CN1944655A - 靶向性共表达新型p53和p53AIP1的重组腺病毒 - Google Patents

Abstract

本发明叙述了一种构建靶向性共表达新型肿瘤抑制基因p53和p53调控的细胞凋零诱导蛋白基因(p53AIP1，下同)的表达盒结构的重组腺病毒的方法及其用途和意义，其主要特征为1)野生型P53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突变成为精氨酸，其他氨基酸组成及其排列顺序不变；2)通过内部核糖体结合位点将新型肿瘤抑制基因p53和p53AIP1基因连接；3)该表达盒的启动子由肿瘤特异性启动子PEG－3来驱动；4)该重组腺病毒是复制缺陷型的血清A5型腺病毒。该新型腺病毒具有靶向性共表达二种抗癌基因，即新型肿瘤抑制基因p53和p53AIP1基因，其产物具有更强细胞凋亡生物功能，但对正常细胞不会造成损伤。因此，在肿瘤，尤其是恶性肿瘤的基因治疗中将具有重要意义。

Description

靶向性共表达新型p53和p53AIP1的重组腺病毒

技术领域

本发明涉及靶向性共表达p53和p53AIP1的重组腺病毒备制方法，其备制的重组腺病毒具有在肿瘤细胞内靶向性共表达具有较野生型P53细胞凋亡功能更强的新型抑癌基因p53和p53调控细胞凋亡诱导蛋白(P53AIP1)，达到直接杀灭恶性肿瘤的效果，可用于多种癌症的基因治疗。故其所在的技术领域与生命医药和生物技术有关。

背景技术

P53基因是肿瘤抑制基因家族中的主要成员，是目前发现与人类肿瘤发生的相关性最高的基因。野生型p53基因在维持细胞正常生长、防止和抑制恶性肿瘤细胞的发生和增生中起重要作用。环境中各种的因素，如紫外线、放射线和化学物质以及机体自身产生的某些代谢产物等都可导致细胞DNA损伤。在正常生理情况下，这些细胞DNA能在某些基因产物作用下进行修复或被降解清除，防止其遗传下去而保持正常DNA的复制，进而保护细胞的正常功能运作。否则损伤的DNA会继续复制、随染色体分离，导致染色体组中出现大量的DNA突变和染色体畸变。这些突变的进一步积聚将便正常细胞最终恶化，发展成癌细胞。

现有的大量研究表明野生型p53蛋白质在细胞内发挥着“基因卫士”的生物功能作用，监视着细胞基因组的完整性和稳定性。在细胞DNA受到损伤时，p53迅速活化p21基因的转录，抑制多种原癌基因，如c-Fos、c-jun、Rb和其他相关基因如IL-6、PCNA的转录，使细胞分裂停滞在G1期节点。同时，野生型p53蛋白质与复制因子(RPA)相互作用，参与DNA的复制和修复。更为重要的是，野生型p53蛋白质能启动细胞程序性死亡过程，诱导细胞自杀，防止具有恶变倾向的细胞进一步分裂、增殖，从而防止癌症的发生。

p53基因突变是人类恶性肿瘤中最常见的遗传变异。据统计，大约有50％的人类肿瘤发生与p53基因突变有关，有30％-40％的乳腺癌、50％的肺癌和70％的结肠癌存在P53基因突变；几乎100％的小细胞性肺癌有p53基因突变。此外，动物实验表明，表达异常p53基因蛋白的小鼠100％的发生肿瘤。

由于p53基因如此重要的生物学功能及其与人类肿瘤发生和恶性程度有密切关系，在八十年代以来，科学家就开始了应用外源野生型p53基因的生物学功能，启动p53基因缺陷型肿瘤细胞的细胞程序性凋亡过程，诱导肿瘤细胞自杀死亡的实验研究和临床肿瘤基因治疗研究。现在众多的研究报告以及临床研究结果证明，野生型p53基因冶疗安全、有效，而且毒副作用小。

临床研究结果表明，野生型p53基因对人头颈肿瘤、脑胶质细胞瘤、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤和肺癌有较好疗效。同时研究还表明野生型p53基因还具有抑制肿瘤组织内血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的作用，因而减少肿瘤组织内血管的形成，减少肿瘤组织的血供，起着进一步促进肿瘤细胞死亡的作用。

