CN1706955A - 肿瘤细胞专一表达免疫调节因子gm－csf的溶瘤性腺病毒重组体的构建及其应用 - Google Patents

肿瘤细胞专一表达免疫调节因子gm－csf的溶瘤性腺病毒重组体的构建及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肿瘤的基因治疗，更具体地说是涉及构建一种肿瘤细胞专一表达免疫调节因子GM－CSF的溶瘤性腺病毒重组体的构建及其应用。

Description

肿瘤细胞专一表达免疫调节因子GM-CSF的溶瘤性腺病毒 重组体的构建及其应用
技术领域：
本发明涉及肿瘤的基因治疗，更具体地说是涉及构建一种肿瘤细胞专一的、且能表达免疫调节因子、诱导机体针对肿瘤细胞产生免疫反应的复制型腺病毒基因重组体。
背景技术：
利用病毒治疗肿瘤可追溯到上世纪初。医生在临床上观察到一些病人的肿瘤在病人经历一场病毒感染之后惊奇的消失了。这个谜团一直到上世纪二十年代才得以解开，并引起众多科学家及临床医生的重视。由此也兴起了利用病毒治疗肿瘤的尝试。到上世纪中叶，已有50多种病毒被用于人或动物肿瘤的治疗[Mullen andTanabe(2002)The Oncologist 7：106-119；McCormick F(2001)Nature Review Cancer1：130-141]。1956年，在美国国家癌症研究所，Smith先生领导的课题组[Smith et al.(1956)9：1211-1218]利用10种野生的人类腺病毒感染HeLa细胞或KB细胞产生的细胞裂解上清液对30多位患有子宫肿瘤的病人进行原位注射、肝动脉及静脉给药治疗。所有的病人在接受注射之后没有出现严重的副作用，只是出现类似于感冒的症状。有为数不少的病人在接受治疗之后肿瘤肿块缩小且出现肿瘤细胞裂解现象。由于当时技术水平的限制，病毒无法得到纯化而使这项工作没有得到进一步的深入研究。但Smith研究组的工作大大的激励了科学家们利用病毒治疗肿瘤的信心[Chiocca EA(2002)Nature Review Cancer 2：938-950]。
随着基因工程技术的进步，特别是对人类病毒研究的深入，在上世纪90年代，科学家们终于能够有目的地利用肿瘤细胞基因表达的特性，用分子生物学技术对病毒基因组进行适当的改造，而能够有目的地构建在肿瘤细胞中繁殖的专一型基因工程病毒[McCormick F(2001)Nature Review Cancer 1：130-141]。如倾向于在脑肿瘤中复制的G207[Martuza et al.(1991)Science 252：854-856]，在p53缺陷型肿瘤细胞中复制的Addl1520(Onyx-015)[Bischoff et al.(1996)Science 274：373-376]和在前列腺肿瘤中复制的CV706[Rodriguez et al.(1997)Cancer Research 57：2559-2563]。这些工作渐渐形成了被称为病毒肿瘤治疗法(Virotherapy)的学科。目前有20多种病毒正在临床试验之中[Mullen and Tanabe(2002)The Oncologist 7：106-119]。
构建肿瘤细胞专一复制病毒的方法有好几种。其中一类方法是利用肿瘤细胞特异的基因调控因子(如启动子和增强子等)，去控制病毒基因组中决定病毒基因表达和病毒复制的几个关键基因，如腺病毒基因组中的EIA、EIB、E2和E4基因[DeWeese et al.(2001)Cancer Research 61：7464-7472]。通过这样改造，使病毒的关键基因的表达及病毒复制受控于安装进去的肿瘤细胞专一的基因调控因子的控制之中，如前列腺专一抗原的启动子和增强子(prostate-specific antigen，PSA，promoterand enhancer)、白球蛋白的启动子和增强子(alpha-feto protein，AFP)及人类的E2F-1基因的启动子等[McMcormick F(2001)Nature Review Cancer 1：130-141]。
人端粒酶(telomerase)是一种控制细胞中染色体末端长度的重要酶，调节细胞在分裂分化过程中染色体末端的长度。人端粒酶主要有三部分组成，其中的RNA和具有催化作用的逆转录酶基因(telomerase reverse transcriptase gene，hTERT)控制着人端粒酶的活性。而hTERT的启动子决定着端粒酶的表达水平和酶的活性。
进一步研究表明，人端粒酶在成年人的正常细胞中没有活性或活性很低[Kim etal.(1994)Science 266：2011-2015；Shay et al.(1997)European Journal of Cancer33：271-282]。但在超过90％的肿瘤细胞中则有较高的表达(Hahn and Weinberg(2002)Nature Review Cancer 2：331-341；Shay and Wright(1996)Current Opinion Oncology 8：66-71)。利用这个特点，科学家们已利用克隆到的hTERT启动子构建了好几例基因表达载体，其中包括最近发表的利用hTERT去控制腺病毒复制的工作[Lanson etal.(2003)Cancer Research 63：7936-7941；Kawashima et al.(2004)Clinical CancerResearch：10：285-292；Kim et al.(2003)Oncogene 22：370-380；Irving et al.(2004)CancerGene Therapy 11：174-185]。
科学家同时也认识到，在早期胚胎发育和分化，特别是在一些细胞，如子宫内膜细胞，造血祖先细胞和干细胞中仍有一定水平的端粒酶的表达[Wright et al.(1996)Development Genetics 18：173-179；Sharma et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：12343-12346；Kolquist et al.(1996)British Journal Cancer 80：1156-1161；Tahara et al.(1999)Oncogene 18：1561-1567；Tanaka et al.(1998)American Journal ofPathology 153：1985-1991]。这种低水平的端粒酶活性引起了想利用hTERT启动子控制治疗型基因表达载体，特别是利用hTERT启动子去控制病毒关键基因制备肿瘤专一的复制型病毒的科研工作者的担心[Hahn WC(2004)Clinical Cancer Research10：1203-1205]。因为如果这样改造后的病毒如果在祖先细胞(progenitor)中由于低水平病毒关键基因的表达而使复制型病毒的大量繁殖，将在临床上引起严重的毒副作用[Huang et al.(2004)Clinical Cancer Research 10：1439-1445；Hahn WC(2004)Clinical Cancer Research 10：1203-1205；Masutomi et al.(2003)Cell 114：241-253]。因此提高hTERT启动子对肿瘤细胞的专一性是研究的课题。
本发明通过对hTERT启动子进行基因改造，提高了hTERT启动子的肿瘤细胞的专一性。
在hTERT启动子中，没有常见的“TATA”这样保守序列。但是两个含有“CACGTG”的E-盒和5个“GC”丰富的Sp-I结合区。这些保守序列是通过C-Myc/Max复合体和Sp-I调控hTERT启动子转录特别端粒酶活性表达的关键[Conget al.(1999)Human Moleular Genetics 8(1)：137-142；Kyo et al.(2000)Nucleic AcidsResearch 28(3)：669-677].很多实验表明Myc是在细胞增殖和细胞周期过程中扮演重要作用，从而进一步通过hTERT启动子而影响到端粒酶的转录和表达。
为了减少hTERT启动子在正常细胞如造血祖先细胞中的活性，进一步提高hTERT启动子的肿瘤细胞的特异性，我们对hTERT启动子做了很详细的序列计算机结构和转录蛋白因子结合的模拟。根据计算机对转录蛋白因子构象的分析，我们对hTERT启动子中多个转录因子的结合部位进行了系统的序列突变分析。在一系列突变体中，我们选择了一个变体，这个变体中在第5个Sp-I结合序列之上变成了一个转录因子E2F-1的结合位点。由原来的’...TTTCCGCGGCCCCGGCC...’(图1)变成了’...TTTCCGCGGCAACGGCC...’(图2).
