
<210>13
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>13
ataacttcgt ataatggatg ctatacgaag ttat                                  34
<210>14
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>14
ataacttcgt ataatgtgtg ctatacgaag ttat                                  34
<210>15
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>15
ataacttcgt ataatgtttg ctatacgaag ttat                                  34
<210>16
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>16
ataacttcgt ataatgtctg ctatacgaag ttat                                  34
<210>17
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>17
ataacttcgt ataatgtacg ctatacgaag ttat                                  34
<210>18
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>18
ataacttcgt ataatgtaag ctatacgaag ttat                                  34
<210>19
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>19
ataacttcgt ataatgtagg ctatacgaag ttat                                  34
<210>20
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>20
ataacttcgt ataatgtata ctatacgaag ttat                                  34
<210>21
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>21
ataacttcgt ataatgtatc ctatacgaag ttat                                  34
<210>22
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>22
ataacttcgt ataatgtatt ctatacgaag ttat                                  34
<210>23
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>23
ataacttcgt ataatgtatg ttatacgaag ttat                                  34
<210>24
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>24
ataacttcgt ataatgtatg gtatacgaag ttat                                  34
<210>25
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>25
ataacttcgt ataatgtatg atatacgaag ttat                                  34
<210>26
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>26
ataacttcgt ataacgtata ctatacgaag ttat                                  34
<210>27
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>27
ataacttcgt ataacgtatc ctatacgaag ttat                                  34
<210>28
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>28
ataacttcgt ataacgtatt ctatacgaag ttat                                  34
<210>29
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>29
ataacttcgt ataaagtata ctatacgaag ttat                                  34
<210>30
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>30
ataacttcgt ataaagtatc ctatacgaag ttat                                  34
<210>31
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>31
ataacttcgt ataaagtatt ctatacgaag ttat                                  34
<210>32
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>32
ataacttcgt ataaggtata ctatacgaag ttat                                  34
<210>33
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>33
ataacttcgt ataaggtatc ctatacgaag ttat                                  34
<210>34
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>34
ataacttcgt ataaggtatt ctatacgaag ttat                                  34
<210>35
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>35
ataacttcgt ataatatata ctatacgaag ttat                                  34
<210>36
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>36
ataacttcgt ataatatatc ctatacgaag ttat                                  34
<210>37
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>37
ataacttcgt ataatctata ctatacgaag ttat                                  34
<210>38
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>38
ataacttcgt ataatctatc ctatacgaag ttat                                  34
<210>39
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>39
ataacttcgt ataatttata ctatacgaag ttat                                  34
<210>40
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>40
ataacttcgt ataatttatc ctatacgaag ttat                                  34
<210>41
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>41
ataacttcgt ataatttatt ctatacgaag ttat                                  34
<210>42
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>42
ataacttcgt ataatgcata ctatacgaag ttat                                  34
<210>43
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>43
ataacttcgt ataatgcatc ctatacgaag ttat                                  34
<210>44
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>44
ataacttcgt ataatgaata ctatacgaag ttat                                  34
<210>45
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>45
ataacttcgt ataatgaatc ctatacgaag ttat                                  34
<210>46
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>46
ataacttcgt ataatggata ctatacgaag ttat                                  34
<210>47
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>47
ataacttcgt ataatggatc ctatacgaag ttat                                  34
<210>48
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>48
ataacttcgt ataatggatt ctatacgaag ttat                                  34
<210>49
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>49
ataacttcgt ataatgtgta ctatacgaag ttat                                  34
<210>50
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>50
ataacttcgt ataatgtttc ctatacgaag ttat                                  34
<210>51
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>51
ataacttcgt ataatgtctt ctatacgaag ttat                                  34
<210>52
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>52
ataacttcgt ataatgtaca ctatacgaag ttat                                  34
<210>53
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>53
ataacttcgt ataatgtaac ctatacgaag ttat                                  34
<210>54
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>突变型loxP的序列
<400>54
ataacttcgt ataatgtagt ctatacgaag ttat                                  34
<210>55
<211>52
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>设计的含有野生型loxP和限制酶识别位点的序列的
     有意义链
<400>55
tcgaggtgca cataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatacgcg tt              52
<210>56
<211>52
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>设计的含有野生型loxP和限制酶识别位点的序列的
     反意义链
<400>56
ctagaacgcg tataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatgtgca cc              52
<210>57
<211>60
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>设计的含有突变型loxP和限制酶识别位点的序列的
     有意义链
<400>57
tcgagtccgg aataacttcg tataacgtat actatacgaa gttatgctag catttaaatg      60
<210>58
<211>60
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>设计的含有突变型loxP和限制酶识别位点的序列的
     反意义链
<400>58
tcgacattta aatgctagca taacttcgta tagtatacgt tatacgaagt tattccggac      60
<210>59
<211>60
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>设计的含有突变型loxP和限制酶识别位点的序列的
     有意义链
<400>59
cgcgcattta aattccggaa taacttcgta taacgtatac tatacgaagt tatgctagca      60
<210>60
<211>60
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>设计的含有突变型loxP和限制酶识别位点的序列的
     反意义链
<400>60
cgcgtgctag cataacttcg tatagtatac gttatacgaa gttattccgg aatttaaatg      60
<210>61
<211>10
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>SwaI接头
<400>61
gatttaaatc                                                             10