野生型p53基因的某些氨基位点在自然状态下存在多态性，例如在47位点存在脯氨酸/丝氨酸多态性。研究发现野生型P5347位点为脯氨酸，其介导的激酶p38MAPK使邻近的46位点丝氨酸磷酸化，可大大增加诱导细胞凋亡的能力；而47位点为丝氨酸的变异，则使p53诱导细胞凋亡的能力下降2-5倍以上。同样，野生型P53基因72位点存在常见的脯氨酸(P72，下同)/精氨酸(R72，下同)多态性，这种多态性对于野生型P53基因的细胞调亡诱导功能上有很大的意义。P53基因为R72型的，其细胞调亡能力比P72型的强2-15倍以上(Murphy M，etal：2003，3(3)：357-65，Nat.Genetics)，其机理被认为至少部份是由于R72型p53基因增加了在线粒体的聚集，能直接与促细胞调亡蛋白BAK相互作用，破坏线粒体，使细胞缺乏能量而导致细胞调亡有关。

新近，一种新的p53突变体，p53-46F，即p53-46S(Ser)突变为P53-46F(Phe)已被证明其促细胞调亡功能在许多癌细胞比野生型p53更有效，对p53下游基因，包括Noxa，p53AIP1和P53RFP的转激活水平比野生型p53更强(Nakamura Y，etal.Cancer Sci.2006.July(97(7)：633-641)。

此外，近年的研究还证明，作为一种p53下游基因，p53AIP1，其促细胞调亡功能比野生型p53更强，其作用机理被认为是下调细胞线粒体膜电位，增加细胞色素c的释放有关。更重要的是，表达野生型P53基因的癌细胞对外源野生型p53的治疗有抗性，但p53AIP1却能有效地杀死表达野生型P53基因的癌细胞。而且，二者同时应用对诱导细胞调亡有协同作用(Oda K，et al.Cell2000.Sep.15.102(6)：849-62；Yoshida K，et al.Cancer Sci.2004 Jan95(1)：91-97；Koschi Matsuda，et al.Cancer Research(2002)62：2883-2889)。

上述研究结果为协同使用上述突变型p53和p53AIP1对多种恶性肿瘤，无论其表达野生型P53还是表达突变型p53，进行更有效地基因治疗奠定了坚实的基础。

毫无疑问，抗癌基因治疗的成败取决于整个表达结构三大元件的最佳组合。第一个元件为进入机体细胞内的腺病毒载体，要求安全、高效；第二个元件为治疗基因的有效性；第三个元件为驱动抗癌基因表达的启动子的强弱及其组织/细胞特异性。

目前，将基因导入体内的载体多为复制缺陷型腺病毒载体。这种载体具有感染能力强、靶细胞可以是处于分裂期或是非分裂期、转染细胞后腺病毒载体基因不整合进入人类基因组、可大量生产高滴度腺病毒及其瞬时表达等特点，故复制缺陷型腺病毒载体是目前在肿瘤基因治疗中的首选载体。

重组腺病毒驱动治疗基因表达的启动子可以有多种来源的启动子。目前使用较多是mCMV启动子，但此启动子几乎没有组织/细胞的特导性，对某些毒性作用较大的基因治疗不大适合。

但无论如何，靶向性基因治疗是目前和将来癌症基因治疗的一个非常重要的发展方向。因此，发现和证明一种肿瘤特异性启动子至关重要。

新近，一种肿瘤特异性启动子已被发现和克隆。这种肿瘤特异性启动子含有调控基因表达的胞核转录因子，活化蛋白因-1(AP-1)的结合位点和polyomavirus enhancer activator 3(PEA3，下同)结合位点。活化蛋白因子-1(AP-1)和PEA-3这二个因子在多数肿瘤细胞中都处于过表达状态。基因突变研究证明将上述二个因子结合位点或其中任何一个位点进行突变，都将失去该启动子驱动目的基因在肿瘤细胞内表达的功能，表明此启动子的上述二个因子结合位点是决定其肿瘤特异性表达的决定性因素，不可偏废。更重要的是，研究已经证明此肿瘤特异性启动子肿瘤细胞内有较强的活性，而在正常细胞内没有或极低活性。因此，被确认为一种肿瘤特异性启动子(Haviv，Y.S.，et al：Curr.Gene Ther.Adv，Drug.Delivery Rev.53，135-154；Haviv，Y.S.，et al：Curr.Gene.Ther.(2003)3，357-365；Su，ZZ.et al.PNAS(2005)，102(4)：1059-1064；Devanand Sarkar，et al.PNAS(2005)，102(39)：14034-14039)，。

同样，病毒载体感染细胞须与细胞上的受体结合才能起作用，故其感染与细胞膜上的受体数量呈正比。某些组织细胞，尤其是肿瘤细胞表面的CAR受体偏少，Ad5对它们的感染受限，故病毒难以感染进入细胞内有效发挥其治疗作用。

综上所述，构建新一代由肿瘤特异性启动子驱动，仅在肿瘤细胞内表达冶疗基因、又具有更强肿瘤细胞感染力，为临床治疗恶性肿瘤提供一种靶向性肿瘤基因治疗的腺病毒，在肿瘤的基因治疗应用中将具有重大的现实意义。