体外试验表明，经过突变之后的hTERT启动子，不但具有原有肿瘤细胞中的活性，而且使它在正常细胞中的“启动”活性大大地降低了，从而阻断了hTERT原始启动子在造血祖先细胞等正常细胞中的转录活性。利用报导基因的转染试验证明，经改造后的启动子在肿瘤细胞中要比野生的启动子高5到10倍，而在正常细胞中的活性则降低了(图6)。利用它控制腺病毒关键基因表达，而构建成的复制型腺病毒对干细胞已没有毒性(图7)。从而可能提高了这类复制型腺病毒在临床上的安全性。
由于E2F-1启动子能在pRb/E2F/p16通道途径缺失的肿瘤细胞中转录连接的基因，而使E2F-1启动子广泛利用于基因治疗，特别是用于构建复制型腺病毒之中[Parr et al.(1997)Nature Medicine 3(10)：1145-1149；Jakubczak et al.(2003)CancerResearch 63：1490-1499；Bristol et al.(2003)Molecular Therapy 7(6)：755-763]。经我们这样的改造后的hTERT启动子，不但有E2F-1基因结合位点，而且有E2F-1启动子中具有的Sp-I和NF-1结合位点，从而使改造后的hTERT启动子可以在端粒酶表达和Rb通道途径变异的肿瘤细胞中转录相关基因。因此这个经我们改造后的hTERT启动子将在这两类肿瘤细胞中有转录功能，而不能在正常细胞包括干细胞中表达，进而大大的提高了它的肿瘤细胞的专一性。
与此同时，我们还进一步将腺病毒的E1A和E1B基因用核糖体介入因子(internal ribosome entry site，IRES)连起来，一同受控于hTERT启动子。这样腺病毒的两个重要基因E1A和E1B在转录上同时受到hTERT启动子的控制，从而进一步提高了病毒的细胞特异性(KH-906)。
腺病毒的基因组当中有着自身控制基因表达调控的元件，如内源的E1A启动子和增强子，其中的增强子与病毒的包装序列是重叠的。因此在一些已发表的文章中，有人将病毒的包装序列从病毒基因组原来的左端搬到右端，以为这样就可以降低病毒内源调控元件对外源基因调控序列及其功能的影响，进而可能提高外源序列对病毒基因表达调控的控制[Bristol et al.(2003)Molecular Therapy 7(6)：755-764；Jakubczak et al.(2003)Cancer Research 63：1490-1499]。但是这样做的后果却出乎设计者的预料。包装序列经搬家的病毒基因组在病毒复制过程中则变得不稳定而产生一系列重组体病毒[WO 02/067861；ASGT 2003 annual meeting，MolecularTherapy]。因此，将病毒包装序列从左端搬到右端的设计是不可行的。那么如何保证病毒基因组稳定，不在放大生产过程产生重组体病毒又能减低病毒内源等因调控元件对外源启动子的影响呢？本发明在腺病毒的末端(ITR)和包装序列(packagingsite)之后，和外源启动子(如hTERT启动子)之前安装一个转录的阻断序列(transcription termination signal)。这些阻断序列可以阻断任何核糖核酸聚合酶(RNApolymerase)介导的基因转录。如SV40早期的多聚(A)信号序列(poly(A)terminalsequence)。体外试验表明由于SV40 poly(A)序列的介入，腺病毒末端序列ITR和重叠于包装序列之中具有增强子效应的序列对hTERT启动子的影响变得很少。
本发明的重组体安装有免疫调节基因。已知的几个溶瘤性病毒当中，都安装有细胞因子GM-CSF。本发明的重组体也安装有GM-CSF，但不局限于只用GM-CSF，可以是其它细胞因子(cytokines)。但是GM-CSF是一种被认为是最具活力的免疫调节因子(Dranoff et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3539-3543)。它是一种分泌型糖蛋白，能刺激粒性白细胞(granulocytes)，单核白细胞(monocytes)，巨噬细胞(macrophage)和树状细胞(dendritic cells)的分化，刺激抗原呈递细胞上的MHC和B7辅助分子的高表达。同时GM-CSF还可促进免疫细胞的组织渗入及B细胞的分化。因此在过去的几年里，科学家利用重组的GM-CSF蛋白和化疗药物一起治疗肿瘤病人。同时，多个利用表达GM-CSF的肿瘤细胞作为肿瘤疫苗正在临床试验之中[Armitage Jo(1998)Blood 92：4491-4508；Mach et al.(2000)CancerResearch 60：3239-3246；Gilboa E(2004)Nature Reviews Cancer 4：401-411]。表达GM-CSF的复制型溶瘤性病毒不但能通过病毒的复制杀死肿瘤细胞，而且由于感染的肿瘤细胞中也表达GM-CSF，在体内建立起了肿瘤疫苗站(in situ cancervaccine/immunotherapy)，具有肿瘤免疫治疗作用。这样，不但省去了常规肿瘤免疫加工过程中的繁琐流程，而且由于肿瘤细胞未经体外分离培养，可以更好保存了肿瘤自身的特性，如抗原的表达，从而使这个“体内”肿瘤疫苗更加有效。这样设计的病毒可能通过原位给药，不但对原位癌细胞具有杀伤作用，也能针对对转移肿瘤产生治疗效果。所以这是一个构建溶瘤性腺病毒很特别的构思和设计。
在本发明的系列病毒之中，有两个病毒是表达一种膜结合型的细胞因子GM-CSF(membrane bound GM-CSF，mbGM-CSF)。在溶瘤腺病毒中利用膜结合型GM-CSF的构思是基于已发表的工作。研究工作表明，膜结合型GM-CSF可以增进与皮下树状细胞(Dentritic cells)的作用，而产生比分泌型GM-CSF对树状细胞更强的调理作用作用[Soo Hoo et al.(1999)Journal of Immundogy 169：7343-7349；Yei et al.(2002) Gene Therapy 6：1302-1311]。在溶瘤性病毒中表达膜结合型细胞因子GM-CSF的构思和重组基因工程药物未见报导。
本发明还提供不同于现有技术的构建溶瘤病毒的制备方法。现在已发表的工作在构建溶瘤病毒或基因工程病毒载体时都是在一种基因工程改造的细胞中进行，如293细胞。由于这类细胞中表达E1已缺失或E1改造之后腺病毒复制繁殖所需的E1区编码的蛋白基因。但这类细胞生产的腺病毒产品中常常是包含着一定水平的野生型腺病毒或重组性腺病毒。其道理是在293细胞一类的生产细胞中含有腺病毒的基因序列，这段“野生”的腺病毒序列，与需要生产的E1已缺失或E1已加工过的腺病毒在细胞内就会产生重组而产生要么是野生型腺病毒，要么是重组型腺病毒。这样就不但会降低产品质量，也会引起可能想不到的毒副作用。我们介绍的生产用细胞将是一类不含腺病毒基因序列的细胞，从而避免了上述介绍的可能问题。
本发明还对腺病毒的表面进行了改造，使它提高与肿瘤细胞的亲和力，而增加感染肿瘤细胞的能力。最近的研究表明，不少肿瘤细胞不表达或在很低水平上表达腺病毒5型受体(the coxsackie virus B and adenovirus receptor，CAR)，而这些肿瘤细胞都表达CD46[Shayakhmetov et al.(2002)Cancer Research 62：1063-1068]。进一步研究指出腺病毒35型所用的受体正是CD46蛋白[Sirena et al.(2004)Journal ofVirology 78(9)：4454-4462]。因此，我们提出将与CD46蛋白受体作用的腺病毒35型上的纤维蛋白基因(Fiber)顶结(knob)序列代替腺病毒5型的顶结而构建一个融合腺病毒与受体作用的重组体。根据推测，这样的重组体将更广泛且更有效地感染肿瘤细胞。
发明内容：
本发明提供一种将肿瘤细胞特异性的转录调控元件安装到人类腺病毒的基因组中去控制腺病毒关键基因的表达的重组体。它是一种溶瘤性病毒与免疫调节基因的重组体，可以达到控制病毒只在肿瘤细胞中复制的目的。本发明的重组体，将具有诱导人体对肿瘤细胞产生特异免疫反应的细胞因子基因与上述肿瘤细胞专一的复制型病毒进行有机结合，能在特定细胞中繁殖、生产，并可直接在肿瘤细胞中复制、表达，具有杀死肿瘤细胞的功能，从而达到预防或和治疗肿瘤的目的。
为实现上述目的，本发明提供一种肿瘤细胞专一的溶瘤性病毒体，以及这种病毒体与免疫调节基因结合的基因工程重组体。该重组体是通过DNA克隆技术将肿瘤细胞专一的启动子和免疫调节基因安装到腺病毒基因组中，构建成一个能在特定肿瘤细胞中繁殖，也能在肿瘤细胞中表达免疫调节基因的融合序列。
本发明的重组体由载体病毒，肿瘤细胞专一的基因调节元件和免疫调节基因构建而成。
所述载体病毒可以为DNA病毒或RNA病毒的任何一种，可以是腺病毒中各种血型型，如腺病毒5型、2型、35型、41型等。其优选载体为腺病毒5型。也可以是改造的腺病毒改造体，如将腺病毒的E1A和E1B基因用核糖体介入因子(internal ribosome entry site，IRES)连起来的腺病毒。如用腺病毒35型上的纤维蛋白基因(Fiber)顶结(knob)序列代替腺病毒5型的顶结而构建一个融合腺病毒。如在腺病毒的末端(ITR)、包装序列(packaging site)之后，和外源启动子(如hTERT启动子)之前安装一个转录的阻断序列(transcription termination signal)。这些阻断序列可以阻断任何核糖核酸聚合酶(RNA polymerase)介导的基因转录。如SV40早期的多聚(A)信号序列(poly(A)terminal sequence)。如在腺病毒E3区中编码10.4K，14.5K和14.7K的序列已删除的腺病毒。
所述肿瘤细胞专一的基因调节元件是肿瘤细胞专一的基因调节元件是任何癌细胞特异的启动子，增强子，静止子或他们的组合，优选的是序列表中序列2所表示的经过改造的hTERT启动子，该启动子有转录因子E2F-1的结合位点。
所述免疫调节基因可以是任何具有刺激诱导免疫反应的基因或它们的变体，如IL-2，IL-10，IL-12，IL-15，IL-24，IL-25，GM-CSF，G-CSF和INF-alpha，INF-beta等。其最优选免疫调节基因为GM-CSF包括分泌型和膜结合型GM-CSF或它们的变体。
本发明的重组体，优选的是，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，将腺病毒的E1A和E1B基因用核糖体介入因子IRES连起来，并且用腺病毒35型上的纤维蛋白基因顶结序列代替腺病毒5型的顶结，并且在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装一个转录的阻断序列，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件是序列表中序列2表示的hTERT启动子，其中的免疫调节基因是GM-CSF基因。优选为膜结合型GM-CSF基因。
本发明的重组体，优选的是，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装一个转录的阻断序列，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件是序列表中序列2表示的hTERT启动子，其中的免疫调节基因是GM-CSF基因，其DNA序列为序列表中序列3表示的序列(命名为KH-901)，其中的GM-CSF基因也可以是膜结合型GM-CSF基因(命名为KH-902)。
本发明的重组体，优选的是，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，并且用腺病毒35型上的纤维蛋白基因顶结序列代替腺病毒5型的顶结，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件是序列表中序列2表示的hTERT启动子，其中的免疫调节基因是GM-CSF基因(命名为KH-904)，优选是膜结合型GM-CSF基因(命名为KH-905)。
本发明的重组体，优选的是，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装一个转录的阻断序列，在腺病毒E3区中编码10.4K，14.5K和14.7K的序列已删除的腺病毒，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件是序列表中序列2表示的hTERT启动子，其中的免疫调节基因是GM-CSF基因，优选是膜结合型GM-CSF基因(命名为KH-903)。
本发明的重组体，优选的是，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装一个转录的阻断序列，并将腺病毒的E1A和E1B基因用核糖体介入因子IRES连起来，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件是序列表中序列2表示的hTERT启动子，其中的免疫调节基因是GM-CSF基因(命名为KH-906)。
本发明的重组体包括但不限于以下重组体：
KH-901，KH-902，KH-903，KH-904，KH-905和KH-906。
其中重组体KH-901的基因序列如序列表中的序列3，其中：
1)1-103：腺病毒左侧臂(ITR)[腺病毒5基因组全序列：Genbank No：BK000408]；
2)194-358：腺病毒基因组包装序列和E1增强子序列；
3)362-534：SV40多聚腺嘌呤核苷酸信号序列和连接序列(linker)(腺病毒5型中碱基从#362到#551已删除)；
4)525-811：经基因工程技术改造的hTERT启动子序列和连接序列；
5)812以右：腺病毒序列包括E1A，E1B，E2等；
6)28995-29436：免疫调节基因人类GM-CSF基因；
7)29437以右：腺病毒序列包括E4已和右侧臂。
重组体KH-900的基因组序列类似于序列3，只是其中的hTERT启动子是野生型没有碱基的改变，请参阅序列1和序列2。在病毒基因包装区与hTERT启动子之间没有多聚腺嘌呤核苷酸信号序列。
重组体KH-902的基因组序列类似于KH-901，只是其中的免疫调节基因GM-CSF有KH-901种的分泌型变成了膜结合型，其序列见序列4。
