CN1141340A - 重组dna病毒和其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于转染动物细胞并携带有外源基因和能够调节该外源基因表达的启动子的重组DNA病毒,该病毒的E2A基因功能被完全缺失。因此该重组DNA病毒能稳定地将外源基因转导到各种动物细胞中,导致外源基因在动物细胞中连续表达。外源基因的连续表达能使遗传病得到有效的治疗。
Description
本发明涉及用于转染动物细胞的重组DNA病毒和其制备方法。本发明还涉及用于制备该重组DNA病毒的携带有编码重组酶识别序列的DNA序列的重组DNA病毒载体。
逆转录病毒已常用作基因转导的病毒载体。然而,逆转录病毒仅被转染到有丝分裂细胞中并整合到宿主细胞染色体中,因此,从安全的角度考虑,逆转录病毒作为病毒载体遇到了问题,特别是在基因治疗中。这样,人们认为应限制逆转录病毒作为病毒载体使用。
腺病毒载体是有利的,表现在它在各种动物的培养细胞中显示出几乎100%的转导效率,与逆转录病毒不同它没有整合到染色体中正机制,并且甚至能将基因转导到具静止核的活细胞中。考虑到这些有利因素,人们认为腺病毒载体在转导外源基因的计划中可应用于十分广泛的领域。因此,在不远的将来会实现将腺病毒载体用作基因治疗的一种主要方法。
腺病毒载体已广泛用作基因治疗或研究在高度分化细胞(例如神经系统细胞)中表达的一种方法。就基因治疗技术而言,人们已广泛研究了体内基因治疗,其中,通过将在活细胞中缺损的基因直接注射到细胞存在和发挥作用的组织中的方法将该基因转导到细胞中。在美国,已允许五个研究小组进行用体内基因治疗方法治疗患有囊性纤维化的病人的临床试验。而且,基因治疗研究也已经扩展到肌肉营养障碍、高脂蛋白血(II型)和脑肿瘤。另一方面,腺病毒载体甚至能将基因转导到有静止核的活细胞中。因此,腺病毒载体已用于将基因转导到分化的细胞中,尤其是神经系统细胞中,然后进行将基因转导到原代培养细胞或动物细胞中的实验。
综上所述,将腺病毒载体特别应用于基因治疗是人们期望的,这是因为该载体能够经直接注射或施用到动物体中使基因表达,并能使基因转导到各种分化的或未分化的细胞(包括神经系统细胞)中。
然而,与逆转录病毒不同,腺病毒缺乏整合到染色体中的任何正机制,导致基因在载体中仅出现暂时的表达。这就是说,表达仅持续几周,最多约2个月。这样,当治疗效果需要保持时,腺病毒应在长的期限内在细胞中稳定存在,以便腺病毒能够连续产生插入到其中的外源基因的表达产物。
最近的研究已揭示出,腺病毒基因组的E2A基因区对腺病毒在细胞中的稳定性起到不利的影响。
因此,本发明对解决上述问题已进行了广泛的研究,并已新发现在腺病毒的E2A基因区和L3基因区存在一个特定区,外源核苷酸可以插入到该区中。外源核苷酸可以用常规的方法直接插入到该特定区中;另外也可以首先向其中插入合适的接头,以构建必需的限制性酶位点,然后将外源核苷酸插入到E2A基因和L3基因之间的所述区内。所述要插入的外源核苷酸可以是编码多肽的外源基因(在转染到细胞后,希望在动物细胞中表达该多肽),或者可以是能作为细胞中天然存在的酶的底物的外源核苷酸。
本发明也已发现,通过使用在E2A和L3区之间具有重组酶识别序列的DNA病毒载体以及能够在动物细胞中表达重组酶基因的重组DNA病毒载体,可以提供在动物细胞腺病毒基因组中缺失E2A基因区的腺病毒载体系统。
这里,"重组酶"一词用来指特定的DNA重组酶它能够识别包含几十个核苷酸的特定DNA序列,以切割该特定序列,并且能够交换由此形成的DNA片段以再连接那些片段。由此,制备了一种能够表达重组酶的重组腺病毒载体,还制备了另一种在E2A基因区两末端相同的方向上携带有两个重组酶识别序列拷贝的重组腺病毒载体。当上述两种腺病毒载体共转染到细胞中时,其它载体中表达的重组酶引起两个重组酶识别序列之间的基因重构,以便两个重组酶识别序列之间的E2A基因区被切掉成环状分子。缺失的E2A基因区的腺病毒裁体变得比含有E2A基因的原始腺病毒载体明显地更稳定且能有利于基因治疗是很有希望的。
已知外源DNA序列可以插入到E2A基因区的右边部分,即图1所示的E3基因区,但不知道存在于E2A基因区左边部分的可以插入外源DNA序列的特定位点。按照本发明,现在已发现在E2A基因和L3基因的终止密码子之间存在一个可插入外源DNA序列的位点。由此,已第一次揭示了将两种重组酶识别序列插入到腺病毒载体中,使E2A基因区位于两者之间,以便不会破坏E2A基因区的功能,但腺病毒遗传上具有的增殖功能被保持。
基于上述发现,进行了进一步的研究,由此完成了本发明。
因此,本发明的一个目的是构建一种重组腺病毒载体系统,其中,被转导到动物细胞中的腺病毒载体更稳定地存在于所述细胞中,并且在特定位点插入到腺病毒载体中的外源基因因此能被连续表达以产生所需产物。本发明的另一个目的是提供用于基因治疗的这样一个系统。
这样,本发明特有的特征如下:
(1)一种用于转染动物细胞的重组DNA病毒,该病毒携带有外源基因和调节所述外源基因表达的启动子,其中E2A基因的功能被全部缺失。
(2)按照(1)的重组DNA病毒,其中所说的DNA病毒是腺病毒。
(3)按照(1)或(2)的重组DNA病毒,其中E2A基因区的部分或全部被缺失。
(4)按照(1)到(3)的任一重组DNA病毒,其中所说的外源基因和所说的调节所述外源基因表达的启动子以朝左侧的方向(与E1A和E1B基因自然转录的方向相反)被插入。
(5)按照(2)到(4)的任一重组DNA病毒,其中所述腺病毒基因组已被缺失包含E1A基因区在内的1.3到9.3%的区段。
(6)按照(5)的重组DNA病毒,其中所说的外源基因和所说的调节该外源基因表达的启动子在缺失所述区段的位点被插入。
(7)按照(6)的重组DNA病毒,其中所说的腺病毒基因组已被进一步缺失包含E3基因区在内的79.6到84.8%的区段。
(8)按照(1)到(7)的任一重组DNA病毒,其中所说的调节外源基因表达的启动子是包含巨细胞病毒增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、兔β-珠蛋白剪接受体和聚(A)序列的杂交启动子(CAG启动子)。
(9)一种用于转染动物细胞的重组DNA病毒,该病毒以相同的方向携带位于E2A基因区两侧的两个重组酶识别序列。
(10)按照(9)的重组DNA病毒,其中所说的DNA病毒是一种腺病毒。
(11)按照(9)和(10)的重组DNA病毒,其中所说的两个重组酶识别序列之一位于E2A基因的和L3基因的终止密码子之间,而不缺失两种基因聚(A)附加信号的功能。
(12)按照(11)的重组DNA病毒,其中两个重组酶识别序列的另一个位于腺病毒基因组的从79.6到84.4%的读框内。
(13)按照(9)到(12)的任一重组DNA病毒,其中所说的重组酶是得自大肠杆菌P1噬菌体的重组酶Cre。
(14)按照(9)到(13)的任一重组DNA病毒,其中所说的重组酶序列的每一种是以下描述的DNA序列(SEQ ID NO:1),该DNA序列是作为重组酶Cre底物的Lox P DNA序列。
5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3'
3'-TATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATA-5′
(15)按照(9)到(14)的任一重组DNA病毒,该病毒携带外源基因。
(16)按照(15)的重组DNA病毒,该病毒携带调节所述外源基因表达的启动子。
(17)按照(16)的重组DNA病毒,其中所说的外源基因和所说的调节所述外源基因表达的启动子以朝左侧的方向(与E1A和E1B基因自然转录的方向相反)被插入。
(18)按照(10)到(17)的任一重组DNA病毒,其中所说的腺病毒基因组已被缺失了包含E1A基因区在内的1.3到9.3%的区段。
(19)按照(18)的重组DNA病毒,其中所说的外源基因和所说的调节该外源基因表达的启动子在已缺失所述区段的位点被插入。
(20)按照(19)的重组DNA病毒,其中所说的腺病毒基因组已被进一步缺失了包含E3基因区在内的79.6到84.8%的区段。
(21)按照(16)到(20)的任一重组DNA序列,其中所说的调节外源基因表达的启动子是包含巨细胞病毒增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、兔β-珠蛋白剪接受体和聚(A)序列的杂交启动子(CAG启动子)。
(22)一种构建E2A基因功能完全缺失的重组DNA病毒的方法,该方法包括以下步骤:
将一种载体(a)和一种重组DNA病毒(b)转导到动物细胞系中,所说的载体(a)具有插入其中的启动子、重组酶基因和聚(A)序列,所说的重组DNA病毒(b)携带位于E2A基因区两侧的以相同方向定位的重组酶识别序列,和
切掉位于两个重组酶识别序列之间的E2A基因区。
(23)按照(22)的构建重组DNA病毒的方法,其中所说的重组DNA病毒(b)是一种腺病毒。
(24)按照(23)的构建重组体DNA病毒的方法,其中所说的载体(a)是一种腺病毒。
(25)按照(22)到(24)的任一构建重组DNA病毒的方法,其中所说的两个重组酶识别序列之一位于E2A基因的和L3基因的终止密码子之间,而并不缺失两种基因聚(A)附加信号的功能。
(26)按照(22)到(25)的任一构建重组DNA病毒的方法,其中所说的重组酶是得自大肠杆菌P1噬菌体的重组酶Cre。
(27)按照(22)到(26)的任一构建重组DNA病毒的方法,其中所说的重组酶序列的每一种是作为重组酶Cre底物的Lox P DNA序列(SEQ ID NO:1)。
(28)按照(22)到(27)的任一构建重组DNA病毒的方法,其中所说的重组DNA病毒(b)携带一个外源基因。
(29)按照(28)的构建重组DNA病毒的方法,其中所说的重组DNA病毒(b)还携带调节所述外源基因表达的启动子。
(30)按照(29)的构建重组DNA病毒的方法,其中所说的外源基因和所说的调节该外源基因表达的启动子以朝左侧方向(与E1A和E1B基因自然转录的方向相反)被插入。
(31)按照(24)到(30)的构建重组DNA病毒的方法,其中所说的载体(a)和重组DNA病毒(b)的腺病毒基因组已被缺失了包含E1A基因区在内的1.3到9.3%的区段。