发明内容

本发明的目的以细胞调亡功能更强的R72型肿瘤抑制基因p53和p53调控的细胞凋亡诱导蛋白为治疗基因，以肿瘤特异性启动子为调控元件，构建新一代抗癌作用更强、但又不损害正常细胞的腺病毒，使其成为临床恶性肿瘤的基因治疗的新一代产品。

本发明的表达新型抑癌基因p53和p53AIP1基因的表达结构，其主要特点为1).野生型P53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突变成为精氨酸，其他氨基酸组成及其排列顺序不变；2).其表达盒由肿瘤特异性启动子、P53(72R型)、内部核糖体结合位点、抑癌基因p53调控的细胞凋亡诱导蛋白基因和SV40多聚腺嘌呤DNA片段构成。因此，该新型腺病毒由于具有靶向性共表达二种抗癌基因，因而其抗癌功能更强、抗癌谱更广，又具有不损伤正常细胞的生物功能。

附图说明

附图1人野生型肿瘤抑制因子p53基因的PCR产物：应用人工合成的特异性引物，以人正常组织cDNA为模板，进行PCR反应，其反应产物在1.5％琼脂糖电泳分离；纯化后进行克隆。第一泳道和第二泳道为PCR产物、第三泳道为Φ174/BsuRI DNA分子量标记物。

附图2肿瘤抑制因子p53突变型R72的内切酶图谱：R72突变型肿瘤抑制因子p53在突变位点形成新的核苷酸内切酶smal1位点。用内切酶smal1分别消化R72突变型和野生型肿瘤抑制因子p53后，R72突变型产生二个DNA片段；野生型仅产生一个DNA片段。图示电泳第一泳道为landa/Hind111 DNA分子量标记物，第二泳道为I kB DNA分子量标记物；第三泳道为野生型肿瘤抑制因子P53；第四泳道R72突变型肿瘤抑制因子P53。

附图3抑癌基因p53调控的细胞凋亡诱导蛋白基因(p53AIP1)的克隆：此为p53AIP1：的EcoR1酶切图谱。经RT-PCR反应，克隆p53AIP1：于T-Easy载体。第一、二泳道为DNA分子量标记物，第三泳道为p53AIP1：的EcoR1酶切结果。箭头所指为p53AIP1：基因。

附图4肿瘤特异性启动子的克隆：应用野生型p53转染，导致的Hela肿瘤细胞凋亡，并抽取总核糖核酸。此徒结果为合成互补脱氧核糖核酸后的PCR反应产物。第一泳道为DNA分子标准、第二、第三和第四道均为PCR反应产物。箭头为PCR反应产物。

附图5由肿瘤特异性启动子驱动的表达盒构成图谱：此表达盒图谱显示由位于N-未端的肿瘤特异性启动子、新型p53、IRES、p53AIP1和SV40多聚腺嘌呤组成，并以不同内切酶位点相连接。

附图6表达由肿瘤特异性启动子驱动的表达盒的重组腺病毒结构图：结构图中两瑞分别为腺病毒的左臂和右臂，表达盒由肿瘤特异性启动子、R72型肿瘤抑制因子p53、内部核糖体结合位点(IRES，下同)、抑癌基因p53调控的细胞凋亡诱导蛋白基因和SV40多聚腺苷酸组成。

附图7新型肿瘤抑制因子p53、内部核糖体结合位点和抑癌基因p53调控的细胞凋亡诱导蛋白基因(p53AIP1)拼接完成后的内切酶图谱：以BamH1酶切重组IRES质粒DNA，产生全长新型肿瘤抑制因子p53片段(上部箭头所示)和另一由全长IRES及较小部份p53AIP1组成的片段(下部箭头所示)。第一和第二道为不同分子量DNA标准物，第三道仅为含p53AIP1基因的重组IRES质粒，第四道为含p53和p53AIP1的IRES质粒。

附图8抑癌因子p53和p53AIP1以及二者协同对肺癌细胞的凋亡作用观察：此为含下述基因的表达质粒三次转染肺癌细胞的平均结果。A，对照组；B，野生型p53；C，突变型p53；D，p53AIP1；E，野生型p53+p53AIP1；D，突变型p53+p53AIP1

具体实施方式

以下的实施例是为了举例说明本发明的内容，而不是以任何方式限制本发明的范围。本发明所用的腺病毒载体为Stratagene公司产品，包括腺病毒穿载体PaDeasy-1。穿梭质粒pShuttle和pShuttle-IRES。