重组体KH-903的基因组序列类似于KH-901，只是其中在E3区中编码10.4K，14.5K和14.7K的序列已删除。删除的序列是与腺病毒碱基29804至碱基30857。这三个基因编码的蛋白会抑制免疫反应，特别是肿瘤坏死因子介导的免疫反应。因此，删除这三个基因的溶瘤性腺病毒可能会诱导产生更强的抗肿瘤的免疫反应。
重组体KH-904基因组序列类似于KH-901只是其中的纤维蛋白基因中编码顶结(knob)的序列由腺病毒5型变成了35型。其详细序列见序列5。最近的研究工作表明，很多肿瘤细胞不表达腺病毒5型的受体蛋白(CAR)，而高水平的表达CD46蛋白。CD46蛋白是腺病毒35型的受体。这样，如果将与CD46蛋白作用的纤维蛋白上的相关序列嫁接到腺病毒5型上，形成的重组体将作用于CD46受体而增高感染肿瘤细胞的效率。
重组体KH-905是在重组体KH-904的基础上将其中的免疫调节蛋白GM-CSF由分泌型变成膜结合型。
重组体KH-906的基因组则是在KH-901的基础上，用核糖体进入序列(Internal ribosome entry site，IRES)取代E1B的启动子[Li et al.(2001)CancerResearch 62：1 Zhang J et al.(2002)Cancer Research 62：3743-3750]。
本发明还包括序列表中序列2所表示的经过改造的hTERT启动子，该启动子有转录因子E2F-1的结合位点。
本发明还包括该启动子的制备，根据图1中hTERT启动子序列设计合成两段引物：
A.5’-GTCTGGATCCGCTAGCCCCACG-3’
B.5’-CGACCGGTGATATCGTTTAATTCGC-3’作为引物，以激活的人体基因组核糖核酸作为模板，经PCR方法扩增到人的hTERT启动子。其中，反应条件为：第一循环：94℃变性5分钟，81℃退火1分钟，72℃延伸2分钟；以后个循环：93℃变性1分钟，68℃退火一分钟，72℃延伸2分钟，共35个循环。由此得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳分析，回收得到hTERT启动子片断。经测序分析，得到的启动子片段与发表的一样(图1)。然后将这段DNA克隆到pUC19载体之中，利用定点突变的方法(Strategene定点诱导方法)将hTERT启动子序列变成图2所示的序列。
本发明还包括本发明的重组体的制备方法，该方法包括以下步骤：
a)含有hTERT启动子序列的腺病毒左侧臂的制备；
b)含有免疫调节基因的腺病毒右侧臂的制备；
c)将腺病毒左侧臂和腺病毒右侧臂转染到293细胞、HeLa细胞、HeLa-S3细胞或A549细胞中，通过同源重组的方法得到权利要求1的重组体。
本发明的重组体具体可以通过如下方法获得：重组病毒是在真核细胞中同源重组获得的。首先含有腺病毒左侧臂序列的PXC.1(购于加拿大的Microbix)在体外通过DNA克隆技术将内源E1A启动子序列删除，取而代之的则是多聚腺嘌呤核苷酸和端粒逆转录酶hTERT启动子序列而得到pKH-901a。同时，腺病毒的右侧臂pBHGE3(购于加拿大的Microbix)通过类似的方法用免疫调节基因GM-CSF取代E3区中的gp19k基因而得到PKH-901b。
PKH-901a和PKH-901b一起转化HeLa细胞，通过同源重组的方法而得到KH-901。同样的，其他重组腺病毒包括KH-900，KH-902，KH-903，KH-904，KH-905和KH-906也通过类似方法而构建而成。
实质上，该重组体可在任何直接细胞或原核细胞中的同源重组的方式获得。
根据上述方案，利用PCR扩增方法在pXC.1的碱基第362位到551位处分别加上内切酶位点SspI和PinAI(AgeI)。hTERT启动子则用PCR从人体基因库中放大得到，并与多聚腺嘌呤核苷酸序列一起在体外经PCR将两个片端取接起来而变成一段DNA。在这段DNA的两端加上内切酶位点SspI和PinAI。经酶切后分离到的DNA片段与多重同样酶切的pXC.1连接，转化大肠杆菌株DH5-alpha细胞(Invitrogen，USA)。转化后挑选10菌斑，在培养箱中培养24小时，提取DNA，经酶切分析鉴定，将得到的序列命名为PKH-901a。
以5’-ATAACCATGTGGCTGC-3’和5’-AAATTACTCCTGGACTGG-3’作为引物，通过PCR从人的激活的巨噬细胞(macrophage)的cDNA中增扩免疫调节因子GM-CSF，将扩增的全长GM-CSF基因克隆到原核质粒pUC19，进行测序验证。随后，利用运输载体将GM-CSF的cDNA片段克隆到pBHGE3当中取代gp19k基因编码区，经测序和酶切检验，将得到的序列命名为pKH-901b。
将构建好的重组载体pKH-901a和pKH-901b其转染HeLa细胞，使二者发生同源共组。两个纯化的质粒DNA用ClaI线性化，然后经lipofectin[USA Invitrogen]介导转化HeLa细胞，经转化10天之后，细胞被刮下来，经冻溶三次，取100微升，在HeLa细胞上进行病毒斑检。8天之后，在低凝点凝胶之下开始看到病毒斑点。挑选6个病毒斑，接种到预先种好的HeLa细胞中，经4天至6天之后，收集并低温保存裂解的细胞液。这些裂解液被用来提取腺病毒的DNA[Qiagen’s kit]，经酶切，PCR和Southern杂交确定病毒的分子结构，将序列命名为KH-901。
本发明的重组体可用于制备治疗和/或预防各种恶性肿瘤的药物。本发明的重组体可以与放疗和化疗一起使用，取得更好的治疗效果。
本发明的重组体可制备成静脉注射，动脉注射，瘤内注射，肌肉注射，皮下注射，器官注射，和胸、腹水内注射的药物组合物。
对于大规模制备，可利用本发明方法制备的重组体，转染到HeLa细胞或HeLa-S3或A549细胞中，经过培养，繁殖，浓缩，纯化等方法制备，得到大批量的可用于制药的本发明重组体原料，再进一步和/或与药物可接受的载体混合，用药物制剂的常规技术，制备成临床上可利用的注射液。
以下通过实验数据说明本发明的有益效果：
实验1、hTERT启动子的活性及肿瘤细胞专一性的比较
将野生型的hTERT启动子(telo)和经突变修饰之后hTERT启动子(Mtelo)与报导基因luciferase(luc)相连。然后分别将这两种质粒DNA转化多种肿瘤细胞和人体正常细胞。48小时之后，转化后的细胞被裂解并用于测定其中luc的表达情况。其中转化效率用lacz报导基因质粒来标准化。从相对的luc活性中可以看出，第一，在肿瘤细胞中，突变修饰之后的hTERT启动子(Mtelo)要比野生型hTERT启动子(telo)活性高很多(见图6)。例如在Hep3B细胞中，Mtelo活性比telo高6倍多，在LNCap细胞中Mtelo启动子比telo启动子高18倍多。第二，在正常细胞中，telo启动子有一定转录活性，而Mtelo启动子则基本上只是背景水平的活性。如在MRC5细胞当中，Mtelo介导的luc活性比telo启动子控制的luc活性要低6倍。这些结果表明，经修饰改造的hTERT启动子具有更强的肿瘤细胞专一性和转录能力。
这个结论在随后的病毒对细胞的杀伤作用实验中得到进一步的确证。野生型腺病毒Ad5，缺陷型腺病毒d1312[E1A缺失]，重组体KH-900和KH-901被用来感染人体初生前皮肤细胞[foreskin keratinocytes，hFKs]和转化人体乳头状瘤病毒血型16型(human papilloma virus type 16，HPV-16)的E6基因(hFKs-E6)。早先的研究工作表明转化HPV16-E6基因细胞具有比父代细胞高许多的端粒酶活性[Horikawa etal.(2001)Journal Virology 75(9)：4467-4472]。病毒感染之后，我们用定量的PCR方法对其中E1A信使mRNA的拷贝数进行分析，确定在hTERT启动子控制之下的腺病毒关键基因E1A的转录表达情况。试验的结果如图7所示，在d1312感染的hFKs和hFKs-E6细胞中没有检测到E1A信使mRNA；在Ad5感染的细胞中检测到高于4000拷贝mRNA；在hFKs和hFKs-E6两种细胞中E1A mRNA的拷贝数差异不大。在KH-900感染的细胞中，hGKs细胞中只有少数信使E1A mRNA，而在hFKs-E6细胞中，则有比在hFKs中高出20倍的E1A信使核糖核酸。有趣的是，在KH-901感染的细胞中，hFKs-E6细胞中比在hFKs细胞中超过100倍的E1A信使核糖核酸，同时，KH-901感染的hFKs细胞中mRNA拷贝数比较低。这个实验表明，Mtelo启动子与报导基因相连时要比telo启动子更强的活性，更高的肿瘤细胞专一性，而且在安装入腺病毒基因组中时，仍表现出更高的专一性和更强的对下游基因的启动转录控制能力。
这个结果在对体外培养的骨髓细胞的试验中也得到进一步的论证。重组体KH-900和KH-901用来感染(每细胞1个感染单位)293细胞和骨髓干细胞，然后检测细胞的存活力，如图8所示，KH-900和KH-901杀伤293细胞的能力相当。KH-901对骨髓干细胞的杀伤能力几乎等于零，但KH-900对骨髓干细胞则有一定杀伤作用。
实验2：重组溶瘤性复制型腺病毒对肿瘤细胞杀伤能力之比较
重组体病毒KH-900，KH-901，KH-902和KH-903对肿瘤细胞杀伤能力的比较是通过测定病毒感染之后存活细胞的多少来确定的。肺癌细胞系A549预先接种在培养皿上等到85％左右饱和度时用病毒去感染，感染的浓度是每个细胞受到1个致斑单位(PFU)(M01＝1)。在病毒感染之后不同时间，对细胞的存活度进行测试[Hallenbeck et al.(1997)Human Gene Therapy 11：1172-1179]。所得的结果如图9。四个重组体腺病毒当中，KH-904的杀死肿瘤细胞能力最强，KH-901和KH-902杀伤肿瘤细胞的能力相差无几，都比KH-904要弱。KH-900杀伤能力最弱。
这个结果表明，经基因工程改造的hTERT启动子(Mtelo)比野生的启动子(telo)要强。同时，带有纤维溶合蛋白基因(Ad5/35)的重组腺病毒比野生的纤维蛋白基因(Ad5)的重组腺病毒要有更强的杀伤肿瘤细胞的能力。这个结论在更多肿瘤细胞和人体正常细胞的杀伤能力比较中得到了进一步的论证[表1]。表1是6种重组腺病毒在9种肿瘤细胞和5种人体正常细胞中所确定的EC50值大小比较。这个实验操作如下：肿瘤细胞在加病毒之前24小时，正常细胞在加病毒之后72小时接种在培养皿中，然后加不同MOI的腺病毒，再行培养。在培养8-10天之后，对培养皿中的细胞进行存活的测试。然后用软件计算出EC50值。EC50值越小表示重组病毒杀死细胞的能力越强。在肿瘤细胞中，KH-901都表现出比KH-900更强的杀伤力。再次表明经基因工程改选后的Mtelo启动子要比野生的telo启动子具有更强的转录活性，而使重组病毒具有更高的杀死肿瘤细胞的能力。KH-901的杀伤能力与KH-902，KH-903想比杀死肿瘤细胞的能力相似。在这6个病毒中，重组体腺病毒KH-904的杀伤肿瘤细胞的能力最强。这与前面得到的结果是相吻合的。
                           表1
细胞 KH-901感染单位/ ELISA(纳克/106细胞/24 生物活性(Bioassay)(纳克/106细胞/24hrs)
LNcaP  10  231±21  195±34
 1  30±9  15±4
Hep3B  10  422±13  355±44
 1  94±6  85±12
SW680  10  527±19  325±44
 1  214±4  135±21
A549  10  784±17  625±94
 1  83±2  55±24
HeLa  10  120±11  105±56
 1  9±1  2±0.3
hFKs  10  5±0.25  3.5±0.4
 1  低于检测水平  低于检测水平
更有意思的是，对人体正常细胞而言，装有基因工程改选过的Mtelo启动子的重组体病毒(包括KH-901，KH-902，KH-903，KH-904)都表现出比KH-900(装有原始未改造的hTERT启动子)弱得多的杀伤能力(因为EC50值更高)。
同时，在E1A基因和E1B基因之间装有核糖体介入因子的重组体腺病毒：KH-906(其中E1A和E1B基因在转录水平上都由经改造的Mtelo启动子控制)则表现出比其他重组体病毒都要高的肿瘤细胞专一性。虽然在对肿瘤细胞的杀死能力比其他重组体要弱一些。
实验3：重组体腺病毒KH-901在肿瘤细胞中表达较高的具有生物学活性的免疫调节因子GM-CSF
重组体腺病毒KH-901用不同的M0I(1和10)感染5种肿瘤细胞和一种人体正常细胞(hFKs)。感染48小时之后，收集细胞，经冻溶和ELISA测定细胞裂解液中的GM-CSFR浓度。结果如图14所示，KH-901在所实验的5种肿瘤细胞中都表达出很高的GM-CSF蛋白，如在前列腺肿瘤细胞中，每106细胞中，每24小时产生30至231纳克的GM-CSF。在同样的实验中，KH-901在正常细胞中，GM-CSF表达很低或检测不到。在如后的生物活性实验中，进一步表明，这些用ELISA检测到的GM-CSF具有生物学活性(结果见表2)。
    细胞   KH-90     KH-901     KH-902     KH-903     KH-904  KH-906
    LoVoA549LNcaPHep3BHeLaSW620CA-33   1.250.582.314.033.852.043.40     0.920.190.220.310.620.201.15     0.850.280.360.530.550.341.17     0.970.490.150.710.730.230.75     0.350.080.010.030.250.040.20  1.010.391.751.710.892.533.15
HUVECBJRPEWI38 27.960.835.446.5 99.3295.4231.792.33121.20 130.4260.529579.5135.84 83.575.4431.782.3391.20 70.61801.8295.369.2 268.3435.4531.7192.33266.23
实验4：重组体腺病毒在动物肿瘤模型上的抗肿瘤活性