(32)按照(31)的构建重组DNA病毒的方法,其中所说的外源基因和所说的调节重组DNA病毒(b)的外源基因表达的启动子在已缺失了所述区段的位点处被插入。
(33)按照(32)的构建重组DNA病毒的方法,其中所说的重组DNA病毒(b)的腺病毒基因组已被进一步缺失包含E3基因区在内的79.6到84.8%的区段。
(34)按照(29)到(33)的任一构建重组DNA病毒的方法,其中所说的调节外源基因表达的启动子是包含巨细胞病毒增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、兔β-珠蛋白剪接受体和聚(A)序列的杂交启动子(CAG启动子)。
(35)按照(22)的构建重组DNA病毒的方法,其中E1A基因在载体(a)和重组DNA病毒(b)两者中的功能已被缺失,其中动物细胞系是表达E1A基因的动物细胞系。
(36)一种用于转染动物细胞的重组DNA病毒,该病毒携带有插入到E2A基因的和L3基因的终止密码子之间的外源基因。
图1概念性地显示了粘粒pAdex1cw的构建。
图2概念性地显示了粘粒pAdex1CAwt的构建。
图3概念性地显示了质粒pA60X99的构建。
图4概念性地显示了质粒pA2L60X99的构建。
图5概念性地显示了质粒pA2L3L6099的构建。
图6显示了从下述实验获得的结果:用重组腺病毒Adex2L3LCANLacZ和Adex1CANCre共转染293细胞,回收共转染过的细胞,提取其DNA,并用所提取到的DNA作为模板完成聚合酶链反应(PCR)。其中第1泳道显示了使用引物(1)和(4)的电泳轮廓图,第二泳道显示了使用引物(2)和(3)的电泳轮廓图。
以下更详细地描述本发明。
用于本发明的DNA病毒载体可以是得自DNA病毒(例如在转染到细胞后仅能在染色体外存在的腺病毒)的任何载体。可以无任何限制地使用这类来源于DNA病毒的载体。这类载体的例子包括腺病毒载体、痘苗病毒载体和乳多空病毒。下文中,本发明将以腺病毒载体进行描述,所述腺病毒载体是转染动物细胞的DNA病毒载体的优选的例子,它携带有一个重组酶基因或一个重组酶识别序列。
用于本发明的腺病毒是利用动物为天然宿主的腺病毒。特别优选的腺病毒是以人为宿主的人腺病毒。人腺病毒基因组是约36kbp的双链线性DNA,并且具有以下所述的独特的结构:DNA链在其两个末端具有约100bp的反向重复序列,且DNA链还具有两个55K蛋白质,该蛋白质已被从E2B基因产物加工并共价连接到所述DNA链两个末端的每一个的5'末端上。
用于本发明的腺病毒的基因组最好是缺失E1基因区,尤其是E1A基因区。这是因为经缺失与腺病毒致癌性转化活性相关的E1A基因区,腺病毒被变成非毒性的,且仅插入到基因组中的外源基因被选择性地表达。不需要缺失全部E1A基因区,但仅缺少部分E1A基因区,特别是仅在E1A基因区的1.3到9.3%的区段)就可达到以上所述的合乎需求的目的。
而且,本发明中使用的腺病毒的基因组也可以被缺失E3基因区。特别是,缺失E3基因区的76.6到84.8%的区段是优选的。因为该区段不是复制腺病毒所必需的。
因此,用于本发明的腺病毒的特征在于,所述腺病毒在除人胎肾来源的细胞系(293细胞系)(其中EA和E1B基因被持续表达)外的常规的宿主细胞中不能增殖。
然而,当腺病毒事实上被转染到人或动物中时,在人或动物中也表达少量的腺病毒蛋白质,因为具有类似于E1A蛋白质功能的蛋白质存在于人或动物细胞中。已知如此表达的腺病毒蛋白质引起细胞介导免疫应答,结果使携带病毒DNA的细胞受到功击和消灭。这是为什么缺失E1A或E1B的病毒载体仅能暂时表达外源基因的原因。Yang et al.,
Nature Genetics,Vol.7,362-369(1993)指出,缺少E2A基因对阻止暂时表达和连续地保持基因表达是有效的。在Yang et al.,的方法中,使用了温度敏感性E2A基因突变株,但当施用到动物上时,尽管能在某种程序上抑制E2A基因的表达,却不能完全阻止该表达。为了完全制止E2A基因的表达功能,可以考虑缺失E2A基因区。然而,E2A基因的表达产物是腺病毒基因组复制必需的,因此,缺失E2A基因的腺病毒即使在293细胞中也不能增殖。
按照本发明,将在E2A基因区两端携带重组酶识别序列的重组腺病毒与表达重组酶的腺病毒共转染到动物细胞中。然后,在细胞中表达的重组酶以在细胞中制备缺失E2A基因区的病毒粒子的方式发挥作用。至少可从表达重组酶的腺病毒供给足够量的E2A基因产物。由此获得的E2A基因缺失的病毒粒子完全不能表达E2A基因。明显地,表达所需基因的期限因此会大大延长。
E2A基因区在其右边具有一个可插入外源序列的位点是公知的。因而,可将重组酶识别序列插入到右边。在E2A基团区的左边,选出E2A基因的和L3基因的终止密码子之间的一特定位点不会阻止转染过的重组腺病毒的增殖。E2A基因区、L3基因区和聚(A)-附加信号区的部分缺失不是优选的,因为所形成的重组腺病毒的增殖被阻止。
就用于本发明的启动子来说,有动物病毒基因启动子和动物细胞基因启动子。动物病毒基因启动子的例子包括SV40基因启动子和腺病毒主要晚期基因启动子。动物细胞基因启动子的例子是胸苷激酶基因启动子,金属硫蛋白基因启动子和免疫球蛋白基因启动子。本发明中特别有利的一种启动子是CAG启动子。该CAG启动子是包含巨细胞病毒增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、兔β-珠蛋白剪接受体和得自兔β-珠蛋白的聚(A)序列的一种杂合启动子。日本专利KOKAI(公开)NO.3(1991)-168087报道该CAG启动子是一个高效表达载体。该CAG启动子可以用限制酶SalI和Hind III从质粒pCAGGS(上述说明书第13页第20行、第20页第14行和第22页第1行到第25页第6行中描述)切下来构建。由此构建的CAG启动子可以用于本发明。
用于本发明的重组酶是一种特异性DNA重组酶,该酶能够识别特定的DNA序列,以切割该序列,并交换由此形成的DNA片段,以再连接那些片段。就这样一种酶来说,有由大肠杆菌噬菌体P1编码的重组酶Cre。这种酶的底物是噬菌体P1中的lox P DNA序列(在Abreniski et al.,
J.Biol.Chem.,1984,
259,1509-1514和Hoess et al.,
P.N.A.S.,1984,
81,1026-1029中描述)。即,lox P DNA序列是重组酶Cre的识别序列。所述重组酶的另一个例子是由得自酵母2μ质粒的FLP基因(在James R.Broarch etal.,
Cell,
29,227-234中描述)编码的重组酶。此外,也可以使用得自
Zyqosaccharomyces rouxii的pSR1质粒的重组酶。这种酶被R基因(在Matsuzaki et al.,
Molecular and CellularBiology,
8,955-962(1988)中描述)编码。在这些酶中,来源细菌噬菌体P1的重组酶Cre对本发明来说是特别优选的。
所述重组酶基因(例如,重组酶Cre基因)可以按公知的PCR方法经扩增细菌噬菌体P1 DNA中编码重组酶的基因序列来制备。其它重组酶基因也可用类似的方法经PCR方法制备。挑选用于PCR方法的引物,以便能扩增编码重组酶全长序列的基因序列。对常规方法构建重组腺病毒载体来说,提供在其末端带有合适的限制性位点的引物是优选的。
所述重组酶的识别序列通常是几十个bp的序列。例如,lox P序列由34个bp组成,核苷酸序列已全部被识别(Abremski etal.,
J.Biol.Chem.,1984,
259,1509-1514和Hoess et al.,
P.N.A.S.,1984,
81,1026-1029)。因此,可以用常规方法化学合成重组酶基因供本发明使用。
用于本发明的聚(A)序列不受特别的限制,但来源兔β-珠蛋白的序列是特别优选的。
在本发明中,将核转移信号序列与重组酶基因一道引入到腺病毒载体中是有利的。例如,可以使用SV40的核转移信号。在腺病毒转染进细胞后,在细胞质中产生重组酶。这样,为了使表达的重组酶对另一个腺病毒载体中的重组酶识别序列发挥作用,必须将重组酶转移到细胞核中。如Daniel Kalderon et al.,
Cell,
39,499-509(1984)中所描述的,核转移信号序列加速重组酶转移到细胞核中。
用于本发明的外源基因不受特别的限制,只要该基因在以上所述的杂交启动子(CAG启动子)或其它启动子的控制下能被表达。从实用的角度来看,优选的例子包括病人中缺损的正常基因,例如,腺苷脱氨酶、肌营养不良蛋白、低密度脂蛋白受体、α-1抗胰蛋白酶、血凝固因子VIII或血凝固因子IX,和半乳糖苷酶α或β;细胞因子,例如白介素1-12、干扰素-α、β或γ、肿瘤坏死因子-α或β、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、生长激素、胰岛素、胰岛素样生长激素、神经营养因子;非自身抗原基因,例如,异-HLA(HLA-B7);编码病毒抗原的核苷酸序列;抗癌基因,例如,P53、RB、WT-1、NM23和NF-1;致癌基因的反义链,例如Ras序列;和自杀基因,例如胸苷激酶和胞嘧啶脱氨酶。
可将启动子、外源基因和聚(A)序列以从上游的顺序或以其反向顺序插入到重组腺病毒载体中。
下面描述构建本发明的重组腺病毒的方法。
(1)首先描述的是构建携带以相同的方向位于E2A基因区两端的两个重组酶识别序列、一个启动子、一个外源基因和一个聚(A)序列的重组腺病毒载体的方法。为方便起见,就使用重组酶Cre为重组酶、lox P为识别序列和Lac Z基因为外源基因的具体实施方案描述该方法。然而,下述方法也可以以基本上类似的方式用于使用其它重组酶、识别序列、启动子和聚(A)序列的其他实施方案中。(a)粘粒pAdex1CAwt的构建①含有CAG启动子的质料pCMwCH31的构建
用EcoRI消化携带CAG启动子的质粒pCAGGS(Niwa et al.,Gene,
108,193-200,1990)。然后,用Klenow酶填充消化产物。然后,使用连接酶用SwaI接头连接DNA片段。用SalI消化所形成的质粒。用Klenow酶填充该DNA片段,接着用连接酶与ClaI接头连接。在用PstI消化如此获得的质粒后,用克列诺酶填充DNA片段成平端,并用连接酶与XhoI接头连接以获得含有CAG启动子的质粒pCMwCH31。