实施例一、R72型肿瘤抑制因子p53的形成：其方法是以克隆的人p53基因为模板，采用基因突变技术，使野生型第72位脯氨酸的密码子ccc(P72)突变成精氨酸的密码子cgg(R72)，在突变区形成新的核苷酸内切酶smal1位点。

i).人野生型肿瘤抑制因子p53基因5’-端Nco1至笫72位密码子片段扩增：

以人野生型P72肿瘤抑制因子p53基因cDNA中N’-端-Nco1-突变区片

段作为模板，用人工合成的引物进行PCR扩增。

PCR引物设计如下：

引物1：

N端：5’-gccttccgggtcactg aggagccg-3’

30 mer                   Nco1

引物2：ccg为精氨酸密码子

N端：5’-gaatgccagaggctgctccc

gtggcccctgca-3’

35 mer

PCR扩增产物经taillng加上腺嘌呤后，连接至T-easy载体，转化细菌后，扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定。

2).人野生型肿瘤抑制因子p53基因笫72密码子区至C-端Nco1片段扩增：

以上述的片段区cDNA为模板，用人工合成的下列引物进行PCR扩增。

PCR引物设计如下：

引物3：ccg为精氨酸密码子

N端  5-aggggccac gggagcagcctctggcattc-3

32 mer

引物4：

N端  5’-gtagatgg

cgcggacgcgggtg-3’

28 mer            Nco1

将PCR扩增的二个产物按1)的方法联接至T-easy载体，经DNA测序正确无误。

3).上述二个PCR片段产物的拼接，形成Nco1～Nco1片段

将1)和2)中含上述DNA片段的T-easy载体质粒DNA分别用Nco1和Smal1完全酶切，纯化后，再与经Nco1酶切的野生型p53基因cDNA进行连接。转化细菌、质粒抽提和经酶切检测拼接方向正确后，构建成R72型的野生型p53基因表达质粒pCMV-neo-p53

实施例二、抑癌基因p53调控的细胞凋亡诱导蛋白基因的克隆：

1)、将含有野生型p53基因的表达质粒转染Hela肿瘤细胞48小时出现细胞凋亡后，收集细胞，并提取总核糖枚核酸，经反转录酶作用，合成互补脱氧核糖枚核酸(cDNA，下同)。

2)、应用PCR技术扩增p53AIP1基因：以上述合成的cDNA为模板，用人工合成的引物进行PCR扩增。

引物设计如下：

引物1：(在N-末端引入内切酶位点Sma1)

5′-ctcccggggatgggatcttcctctgaggcgagcttcaga-3′

引物2：(在c-末端引入内切酶位点Xba1)

5′-tgagatcttcagttcccagctctgtccaatgctctg-3′

PCR扩增产物经tailing加上腺嘌呤后，连接至T-easy载体，转化细菌后，扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定。

实施例三、肿瘤特异性启动子DNA片段的人工合成及其克隆：根椐巳知基因序列，按常规技术人工合成肿瘤特异性启动子的DNA片段，并以下述引物进行PCR扩增。

引物1：(在N-末端引入内切酶位点Nru1、Kpn1和Xba1)

5’-tgtcgcgaggtacctctagaatttcagtgttgttttcct-3’

引物2：(在C-末端引入内切酶位点EcoR1和Stu1)

5′-gcgatatcaggcctgtccggttcggtttgccaaaagcg-3′

PCR扩增产物经tailing加上腺嘌呤后，连接至T-easy载体，转化细菌后，扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定。

实施例四、由肿瘤特异性启动子、新型p53、内部核糖体结合点(IRES)和p53AIP1组成的表达盒的构建。本实施例所用的Stratagene公司产品为pShuttle-IRES，以此载体为骨架构建表达盒。通过多次不同的内切酶消化、连接反应、感受态细菌转化和测序证实，完成此表达盒构建。即以5’-末端为Sma1内切酶位点和3’-末端为Xba1内切酶位点的P53AIP1基因片段拼接于SV40多聚腺嘌呤的上游，而位于IRES的下游；以5’-末端为EcoR V和3’-末端为Not1内切酶位点的新型P53片段，拼接于IRES的上游；以5’-末端为Nru1和3’-末端为EcoR1内切酶位点的肿瘤特异性启动子PEG-3片段，拼接于新型P53片段的上游，至此，此表达盒构建才告完成。

实施例五、构建含此表达盒的腺病毒穿梭质粒

1).以内切酶Kpn1和Sal1消化上述含表达盒的pIRES质粒DNA，将产生Kpn1-Kpn1片段和Kpn1-Sal1二个DNA片段，由此，该表达盒将包含SV40的多聚腺嘌呤DNA序列。消化后，经1.2％琼脂糖电泳分离、纯化所需DNA片段备用。