前列腺肿瘤细胞系LNeap细胞被用来在裸鼠上建立肿瘤模型，在皮下接种6百万细胞，在4个星期之后可以看到肿瘤长到200立方微升左右。这个时候给药，一共给三针(第1天，第5天和第9天)，每针给药3×1010病毒颗粒。然后每个星期测量肿瘤体积两次。所得的肿瘤生长数据如图10。
在这个实验中三种重组型腺病毒KH-901，KH-904和KH-907(没有显示，与KH-901一样只是其中没有GM-CSF基因)被用来注射肿瘤，同时Add1520作为对照，也包括在实验之中。
从图10中可以看出，不含病毒的制剂处理的肿瘤长得很快，48天之后的对照组的肿瘤体积是开始给药时的百分之1200(1200％)。而经病毒处理的肿瘤，肿瘤生长受到了一定的抑制，如经KH-901处理的肿瘤remain the same as baseline，KH-904处理的肿瘤则使肿瘤体积缩小到开始给药时的百分之15(15％)。这个时候，经Addl1520处理的肿瘤则生长受一定影响，其体积是开始给药时的百分之850(850％)。
这说明KH-901和KH-904的杀伤肿瘤的能力比Addl1520(Onyx-015)要强。其中KH-904又比KH-901要强，这与前面在细胞水平中得到的结果是吻合的。
需要指出的是，虽然这是在裸鼠上做的肿瘤模拟实验，我们也看到KH-901的杀伤肿瘤的能力比KH-907(没有GM-CSF基因)要强。
在这个实验过程中，对肿瘤中GM-CSF表达情况也作了纪录。经给药之后14天，在Addl1520处理和KH-907处理的动物血中没有检测到GM-CSF的表达，而在KH901和KH-904处理的动物血中，分别检测到2.322微克/毫升和2.776微克/毫升的GM-CSF。这个结果表明，重组腺病毒中的GM-CSF不但在体外肿瘤细胞中表达，而且在动物身上的肿瘤中也有较高水平的表达。
这个程序组建重组腺病毒的效率高，可操作性强。其它的重组腺病毒将分别在
实施例中作具体介绍。
本发明的重组溶瘤性复制型腺病毒重组体具有以下特点：
1.结构特点：
这些重组体是一些活的重组腺病毒，能在肿瘤细胞中复制繁殖。不同于现有的化学合成药和基因工程药物。能直接在肿瘤细胞中专一表达复制，生物学活性高，可达到有效治疗作用。腺病毒中还携带免疫调节基因。这样，这个基因能在感染的肿瘤细胞中表达定点诱导针对肿瘤细胞的免疫反应。且安全性好，致病性低，尤其是安装肿瘤调控元件之后。
2.应用特点：
安装的肿瘤调控元件在超过90％的肿瘤中都有活性，即在绝大多部分的肿瘤细胞中，这类腺病毒的关键基因可以表达而使病毒能够复制繁殖，进而杀死肿瘤细胞。所以这些重组溶瘤性复制型腺病毒将是非常广泛的，如头颈癌、肺癌、直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌等。
由于在这肿瘤专一的腺病毒中装有表达免疫调节因子的基因，正如前文中所述，这类产品将不但具有由于腺病毒复制感染而杀死肿瘤，而且在肿瘤细胞中表达的细胞因子，将调节免疫反应而通过加强免疫系统而对原位及扩散的肿瘤进行进攻，进而杀死肿瘤细胞。
不同于现有产品的特点还包括：1)这些产品的肿瘤专一性提高了，不感染正常体细胞和干细胞；这些病毒在临床使用之中的副作用更低。2)表达免疫调节因子，包括分泌型和膜结合型免疫调节因子；使机体产生免疫作用，可杀伤远处肿瘤，减少复发；3)经过病毒外壳的改变，这些腺病毒对大部分肿瘤细胞的感染力大大的提高了，进而使它成为有可能有更好的治疗作用。
本发明的贡献在于：
1)通过定向突变修饰肿瘤细胞基因调控元件hTERT启动子，使之具有更高的肿瘤细胞特异性和转录活性，从而降低相连基因在部分成年体细胞特别是生殖细胞，造血祖先细胞和干细胞中表达的可能性，进而提高靶向作用效率。利用改造后的hTERT启动子构建成的溶瘤性复制型腺病毒不能在骨髓细胞中繁殖，而能有效杀灭多种肿瘤细胞。
2)利用肿瘤细胞专一的溶瘤性腺病毒表达可引起免疫反应的免疫调节基因GM-CSF，这样构件的病毒，不但可以通过原位给药，溶瘤性病毒通过复制繁殖而裂解肿瘤细胞，同时又通过裂解细胞中产生的肿瘤抗原结合肿瘤细胞中表达的GM-CSF而产生强烈的针对肿瘤细胞的免疫反应(immune responses against cancer)。特别值得一提的是这种肿瘤专一的抗肿瘤免疫反应可以通过“教育”人体的免疫系统而对扩散的肿瘤发起攻击而将它们杀灭。这种经过“教育”的抗肿瘤特异免疫反应可以在病人体内持续很长时间，从而在病人体内起到预防肿瘤复发的作用。
3)通过对腺病毒表面的改变而使其对绝大部分肿瘤细胞有较强的感染力。由于很大一部分肿瘤细胞中不表达或低水平表达腺病毒血型型5(Ad5)的受体蛋白(CAR)，因此经常会看到Ad5不能很好地感染肿瘤细胞的现象。通过将腺病毒血型35(Ad35)的受体作用的结合位点和序列接到Ad5基因组中去，就可以大大的提高其感染多数肿瘤细胞的效率。体外和体内试验都已证明了这种设计中构建的重组体的优越性(参见实验例)。
序列表说明：
序列1：人体hTERT启动子的碱基序列及转录因子的结合位点.SP-1(GC-boxes)：SP1结合位点；E-boxes：Myc的结合部位；NF-1：和NF因子结合的位点。序列2：经修饰突变改造而具更高肿瘤细胞专一性及转录活性的hTERT启动子.E2F-1：E2F转录因子结合部位。
序列3：重组体KH-901的基因组序列：
1)1-103：腺病毒左侧臂(ITR)[腺病毒5基因组全序列：Genbank No：BK000408]；
2)194-358：腺病毒基因组包装序列和E1增强子序列；
3)362-534：SV40多聚腺嘌呤核苷酸信号序列和连接序列(linker)(腺病毒5型中碱基从#362到#551已删除)；
4)525-811：经基因工程技术改造的hTERT启动子序列和连接序列；
5)812以右：腺病毒序列包括E1A，E1B，E2等；
6)28995-29436：免疫调节基因人类GM-CSF基因；
7)29437以右：腺病毒序列包括E4已和右侧臂。
序列4：重组体KH-902的基因组中免疫调节因子GM-CSF基因的膜结合型基因(mbGM-CSF)序列。
序列5：重组体KH-904的基因组中含腺病毒血型35型的纤维蛋白基因序列(Fiberknob：Ad5/35)。
附图说明：
图1：人体hTERT启动子的碱基序列及转录因子的结合位点.SP-1(GC-boxes)：SP1结合位点；E-boxes：Myc的结合部位；NF-1：和NF因子结合的位点。
图2：经修饰突变改造而具更高肿瘤细胞专一性及转录活性的hTERT启动子.E2F-1：E2F转录因子结合部位。
图3-1和图3-2：重组体腺病毒的结构示意图。
图4-1，图4-2和图4-3：重组腺病毒KH-901的构建过程示意图
图5：重组腺病毒KH-901的技术路线框图。
图6：hTERT启动子的活性：野生型启动子(telo)与改造型启动子(Mtelo)之比较。
图7：重组体腺病毒在人体初始hFK细胞和转化乳头状病毒(HPV)E6基因的hFKs-E6细胞中E1A信使核糖核酸的表达。
图8：重组体病毒对体外培养的正常骨髓细胞(bone marrow stem cells)杀伤活性的比较。
图9：重组体腺病毒在A549细胞中杀死细胞能力之比较(存活细胞百分比)。
图10：重组体在前列腺肿瘤模型上杀死肿瘤能力之比较。
具体实施方式：
下列实施例是对本发明的进一步解释和证明，对本发明不构成任何限制。
实施例1：
构建溶瘤性复制型腺病毒重组体KH-901及鉴定(如图4和图5所示)
2.根据图1中hTERT启动子序列设计合成两段引物：
A.5’-GTCTGGATCCGCTAGCCCCACG-3’
B.5’-CGACCGGTGATATCGTTTAATTCGC-3’
作为引物，以激活的人体基因组核糖核酸作为模板，经PCR方法扩增到人的hTERT启动子。其中，反应条件为：第一循环：94℃变性5分钟，81℃退火1分钟，72℃延伸2分钟；以后个循环：93℃变性1分钟，68℃退火一分钟，72℃延伸2分钟，共35个循环。由此得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳分析，回收得到hTERT启动子片断。经测序分析，得到的启动子片段与发表的一样(图1)。然后将这段DNA克隆到pUC19载体之中，利用定点突变的方法(Strategene定点诱导方法)将hTERT启动子序列变成图2所示的序列。
3.PCR扩增多聚腺嘌呤核苷酸信号序列。引物分别为：
C.5’-TAATATTTGTCTAGGGCCGCGGGGGATCTCTGC-3’
D.5’-GGATCCAGACATGATAAGATACATTGAGAG-3’
用pCMV/zero(Invitrogen，USA)作模板，同上的退火条件，扩增poly(A)序列，纯化后测序验证。
4.将纯化后的hTERT启动子片段和poly(A)DNA片段放在一起将95℃变性5分钟，冷却到室温，然后用引物A和引物D做引物，以冷却后的hTERT启动子和poly(A)DNA片段混合物作模板，进行放大得到一段大小在500个碱基对左右的DNA片段。经纯化测序验证。验证正确之后用SspI和AgeI切割，纯化得到所要的插入片段，这个片段含有poly(A)信号序列和hTERT启动子。
5.pXC.1(购自加拿大的Microbix)在碱基对第339和第551的地方分别用定点突变的方法(Strategene定点诱导方法)加上酶切位点SspI和PinAI(AgeI)切口。经突变之后的质粒，用SspI和AgeI切开，跑胶分离作为载体。这个载体与第3步中纯化到，并经SspI和AgeI酶切割的poly(A)/hTERT启动子片段相联接。连接20小时之后，转化DH5α大肠杆菌，经4℃孵育30分钟，42℃热休克30秒钟，再在4℃孵育2分钟，加1mL LB培养液在37℃培养箱中培养45分钟。然后转到含安卡青霉素的琼脂培养板上24小时之后，用灭菌牙签挑取单个细菌克隆，然后放入干净的含有LB的培养瓶中，24小时之后，按照常规方法提取质粒DNA用酶切筛选所需质粒，得阳性克隆，命名为pKH-901a，然后经测序确定其序列是正确。含有腺病毒左侧臂，已装序列，poly(A)序列，hTERT启动子(Mtelo)，E1A和部分E1B基因序列。
6.腺病毒右侧臂部分的构建。
pBHGE3(购于加拿大Microbix公司)用BsiWI和NotI酶切，然后接到pGEM-7载体上(Promega公司购得)。然后用两对引物放大其中两个片段。
引物设计如下：
E.5’-AACCAAGGCGAACCTT-3’
F.5’-CCACATGGTTATCTTGG-3’
G.5’-CCAGTCCAGGAGTAATTTAC-3’
H.5’-TGCGCTTTAGGCAGCAGATG-3’
利用这两对引物和pBHGE3作模板放大得到两段DNA序列。然后利用下面两个引物：
M.5’-CCACCCAAGATAACCATGTGGCTGC-3’
N.5’-AACTTAGTAAATTACTCCTGGACTGG-3’
用激活的人体巨噬细胞的cDNA作模板根据上述类似的放大扩增条件，得到大量的GM-CSF基因的cDNA片段。纯化之后测序确认序列，将这段cDNA和上面从pBHGE3放大得的两段DNA一起作模板，已引物E和H进行扩增放大而得到一段DNA片段，纯化之后测序确定其序列。经BsiWI和NotI酶切割之后接到上述pGEM-7载体中。然后进一步转接到pBHGE3之中，而得到右侧端质粒DNA命名为pKH-901b。这个质粒含有部分EIB基因，E2基因，E3基因，GM-CSF和E4基因。
7.重组腺病毒KH-901的构建。
pKH-901a和pKH-901b质粒DNA分别用NdeI和ClaI酶切割使之线性化，经纯化后一起转化HeLa细胞(Invitrogen转化剂)。在37℃培养10天之后，将细胞收集起来，经冻溶三次，取100微升细胞上清液进行病毒菌斑分离试验，再加入细胞上清液之后8到12天之内，可以在低凝点琼脂胶之下，清晰看到很多分离的较好的病毒斑点。然后利用10微升的自动取样枪吸取10微升，加到预先种植好的HeLa细胞之中。4-8天之后，可以看到所有的细胞都裂解了，收集此细胞裂解清液。冻溶三次取200微升，提取其中的病毒DNA。利用PCR方法和Southern杂交的方法确认病毒的结构。然后在HeLa细胞重复分离3次，得到单克隆病斑在HeLa细胞中成长起来，保存在-80℃的冷冻箱中，取部分裂解液，确认病毒序列后命名为KH-901。
大批量产生KH-901的方法将在另文中介绍，简要的操作步骤如下：Hela-S3(HeLa细胞经体外筛选变成能在无小牛血清的培养液中悬浮生长)。接种在3升的培养器皿中，然后等长到一定数目的细胞之后，接种KH-901，再培养2-3天，收集细胞，往CsCl2梯度离心方法或离子交换(ion exchange)的方法分离纯化病毒，然后保存在适当的制剂之中，如PBS和甘油。
实施例2
KH-900的构建类似于KH-901的流程，只是在pKH-901a质粒中，没有多聚腺嘌呤核苷酸序列，在hTERT启动子片段中没有突变，序列如同序列1。得到的新质粒称为pKH-900a。质粒pKH-900a与pKH-901b在HeLa细胞中共转化而得到KH-900。
实施例3
KH-902的构建类似于KH-901，只是将其中PKH-901b中的GM-CSF cDNA基因换成如序列4的膜结合型GM-CSF基因。此质粒命名为pKH-902b。质粒pKH-902b和pKH-901a在HeLa细胞中一起转化而得到KH-902。
实施例4
KH-903的构建与KH-901类似，只是将pKH-901b中的编码10.4k，14.5k和14.7k的编码序列用常规的基因工程方法切除，得到的质粒命名为pKH-903b。pKH-901a和PKH-903b在HeLa细胞中共转化而得到KH-903。
实施例5
KH-904的构建与KH-901类似，唯一不同的是其中的pKH-901b中的纤维蛋白基因的端结(Knob)由腺病毒血型5型序列变成血型35型。如序列5，得到的质粒命名为pKH-904b。
实施例6
KH-905的构建与KH-904类似，只是其中pKH-904b中GM-CSF基因由分泌型变成了膜结合型，如序列4。得到的序列命名为pKH-905b。pKH-901a和pKH-905b一起共转化HeLa细胞而得到KH-905。PCR分析和序列测试确定病毒的结构和序列。
实施例7