在用各自的限制酶消化后,用在琼脂糖凝肢上进行的电泳证实原始限制酶位点的消失和各自插入的接头。②pAdex1c的构建
此后描述的实施例1(2),(i)到(iV)的方法用于构建pAdex1c,该方法简要描述如下:
制备了以下三个质粒:
含有缺失E1基因区的腺病毒基因组中左端17%区段的质粒pUAF0-17D。
由向pUC19中插入一个2.8kb片段获得质粒pUAF0-8,所述片段相应于腺病毒基因组左端8%区段,通过用BamHI接头连接5型腺病毒DNA,然后用HindIII消化制备。
由在HindIII位点向puC19中插入一个3.4kb片段获得质粒pUAF8-17。所述片段相应于腺病毒基因组左端的8-17%区段,由用HindIII消化腺病毒DNA获得。
然后,将一个得自质粒pUAF0-8的454bp BamHI-ClaI片段与一个得自质粒pUAF8-17的2.9kb HindIII-ClaI片段连接。将所形成的连接产物在BamHI/HindIII位点插入到pUC19中以获得质粒pUAF0-17D。
此外,用Bst1107和EcoRI消化5型腺病毒DNA以获得21.6kb片段。另外制备一个得自腺病毒基因组pX2W的6.5kb EcoRI-SalI片段。
另一方面,用Asp718和BamHI消化卡隆粒9-11(I.Saito & G.Stark,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,
83,8664-8668,1986),用克列诺酶填平该DNA片段然后进行自身连接。此后,在EcoRI位点插入BamHI接头,以制备卡隆粒chdRBR7-11。
将质粒pUAF0-17的2.9kb BamHI-Bst1107片段、腺病毒基因组的21.6kb Bst1107-EcoRI片段和pX2W的6.5kb EcoRI-SwaI片段与一种DNA片段连接,所述DNA片段是经用EcoRI和Ecl36I消化卡隆粒chdRBR7-11获得的。所形成的连接产物进行体外包装以转染进DH5α。从由此获得的转化体中分离一种携带有目标片段的转化体,命名为pAdex1c。③盒式粘粒pAdex1cw的构建
在用ClaI消化后,进行乙醇沉淀以重新获得pAdex1c。将重新获得的pAdex1c与合成接头(1)(SEQ ID NO:2)混合,所述接头是5'末端磷酸化的,并且含有SwaI、ClaI、SalI和NruI位点,如下面的描述:
合成接头(1):
5'-CGATTTAAATCGATTGTCGACTCGCGA-3′
3'-TAAATTTAGCTAACAGCTGAGCGCTGC-5′将所述混合物在含有ATP和T4 DNA连接酶的溶液中反应过夜使发生连接。在通过加热使连接灭活后,用SwaI消化连接产物。经过消化,SwaI片断从具有多个插入其中的接头的产物切下,获得仅插入一个接头的粘粒。接着,将反应溶液加到离心柱(Spun column)(Pharmacia Inc.)上以除去从接头衍生出的小片段。此后,用T4DNA连接酶进行连接,经自退火环化,然后经体外包装。经用BamHI和NruI同时消化证实从每一集落制备的粘粒DNA的构建。当以预期的方向插入时,形成一个483bp片断,当以相反的方向插入时,形成一个464bp片段。这样证实获得了目标盒式粘粒pAdex1cw,如图1所示。④盒式粘粒pAdex1pCAw的构建
用HindIII和ClaI同时消化以上①构建的质粒pCMwCH31。用克列诺酶将DNA片段填补,并用在5'末端磷酸化的PmeI接头连接。在经加热灭活连接酶后,用Psp1406I消化连接产物。经过消化,从具有多个插入其中的接头的产物上切下Psp1406I片段,获得在DNA片段两端的每一端插入一个接头的粘粒。接着,使反应溶液进行凝胶电泳以切下含有2.3kb DNA片段的凝胶。经电泳从凝胶回收DNA片段。接下来用ClaI消化pAdex1cw,加到离心柱(PharmaciaInc.)除去所形成的小片段。使用T4 DNA连接酶将剩下的DNA片段与前述的2.3kb DNA片段连接。在加热灭活连接酶后,将ClaI加入到系统中以消化由自退火形成的环状粘粒。将DNA片段用于体外包装。
采用BamHI和XhoI同时消化证实从每一集落制备的粘粒DNA的构建。当插入到预期的方向上时,形成483bp和4.8kb的两个片段。当以相反的方法插入时,形成2.7kb和2.5kb的两个片段。这证实获得了目标盒式粘粒pAdex1pCAw。⑤盒式粘粒pAdex1CAwt的构建[SAIBO KOGAKU(CellEngineering),
13(8),759(1994)]
在用SwaI消化后,进行乙醇沉淀以回收pAdex1pCAw。将回收到的pAdex1pCAw与合成接头(2)(SEQ ID NO:3)混合,所述接头是5'末端磷酸化的,并且含有ClaI、XbaI、SpeI、PacI、SwaI和ClaI位点,如下面的描述:
合成接头(2):
5′-ATCGATTCTAGACTAGTTTAATTAATTTAAATCGAT-3'
3'-TAGCTAAGATCTGATCAAATTAATTAAATTTAGCTA-5'将所述混合物在含有ATP和T4 DNA连接酶的溶液中反应一夜使发生连接。在加热灭活连接酶后,向其中加入20单位PacI进行消化。经过消化,从具有多个插入其中的接头的产物切下PacI片段,获得仅插入一个接头的粘粒。接着,将反应溶液加到离心柱(PharmaciaInc.制造)上以除去从接头衍生出的小片段。此后,在含有T4 DNA连接酶的溶液中连接过夜,接着经自退火环化。加热灭活连接酶后,将所形成的产物用于体外包装。经采用XbaI和XhoI同时消化证实从每一集落制备的粘粒DNA的构建。当以预期的方向插入时,形成一个522bp片段,当以相反的方向插入时,形成一个568bp片段。这样证实获得了目标盒式粘粒pAdex1CAwt,如图2所示。(b)插入了loxP的粘粒的构建I盒式粘粒pAdex2L3LCAwt的构建①质粒pA60X99X的制备
在用BamHI消化盒式粘粒pAdex1CAwt后,加热灭活限制酶。然后用T4 DNA连接酶连接所形成的DNA片段过夜。使用这一反应混合物转化大肠杆菌DH5α(GIBCO BRL),并从所形成的转化体制备质粒DNA,以获得目标质粒pA60X99X。②质粒pA60X99的制备(不同于腺病毒,除去了XbaI位点)。
在用XbaI消化质粒pA60X99X后,将反应混合物在琼脂糖凝胶上进行电泳。切下一段含有23.8kb DNA片段(它仅在两个XbaI位点中的一个位点上被消化)的凝胶,从电泳凝胶回收该DNA片段。然后,将所述片段用克列诺酶(Takara Shuzo Co.,Ltd.)填补,接着用T4 DNA连接酶连接过夜。用这一反应混合物转化大肠杆菌DH5α。从如此获得的转化体制备质粒DNA。用BsrGI和XbaI同时消化这些质粒DNA,获得6.2bp DNA片段命名为质粒pA60X99,如图3所示。③质粒pA2L60X9的制备(loxP插入到BsrGI位点)。
在用XhoI消化质粒pULL2r(按下文中描述的方法制备)后,将消化产物的两端用克列诺酶(Takara Shuzo Co.,Ltd.)填补。用苯酚-氯仿(1∶1)抽提后,接着用乙醇沉淀。经离心收集沉淀,溶解在60μl TE缓冲液中。该反应混合物在含有ATP和T4 DNA连接酶的连接酶溶液(总终体积为50μl)中与5'-末端磷酸化的KpnI接头(Takara Shuzo Co.,Ltd.)混合并反应过夜,使其发生连接。然后用Asp718(Boehringer)消化连接产物。将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。切下一段含有携带loxP的64bp DNA片段的凝胶,通过电泳从凝胶重新获得所述DNA片段。
以上提到的质粒pULL2r按以下方法制备。用限制酶Ecl136II消化质粒pUC119(Takara Shuzo Co.,Ltd.),接着用碱性磷酸酶处理。然后将pUC119-Ecl136II片段和以下合成DNA片段(SEQID NO:4)进行连接:
5'-CGAACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCGAGTCG-3'
3'-GCTTGCGCA
TATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAGAGCTCAGC-5'其中下面划线的序列表示loxP位点。该合成DNA片段携带loxP序列(在其末端具有MluI位点和XhoI位点),当Mlui和XhoI位点被连接时,消化所述序列形成NruI位点。这样,获得已插入两个合成DNA片段的质粒pULL2r。
另一方面,用包含在50μl溶液中的50单位的BsrGI消化10μg质粒pA60X99。将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳以切下含23.8kb DNA片段的凝胶。通过电泳从凝胶回收DNA片段。使回收的DNA片段和前述的64bp DNA片段(携带loxP)在含有ATP和T4 DNA连接酶的溶液中反应一夜使其发生连接。将无菌水和BsrGI活性缓冲剂加入到反应混合物中。在经70℃温育10分钟灭活连接酶后,用BsrGI消化由自退火形成的环状pA60X99。用10μl这种反应混合物转化大肠杆菌DH5α。从如此获得的转化体制备质粒DNA。
为了验证插入的loxP的取向,用ApaI和MluI同时消化质粒DNA,并将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。当以预期的方向插入时,形成366bp和219bp的两个片段,当以相反的方向插入时,形成334bp和251bp的两个片段。在用NruI消化的情况下,当以预期的方向插入时,形成一个573bp片段,当以相反的方向插入时,形成一个533bp片段。而且,在用DraI和KpnI同时消化的情况下,当一个loxP以预期的方向插入时,形成一个320bp片段,当两个loxP序列以预期的方向插入时,形成一个384bp片段。这样获得了符合所有上述三种情况的目的质粒,即目标质粒pA2L60X99(仅一个loxP已以预期的方向插入其中),如图4所示。④质粒pA2L3L6099的制备(loxP插入到XbaI位点)