2).以内切酶Kpn1和Sal1消化pShuttle穿梭载体质粒DNA，经1.2％琼脂糖电泳分离、纯化线性化的pShuttle载体DNA备用。

3).将上述线性化的pShuttle载体DNA片段和消化表达盒产生的Kpn1-Kpn1片段和Kpn1-Sal1二个DNA片段，在连接酶作用下进行拼接反应，并转化感受态细菌，培养扩增。

4).筛选细菌转化子，培养扩增，抽取重组质粒DNA，最后再经酶切消化和DNA测序证实。

实施例六、靶向性共表达新型p53和p53AIP1基因的重组腺病毒

1).制备线性化含新型p53和p53AIP1基因表达盒的重组穿梭质粒pShuttle-p53-p53AIP1：取适量上述重组穿梭质粒DNA，经核苷酸内切酶Pme1消化、电泳分离、纯化Pme1酶切线性化重组穿梭质粒DNA，备用。

2).将上述线性化重组穿梭质粒DNA电击转化已预转化腺病毒载体pAdEasy-1的BJ5183-AD-1细菌，进行同源重组，并以抗生素卡拉霉素进行筛选。含腺病毒载体pAdEasy-1重组体的细菌将为耐卡拉霉素细株。

3).扩增含腺病毒载体pAdEasy-1重组体的、耐卡拉霉素的细株，即扩增重组腺病毒载体pAdEasy-1DNA。抽提腺病毒载体pAdEasy-1重组体DNA，用内切酶Pac1消化，线性化腺病毒载体pAdEasy-1重组体DNA，并分离纯化备用。

4).按Stratagene公司关于AdEasy XL Adenoviral Vector System说明手册介绍的方法，将上述纯化备用的线性化腺病毒载体pAdEasy-1重组体DNA转染AD-胚胎肾293细胞。

5).转染AD-胚胎肾293细胞7-10后，备制原代重组腺病毒母液，并优化原代重组腺病毒母液的感染AD-胚胎肾293细胞的条件，扩增重组腺病毒。

6).扩增足量的高滴定度的重组腺病毒，用于研究和动物试验。

                           序列表

Individual Applicant

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City：广州市

State：广东省

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FaxNumber：020-38491559

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<110>LastName：王

<110>FirstName：尚武

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ccttccgggt cactgccatg gaggagccgc agtcagatcc tagcgtcgag ccccctctga    180

gtcaggaaac attttcagac ctatggaaac tacttcctga aaacaacgtt ctgtccccct    240

tgccgtccca agcaatggat gatttgatgc tgtccccgga cgatattgaa caatggttca    300

ctgaagaccc aggtccagat gaagctccca gaatgccaga ggctgctccc cgggtggccc    360

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tagtaattcg cggccgcgtc g                                              1701

<212>Type：DNA

<211>Length：1701

     SequenceName：p53(72R)