KH-906的构建与KH-901相似，只是其中用到的质粒pKH-901a中的E1B启动子换成了核糖体进入序列。做得的质粒称为pKH-906a。然后pKH-906a与pKH-901b一起转化HeLa细胞得到KH-906[Li et al.(2001)Cancer Research 62：2667-2674]。PCR分析和序列测试确定病毒的结构和序列。
                                序列表
<110>成都康弘科技实业(集团)有限公司
<120>肿瘤细胞专一表达免疫调节因子GM-CSF的溶瘤性腺病毒重组体的构建及其应用
<160>5
<210>1
<211>252
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ctagccccac gtggcggagg gactggggac ccgggcaccc gtcctgcccc ttcaccttcc      60
agctccgcct cctccgcgcg gaccccgccc cgtcccgacc cctcccgggt ccccggccca     120
gccccctccg ggccctccca gcccctcccc ttcctttccg cggccccgcc ctctcctcgc     180
ggcgcgagtt tcaggcagcg ctgcgtcctg ctgcgcacgt gggaagccct ggccccggcc     240
acccccgcga tg                                                         252
<210>2
<211>253
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>2
ctagccccac gtggcggagg gactggggac ccgggcaccc gtcctgcccc ttcaccttcc      60
agctccgcct cctccgcgcg gaccccgccc cgtcccgacc cctcccgggt ccccggccca     120
gccccctccg ggccctccca gcccctcccc ttcctttccg cggcaacgcc ctctccttcg     180
cggcgcgagt ttcaggcagc gctgcgtcct gctgcgcacg tgggaagccc tggccccggc     240
cacccccgcg atg 253
<210>3
<211>35852
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>3
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt      60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt     120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg     180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag     240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc aggaaaactg aataagagga     300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg     360
ggatctctgc aggaatttga tatcaagctt atcgataccg tcgaaacttg tttattgcag     420
cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt     480
cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggatcc     540
gctagcccca cgtggcggag ggactgggga cccgggcacc cgtcctgccc cttcaccttc     600
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agccccctcc gggccctccc agcccctccc cttcctttcc gcggcaacgc cctctccttc     720
gcggcgcgag tttcaggcag cgctgcgtcc tgctgcgcac gtgggaagcc ctggccccgg     780
ccacccccgc gaattaaacg atatcaccgg tcgactgaaa atgagacata ttatctgcca     840
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actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca cctacccttc acgaactgta     960
tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgaggag gcggtttcgc agatttttcc    1020
cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta ctcacttttc cgccggcgcc    1080
cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag cagccggagc agagagcctt    1140
gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc gatcttacct gccacgaggc    1200
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agatattatg tgttcgcttt gctatatgag gacctgtggc atgtttgtct acagtaagtg    1380
aaaattatgg gcagtgggtg atagagtggt gggtttggtg tggtaatttt ttttttaatt    1440
tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt attgtgattt ttttaaaagg tcctgtgtct    1500
gaacctgagc ctgagcccga gccagaaccg gagcctgcaa gacctacccg ccgtcctaaa    1560
atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt ctagagaatg caatagtagt    1620
acggatagct gtgactccgg tccttctaac acacctcctg agatacaccc ggtggtcccg    1680
ctgtgcccca ttaaaccagt tgccgtgaga gttggtgggc gtcgccaggc tgtggaatgt    1740
atcgaggact tgcttaacga gcctgggcaa cctttggact tgagctgtaa acgccccagg    1800
ccataaggtg taaacctgtg attgcgtgtg tggttaacgc ctttgtttgc tgaatgagtt    1860
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atattcacct ggcccgcggt gatgcctttg agggtggccg catccatctg gtcagaaaag    6300
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gcattgactg ggtctgtgtg cgctttgcat atctcagaca ccatccccag tacagggaca   30060
ggactatagc tgagcttctt agaattcttt aattatgaaa tttactgtga cttttctgct   30120
gattatttgc accctatctg cgttttgttc cccgacctcc aagcctcaaa gacatatatc   30180
atgcagattc actcgtatat ggaatattcc aagttgctac aatgaaaaaa gcgatctttc   30240
cgaagcctgg ttatatgcaa tcatctctgt tatggtgttc tgcagtacca tcttagccct   30300
agctatatat ccctaccttg acattggctg gaaacgaata gatgccatga accacccaac   30360
tttccccgcg cccgctatgc ttccactgca acaagttgtt gccggcggct ttgtcccagc   30420
caatcagcct cgccccactt ctcccacccc cactgaaatc agctacttta atctaacagg   30480
aggagatgac tgacacccta gatctagaaa tggacggaat tattacagag cagcgcctgc   30540
tagaaagacg cagggcagcg gccgagcaac agcgcatgaa tcaagagctc caagacatgg   30600
ttaacttgca ccagtgcaaa aggggtatct tttgtctggt aaagcaggcc aaagtcacct   30660
acgacagtaa taccaccgga caccgcctta gctacaagtt gccaaccaag cgtcagaaat   30720
tggtggtcat ggtgggagaa aagcccatta ccataactca gcactcggta gaaaccgaag   30780
gctgcattca ctcaccttgt caaggacctg aggatctctg cacccttatt aagaccctgt   30840
gcggtctcaa agatcttatt ccctttaact aataaaaaaa aataataaag catcacttac   30900
ttaaaatcag ttagcaaatt tctgtccagt ttattcagca gcacctcctt gccctcctcc   30960
cagctctggt attgcagctt cctcctggct gcaaactttc tccacaatct aaatggaatg   31020
tcagtttcct cctgttcctg tccatccgca cccactatct tcatgttgtt gcagatgaag   31080
cgcgcaagac cgtctgaaga taccttcaac cccgtgtatc catatgacac ggaaaccggt   31140
cctccaactg tgccttttct tactcctccc tttgtatccc ccaatgggtt tcaagagagt   31200
ccccctgggg tactctcttg cgcctatccg aacctctagt tacctccaat ggcatgcttg   31260
cgctcaaaat gggcaacggc ctctctctgg acgaggccgg caaccttacc tcccaaaatg   31320
taaccactgt gagcccacct ctcaaaaaaa ccaagtcaaa cataaacctg gaaatatctg   31380
cacccctcac agttacctca gaagccctaa ctgtggctgc cgccgcacct ctaatggtcg   31440
cgggcaacac actcaccatg caatcacagg ccccgctaac cgtgcacgac tccaaactta   31500
gcattgccac ccaaggaccc ctcacagtgt cagaaggaaa gctagccctg caaacatcag   31560
gccccctcac caccaccgat agcagtaccc ttactatcac tgcctcaccc cctctaacta   31620
ctgccactgg tagcttgggc attgacttga aagagcccat ttatacacaa aatggaaaac   31680
taggactaaa gtacggggct cctttgcatg taacagacga cctaaacact ttgaccgtag   31740
caactggtcc aggtgtgact attaataata cttccttgca aactaaagtt actggagcct   31800
tgggttttga ttcacaaggc aatatgcaac ttaatgtagc aggaggacta aggattgatt   31860
ctcaaaacag acgccttata cttgatgtta gttatccgtt tgatgctcaa aaccaactaa   31920
atctaagact aggacagggc cctcttttta taaactcagc ccacaacttg gatattaact   31980
acaacaaagg cctttacttg tttacagctt caaacaattc caaaaagctt gaggttaacc   32040
taagcactgc caaggggttg atgtttgacg ctacagccat agccattaat gcaggagatg   32100
ggcttgaatt tggttcacct aatgcaccaa acacaaatcc cctcaaaaca aaaattggcc   32160