在用XhoI于100μl溶液中消化质粒pULL2r后,将消化产物的两端用克列诺酶(Takara Shuzo Co.,Ltd.)填补。用苯酚-氯仿(1∶1)抽提,接着用乙醇沉淀。离心收集沉淀并溶解在TE缓冲剂中。该溶液在含有ATP和T4 DNA连接酶的连接酶溶液(总终体积50μl)中与5'-末端磷酸化的SpeI接头(Takara Shuzo Co.,Ltd.)混合和反应一夜使其发生连接。进一步加入SpeI进行消化后,将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。切下一段含有64bp DNA片段(携带loxP)的凝胶通过电泳从凝胶获得所述DNA片段。
在用XbaI消化质粒pA2L60X99后,将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。切下一段含有23.8kb DNA的片段,经电泳从所述凝胶重新获得所述DNA片段。将这种DNA片段在含有ATP和T4 DNA连接酶的连接溶液中与前述的携带loxP的64bp DNA片段反应一夜使其发生连接。在加热灭活连接酶后,用XbaI处理连接产物以消化由自退火形成的环状pA2L60X99。用这一反应混合物转化大肠杆菌DH5α。从如此获得的转化体制备质粒DNA。
为了验证插入的loxP的取向,用BglII和MluI同时消化上述质粒DNA。将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。当以预期的方向插入时,形成366bp和503bp的两个片段,当以相反的方向插入时,形成398bp和471bp的两个片段。在用ApaI和MluI同时消化的情况下,当以预期的方向插入时形成一个660bp的片段,当以相反的方向插入时形成一个628bp的片段。另外,在用EcoNI和MluI同时消化的情况下,当以预期的方向插入时形成一个311bp的片段,当以相反的方向插入时形成一个343bp的片段。此外,在用HpaI和SacI同时消化的情况下,当一个loxP以预期的方向插入时形成一个397bp的片段,当两个loxP序列以相反的方向插入时形成一个461bp的片段如此获得了符合所有上述四种情况的目标质粒,即目标质粒LpA2L3L6099(仅一个loxP已以预期的方向插入其中)。如图5所示。⑤盒式质粒pAdex2L3LCAwt的构建
在用Csp45I(Toyobo Co.,Ltd.),然后相继用BamHI和用EcoRI在反应溶液中消化盒式粘粒pAdex1CAwt后,进行琼脂糖凝胶电泳,以进行检验。切下一段含有21kb DNA片段的凝胶,经电泳从所述凝胶回收所述DNA片断。当回收的21kb BamHI-DNA片段时,用Csp45I和EcoRI进行消化以防沾污其它片段。
在用BamHI消化质粒pA2L3L6099后,用苯酚一氯仿(1∶1)抽提DNA片断。使用葡聚糖凝胶G25(已事先用TE平衡)将水层进行凝胶过滤。使所述回收到的DNA片段在含有ATP和T4 DNA连接酶的溶液中与前述的21kb DNA片段连接过夜。在加热灭活连接酶后,盒式粘粒用于体外包装。
这就是说,一份盒式粘粒用Gigapack XL试剂盒(StratageneCo.,Ltd.)进行体外包装。剩下的粘粒在-80℃下冻干。因为Gigapack XL试剂盒对42kb或更小的粘粒提供低的包装效率,所以该试剂盒可以在某种程度上选择由于包含插入序列,变得更大的粘粒。在本发明中,在挑出的10个集落中,它们中的大多数包含插入序列。因此,可以容易地获得目标克隆(即,病毒基因组已与其恰当地连接的克隆)。用Izumu Saito,et al.,
JIKKEN IGAKU (Experimental Medicine),
7,183-187(1989)中所述的常规方法处理所述的粘粒。
将包装完的粘粒转染进大肠肝茵DH5α(GIBCO BRL)。即,将粘粒以各种浓度接种到每-Ap+琼脂板(补充了氨苄青霉素)和Ap+LB(池),接着温育过夜。从池中抽提并制备小量制备出的DNA,用来经限制酶DraI消化后检测具有插入序列的粘粒的比率。将集落连带琼脂板一起挑出,在Ap+LB中培养一夜以制备小量DNA。接着用DraI消化证实从每一集落制备的粘粒的结构。当以预期的取向插入时,形成一个891bp片段。当以相反的取向插入时,形成一个1.4kb片断。按照这一方法,获得了目标盒式粘粒pAdex2L3LCAwt。
即,用NruI和连接酶制备一种携带表达单位但缺失大多数腺病毒DNA的质粒,然后从该质粒制备一个DNA片段,用于cDNA克隆的最终证实。(C)插入loxP的粘粒的构建II盒式粘粒pAdex2L3LCAwt的构建①质粒pUCA6065的制备
在用BbmHI和PstI消化pA60X99后,将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳,以切下一段含有1.7kb的携带BsrGI位点的DNA片段的凝胶。通过电泳从这一凝胶回收所述DNA片段。以类似的方法用BamHI和PstI消化pUC19以重新获得一个2.7kb DNA片段。然后,将两种片段加到缓冲剂中用于连接反应,进一步向其中加入ATP和T4 DNA连接酶。将反应进行过夜使其发生连接。用该反应混合物转化大肠杆菌DH5α,从所形成的转化体制备质粒DNA,以获得目标质粒pUCA6065。②质粒p2LA6065的制备
用BamHI和AflIII消化质粒pUCA6065以制备一个780bp的DNA片段。另外,用BamHI和BsrGI消化相同的质粒以制备一个3.6kb的DNA片段。将这两种片段与如下所示的携带loxP的接头DNA(SEQID NO:11)混合。5’-CATGTAATTT AAATCTCGAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATACGCGT
3’-ATTAAA TTTAGAGCTC TATTGAAGCA TATTACATAC GATATGCTTC AATATGCGCAATTTAAATGT AAAAATAATG TACTAGAGAC ACTTTCAATA AAGGCAAATG CTTTTATTT-3′TAAATTTACA TTTTTATTAC ATGATCTCTG TGAAAGTTAT TTCCGTTTAC GAAAATAAAC ATG-5′将混合物加入到缓冲剂中用于连接反应,进一步向其中加入ATP和T4连接酶。使反应进行过夜使其发生连接。用该反应混合物转化大肠杆菌DH5α,从所形成的转化体制备质粒DNA。这样获得了一个接头DNA已插入其中的目标质粒p2LA6065。③粘粒pA2LA3L6099的制备
用BamHI和SfiI(或BglI)消化质粒p2LA6065,以制备一个1.5kb的DNA片段。另外,用BamHI和SfiI消化质粒pA2L3L6099,以制备约22kb的DNA片段。将这两种片段加入到缓冲剂中用于连接反应,进一步向其中加入ATP和T4 DNA连接酶。使反应进行过夜使其发生连接,用该反应混合物转化大肠杆菌DH5α,并从所形成的转化体制备质粒DNA。这样获得了目标粒pA2LA3L6099。④盒式粘粒pAdex2LA3LCAwt的构建
以类似于以上(b)⑤所述的构建pAdex2L3LCAwt的方式从pA2LA3L6099和pAdex1CAwt构建粘粒pAdex2LA3LACAwt。(d)插入loxP的粘粒的构建III盒式粘粒pAdex2LD3LD3LCAwt的构建①质粒pHSGA6065的制备
在用BamHI和PstI消化pA60X99后,将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。切下一段含有1.7kb的携带BsrGI位点的DNA片段的凝胶。经电泳从所述凝胶上回收所述DNA片段。用BamHI和PstI消化质粒pHSG299(Takara Shuzo Co.,Ltd.)。以类似的方式重新获得一个2.7kb的DNA片段。然后,将两种片段加到缓冲剂中用于连接酶反应,向其中再加入ATP和T4 DNA连接酶。将反应进行过夜使其发生连接。用该反应混合物转化大肠杆菌DH5α,并从所形成的转化体制备质粒DNA,以获得目标质粒pHSGA6065。②质粒p2LD6065的制备
用BsrGI和DraI消化质粒pHSGA6065,以制备一个4.4kb的DNA片段。将该片段与以下所示的携带loxP的接头DNA(SEQ ID NO:12)混合:5’-GTACACTCTC GGGTGATTAT TTACCCCCAC CCTTGCCGTC TGCGCCGATT TAAATCTCGA
3’-TGAGAG CCCACTAATA AATGGGGGTG GGAACGGCAG ACGCGGCTAA ATTTAGAGCTGATAACTTCG TATAATGTAT GCTATACGAA GTTATACGCG TATTTAAATC CGTTT-3’CTATTGAAGC ATATTACATA CGATATGCTT CAATATGCGC ATAAATTTAG GCAAA-5’将反应混合物加到缓冲剂中用于连接酶反应,向其中再加入ATP和T4 DNA连接酶。将反应进行过夜使其发生连接。用该反应混合物转化大肠杆菌DH5α,并从得到的转化体制备质粒DNA。由此获得了其中已插入一个DNA接头的目标质粒p2LD6065。③质粒pA2LD3L6099的制备
用BamHI和SfiI(或BglI)消化质粒p2LD6065以制备一个1.5kb的DNA片段。另外,用BamHI和SfiI消化质粒pA2L3L6099以制备约22kb的DNA片段。将两种片段加入到缓冲剂中用于连接酶反应,向其中再加入ATP和T4 DNA连接酶。将反应进行过夜使其发生连接。用该反应混合物转化大肠杆菌DH5α,并从所形成的转化体制备质粒DNA。如此获得了目标质粒pA2LD3L6099。④盒式粘粒pAdex2LD3LCAwt的构建