Claims (33)

1.具有以下性质的突变型loxP序列：
(a)由在来自大肠杆菌P1噬菌体的下面的野生型loxP序列中，中央部分的8个碱基(间隔区)的第2个(T)、第3个(G)、第4个(T)或第5个(A)碱基中有一个碱基以及第6个(T)或第7个(G)碱基中有一个碱基被置换为不同的碱基，
                  12345678
5’-ATAACTTCGTATA  ATGTATGC TATACGAAGTTAT-3’
                    间隔区
(b)即使在重组酶Cre存在下与野生型loxP序列之间也不发生特异性DNA重组反应，
(c)在重组酶Cre存在下，与具有同一序列的另一突变型loxP序列之间能发生特异性DNA重组反应。
2.权利要求1记载的突变型loxP序列，是序列编号：26、29、30、35、39、42或49表示的序列。
3.权利要求1记载的突变型loxP序列，间隔区以外的区域至少有1个碱基的置换。
4.权利要求1记载的突变型loxP序列，是即使在重组酶Cre存在下与具有不同序列的另一突变型loxP序列之间也不发生特异DNA重组反应的序列。
5.具有以下性质的突变型loxP序列：
(a)由在来自大肠杆菌P1噬菌体的下述的野生型loxP序列中，从中央部分的8个碱基(间隔区)的第2个(T)、第3个(G)、第4个(T)碱基中选出的一个碱基被不同的碱基置换，
                  12345678
5’-ATAACTTCGTATA  ATGTATGC TATACGAAGTTAT-3’
                   间隔区
(b)即使在重组酶Cre存在下与野生型loxP序列之间也不发生特异性DNA重组反应，
(c)在重组醇Cre存在下，与具有同一序列的另一突变型loxP序列之间能发生特异性DNA重组反应。
6.权利要求5记载的突变型loxP序列，间隔区以外的区域至少有1个碱基的置换。
7.权利要求5记载的突变型loxP序列，是即使在重组酶Cre存在下，与具有不同序列的另一突变型loxP序列之间也不能发生特异性DNA重组反应的序列。
8.含有权利要求1至7中任一项记载的突变型loxP序列的DNA。
9.权利要求8记载的DNA，其中含有至少一个野生型loxP序列以及至少一个权利要求1记载的突变型loxP序列。
10.权利要求9记载的DNA，在野生型loxP序列和突变型loxP序列之间插入了所希望的基因。
11.权利要求8记载的DNA，其中含有至少一个野生型loxP序列以及至少一个权利要求5记载的突变型loxP序列。
12.权利要求11记载的DNA，在野生型loxP序列和突变型loxP序列之间插入了所希望的基因。
13.权利要求8记载的DNA，其中至少含有2个序列互不相同的权利要求4记载的突变型loxP序列。
14.权利要求13记载的DNA，是在序列互不相同的2个突变型loxP序列之间插入了所希望的基因的DNA。
15.权利要求8记载的DNA，其中至少含有2个序列互不相同的权利要求7记载的突变型loxP序列。
16.权利要求15记载的DNA，在序列互不相同的2个突变型loxP序列之间插入了所希望的基因。
17.通过权利要求9至16中任一项记载的DNA转化的细胞。
18.基因置换方法，是在重组酶Cre存在下，使下面的DNA(a)和DNA(b)反应，得到下面DNA(c)的过程构成的：
(a)依次含有野生型loxP序列、基因A和权利要求1或5记载的突变型loxP序列的DNA；