atggcctaga atttgattca aacaaggcta tggttcctaa actaggaact ggccttagtt   32220
ttgacagcac aggtgccatt acagtaggaa acaaaaataa tgataagcta actttgtgga   32280
ccacaccagc tccatctcct aactgtagac taaatgcaga gaaagatgct aaactcactt   32340
tggtcttaac aaaatgtggc agtcaaatac ttgctacagt ttcagttttg gctgttaaag   32400
gcagtttggc tccaatatct ggaacagttc aaagtgctca tcttattata agatttgacg   32460
aaaatggagt gctactaaac aattccttcc tggacccaga atattggaac tttagaaatg   32520
gagatcttac tgaaggcaca gcctatacaa acgctgttgg atttatgcct aacctatcag   32580
cttatccaaa atctcacggt aaaactgcca aaagtaacat tgtcagtcaa gtttacttaa   32640
acggagacaa aactaaacct gtaacactaa ccattacact aaacggtaca caggaaacag   32700
gagacacaac tccaagtgca tactctatgt cattttcatg ggactggtct ggccacaact   32760
acattaatga aatatttgcc acatcctctt acactttttc atacattgcc caagaataaa   32820
gaatcgtttg tgttatgttt caacgtgttt atttttcaat tgcagaaaat ttcaagtcat   32880
ttttcattca gtagtatagc cccaccacca catagcttat acagatcacc gtaccttaat   32940
caaactcaca gaaccctagt attcaacctg ccacctccct cccaacacac agagtacaca   33000
gtcctttctc cccggctggc cttaaaaagc atcatatcat gggtaacaga catattctta   33060
ggtgttatat tccacacggt ttcctgtcga gccaaacgct catcagtgat attaataaac   33120
tccccgggca gctcacttaa gttcatgtcg ctgtccagct gctgagccac aggctgctgt   33180
ccaacttgcg gttgcttaac gggcggcgaa ggagaagtcc acgcctacat gggggtagag   33140
tcataatcgt gcatcaggat agggcggtgg tgctgcagca gcgcgcgaat aaactgctgc   33200
cgccgccgct ccgtcctgca ggaatacaac atggcagtgg tctcctcagc gatgattcgc   33260
accgcccgca gcataaggcg ccttgtcctc cgggcacagc agcgcaccct gatctcactt   33320
aaatcagcac agtaactgca gcacagcacc acaatattgt tcaaaatccc acagtgcaag   33380
gcgctgtatc caaagctcat ggcggggacc acagaaccca cgtggccatc ataccacaag   33440
cgcaggtaga ttaagtggcg acccctcata aacacgctgg acataaacat tacctctttt   33500
ggcatgttgt aattcaccac ctcccggtac catataaacc tctgattaaa catggcgcca   33560
tccaccacca tcctaaacca gctggccaaa acctgcccgc cggctataca ctgcagggaa   33620
ccgggactgg aacaatgaca gtggagagcc caggactcgt aaccatggat catcatgctc   33680
gtcatgatat caatgttggc acaacacagg cacacgtgca tacacttcct caggattaca   33740
agctcctccc gcgttagaac catatcccag ggaacaaccc attcctgaat cagcgtaaat   33800
cccacactgc agggaagacc tcgcacgtaa ctcacgttgt gcattgtcaa agtgttacat   33860
tcgggcagca gcggatgatc ctccagtatg gtagcgcggg tttctgtctc aaaaggaggt   33900
agacgatccc tactgtacgg agtgcgccga gacaaccgag atcgtgttgg tcgtagtgtc   33960
atgccaaatg gaacgccgga cgtagtcata tttcctgaag caaaaccagg tgcgggcgtg   34020
acaaacagat ctgcgtctcc ggtctcgccg cttagatcgc tctgtgtagt agttgtagta   34080
tatccactct ctcaaagcat caggcgcccc ctggcttcgg gttctatgta aactccttca   34140
tgcgccgctg ccctgataac atccaccacc gcagaataag ccacacccag ccaacctaca   34200
cattcgttct gcgagtcaca cacgggagga gcgggaagag ctggaagaac catgtttttt   34260
tttttattcc aaaagattat ccaaaacctc aaaatgaaga tctattaagt gaacgcgctc   34320
ccctccggtg gcgtggtcaa actctacagc caaagaacag ataatggcat ttgtaagatg   34380
ttgcacaatg gcttccaaaa ggcaaacggc cctcacgtcc aagtggacgt aaaggctaaa   34440
cccttcaggg tgaatctcct ctataaacat tccagcacct tcaaccatgc ccaaataatt   34500
ctcatctcgc caccttctca atatatctct aagcaaatcc cgaatattaa gtccggccat   34560
tgtaaaaatc tgctccagag cgccctccac cttcagcctc aagcagcgaa tcatgattgc   34620
aaaaattcag gttcctcaca gacctgtata agattcaaaa gcggaacatt aacaaaaata   34680
ccgcgatccc gtaggtccct tcgcagggcc agctgaacat aatcgtgcag gtctgcacgg   34740
accagcgcgg ccacttcccc gccaggaacc ttgacaaaag aacccacact gattatgaca   34800
cgcatactcg gagctatgct aaccagcgta gccccgatgt aagctttgtt gcatgggcgg   34860
cgatataaaa tgcaaggtgc tgctcaaaaa atcaggcaaa gcctcgcgca aaaaagaaag   34920
cacatcgtag tcatgctcat gcagataaag gcaggtaagc tccggaacca ccacagaaaa   34980
agacaccatt tttctctcaa acatgtctgc gggtttctgc ataaacacaa aataaaataa   35040
caaaaaaaca tttaaacatt agaagcctgt cttacaacag gaaaaacaac ccttataagc   35100
ataagacgga ctacggccat gccggcgtga ccgtaaaaaa actggtcacc gtgattaaaa   35160
agcaccaccg acagctcctc ggtcatgtcc ggagtcataa tgtaagactc ggtaaacaca   35220
tcaggttgat tcatcggtca gtgctaaaaa gcgaccgaaa tagcccgggg gaatacatac   35280
ccgcaggcgt agagacaaca ttacagcccc cataggaggt ataacaaaat taataggaga   35340
gaaaaacaca taaacacctg aaaaaccctc ctgcctaggc aaaatagcac cctcccgctc   35400
cagaacaaca tacagcgctt ccacagcggc agccataaca gtcagcctta ccagtaaaaa   35460
agaaaaccta ttaaaaaaac accactcgac acggcaccag ctcaatcagt cacagtgtaa   35520
aaaagggcca agtgcagagc gagtatatat aggactaaaa aatgacgtaa cggttaaagt   35580
ccacaaaaaa cacccagaaa accgcacgcg aacctacgcc cagaaacgaa agccaaaaaa   35640
cccacaactt cctcaaatcg tcacttccgt tttcccacgt tacgtcactt cccattttaa   35700
ttaagaaaac tacaattccc aacacataca agttactccg ccctaaaacc tacgtcaccc   35760
gccccgttcc cacgccccgc gccacgtcac aaactccacc ccctcattat catattggct   35820
tcaatccaaa ataaggtata ttattgatga tg                                 35852
<210>4
<211>582
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>4
atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc      60
cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg     120
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cttatcatcc tcatcatgct ttggcagaag aagccacgtt ag 582
<210>5
<211>1772
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>5
atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatcctat gacacggaaa      60
ccggtcctcc aactgtgcct tttcttactc ctccctttgt atcccccaat gggtttcaag     120
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gagccttggg ttttgattca caaggcaata tgcaacttaa tgtagcagga ggactaagga     780
ttgattctca aaacagacgc cttatacttg atgttagtta tccgtttgat gctcaaaacc     840
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ttaacctaag cactgccaag gggttgatgt ttgacgctac agccatagcc attaatgcag    1020
gagatgggct tgaatttggt tcacctaatg caccaaacac aaatcccctc aaaacaaaaa    1080
ttggccatgg cctagaattt gattcaaaca aggctatggt tcctaaacta ggaactggcc    1140
ttagttttga cagcacaggt gccattacag taggaaacaa aaataatgat aagctaacct    1200
tatggactgg aataaaccct ccacctaact gtcaaattgt ggaaaacact aatacaaatg    1260
atggcaaact tactttagta ttagtaaaaa atggagggct tgttaatggc tacgtgtctc    1320
tagttggtgt atcagacact gtgaaccaaa tgttcacaca aaagacagca aacatccaat    1380
taagattata ttttgactct tctggaaatc tattaactga ggaatcagac ttaaaaattc    1440
cacttaaaaa taaatcttct acagcgacca gtgaaactgt agccagcagc aaagccttta    1500