以类似于以上(b)⑤所述的构建pAdex2L3LCAwt的方式从pA2LD3L6099和pAdex1CAwt构建粘粒质粒pAdex2LD3LACAwt。(e)腺病毒DNA-末端蛋白复合物(Ad5 dlX DNA-TPC和Adex1CANLacZ DNA-TPC)的制备
①使用Ad5dlX(I.Saito et al.,J.Virology,Vol.54,711-719(1985))或Adex1CANLacZ作为腺病毒DNA。将Ad5 dlXDNA-TPC和Adex1CANLacZ分别转染进Hela细胞(以10 Roux管的量)和293细胞,接着培养。
即,以0.2ml/Roux管的量转染Ad5-dlX或Adex1CANLacZ的病毒溶液(~109 Pfu/ml)。3天后将细胞去膜并离心收集。大多数腺病毒粒子不存在于培养基中而存在于细胞核中。因此,该病毒易于从感染细胞纯化。
在无菌状态下进行下列过程。
②将如此获得的细胞悬浮在Tris-HCl(PH8.0)中,用封闭型超声波发生器进行超声波处理,以杀灭细胞从而释放出病毒。
③在经离心除去由此获得的细胞碎片后,将上清液覆盖于装在超速离心机SW28管中的氯化铯溶液(比重为1.43)上。接着用垫层离心法进行浓缩。
④将界面下紧靠界面的病毒层转移到SW50.1管中。一般来说,界面下紧靠界面的病毒层是肉眼可见的。收集含有病毒层和其下面的层的5ml氯化铯溶液。同时,另一支管装满氯化铯溶液(比重为1.34)
将这些管于35krpm、4℃下离心过夜。收集如此形成的表明病毒存在的白色带,并转移到事先形成梯度的管中。将该管进一步在35krpm,4℃下超离心4小时。
⑤收集表明病毒存在的白色带,并以相同的量与8M盐酸胍混合。此外,将盐酸胍饱和的氯化铯加入到混合物中。所形成的混合物装入到VTi65管中。用4M盐酸胍使颗粒蛋白变性以引起分解,从而释放出DNA-TPC复合物。
⑥将以上所述的管以55krpm,15℃下超离心一夜,接着以0.2ml分级分离。从每一级馏份中取出1μl,与1μg/ml溴化乙锭水溶液混合,用荧光染色证实DNA存在或不存在。收集含有DNA的两或三个级份。
⑦所述级份对500ml TE透析过夜两次,然后在-80℃下贮存。以测定DNA的常规方法据OD260值测定如此获得的Ad5dlX DNA-TPC复合物或Adex1CANLacZ DNA-TPC复合物的量。
⑧以足量的AgeI消化所形成的Ad5dlX DNA-TPC复合物或Adex1CANLacZ DNA-TPC复合物2小时。在经葡聚糖凝胶G25柱的凝胶过滤后,将该复合物在-80℃下贮存,用于按以下步骤构建携带loxP的重组腺病毒。(f)插入loxP的重组腺病毒的制备
通过将SV40的核转移信号序列加入到大肠杆菌LacZ基因的5'-末端获得NLacZ基因。
①向直径为6cm和10cm的每个培养皿中装入在加有10%FCS的DME中培养过的293细胞。②-1 Ad5d1X2L3L和Adex2L3LCANLacZ的构建
在将8μg粘粒pAdex2L3LCAwt DNA(具有loxP和一个导入其中的表达单位)与1μg事先用AgeI消化过的Ad5dlX DNA-TPC复合物或1μg事先用AgeI消化过的Ad5dlX DNA-TPC复合物或1μg事先用AgeI消化过的Adex1CANLacZ混合后,用Celfect试剂盒(Pharmacia)按磷酸钙方法在6cm培养皿中进行转染。即,将混合物滴加到6cm培养皿中的培养基上,并继续培养。
在培养过夜(约16小时)后,第二天早晨交换培养基。然后在当天晚上,将含有细胞的培养基与含5%FCS的DME一起以0.1ml/孔的量倒入到三个96-孔胶原涂覆板(未稀释的贮存液、10倍稀释液和100倍稀释液)的孔中。为了避免各板之间细胞计数上的明显差异,将从10cm培养皿收获的293细胞的1/3加到两块稀释液板的每块上。②-2 Ad5dlX2LA3L和Adex2LA3LCANLacZ的构建
在将8μg粘粒pAdex2LA3LCAwt DNA(具有loxP和一个导入其中的表达单位)与1μg事先用AgeI消化过的Ad5dlX DNA-TPC复合物或1μg事先用AgeI消化过的Adex1CANLacZ DNA-TPC混合后,用Celfect试剂盒(Pharmacia)按磷酸钙方法在6cm培养皿中进行转染。即,将混合物滴加到6cm培养皿中的培养基上,并继续培养。
在培养一夜(约16小时)后,第二天早晨交换该培养基。然后在当天晚上,将含有细胞的培养基与含5%FCS的DME一起以0.1ml/孔的量倒入到三个96-孔胶原涂覆板(未稀释的贮存液、10倍稀释液和100倍稀释液)的孔中。为了避免各板之间细胞计数上的明显差异,将从10cm培养皿收获的293细胞的1/3加到两块稀释液板的每块上。②-3 Ad5dlX2LD3L和Adex2LD3LCANLacZ的构建
在将8μg粘粒pAdex2LD3LCAwt DNA(具有插入的loxP和导入其中的一个表达单位)与1μg事先用AgeI消化过的Ad5d1X DNA-TPC复合物或1μg事先用AgeI消化过的Adex1CANLacZ DNA-TPC复合物混合后,用Celfect试剂盒按磷酸钙方法在6cm培养皿中进行转染。即,将混合物滴加到6cm培养皿中的培养基上,并继续培养。
在培养过夜(约16小时)后,第二天早晨交换培养基。然后在当天晚上,将含有细胞的培养基与含5%FCS的DME一起以0.1ml/孔的量倒入到三个96-孔胶原涂覆板(未稀释的贮存液、10倍稀释液和100倍稀释液)的孔中。为了避免各板之间细胞计数上的明显差异,将从10cm培养皿收获的293细胞的1/3加到两块稀释液板的每块上。
③3或4天和8或10天后,再向每孔中加入50μl含10%FCS的DME。当293细胞系变薄时,应将含10%FCS的DME更早地加入到孔中。
在7-20天可观察到孔中病毒已增殖且细胞死亡。含有死细胞的培养基用无菌的巴氏吸管从细胞完全死亡的每孔中转移到1.5ml无菌管中。将该管迅速在-80℃下冷冻干燥并贮存。
④在15到25天结束观察。从装有培养基的管中挑选出约10支管,所述培养基含有相对较晚的阶段死之的细胞。在超声波处理后,在5krpm下离心10分钟。在-80℃下贮存所得到的上清液,用作第一种子。
在较早的阶段病毒已开始增殖的孔预示着由多种病毒株混合感染的较高的可能性。
⑤将293细胞系装入24-孔板中,并将5%FCS-DME(0.4ml/孔)和10μl第一病毒种子加入到孔中。设置二个重复。
⑥在约3天细胞完全死亡时,用类似于上述制备第一病毒种子的方法经超声波处理和离心处理从重复试验孔之一获得上清液。将如此获得的上清液在-80℃下贮存,用作第二种子。将重复试验孔另一孔中的死亡细胞在5000rpm下离心5分钟,弃去上清液。将单独的细胞在-80℃下贮存(细胞团)。收集10种病毒株的所述细胞团,按以下方法从感染细胞抽提完整DNA。向每一细胞团中加入400μl细胞DNA的TNE(50mM Tris-HCl,PH7.5,100mM Nacl、10mMEDTA)、4μl蛋白酶K(10mg/ml)和4μl 10%SDS。
⑦在50℃下处理1小时后,用苯酚一氯仿抽提两次,并用氯仿抽提两次,然后用乙醇沉淀。将用乙醇沉淀重新获得的核酸溶解在含有20μg/ml核糖核酸酶的50μl TE中。
在用XhoI(它切开表达单位并识别含CG的位点)消化15μl溶液后,将消化产物与一种表达盒式粘粒的XhoI消化产物一起在琼脂糖凝胶(有约15cm长)上电泳一夜。比较由此获得的电泳带型。选择具有表示两个插入的loxP序列断裂模式的带的克隆,所述序列从用XhoI消化loxP中识别位点产生。弃去给出表示未确定DNA序列的许多带的克隆,因为有可能克隆被有缺失的病毒沾污。
使用如此获得的插入3 loxP的重组腺病毒Ad5d1X2L3L、Ad5d1X2LA3L或Ad5d1X2LD3L和携带有目标外源核苷酸表达单位的一种粘粒,可以按照构建重组腺病毒公知的方法构建重组腺病毒,该重组腺病毒已插入了外源基因表达单位和loxP,所述方法例如,JIKKEN IGAKU BESSATSU(Esperimental Medicine,ExtraIssue),Bio Manual Series No.4,IDENSHI DONYU-TO-HATSUGEN KAISEKI-HO(Study on Gene Transduction andExpression),page43-58)中描述的COS-TPC方法。
(g)缺失E2A基因腺病毒的构建及其结构的证实
将重组腺病毒Adex2L3LCANLacZ和Adex1CANCre分别以10和3的多重性感染转染进293细胞,接着进行培养。4天后,回收细胞,按以上描述的方法制备DNA。由两种方法(即,以下描述的SmaI消化和PCR)证实所形成的Adexd123CANLacZ具有这样一种结构,即已切去位于两个loxP序列之间的包含E2A基因的区域。
对Adex2LA3LCANLacZ和Adex2LD3LCANlacZ,也可以类似地被证实,这些重组腺病毒具有所期望的结构。1.SmaI消化
用SmaI消化接着进行凝胶电泳导致切除位于两个loxP序列之间的区域,形成一个4.7kb的片段。从比较上述4.7kb片段的带和4.45kb的带(通常在Adex2L3LCANLacZ、Adex1CANCre和Adexd123CANlacZ中观察到的)之间的带密度,确定在回收的重组腺病毒中Adex123CANLacZ占多少百分比。2.PCR证实
用0.1ng制备的DNA作为模板,在常规条件下进行PCR反应。将产物在琼脂糖凝胶上进行电泳分析。使用的引物优选地是寡核苷酸(1)(SEQ ID NO:5)、寡核苷酸(2)(SEQ ID NO:6)、寡核苷酸(3)(SEQ ID NO:7)和寡核苷酸(4)(SEQ ID NO:8),如下所示:
寡核苷酸(1)
5'-CAACTCCATGCTCAACAGTCCCCAGGTACA-3′
寡核苷酸(2)
5'-GATTTTTAAACGGCGCAGACGGCAAG-3′
寡核苷酸(3)
5'-GTGAGCTTAGAAAACCCTTAG-3'
寡核苷酸(4)
5'-AGATACCCCTTTTGCACTGGTGCAAGTTAAC-3′