(b)依次含有野生型loxP序列、基因B和与DNA(a)相同的突变型loxP序列的环状DNA；
(c)在DNA(a)中基因A被基因B置换的DNA；这里基因A和基因B是互不相同的任意的基因。
19.权利要求18记载的方法，其特征是：基因B不是功能性的基因。
20.权利要求18记载的方法，其特征是：基因A不是功能性的基因。
21.权利要求18记载的方法，其特征是：DNA(a)是细胞染色体DNA、DNA(b)是质粒DNA或双链环状DNA病毒的DNA。
22.权利要求18记载的方法，其特征是：DNA(a)是细胞染色体DNA，DNA(b)具有通过在细胞内转变、变成双链环状DNA的性质。
23.权利要求18记载的方法，其特征是：DNA(a)是双链DNA病毒的染色体DNA，DNA(b)是质粒DNA或双链环状DNA病毒的DNA。
24.权利要求18记载的方法，其特征是：DNA(a)是双链DNA病毒的染色体DNA，DNA(b)具有通过在细胞内转变、变成双链环状DNA的性质。
25.权利要求23记载的方法，其特征是：DNA(a)的双链DNA病毒是腺病毒。
26.基因置换方法，是在重组酶Cre存在下，使下面的DNA(a)和DNA(b)反应，得到下面DNA(c)的过程构成的：
(a)含有序列互不相同的权利要求4或7记载的第1突变型loxP序列和第2突变型loxP序列以及基因A的DNA，具有第1突变型loxP序列/基因A/第2突变型loxP序列的顺序；
(b)依次含有第1突变型loxP序列、基因B和第2突变型loxP序列的环状DNA；
(c)在DNA(a)中基因A被基因B置换的DNA；这里基因A和基因B是互不相同的任意的基因。
27.权利要求26记载的方法，其特征是：基因B不是功能性的基因。
28.权利要求26记载的方法，其特征是：基因A不是功能性的基因。
29.权利要求26记载的方法，其特征是：DNA(a)是细胞染色体DNA、DNA(b)是质粒DNA或双链环状DNA病毒的DNA。
30.权利要求26记载的方法，其特征是：DNA(a)是细胞染色体DNA，DNA(b)具有通过在细胞内转变、变成双链环状DNA的性质。
31.权利要求26记载的方法，其特征是：DNA(a)是双链DNA病毒的染色体DNA，DNA(b)是质粒DNA或双链环状DNA病毒的DNA。
32.权利要求26记载的方法，其特征是：DNA(a)是双链DNA病毒的染色体DNA，DNA(b)具有通过在细胞内转变、变成双链环状DNA的性质。
33.权利要求31记载的方法，其特征是：DNA(a)的双链DNA病毒是腺病毒。
CNB988127237A 1997-11-13 1998-11-12 突变型loxP序列及其应用 Expired - Lifetime CN1173039C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP33128997 1997-11-13
JP331289/1997 1997-11-13
JP27315098A JP4206154B2 (ja) 1997-11-13 1998-09-28 変異型ｌｏｘＰ配列とその応用
JP273150/1998 1998-09-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1283233A CN1283233A (zh) 2001-02-07
CN1173039C true CN1173039C (zh) 2004-10-27