tgccaagtac tacagcttat cccttcaaca ccactactag ggatagtgaa aactacattc    1560
atggaatatg ttactacatg actagttatg atagaagtct atttcccttg aacatttcta    1620
taatgctaaa cagccgtatg atttcttcca atgttgccta tgccatacaa tttgaatgga    1680
atctaaatgc aagtgaatct ccagaaagca acatagctac gctgaccaca tccccctttt    1740
tcttttctta cattacagaa gacgacaact aa 1772

Claims (30)

1.一种肿瘤细胞专一的，可以表达一种免疫调节细胞因子的溶瘤性复制型病毒重组体，其特征在于，该重组体由载体病毒，肿瘤细胞专一的基因调节元件和免疫调节基因构建而成。
2.权利要求1的重组体，其特征在于，所述载体病毒为DNA病毒或RNA病毒的任何一种。
3.权利要求2的重组体，其特征在于，所述载体病毒为腺病毒或其改造型。
4.权利要求3的重组体，其特征在于，所述腺病毒选自腺病毒5型、2型、35型、41型。
5.权利要求3的重组体，其特征在于，所述腺病毒改造体为，将腺病毒的E1A和E1B基因用核糖体介入因子IRES连起来的腺病毒。
6.权利要求3的重组体，其特征在于，所述腺病毒改造体为，用腺病毒35型上的纤维蛋白基因顶结序列代替腺病毒5型的顶结而构建的腺病毒。
7.权利要求3的重组体，其特征在于，所述腺病毒改造体为，在腺病毒的末端、包装序列之后，外源启动子之前安装一个转录的阻断序列的腺病毒。
8.权利要求3的重组体，其特征在于，所述腺病毒改造体为，在腺病毒E3区中编码10.4K，14.5K和14.7K的序列已删除的腺病毒。
9.权利要求3的重组体，其特征在于，所述腺病毒改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，将腺病毒的E1A和E1B基因用核糖体介入因子IRES连起来，并且用腺病毒35型上的纤维蛋白基因顶结序列代替腺病毒5型的顶结，并且在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装一个转录的阻断序列。
10.权利要求9的重组体，其特征在于，所述阻断序列为SV40早期的多聚(A)信号序列。
11.权利要求1的重组体，其特征在于，所述肿瘤细胞专一的基因调节元件是任何癌细胞特异的启动子，增强子，静止子或他们的组合。
12.权利要求11的重组体，其特征在于，所述启动子是序列表中序列2表示的hTERT启动子。
13.权利要求1的重组体，其特征在于，所述免疫调节基因是是能提高人体免疫能力的任何一种细胞因子基因。
14.权利要求13的重组体，其特征在于，所述能提高人体免疫能力的细胞因子基因选自IL-2，IL-10，IL-12，IL-15，IL-24，IL-25，GM-CSF，G-CSF和INF-alpha，INF-beta基因或它们的变体。
15.权利要求13的重组体，其特征在于，所述能提高人体免疫能力的细胞因子基因是GM-CSF基因或它的变体。
16.权利要求15的重组体，其特征在于，所述能提高人体免疫能力的细胞因子基因GM-CSF基因是膜结合型GM-CSF基因。
17.权利要求1的重组体，其特征在于，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，将腺病毒的E1A和1B基因用核糖体介入因子IRES连起来，并且用腺病毒35型上的纤维蛋白基因顶结序列代替腺病毒5型的顶结，并且在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装一个转录的阻断序列，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件是序列表中序列2表示的hTERT启动子，其中的免疫调节基因是GM-CSF基因。
18.权利要求17的重组体，其特征在于，其中的免疫调节基因是膜结合型GM-CSF基因。
19.权利要求1的重组体，其特征在于，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装一个转录的阻断序列，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件是序列表中序列2表示的hTERT启动子，其中的免疫调节基因是GM-CSF基因，其DNA序列为序列表中序列3表示的序列。
20.权利要求19的重组体，其特征在于，其中的免疫调节基因是膜结合型GM-CSF基因。
21.权利要求1的重组体，其特征在于，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，并且用腺病毒35型上的纤维蛋白基因顶结序列代替腺病毒5型的顶结，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件是序列表中序列2表示的hTERT启动子，其中的免疫调节基因是GM-CSF基因。
22.权利要求21的重组体，其特征在于，其中的免疫调节基因是膜结合型GM-CSF基因。
23.权利要求1的重组体，其特征在于，其中的载体病毒是腺病毒改造体，该改造体是这样一种改造体，在腺病毒序列上，在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装一个转录的阻断序列，在腺病毒E3区中编码10.4K，14.5K和14.7K的序列已删除的腺病毒，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件是序列表中序列2表示的hTERT启动子，其中的免疫调节基因是GM-CSF基因。
24.权利要求23的重组体，其特征在于，其中的免疫调节基因是膜结合型GM-CSF基因。
25.一种启动子，其特征在于，具有序列表中序列2表示的核苷酸序列。
26.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1-24的重组体。
27.权利要求26的组合物，是注射剂。
28.权利要求26的组合物，其特征在于，可以联合用于肿瘤的放疗和化疗。
29.权利要求1的重组体在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。
30.权利要求1的重组体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.含有hTERT启动子序列的腺病毒左侧臂的制备；
b.含有免疫调节基因的腺病毒右侧臂的制备；
c.将腺病毒左侧臂和腺病毒右侧臂转染到293细胞、HeLa细胞、HeLa-S3细胞或A549细胞中，通过同源重组的方法得到权利要求1的重组体。
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JP2007526164A JP4874247B2 (ja) 2004-06-07 2004-11-19 腫瘍溶解性アデノウイルス組換え体、特に、腫瘍において免疫調節因子ｇｍ−ｃｓｆを発現する組換え体の構築およびその利用
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PCT/CN2004/001321 WO2005121343A1 (fr) 2004-06-07 2004-11-19 Construction d'une recombinaison d'adenovirus oncolytique exprimant de facon specifique un facteur immunomodulateur gm-csf dans des cellules tumorales et utilisations correspondantes
DK04797352.4T DK1767642T3 (da) 2004-06-07 2004-11-19 Konstruktion af onkolytiske adenovirus rekombinant specifikt udtrykkende immunmodulatorisk faktor gm-csf i tumorceller og anvendelser deraf
US11/628,760 US7951585B2 (en) 2004-06-07 2004-11-19 Construction of oncolytic adenovirus recombinant specifically expressing immune modulatory factor GM-CSF in tumor cells and uses thereof
RU2006146665/13A RU2361611C2 (ru) 2004-06-07 2004-11-19 Конструирование рекомбинанта онколитического аденовируса, специфически экспрессирующего иммуномодуляторный фактор gm-csf в опухолевых клетках, и его применение
BRPI0418805A BRPI0418805B8 (pt) 2004-06-07 2004-11-19 construção de recombinante de adenovírus oncolítico expressando especificamente um fator imunomodulatório gmcsf em células tumorais e seus usos
ES04797352.4T ES2466415T3 (es) 2004-06-07 2004-11-19 Construcción de recombinante de adenovirus oncolítico que expresa específicamente el factor inmunomodulador GM-CSF en células tumorales y usos del mismo

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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101391104B (zh) * 2007-09-21 2010-10-06 成都康弘生物科技有限公司 肿瘤细胞专一表达免疫调节因子gm-csf的溶瘤性腺病毒重组体的新用途
WO2012116636A1 (zh) * 2011-03-02 2012-09-07 北京锤特生物科技有限公司 靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒及其应用
CN104204805A (zh) * 2012-03-14 2014-12-10 萨克生物研究学院 腺病毒肿瘤诊断法
CN111630159A (zh) * 2017-12-13 2020-09-04 基因药物株式会社 重组腺病毒及包含此病毒的干细胞
CN113444730A (zh) * 2021-03-17 2021-09-28 昆明市延安医院 一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法
CN115029325A (zh) * 2021-03-08 2022-09-09 南京惟亚德生物医药有限公司 一种重组溶瘤腺病毒及其应用

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008527981A (ja) * 2005-01-25 2008-07-31 アポロ ライフ サイエンシズ リミテッド 治療目的および診断目的のためにパラメーターにより選択されたｇｍ−ｃｓｆ、ｉｌ−３、ｉｌ−４、ｉｌ−５、ならびにそのキメラ
CA2995971A1 (en) 2005-03-25 2006-10-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf antagonist formulations
JP5216002B2 (ja) 2006-06-16 2013-06-19 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 硝子体内投与に適したｖｅｇｆアンタゴニスト製剤
JP2008048621A (ja) * 2006-08-22 2008-03-06 Chiba Prefecture キメラ型アデノウイルスとその作製方法並びにそれを用いた医薬
CN103221423B (zh) 2010-09-24 2015-09-30 昂克斯治疗有限公司 溶瘤腺病毒载体及与其相关的方法和用途
WO2012088446A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists and antagonists of interleukin-2
EP3763379A1 (en) 2011-01-13 2021-01-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of a vegf antagonist to treat angiogenic eye disorders
JP5971599B2 (ja) * 2011-08-23 2016-08-17 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 制限増殖型アデノウイルス
US9624476B2 (en) 2011-08-23 2017-04-18 National Institute Of Biomedical Innovation Conditionally replicating adenovirus