     SequenceDescription：

MetGluGluProGlnSerAspProSerValGluProProLeuSerGlnGluThrPheSer

1           5              10              15            20

AspLeuTrpLysLeuLeuProGluAsnAsnValLeuSerProLeuProSerGlnAlaMet

            25             30             35             40

AspAspLeuMetLeuSerProAspAspIleGluGlnTrpPheThrGluAspProGlyPro

            45             50             55             60

AspGluAlaProArgMetProGluAlaAlaProArgValAlaProAlaProAlaAlaPro

            65             70             75             80

ThrProAlaAlaProAlaProAlaProSerTrpProLeuSerSerSerValProSerGln

            85             90             95             100

LysThrTyrGlnGlySerTyrGlyPheArgLeuGlyPheLeuHisSerGlyThrAlaLys

            105            110            115            120

SerValThrCysThrTyrSerProAlaLeuAsnLysMetPheCysGlnLeuAlaLysThr

            125            130            135            140

CysProValGlnLeuTrpValAspSerThrProProProGlyThrArgValArgAlaMet

            145            150            155            160

AlaIleTyrLysGlnSerGlnHisMetThrGluValValArgArgCysProHisHisGlu

            165            170            175            180

ArgCysSerAspSerAspGlyLeuAlaProProGlnHisLeuIleArgValGluGlyAsn

            185            190            195            200

LeuArgValGluTyrLeuAspAspArgAsnThrPheArgHisSerValValValProTyr

            205            210            215            220

GluProProGluValGlySerAspCysThrThrIleHisTyrAsnTyrMetCysAsnSer

            225            230            235            240

SerCysMetGlyGlyMetAsnArgArgProIleLeuThrIleIleThrLeuGluAspSer

            245            250            255            260

SerGlyAsnLeuLeuGlyArgAsnSerPheGluValHisValCysAlaCysProGlyArg

            265            270            275            280

AspArgArgThrGluGluGluAsnLeuArgLysLysGlyGluProHisHisGluLeuPro

            285            290            295            300

ProGlySerThrLysArgAlaLeuProAsnAsnThrSerSerSerProGlnProLysLys

            305            310            315            320

LysProLeuAspGlyGluTyrPheThrLeuGlnIleArgGlyArgGluArgPheGluMet

            325            330            335            340

PheArgGluLeuAsnGluAlaLeuGluLeuLysAspAlaGlnAlaGlyLysGluProGly

            345            350            355            360

GlySerArgAlaHisSerSerHisLeuLysSerLysLysGlyGlnSerThrSerArgHis

            365            370            375            380

LysLysLeuMetPheLysThrGluGlyProAspSerAspTer

            385            390

Sequence

<213>OrganismName：Rat

<400>PreSequenceString：

tgaggctcgc gaggtacctc tagaatttca gtgttgtttt cctctctcca cctttctcag    60

ggacttccga aactccgcct ctccggtgac gtcagcatag cgctgcgtca gactataaac    120

tcccgggtga tcgtgttggc gcagattgac tcagttcgca gcttgtggaa gattacatgc    180

gagaccccgc gcgactccgc atccctttgc cgggacagcc tttgcgacag cccgtgagac    240

atcacgtccc cgagccccac gcctgagggc gacatgaacg cgctggcctt gagagcaatc    300

cggacccacg atcgcttttg gcaaaccgaa ccggacaggc ctgctagccg atatcgtgtt    360

ca                                                                   362

<212>Type：

<211>Length：362

     SequenceName：PEG-3 Promotor

     SequenceDescription：DNA

Sequence

--------

<213>OrganismName：Human

<400>PreSequenceString：P53AIP1

tggacccccg ggctggatcc tgatgggatc ttcctctgag gcgagcttca gatctgctca    60

agcttcctgc agtggggcca ggaggcaggg cctgggcagg ggagaccaga acctctcggt    120

gatgcctccg aatggcaggg ctcagacaca cacacctggc tgggtaagtc cctgcagtga    180

aaaccgagac ggtcttttgc ctgccacagc cccgggcaga ctctgctctc accgtggtgc    240

cgacatccca agttttcaga ctcaccagga cccagtgaca gcatctgggt cctcagagct    300

gcatgcggac tgtccccagt tcagagcatt ggacagagct gggaactgac agaattccat    360

ctagacggta                                                           370

<212>Type：DNA

<211>Length：370

     SequenceName：P53AIP1

     SequenceDescription：

<212>Type：DNA

<211>Length：339

     SequenceName：P53AIP1

     SequenceDescription：

MetGlySerSerSerGluAlaSerPheArgSerAlaGlnAlaSerCysSerGlyAlaArg

            5              10             15             20

ArgGlnGlyLeuGlyArgGlyAspGlnAsnLeuSerValMetProProAsnGlyArgAla

            25             30             35             40

GlnThrHisThrProGlyTrpValSerProCysSerGluAsnArgAspGlyLeuLeuPro

            45             50             55             60

AlaTrpAlaProGlyArgLeuCysSerHisArgGlyAlaAspIleProSerPheGlnThr

            65             70             75             80

HisGlnAspProValThrAlaSerGlySerSerGluLeuHisAlaAspCysProGlnPhe

            85             90             95             100

ArgAlaLeuAspArgAlaGlyAsn

            105

Sequence

--------

<213>OrganismName：human

<400>PreSequenceString：

tgaggctcgc gaggtacctc tagaatttca gtgttgtttt cctctctcca cctttctcag    60