Family

ID=26550537

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB988127237A Expired - Lifetime CN1173039C (zh) 1997-11-13 1998-11-12 突变型loxP序列及其应用

Country Status (12)

Country Link
US (1) US6465254B1 (zh)
EP (1) EP1035208B1 (zh)
JP (1) JP4206154B2 (zh)
KR (1) KR100639088B1 (zh)
CN (1) CN1173039C (zh)
AT (1) ATE412759T1 (zh)
AU (1) AU741415B2 (zh)
CA (1) CA2309386C (zh)
DE (1) DE69840173D1 (zh)
DK (1) DK1035208T3 (zh)
NZ (1) NZ504307A (zh)
WO (1) WO1999025851A1 (zh)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6964861B1 (en) 1998-11-13 2005-11-15 Invitrogen Corporation Enhanced in vitro recombinational cloning of using ribosomal proteins
AU724922B2 (en) 1995-06-07 2000-10-05 Invitrogen Corporation Recombinational cloning using engineered recombination sites
US6720140B1 (en) 1995-06-07 2004-04-13 Invitrogen Corporation Recombinational cloning using engineered recombination sites
US5851808A (en) 1997-02-28 1998-12-22 Baylor College Of Medicine Rapid subcloning using site-specific recombination
CA2307016A1 (en) 1997-10-24 1999-05-06 Life Technologies, Inc. Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites
JP4153607B2 (ja) 1998-11-18 2008-09-24 大日本住友製薬株式会社 新規な組換えアデノウイルス
AU774643B2 (en) 1999-03-02 2004-07-01 Invitrogen Corporation Compositions and methods for use in recombinational cloning of nucleic acids
WO2001011058A1 (en) * 1999-08-09 2001-02-15 Monsanto Technology Llc Novel cloning methods and vectors
JP2001321174A (ja) * 2000-05-11 2001-11-20 Japan Science & Technology Corp アンチセンス型ジーントラップベクター
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
WO2002028175A2 (en) * 2000-10-03 2002-04-11 Association Pour Le Developpement De La Recherche En Genetique Moleculaire (Aderegem) Transgenic mouse for targeted recombination mediated by modified cre-er
FR2814642B1 (fr) * 2000-10-03 2005-07-01 Ass Pour Le Dev De La Rech En Souris transgenique pour la recombinaison ciblee mediee par la cre-er modifiee
WO2002083889A2 (en) * 2001-04-10 2002-10-24 Imperial College Innovations Limited Methods for the production of minicircles
US6838285B2 (en) * 2001-09-18 2005-01-04 Becton Dickinson Site specific recombinase based method for producing adenoviral vectors
US8178320B2 (en) 2001-11-22 2012-05-15 Keio University Artificial antibody library with super-repertory
US6818420B2 (en) 2002-02-27 2004-11-16 Biosource International, Inc. Methods of using FET labeled oligonucleotides that include a 3′-5′ exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same
IL164687A0 (en) 2002-05-02 2005-12-18 Univ North Carolina Cellular libraries and methods for the preparationthereof
IL166612A0 (en) * 2002-08-29 2006-01-15 Univ Leland Stanford Junior Circular nucleic acid vectors and methods for making and using the same
US20040216178A1 (en) * 2003-03-03 2004-10-28 Jones Stephen N Regulation of mdm2 function
EP2202322A1 (en) 2003-10-31 2010-06-30 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Methods for producing a paired tag from a nucleic acid sequence and methods of use thereof