FI123955B (en) 2011-11-25 2014-01-15 Oncos Therapeutics Ltd Oncolytic adenovirus
US9017672B2 (en) 2012-05-11 2015-04-28 Immunicum Aktiebolag Hexon Tat-PTD modified adenovirus and uses thereof
EP2971008B1 (en) 2013-03-14 2018-07-25 Salk Institute for Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
KR20160002848A (ko) * 2013-03-24 2016-01-08 오이신 바이오테크놀로지스 표적 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 시스템 및 방법
WO2014171526A1 (ja) * 2013-04-17 2014-10-23 国立大学法人九州大学 遺伝子改変コクサッキーウイルス
LT3021859T (lt) 2013-10-25 2018-06-11 Psioxus Therapeutics Limited Onkolitiniai adenovirusai su heterologiniais genais
RU2682762C2 (ru) * 2013-11-27 2019-03-21 Общество С Ограниченной Ответственностью "Панацела Лабс" Улучшенный вектор, экспрессирующий toll-подобный рецептор и агонист, и применение в терапии рака
EP3391892A1 (en) 2015-04-30 2018-10-24 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenovirus encoding a b7 protein
JP7064437B2 (ja) 2015-12-17 2022-05-10 サイオクサス セラピューティクス リミテッド 抗ｔｃｒ複合体抗体又は断片をコードするｂ群アデノウイルス
KR102471633B1 (ko) 2016-02-23 2022-11-25 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 바이러스 동역학에 미치는 영향 최소화를 위한 치료용 아데노바이러스의 외인성 유전자 발현
WO2017147265A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
CN110062630A (zh) 2016-12-12 2019-07-26 萨克生物研究学院 肿瘤靶向合成腺病毒及其用途
CA3047140A1 (en) 2017-01-09 2018-07-12 Oisin Biotechnologies Constructs for expression of therapeutic proteins in target cells
CA3067909A1 (en) * 2017-06-19 2018-12-27 Medicenna Therapeutics Inc. Uses and methods for il-2 superagonists, agonists, and fusions thereof
JP2021526505A (ja) 2018-04-18 2021-10-07 オイシン バイオテクノロジーズ，インク． 治療用タンパク質の標的細胞に特異的な産生のための、および、標的細胞に関連する疾患、疾病、または障害の処置のための、融合性脂質ナノ粒子、および、融合性脂質ナノ粒子の製造方法と使用方法
KR20210093303A (ko) 2018-11-21 2021-07-27 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치 아데노바이러스 및 아데노바이러스의 사용 방법
WO2020166727A1 (ja) * 2019-02-12 2020-08-20 国立大学法人大阪大学 ヒト３５型アデノウイルスを基板とした腫瘍溶解性ウイルス
JP7381604B2 (ja) 2019-04-29 2023-11-15 メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ 癌を治療するための多価ｐｄ－ｌ１結合化合物
JP2023519926A (ja) * 2020-03-23 2023-05-15 キュリジン カンパニー，リミテッド 二重特異性核酸分子を含む抗癌ウイルスの構造
RU2753742C1 (ru) * 2020-10-16 2021-08-24 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (Новосибирский государственный университет, НГУ) Рекомбинантный штамм Ad6-hTERT-GMCSF, содержащий встройку промотора теломеразы человека hTERT, а также гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, обладающий избирательной цитолитической активностью против теломераза-положительных опухолевых клеток и экспрессирующий активный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7592317B1 (en) * 1994-08-11 2009-09-22 The University Of Chicago Constitutive gene expression in conjuction with ionizing radiation
AU3551195A (en) 1994-09-23 1996-04-09 Somatix Therapy Corporation Chimeric adenovirus for gene delivery
US6020191A (en) 1997-04-14 2000-02-01 Genzyme Corporation Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression
US5891432A (en) * 1997-07-29 1999-04-06 The Immune Response Corporation Membrane-bound cytokine compositions comprising GM=CSF and methods of modulating an immune response using same
US6348450B1 (en) 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
AU762493B2 (en) 1998-03-11 2003-06-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Induction of apoptic or cytotoxic gene expression by adenoviral mediated gene codelivery
CN1298451A (zh) * 1998-04-24 2001-06-06 昂尼克斯药物公司 用于治疗疾病的腺病毒载体
US6627190B2 (en) 1999-07-12 2003-09-30 Saint Louis University Recombinant adenovirus vectors that are replication-competent in tert-expressing cells
GB9916851D0 (en) * 1999-07-20 1999-09-22 Univ Wales Bangor Manipulation of particles in liquid media
DK1230378T3 (da) 1999-11-15 2007-10-08 Onyx Pharma Inc Et onkolytisk adenovirus
DE60116513T2 (de) * 2000-08-10 2006-09-21 Crucell Holland B.V. Adenovirenvektoren zur transduktion der chondrozyten
US6713055B2 (en) 2000-11-27 2004-03-30 Geron Corporation Glycosyltransferase vectors for treating cancer
IL152420A0 (en) * 2001-02-23 2003-05-29 Novartis Ag Novel oncolytic adenoviral vectors
CN1177053C (zh) 2001-04-13 2004-11-24 上海华康生物技术有限公司 靶向性、高表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒及其制法和用途
US6905678B2 (en) * 2001-07-07 2005-06-14 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors with cell type specificity for mesenchymal stem cells
CN1195056C (zh) * 2001-07-12 2005-03-30 钱其军 一种在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒及其构建方法
US20030099616A1 (en) * 2001-07-25 2003-05-29 Irving John M. Dual specificity tumor killing vectors driven by the telomerase promoter
US20030082722A1 (en) 2001-08-08 2003-05-01 Bingliang Fang Method for amplifying expression from a cell specific promoter
JP3867968B2 (ja) * 2002-07-08 2007-01-17 関西ティー・エル・オー株式会社 腫瘍細胞において選択的に増殖する腫瘍融解ウイルス
CN1259106C (zh) * 2002-12-23 2006-06-14 中国科学院上海生命科学研究院 一种抗癌靶向基因病毒药物的制备方法
ES2292271B1 (es) 2004-05-20 2009-02-16 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Un vector hibrido adenovirus-alfavirus para la administracion eficaz y expresion de genes terapeuticos en celulas tumorales.

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101391104B (zh) * 2007-09-21 2010-10-06 成都康弘生物科技有限公司 肿瘤细胞专一表达免疫调节因子gm-csf的溶瘤性腺病毒重组体的新用途
WO2012116636A1 (zh) * 2011-03-02 2012-09-07 北京锤特生物科技有限公司 靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒及其应用
CN104204805A (zh) * 2012-03-14 2014-12-10 萨克生物研究学院 腺病毒肿瘤诊断法
CN104204805B (zh) * 2012-03-14 2017-08-01 萨克生物研究学院 腺病毒肿瘤诊断法
CN111630159A (zh) * 2017-12-13 2020-09-04 基因药物株式会社 重组腺病毒及包含此病毒的干细胞
CN115029325A (zh) * 2021-03-08 2022-09-09 南京惟亚德生物医药有限公司 一种重组溶瘤腺病毒及其应用
CN113444730A (zh) * 2021-03-17 2021-09-28 昆明市延安医院 一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法

Also Published As

Publication number Publication date
PL1767642T3 (pl) 2014-08-29
BRPI0418805B1 (pt) 2021-01-26
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CA2568995E (en) 2005-12-22
DK1767642T3 (da) 2014-05-26
ES2466415T3 (es) 2014-06-10
RU2006146665A (ru) 2008-07-20
EP1767642A4 (en) 2008-06-25
CA2568995C (en) 2012-02-21
US20100047208A1 (en) 2010-02-25
BRPI0418805A (pt) 2007-10-16
CA2568995A1 (en) 2005-12-22

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