ggacttccga aactccgcct ctccggtgac gtcagcatag cgctgcgtca gactataaac    120

tcccgggtga tcgtgttggc gcagattgac tcagttcgca gcttgtggaa gattacatgc    180

gagaccccgc gcgactccgc atccctttgc cgggacagcc tttgcgacag cccgtgagac    240

atcacgtccc cgagccccac gcctgagggc gacatgaacg cgctggcctt gagagcaatc    300

cggacccacg atcgcttttg gcaaaccgaa ccggacaggc ctgctagccg atatcgccac    360

cgtccaggga gcaggtagct gctgggctcc ggggacactt tgcgttcggg ctgggagcgt    420

gctttccacg acggtgacac gcttccctgg attggcagcc agactgcctt ccgggtcact    480

gccatggagg agccgcagtc agatcctagc gtcgagcccc ctctgagtca ggaaacattt    540

tcagacctat ggaaactact tcctgaaaac aacgttctgt cccccttgcc gtcccaagca    600

atggatgatt tgatgctgtc cccggacgat attgaacaat ggttcactga agacccaggt    660

ccagatgaag ctcccagaat gccagaggct gctccccggg tggcccctgc accagcagct    720

cctacaccgg cggcccctgc accagccccc tcctggcccc tgtcatcttc tgtcccttcc    780

cagaaaacct accagggcag ctacggtttc cgtctgggct tcttgcattc tgggacagcc    840

aagtctgtga cttgcacgta ctcccctgcc ctcaacaaga tgttttgcca actggccaag    900

acctgccctg tgcagctgtg ggttgattcc acacccccgc ccggcacccg cgtccgcgcc    960

atggccatct acaagcagtc acagcacatg acggaggttg tgaggcgctg cccccaccat    1020

gagcgctgct cagatagcga tggtctggcc cctcctcagc atcttatccg agtggaagga    1080

aatttgcgtg tggagtattt ggatgacaga aacacttttc gacatagtgt ggtggtgccc    1140

tatgagccgc ctgaggttgg ctctgactgt accaccatcc actacaacta catgtgtaac    1200

agttcctgca tgggcggcat gaaccggagg cccatcctca ccatcatcac actggaagac    1260

tccagtggta atctactggg acggaacagc tttgaggtgc atgtttgtgc ctgtcctggg    1320

agagaccggc gcacagagga agagaatctc cgcaagaaag gggagcctca ccacgagctg    1380

cccccaggga gcactaagcg agcactgccc aacaacacca gctcctctcc ccagccaaag    1440

aagaaaccac tggatggaga atatttcacc cttcagatcc gtgggcgtga gcgcttcgag    1500

atgttccgag agctgaatga ggccttggaa ctcaaggatg cccaggctgg gaaggagcca    1560

ggggggagca gggctcactc cagccacctg aagtccaaaa agggtcagtc tacctcccgc    1620

cataaaaaac tcatgttcaa gacagaaggg cctgactcag actgacattc tccacttctt    1680

gttccccact gacagcctcc cacccccatc tctccctccc ctgccatttt gggttttggg    1740

tctttgaacc cttgcttgca ataggtgtgc gtcagaagca cccaggactt ccatttgctt    1800

tgtcccgggg ctccactgaa caagttggcc tgcactggtg ttttgttgtg gggaggagga    1860

tggggagtag gacataccag cttagatttt aaggttttta ctgtgaggga tgtttgggag    1920

atgtaagaaa tgttcttgca gttaagggtt agtttacaat cagccacatt ctaggtaggg    1980

acccacttca ccgtactaac cagggaagct gtccctcact gttgactagt aacggccgcc    2040

agtgtgctgg aattaattcg ctgtctgcga gggccggctg ttggggtgag tactccctct    2100

caaaagcggg catgacttct gcgctaagat tgtcagtttc caaaaacgag gaggatttga    2160

tattcacctg gcccgcggtg atgcctttga gggtggccgc gtccatctgg tcagaaaaga    2220

caatcttttt gttgtcaagc ttgaggtgtg gcaggcttga gatctggcca tacacttgag    2280

tgacaatgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagg tccaactgca    2340

ggtcgatcga gcatgcatct agggcggcca attcgcccct ctccctcccc cccccctaac    2400

gttactggcc gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgtgt ttgtctatat gtgattttcc    2460

accatattgc cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg    2520

agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt gaatgtcgtg    2580

aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc gaccctttgc    2640

aggcagcgga accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa    2700

gatacacctg caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa    2760

agagtcaaat ggctctcctc aagcgtagtc aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta    2820

ccccattgta tgggaatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc    2880

gaggttaaaa aagctctagg ccccccgaac cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca    2940

cgatgataag cttgccacaa ccccgggctg gatcctgatg ggatcttcct ctgaggcgag    3000

cttcagatct gctcaagctt cctgcagtgg ggccaggagg cagggcctgg gcaggggaga    3060

ccagaacctc tcggtgatgc ctccgaatgg cagggctcag acacacacac ctggctgggt    3120

aagtccctgc agtgaaaacc gagacggtct tttgcctgcc acagccccgg gcagactctg    3180

ctctcaccgt ggtgccgaca tcccaagttt tcagactcac caggacccag tgacagcatc    3240

tgggtcctca gagctgcatg cggactgtcc ccagttcaga gcattggaca gagctgggaa    3300

ctgacagaat tccactagat aactgatcat aatcagccat accacatttg tagaggtttt    3360

acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat    3420

tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac    3480

aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat    3540

caatgtatct taacgcgtcg agtgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta    3600

tcttatcatg tctgtatacc gtcgac                                         3626

<212>Type：DNA

<211>Length：3626

     SequenceName：表达盒

     SequenceDescription：

Claims (9)