ATE469984T1 (de) 2003-12-01 2010-06-15 Life Technologies Corp Rekombinationsstellen enthaltende nukleinsäuremoleküle und verfahren zur verwendung davon
WO2005081632A2 (en) * 2004-02-26 2005-09-09 State Of Israel, Ministry Of Agriculture, Agricultural Research Organization Enzymes, cells and methods for site specific recombination at asymmetric sites
JP2006333742A (ja) * 2005-05-31 2006-12-14 Chemicals Evaluation & Research Institute 細胞及び細胞へのｄｎａ導入方法
MX2008000764A (es) * 2005-07-18 2008-03-24 Pioneer Hi Bred Int Sitios de recombinacion frt modificados y metodos de uso.
EP1948803A4 (en) * 2005-10-13 2009-11-25 Bc Cancer Agency MODULAR GENOME FOR SYNTHETIC BIOLOGY AND METABOLISM MANIPULATION
US20070143881A1 (en) * 2005-12-16 2007-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and Compositions for Improving the Efficiency of Site-Specific Polynucleotide Exchange
CA2651895C (en) 2006-05-09 2014-05-06 The Curators Of The University Of Missouri Plant artificial chromosome platforms via telomere truncation
BRPI0712398A2 (pt) 2006-05-17 2012-10-16 Pioneer Hi-Bred International minicromossomo artificial de planta, planta de milho, polinucleotìdeo isolado, construção recombinante, planta transgênica de milho e método para produzir uma planta transgênica de milho compreendendo um minicromossomo artificial de planta tendo centrÈmero funcional
EP2167666A2 (en) 2007-06-29 2010-03-31 Pioneer Hi-Bred International Inc. Methods for altering the genome of a monocot plant cell
EP2067858A1 (en) 2007-12-07 2009-06-10 Universidad de Sevilla Animal models for neurodegenerative diseases
CN102016068A (zh) 2008-01-09 2011-04-13 生命科技公司 制备用于核酸测序的配对标签文库的方法
US9540637B2 (en) 2008-01-09 2017-01-10 Life Technologies Corporation Nucleic acid adaptors and uses thereof
ES2337973B8 (es) 2008-05-16 2011-07-21 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Adenovirus auxiliares auto-inactivantes para la produccion de adenovirus recombinantes de alta capacidad.
EP2529017A2 (en) 2009-12-30 2012-12-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for targeted polynucleotide modification
EA201391373A1 (ru) 2011-03-23 2014-07-30 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Способы получения сложного локуса трансгенных признаков
CA2834375C (en) 2011-04-27 2020-07-14 Amyris, Inc. Methods for genomic modification
CA2844470A1 (en) 2011-06-21 2013-05-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for producing male sterile plants
WO2013135729A1 (en) * 2012-03-12 2013-09-19 Dsm Ip Assets B.V. Recombination system
CN103361342B (zh) * 2012-03-30 2019-01-25 上海杰隆生物工程股份有限公司 一种转基因定位整合的方法及其应用
US20140173775A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for producing and selecting transgenic plants
ES2523016B1 (es) 2013-05-20 2015-09-09 3P Biopharmaceuticals Vectores alfavirales y líneas celulares para la producción de proteínas recombinantes
JP6652489B2 (ja) 2013-12-19 2020-02-26 アミリス， インコーポレイテッド ゲノム組込みのための方法
JP2018501814A (ja) 2014-11-11 2018-01-25 クララ フーズ カンパニー 卵白タンパク質産生のための方法および組成物
CN105316362B (zh) * 2015-08-19 2020-03-17 暨南大学 一种Dual-RMCE介导的TCR基因置换系统及其方法
AU2016315655A1 (en) 2015-08-28 2018-02-01 E. I. Du Pont De Nemours And Company Ochrobactrum-mediated transformation of plants