就PCR的反应溶液来说,优选地是包含50mMKCl、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTP混合物和0.2μM每一种引物、0.1ng模板DNA和0.5单位Taq聚合酶的10M Tris-HCl(PH8.3)。
PCR反应条件优选的例子是,在95℃下分解双链1.5分钟,在64℃下退火1.0分钟,在70℃下链延长反应1.0分钟,且反应循环30次。
当使用寡核苷酸(1)和(4)作为引物时,检测到一个被假定显示有393bp序列的带,表明存在缺失E2A基因的Adexd123CANLacZ。当使用寡核苷酸(2)和(3)作为引物时,检测到一个被假定显示有221bp序列的带,说明被Cre基因产物切掉的环状E2A基因的存在。由此揭示出,形成了Adexd123CANLacZ,其中,位于loxP序列之间的E2A基因区已被从Adex2L3LCANLacZ切除。如图6所示。(2)下面将描述构建携带一个启动子、一个重组酶基因和聚(A)序列的重组腺病毒载体的方法。
在下列方法中,使用重组酶Cre基因作为重组酶基因的实施方案以一个实施例描述。然而,该方法对使用其它重组酶基因的实施方案也是适用的。
①分别用限制酶PstI和XbaI(Takara Shuzo Co.,Ltd.)同时消化由PCR制备的重组酶Cre基因和质粒pUC19(Takara ShuzoCo.,Ltd.)。将DNA片段混合并相互连接,以获得具有插入其中的重组酶基因Cre的质粒pUCCre。
⑦用限制酶SwaI(Boehringer)消化包含CAG启动子的盒式粘粒pAdex1CAwt,将所形成的DNA片断与由用限制酶PstI和XbaI(Takara Shuzo Co.,Ltd.)同时消化pUCCre获得的DNA片段混合,接着用克列诺酶(Takara Shuzo Co.,Ltd.)使其成平端。然后,沉淀盒式粘粒并用T4 DNA连接酶连接。如此获得了具有插入其中的重组酶Cre基因的盒式粘粒。
当使用除CAG启动子外的其它启动子时,以下方法是有利的。首先,从全长腺病毒基因组(36kb)缺失掉1.9kb E3区和2.9kb E1A.E1B区(它们对于复制是非必需的),以形成具有约31kb基因组DNA的盒式粘粒。另一方面,制备携带有一个启动子重组酶Cre基因和聚(A)序列的质粒。用合适的限制酶消化处理上述盒式粘粒和质粒,获得具有在E1A.E1B区缺失位点插入到腺病毒基因组中的重组酶Cre基因表达单位的盒式粘粒。
③用Gigapack XL(Stratagene Co.,Ltd.)将如此获得的盒式粘粒进行体外包装。
④另一方面,制备腺病毒DNA-末端蛋白复合物(Ad5 d1X DNA-TPC)。使用一种腺病毒DNA,Ad5 d1X(I.Saito et al.,J.Virology,vol.54,711-719(1985))。将Ad5 d1X DNA以10Roux管的量转染进Hela细胞。接着进行培养。回收病毒粒子,然后用盐酸胍处理。用超离心分离并回收DNA-TPC。
用足量的EcoT22I消化如此获得的Ad5d1X DNA-TPC复合物,用于以下步骤。
⑤在最后步骤中,将具有插入其中的重组酶Cre基因的盒式粘粒与事先用EcoT22I消化的Ad5d1X DNA-TPC复合物混合,然后按照磷酸钙方法用Celfect试剂盒(Pharmacia)进行转染。从培养基(其中细胞因病毒增殖而死亡)中回收病毒溶液。如此获得了携带启动子、重组酶基因和聚(A)序列的重组腺病毒载体。
按照本发明,携带有目标外源基因表达单位并完全缺失E2A基因功能的重组腺病毒可以有效地用于治疗包括遗传病在内的各种疾病。更详细地说,适当稀释含有本发明的重组腺病毒的高滴度的病毒溶液,该稀释的溶液可经合适的途径给药,例如,局部的(中枢神经系统、门静脉)、口腔地(使用包有肠溶衣的)、经吸入、经皮下等。
此后,参照实施例和参考实施例用于更详细地描述本发明,但不能认为是对其的限定。
在实施例中,除非有其它说明,按照Molecular Cloning,ALaboratory Manual,edited by T.Maniatis et al.,secondedition(1989),Cold Spring Harbor Laboratory中描述的改进的方法进行操作噬茵体、质粒、DNA、各种酶、大肠杆菌,培养细胞等的各种步骤。限制酶和修饰酶从Takara Shuzo Co.,Ltd.,New England Biolabs(NEB)、Stratagene或Boehringer购得,并按照其说明使用。实施例1pAdex1CAwt的构建含CAG启动子的质粒pCMwCH31的构建用EcoRI消化携带CAG启动子的质粒pCAGGS(Niwa et al.,Gene,
108,193-200,1990)。然后,用克列诺酶填补所形成的DNA片段。此后,用一种连接酶使该DNA片段与SwaI接头连接。用SalI消化所形成的质粒。用克列诺酶使该DNA片段成平端,接着用一种连接酶使其与ClaI接头连接。在用PstI消化如此获得的质粒后,用克列诺酶将DNA片段填补成平端,并用连接酶使其与XhoI接头连接。在用各自的限制酶消化后,用琼脂糖凝胶电泳证实原始限制酶位点消失且插入了每一接头。②pAdex1c的构建(i)含有在缺失了E1基因区的腺病毒基因组的左端的17%区段的质粒pUAF0-17D的构建
用S1核酸酶使5型腺病毒DNA成平端,并在平端上连接BamH接头。用HindIII消化得到具有2.8kb并相应于腺病毒基因组左端的8%的目标DNA片段。用琼脂糖凝胶分离并回收该片段,并插入到预先用BamHI/HindIII消化的pUC19的BamHI/HindIII位点。如此获得的质粒命名为pUAF0-8。
(ii)用HindIII消化腺病毒DNA。从凝胶上回收目标3.4kb DNA片段(相应于腺病毒基因组左端的8-17%)并在HindIII位点插入到pUC19中。如此获得的质粒命名为pUAF8-17。
在质粒pUAF0-8中,用ClaI接头将相应于碱基编号454的PvuII位点转换成ClaI位点。此处提到的碱基编号来源于腺病毒DNA的碱基编号。用BamHI/ClaI消化所述质粒。用琼脂糖凝胶电泳回收454bp BamHI/ClaI片段。
在质粒pUAF8-17中,用ClaI接头将相应于碱基编号3328的BglII位点转换成ClaI位点。然后用BamHI/ClaI消化所述质粒。用琼脂糖凝胶电泳回收2.9kb BamHI/ClaI片段。
将得自质粒pUAF0-8的454bp BamHI/ClaI片段与得自质粒pUAF8-17的2.9kb HindIII-ClaI片段连接。将所形成的连接产物插入到pUC19的BamHI/HindIII位点。如此获得的质粒命名为pUAF0-17D。该质粒含有E1基因区缺失的腺病毒基因组的17%。(iii)腺病毒基因组Bst1107-EcoRI片段(21.6kb)的制备
用Bst1107和EcoRI消化5型腺病毒DNA。经用琼脂糖凝胶电泳分离后,回收目标21.6kb片段。(iv)腺病毒基因组EcoRI-SalI片段(6.5kb)的制备
用SwaI接头将pX2S的SalI位点(I.Saito et al.,J.Virology,Vol.54,711-719(1985))转换成SwaI位点。用EcoRI和SwaI消化所形成的pX2W。用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段后,回收目标6.5kb片段。(v)卡隆粒chdRBR7-11的制备
为了除去卡隆粒9-11(I.Saito & G.Stark,
Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.,
83,8664-8668,1986)中KpnI、SmaI和BamHI位点,用Asp718和BamHI消化卡隆粒9-11。用克列诺酶将所形成的DNA片段填平,然后进行自连接。使用连接的序列的转化给出目标卡隆粒,命名为卡隆粒6-11。将BamHI接头插入到卡隆粒6-11的EcoRI位点。如此获得的卡隆粒命名为卡隆粒7-11。(vi)pAdex1C的制备
将得自pUAF0-17的2.9kb BamHI-Bst1107片段、得自腺病毒基因组的21.6kb Bst1107-EcoRI片段和得自pX2W的6.5kb EcoRI-SwaI片段与预先用EcoRI和Ec136I消化的chdRBR7-11连接。将该连接的序列进行体外包装,并转化进大肠杆菌DH5α。从该转化体分离出目标粘粒。命名为pAdex1C。(3)盒式粘粒pAdex1CW的构建
在用20单位ClaI消化后,进行乙醇沉淀以回收pAdex1C。将回收的pAdex1(1μg)与0.01μg合成接头(1)(SEQ ID NO:2)混合,所述接头在5'末端磷酸化并包含SwaI、Clai、SalI和NruI位点,如下面的描述。
合成接头(1):
5'-CGATTTAAATCGATTGTCGACTCGCGA-3'
3'-TAAATTTAGCTAACAGCTGAGCGCTGC-5′将混合物在总共18μl的含有ATP和T4连接酶的溶液中反应一夜使其发生连接。在70℃温育10分钟灭活连接酶后,向其中加入20单位的SwaI用来进行消化。按该消化,从具有插入其中的多个接头的产物上切下SwaI片段,获得其中仅插入一个接头的粘粒。接着将反应溶液用到离心柱(Pharmacia Inc.)上以除去由接头衍生的小片段。此后,在总共18μl的含有ATP和T4 DNA连接酶的溶液中进行连接反应过夜,接着经自退火环化。经在70℃温育10分钟灭活连接酶后,将1μl所形成的产物用于体外包装。
经用BamHI和NruI同时消化证实从每种集落制备的粘粒DNA的构建。当以预期的方向插入时,形成一个483bp片段,当以相反的方向插入时,形成一个464bp片段。由此证实获得了目标盒式粘粒pAdex1CW,如图1所示。④盒式粘粒pAdex1pCAw的构建