1，一种靶向性共表达新型p53和p53AIP1的重组腺病毒。本发明使用的腺病毒载体为Stratagene公司的产品AdEasy-1载体，为E1和E3区缺失的腺病毒载体。本发明构建的表达盒由肿瘤特异性动子、新型p53、IRES、p53AIP1和SV40多聚腺嘌呤组成，其主要特征为：

a).人野生型p53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突变成为精氨酸，其他氨基酸组成及其排列顺序不变；

b).P53抑癌基因在其N-末端以内切酶EcoR V和C-末端以内切酶Not1片段拼接于pIRES质粒上游；

c).p53AIP1基因在其N-末端以内切酶Sma1和C-末端以内切酶Xba 1片段拼接于pIRES质粒下游；

d).肿瘤特异性启动子在其N-末端以内切酶Nru1和C-末端以内切酶EcoRV片段拼接于新型p53基因的上游；

经重组后，该表达盒位于腺病毒载体的E1缺失区。该重组腺病毒具有靶向性共表达p53和p53AIP1的作用，因而具有更强细胞凋亡功能、抗癌谱更广的生物功能。

2.根椐权利要求1，一种肿瘤特异性启动子驱动共表达二种有协同抗癌作用基因的表达盒，其含有下列氨基酸序列和具有转录功能的脱氧核苷酸序列：

a).与人肿瘤抑制基因p53的亲本多肽的氨基酸序列基本一致，仅有一个氨基酸的取代，即此肿瘤抑制基因p53的第72异氨基酸由精氨酸(R72)代替野生型P53同一位置的脯氨酸(P72)。所述肿瘤抑制基因p53亲本来源于人；

b)一种亲本源于人的p53调控的细胞凋亡诱导蛋白(p53AIP1)基因；

c)肿瘤特异性启动子为鼠源PEG-3基因的启动子，该启动子包含的区域为-118到+194脱氧核苷酸组成；

d)内部校核糖体结合位点(IRES)源于脑心肌炎病毒。

3.根椐权利要求1和要求2所述重组腺病毒，其特征在于表达盒中驱动共表达新型入肿瘤抑制基因p53和p53AIP1基因的启动子序列不仅限于鼠源肿瘤特异性PEG-3基因启动子，也包括其他肿瘤特异性启动子，如人端粒酶启动子、雌激素和低氧反应启动子、人前列腺癌特异因子启动和肝胎儿甲型球蛋白启动子(AFP，胎甲球蛋白启动子)；。

4、根椐权利要求1，表达盒中共表达的p53基因既可位于IRES的上游，也可位于其下游；p53AIP1亦如此。

5、根椐权利要求1和要求3，由肿瘤特异性启动子驱动共表达的、位于IRES上游的基因既可是本发明的新型P53(72R)，也可以是p53(46F)；位于IRES下游的基因既可是p53AIP1基因，也可以是其他促细胞凋亡基因，如Noxa、p53RFP和P27(Kip1)；免疫调节因子，如MDA-7/IL-24、IL-2、IL-6、IFN-γ，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和TNF-a等。

6、根椐权利要求1，本发明使用的腺病毒载体为Stratagene公司的产品AdEasy-1载体，为E1和E3区缺失的复制缺陷型腺病毒载体。但本发明使用的腺病毒载体不限于此复制缺陷型Ad5型腺病毒，也包括条件性复制的腺病毒载体，如本人申请的另一专利“一种用于临床肿瘤基因治疗的新型腺病毒载体”所叙述的腺病毒载体。该专利叙述的条件性复制腺病毒载体为一种由肿瘤特异性启动子驱动腺病毒复制因子E1A基因仅在肿瘤细胞内表达，因而具有仅能在肿瘤细胞内复制的能力。而且，其纤维蛋白AB环、H1环和/或Shaft进行了突变，具有感染力更强、感染细胞谱更广的特点。

7、根椐权利要求1，此靶向性共表达新型p53和p53AIP1的重组腺病毒为一种用于治疗多种恶性癌症疾病的基因治疗药物，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

8、如权利要求7所述的基因治疗药物，其特征在于，权利要求1所述的由肿瘤特异性启动子驱动R72型人p53基因和p53AIP1基因共表达的重组腺病毒，所述的有效抗癌成份为细胞凋亡功能更强的R72型人p53基因和p53AIP1基因的表达蛋白质。

9、如权利要求1、5、6、7和8的基因治疗表达组合药物，其特征除权利要求1所述的靶向性共表达R72型人p53基因和p53AIP1基因的重组腺病毒之外，还包括由此肿瘤特异性启动子靶向性共表达含有其他具有抗癌治疗效果的促细胞凋亡因子、细胞因子和/或免疫调节因子通过内部核糖体结合位点(IRES)与R72型人p53基因或p53AIP1基因相连接的表达盒的重组腺病毒。

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