EP3458595A2 (en) 2016-05-18 2019-03-27 Amyris, Inc. Compositions and methods for genomic integration of nucleic acids into exogenous landing pads
EP3997118A4 (en) 2019-07-11 2023-07-19 Clara Foods Co. PROTEIN COMPOSITIONS AND CONSUMABLE PRODUCTS THEREOF
US10927360B1 (en) 2019-08-07 2021-02-23 Clara Foods Co. Compositions comprising digestive enzymes
AU2021459965A1 (en) * 2021-08-13 2024-02-22 Shanghai Sinobay Biotechnology Co., Ltd. A Hypoxia-triggered Artificial Transcription Factor, A Hypoxia-triggered Transcription Control System and Use Thereof
CN117165627A (zh) * 2022-05-27 2023-12-05 上海科技大学 基于Cre-LoxP和CRISPR的核酸构建体及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6228646B1 (en) * 1996-03-07 2001-05-08 The Regents Of The University Of California Helper-free, totally defective adenovirus for gene therapy
JP2002511732A (ja) * 1996-10-11 2002-04-16 ザ・テキサス・エイ・アンド・エム・ユニヴァーシティ・システム トランスジェニック動物を発生させるための組成物および方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP4206154B2 (ja) 2009-01-07
JPH11196880A (ja) 1999-07-27
CA2309386C (en) 2010-07-13
AU1052699A (en) 1999-06-07
ATE412759T1 (de) 2008-11-15
CN1283233A (zh) 2001-02-07
DK1035208T3 (da) 2009-02-23
EP1035208A1 (en) 2000-09-13
AU741415B2 (en) 2001-11-29
CA2309386A1 (en) 1999-05-27
NZ504307A (en) 2001-07-27
WO1999025851A1 (fr) 1999-05-27
DE69840173D1 (de) 2008-12-11
KR100639088B1 (ko) 2006-10-27
EP1035208A4 (en) 2002-01-30
KR20010032020A (ko) 2001-04-16
US6465254B1 (en) 2002-10-15
EP1035208B1 (en) 2008-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1173039C (zh) 突变型loxP序列及其应用
CN1141340A (zh) 重组dna病毒和其制备方法
CN1650020A (zh) 生产腺病毒载体的手段和方法
CN1110564C (zh) 不含活污染颗粒的腺病毒、其制备方法和用途
CN1201013C (zh) 用于减少同源重组现象的腺病毒载体及方法
CN1571844A (zh) 利用vsv－g假型化猴免疫缺陷病毒载体将基因导入灵长类胚胎干细胞
CN1826414A (zh) 突变型腺伴随病毒的病毒颗粒及其使用方法
CN1650021A (zh) 稳定的腺病毒载体及其增殖方法
CN1653184A (zh) 改进的安卡拉痘苗病毒(mva)基因组中作为插入位点的基因间隔区
CN1717483A (zh) 人类人工染色体(hac)载体
CN1628169A (zh) 含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体
CN1706955A (zh) 肿瘤细胞专一表达免疫调节因子gm－csf的溶瘤性腺病毒重组体的构建及其应用
CN1119459A (zh) 肿瘤疫苗的制备方法
CN1232644C (zh) 细胞内生基因活性化的优化方法
CN1497049A (zh) 雄激素受体复合物-相关蛋白
CN1639333A (zh) 利用基因重组蚕生产生理活性蛋白质的方法
CN1884556A (zh) 一种具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体
CN1293196C (zh) 具有副作用降低的特性的新型重组腺病毒载体
CN1170040A (zh) 包含转运信号之基因的核酸构建体
CN1944655A (zh) 靶向性共表达新型p53和p53AIP1的重组腺病毒
CN1109260A (zh) 转导醛脱氢酶-1基因的反转录病毒载体及其应用
CN1898390A (zh) 用于在改良安卡拉痘苗病毒中进行表达的启动子
CN1309716A (zh) 包含具重组转录因子结合位点的嵌合启动子的表达系统
CN1602359A (zh) 靶向性载体的制备方法及其应用
CN1170931C (zh) 血管发生相关分子

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: NIPPO SUMITOMO PHARMACEUTICALS CO., LTD.

Free format text: FORMER NAME OR ADDRESS: SUMITOMO PHARMACEUTICALS CO., LTD.

CP03 Change of name, title or address

Address after: Osaka

Patentee after: Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.

Address before: Osaka

Patentee before: Sumitomo Chemical Co., Ltd.

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1077744

Country of ref document: HK

CX01 Expiry of patent term
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20041027