用HindIII和ClaI同时消化以上①构建的质粒pCMwCH31。将DNA片断用克列诺酶填补,并与预先在5'末端磷酸化的PmeI接头连接。在70℃温育10分钟灭活连接酶后,用Psp1406I消化连接产物。经消化从具有插入其中的多个接头的产物上切下Psp1401I片段,以获得其中在DNA片段的两端之一插入一个接头的粘粒。接着,将反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳以切除一段含有2.3kb DNA片段的凝胶。通过电泳从该凝胶上回收DNA片段。接着用ClaI消化pAdex1cw,并经应用到离心柱(Pharmacia Inc.)上除去所形成的小片段。剩下的DNA片段(1μg)在总共18μl的含有ATP和T4 DNA连接酶的溶液中与0.1μg前面所说的2.3kb DNA片段反应过夜,以进行连接。在经70℃温育10分钟天活连接酶后,将总共2μl的ClaI加入到1/4量的反应混合物中以消化从自退火形成的环状粘粒,1μl DNA片段用于体外包装。
经用BamHI和XhoI同时消化证实从每一集落制备的粘粒DNA的结构。当以预期的方向插入时,形成483bp和4.8kb的两个片段,当以相反的反向插入时,形成2.7kb和2.5kb的两个片段。由此证实获得了目标盒式粘粒pAdex1pCAw。
⑤盒式粘粒pAdex1CAwt(
SAIBO KOGAKU(Cell Engineering),13(8),759,1994)的构建
在用20单位的SwaI消化后,进行乙醇沉淀,以回收1μgpAdex1pCAw。将回收的pAdex1pCAw与0.01μg的合成接头(2)(SEQID NO:3)混合,所述接头在5'-末端磷酸化,并含有ClaI、XbaI、SpeI、PacI、SwaI和ClaI位点,如下的描述:
合成接头(2):
5′-ATCGATTCTAGACTAGTTTAATTAATTTAAATCGAT-3'
3′-TAGCTAAGATCTGATCAAATTAATTAAATTTAGCTA-5'混合物在总量为18μl的含有ATP和T4 DNA连接酶的溶液中反应一夜,使发生连接。在经70℃温育10分钟使连接酶灭活后,向其中加入20单位的PacI以进行消化。经消化,从具有插入其中的多个接头的产物上切下PacI片段,获得其中仅插入一个接头的粘粒。接着将反应溶液加到离心柱(Pharmacia Inc.)上以除去由接头衍生的小片段。此后,在总共18μl的含有ATP和T4 DNA连接酶的溶液中进行连接反应一夜,接着经自退火环化。经在70℃温育10分钟灭活连接酶后,将1μl所形成的产物用于体外包装。
经用XbaI和XhoI同时消化证实从每种集落制备的粘粒DNA的结构。当以预期的方向插入时,形成一个522bp的片段,当以相反的方向插入时,形成一个568bp的片段,由此证实获得了目标盒式粘粒pAdex1CAwt,如图2所示。实施例2 插入3 loxP的质粒的构建①质粒pA60X99X的制备
在于20μl反应溶液中用15单位的BamHI消化0.5μl盒式粘粒pAdex1CAwt后,在70℃下加热15分钟使BamHI灭活。使用1/4量的反应混合物在总量为20μl的含有ATP和T4 DNA连接酶的连接酶缓冲液中进行连接反应过夜。用10μl反应混合物转化大肠杆菌DH5α,并从所形成的转化体制备质粒DNA,以获得目标质粒pA60X99X。②质粒pA60X99(除去了XbaI位点,不同于腺病毒)的制备
5μl质粒pA60X99X于50μl含10单位XbaI的溶液中反应5分钟后,将反应混合物在琼脂糖凝胶上进行电泳。切下一段含有23.8kb DNA片段(由仅在两个XbaI位点中一个位点消化而制备)的凝胶,经电泳从该凝胶回收所述DNA片段。接着,将0.2μg该片段在50μl包含5单位的克列诺酶(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的反应系统中反应,以用酶填补两端。然后,将1/5量的反应混合物在总量为20μl的含ATP和T4 DNA连接酶的溶液中反应一夜,以发生连接。用10μl该反应混合物转化大肠杆菌DH5α,从如此获得的转化体制备质粒DNA。用BsrGI和XbaI同时消化这些质粒,获得一个6.2kb的DNA片段,命名为质粒pA60X99,如图3所示。③质粒pA2L60X99(loxP插入到BsrGI位点)的制备
用150单位XhoI于125μl反应溶液中消化按以下方法制备的30μg质粒pULL2r后,在70℃下加热15分钟灭活XhoI。接着在该反应系统中用12单位的克列诺酶(Takara Shuzo Co.,Ltd.)填补DNA片段的两端。用苯酚-氯仿(1∶1)抽提,接着进行乙醇沉淀。离心收集该沉淀,并溶解在TE缓冲液(由将1mMEDTA加入到10mM Tris-盐酸(PH7.5)获得)中。然后,使反应混合物的一半在总量为50μl的含ATP和T4 DNA连接酶的连接酶反应溶液中与0.2μg 5'-末端磷酸化的KpnI接头(Takara Shuzo Co.,Ltd.)反应过夜,以发生连接。在70℃下加热15分钟灭活连接酶后,用100单位Asp718在80μl反应系统中消化连接产物。将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。切下一段含64bp的携带loxP的DNA片段的凝胶,并经电泳从该凝胶回收所述的DNA片段。
按如下方法制备上面使用的质粒pULL2r。用限制酶Ecl136II消化质粒pUC119(Takara Shuzo Co.,Ltd.),接着用碱性磷酸酶处理。然后进行tpUC119-Ecl136II片段与以下合成DNA片段(SEQ IDNO:4)之间的连接:
5’-CGAACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCGAGTCG-3’
3’-GCTTGCGCA
TATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAGAGCTCAGC-5’其中,下面划线的序列表示loxP位点。该合成DNA片段携带在其末端具有MluI位点和XhoI位点的loxP序列,且当Mlui和XhoI位点相连时,将该DNA设计成形成NruI位点。这样,获得了其中已插入两个合成DNA片段的质粒pULL2r。
另一方面,用包含在50μl溶液中的50单位BsrGI消化10μg质粒pA60X99。此后,将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳,以切下一段含23.8kb DNA片段的凝胶。经电泳从该凝胶回收所述的DNA片段。在总量为25μl的含有ATP和T4 DNA连接酶的溶液中使回收的DNA片段与前面所说的64bp的携带loxP的DNA片断反应一夜,使发生连接。向反应混合物的一半中加入无菌水和用于BsrGI消化的缓冲液,使总体积为18μl。将反应混合物在70℃下温育10分钟以灭活连接酶。在将20单位的BsrGI(总终体积20μl)加入到反应混合物中后,使混合物在37℃下反应1小时以消化产生的由自退火形成的环状pA60X99。用10μl该反应混合物转化大肠杆菌DH5α。从如此获得的转化体制备质粒DNA。
为了证实插入的loxP的取向,取ApaI和MluI同时消化质粒DNA,将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。当以预期的方向插入时,形成366bp和219bp的两个片段,当以相反的方向插入时,形成334和251bp的两个片段。在用NruI消化的情况下,当以预期的方向插入时,形成一个573bp的片段,当以相反的方向插入时,形成一个533bp的片段。另外,在用DraI和KpnI同时消化的情况下,当一个loxP以预期的方向插入时,形成一个320bp片段,当两个loxP序列以相反的方向插入时,形成一个384bp片段。这样获得了符合所有上述三种情况的目标质粒,即,目标质粒pA2L60X99,仅一个loxP以预期的取向插入其中。如图4所示。④质粒pA2L3L6099(loxP插入到XbaI位点)的制备
经在100μl包含100单位XhoI的溶液中反应而消化20μg质粒pULL2r后,在70℃下加热15分钟灭活所述酶。接着,使形成的DNA片段在含8单位克列诺酶(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的溶液中反应,以用酶填补两端。用苯酚-氯仿(1∶1)抽提反应混合物,接着用乙醇沉淀。离心收集沉淀并溶解在30μl TE缓冲液中。使全部体积的溶液在包含ATP和T4 DNA连接酶的连接酶溶液(总终体积50μl)中与0.4μg 5'-末端磷酸化的SpeI接头(Takara Shuzo Co.,Ltd.)反应过夜而实现连接。在70℃下加热10分钟灭活连接酶。在再加入54单位SpeI进行消化后,将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。切下一段含有64bp的携带loxP的DNA片段的凝胶,并经电泳从该凝胶回收所述的DNA片段。
另一方向,使10μg质粒pA2L60X99在50μl含10单位XbaI的溶液中反应,以进行消化。将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。切下一段含有23.8kb DNA片段的凝胶,经电泳从该凝胶回收所述DNA片段。然后,将0.5μg所述DNA片段在总量为16μl的含ATP和T4 DNA连接酶的连接酶溶液中与0.005μg前面所说的64bp的携带loxP的DNA片段反应过夜,使发生连接。向反应混合物中加入14μl稀释5倍的TE,并在70℃下加热10分钟灭活连接酶。此后,将总量为20μl的20单位XbaI加入到1/4体积的反应混合物中,以消化由自退火形成的环状pA2L60X99。使用10μl该反应混合物转化大肠杆菌DH5α。从如此获得的转化体制备质粒DNA。
为了证实插入loxP的取向,用BglII和MluI同时消化质粒DNA。将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。当以预期的取向插入时,形成366bp和503bp的两个片段。当以相反的取向插入时,形成398bp和471bp的两个片段。在用ApaI和MluI同时消化的情况下,当以预期的取向插入时,形成一个660bp片段,当以相反的取向插入时,形成一个628bp片段。另外,在用EcoNI和MluI同时消化的情况下,当以预期的取向插入时,形成一个311bp片段,当以相反的取向插入时,形成一个343bp片段。此外,在用HpaI和SacI同时消化的情况下,当一个loxP以预期的取向插入时,形成一个397bp片段,当两个loxP序列以预期的取向插入时,形成一个461bp片段。如此获得了如图5所示的符合所有上述四种情况的目标质粒,即,仅有一个loxP以预期的取向插入其中的目标质粒pA2L3L6099。⑤盒式粘粒pAdex2L3LCAwt的构建
在100μl含40单位Csp45I的反应溶液中消化10μg盒式粘粒pAdex1CAwt后,将30单位的BamHI和40单位的EcoRI连续加入到反应溶液中。进行琼脂糖凝胶电泳来检测。切下一段含有21kbDNA片段的凝胶,从该凝胶上经电泳回收所述的DNA片段。当回收到21kbBamHI-DNA片段时,用Csp45I和EcoRI进行消化,以防沾污其它片段。
在50μl含30单位的BamHI的溶液中消化5μg质粒pA2L3L6099后,用苯酚-氯仿(1∶1)抽提DNA片段,用预先以TE平衡的葡聚糖凝胶G25将水层进行凝胶过滤。然后,在总量为18μl的含ATP和T4 DNA连接酶的溶液中将0.5μg回收的DNA片段与0.5μg前述的21kbDNA片段连接过夜。在70℃温育10分钟灭活连接酶后,1μl盒式粘粒用于体外包装。
即,以1/4的量使用一种入体外包装试剂盒——Gigapack XL(Stratagene Co.,Ltd.,USA),将剩下的溶液在-80℃下冻干。因为Gigapack XL对42kb或更小的粘粒提供低的包装效率,所以该试剂盒能在某种程度上选择经包含插入序列变得更大的粘粒。在这一实验中,当收集10个集落时,它们中大多数包含插入序列。因此,能够容易地获得具有所期望的取向的克隆(即,其中腺病毒基因组被适当地连接的克隆。用Izumu Saito,et al.,JIKKEN IGAKU(Experimental Medicine),
7,183-187(1989)中描述的常规方法处理粘粒。
将所述包装过的粘粒转染进大肠杆菌DH5α(GIBCO BRL)。即,将粘粒以1/200、1/20、1/2和剩余部分的量分别接种到三块Ap+琼脂板(外加了氨苄青霉素)的每一块上和5ml Ap+LB(池)中,接着温育过夜。
从池中抽提并制备小剂量的DNA,以便经限制酶DraI消化检测具有插入序列的粘粒的比率。将茵落与琼脂板一起挑取,在Ap+LB中培养一夜,以制备小剂量的DNA。
接着用DraI消化证实从每一菌落制备的粘粒的结构。当以预期的取向插入时,形成一个891bp的片段,当以相反的取向插入时,形成一个1.4kb的片段。由此证实获得了目标盒式粘粒pAdex2L3LCAwt。实施例3腺病毒DNA-末端蛋白质复合物(Ad5 d1X DNA-TPC和Adex1CANLacZDNA-TPC)的制备
①使用Ad5dlX(I.Saito et al.,
J.Virology vol.54,711-719(1985))或Adex1CANLacZ作为腺病毒DNA。将Ad5 dlx DNA和Adex1CANLacZ分别转染进Hela细胞(以10 Roux管的量)和293细胞,接着培养。
即,以0.2ml/Roux管的量转染Ad5-dlx或Adex1CANLacZ的病毒溶液(~109PFU/ml)。3天后将细胞去膜并离心收集。大多数腺病毒粒子不存在于培养基中,而存在于细胞核中,因此,该病毒易于从感染细胞纯化。
在无菌状态下进行下列过程。
②将如此获得的细胞悬浮在Tris-HCl(PH8.0)中,用封闭型超声波发生器进行超声波处理,以破坏细胞从而释放出病毒。
③在经离心除去由此获得的碎片后,将上清液覆盖于装在超速离心机SW28管中的氯化铯溶液(比重为1.43)上。接着用垫层离心法进行浓缩。
④将界面下紧靠界面的病毒层转移到SW50.1管中。一般来说,界面下紧靠界面的病毒层是肉眼可见的。收集5ml病毒层。同时另一支管装满氯气铯溶液(比重为1.34)。
将这些管于35k rpm、4℃下离心过夜,收集如此形成的表明病毒存在的白色层,并转移到事先形成梯度的管中。将该管进一步在35krpm,4℃下超离心4小时。
⑤收集表明病毒存在的白色层,并以相同的量与8M盐酸胍混合。此外,将4M盐酸胍饱和的氯化铯加入到混合物中。所形成的混合物装入到VTi65管中。用4M盐酸胍使颗粒蛋白变性以引起分解,从而释放出DNA-TPC复合物。
⑥将以上所述的管在55k rpm于15℃下超离心一夜,接着以0.2ml分馏。从每一级份中取出1μl,与1μg/ml溴化乙锭水溶液混合,用荧光染色证实DNA存在或不存在。收集含有DNA的两或三个级份。
⑦所述级份对500ml TE透析过夜两次,然后在-80℃下贮存。以测定DNA的常规方法据OD260值测定如此获得的Ad5dlX DNA-TPC复合物或Adex1CANLacZ DNA-TPC复合物的量。
③以足量的AgeI消化所形成的Ad5dlX DNA-TPC复合物或Adex1CANLacZ DNA-TPC复合物2小时在经葡聚糖凝胶G25柱的凝胶过滤后,将该复合物在-80℃下贮存。
同时,可将该DNA-TPC复合物使用限制酶的消化、透析和凝胶过滤,但不进行电泳、苯酚处理和乙醇沉淀。氯化铯平衡离心仅可作为一种浓缩方法使用。因此,在尽可能在高的浓度下保持DNA-TPC复合物。从10Roux管的感染细胞可获得约300μg的DNA-TPC复合物。
⑨收集DNA-TPC复合物溶液,向其中加入10μl用于电泳的BPB缓冲液。然后向混合物中加入1μl蛋白酶K(10mg/ml)。将所形成的混合物在37℃下温育10分钟以消化DNA-TPC复合物的末端蛋白质。在苯酚处理后,经琼脂糖上的电泳分离上清液,以证实消化完成。
在经离心凝胶过滤除去EcoT221-消化的DNA-TPC中的限制酶缓冲液后,将所形成的产物分别装入管中,并在-80℃下贮存。实施例4插入了loxP的重组腺病毒(Ad5dlX2L3L和Adex2L3LCANLacZ)的制备通过将SV40的核转移信号序列加入到大肠杆菌LacZ基因的5'-末端获得NLacZ基因。
①向直径为6cm和10cm的每个培养皿中装入在加有10%FCS的DME中培养过的293细胞。
②在将8μg插入了loxP的粘粒pAdex2L3LCAwt DNA(具有导入其中的表达单位)与1μg事先用AgeI消化过的Ad5dlX DNA-TPC复合物或1μg事先用AgeI消化过的Adex1CANLacZ混合后,用Celfeet试剂盒(Pharmacia)按磷酸钙方法在6cm培养皿中进行转染。即,将混合物滴加到6cm培养皿中的培养基上,并继续培养。
在培养过夜(约16小时)后,第二天早晨交换培养基。然后在当天晚上,将含有细胞的培养基与含5%FCS的DME一起以0.1ml/孔的量倒入到三个96-孔胶原涂覆板(未稀释的贮存液、10倍稀释液和100倍稀释液)的孔中。为了避免各板之间细胞计数上的明显差异,将从10cm培养皿收获得的293细胞的1/3加到两块稀释液板的每块上。
③3或4天和8或10天后,再向每孔中加入50μl含10%FCS的DME。当293细胞系变薄时,应将含10%FCS的DME更早地加入到孔中。
在7-20天可观察到孔中病毒已增殖且细胞死亡。含有死细胞的培养基用无菌的巴氏吸管从细胞完全死亡的每孔中转移到1.5ml无菌管中。将该管迅速在-80℃下冷冻干燥并贮存。
④在15到25天进行观察。从装有培养基的管中挑选出约10支管,所述培养基含有相对较晚的阶段死亡的细胞。在超声波处理后,在5k rpm下离心10分钟。在-80℃下贮存所形成的上清液,用作第一种子。
在较早的阶段病毒已开始增殖的孔预示由多种病毒株混合感染的较高的可能性。
⑤将293细胞系装入24-孔板中,并将5%FCS-DME(0.4ml/孔)和10μl第一病毒种子加入到孔中。设置二个重复。
⑥在约3天细胞完全死亡时,用类似于上述制备第一病毒种子的方法经超声波处理和离心处理从重复试验孔之一获得上清液。将如此获得的上清液在-80℃下贮存,用作第二种子。将重复试验孔另一孔中的死亡细胞在5000rpm下离心5分钟,弃去上清液。将单独的细胞在-80℃下贮存(细胞团)。收集10种病毒株的所述细胞团,按以下方法从感染细胞抽提全DNA。向每一细胞团中加入400μl细胞DNA TNE(50mM Tris-HCl,PH7.5,100mM NaCl、10mM EDTA)、4μl蛋白酶K(10mg/ml)和4μl 10%SDS。
⑦在50℃下处理1小时后,用苯酚-氯仿抽提两次,并用氯仿抽提两次,然后用乙醇沉淀。将用乙醇沉淀重新获得的核酸溶解在含有20μg/ml核糖核酸酶的50μl TE中。
在用识别含GC的位点的XhoI将15μl溶液消化后,将消化产物与表达粘粒盒的XhoI表达消化后一起在琼脂糖凝胶(有约15cm长)上电泳一夜。比较由此获得的电泳带型。选择显示表示插入其中的两个loxP序列的消化模式的带的克隆。弃去提供表示未确定DNA序列的许多带的克隆,因为有可能克隆被有缺失的病毒沾污。实施例5缺失E2A基因的腺病毒的构建及其结构的证实
将重组腺病毒Adex2L3LCANLacZ和AdexlCANCre以10的复合感染转染进293细胞,接着进行培养。通过将SV40的核酸转移信号序列加入到Cre基因的5'-末端获得NCre基因。
4天后按以下描述的方法制备DNA。由两种方法(即,以下描述的SamI消化和PCR)证实所形成的Adex123CANLacZ具有这样一种结构,即已切去位于两个loxP序列之间的包含E2A基因的区。1.用SmaI消化
用SmaI消化后,进行凝胶电泳。结果是被注意到,切去了位于两个loxP序列之间的区,因此形成了一个4.7kb的片段。从比较上述4.7kb的带和4.45kb的带(通常在Adex2L3LCANLacZ、Adex1CANCre和Adexd123CANLacZ中观察到的)之间的带密度,确定回收的重组腺病毒中约30%区段是Adexd123CANLacZ。2.PCR证实
用0.1ng制备的DNA作为模板,在常规条件下进行PCR反应。产物用琼脂糖凝肢上的电泳分析。使用的引物优选地是如下所示的寡核苷酸(1)(SEQ ID NO:5)、寡核苷酸(2)(SEQ ID NO:6)、寡核苷酸(3)(SEQ ID NO:7)、寡核苷酸(4)(SEQ ID NO:8)。寡核苷酸(1)5,-CAACTCCATGCTCAACAGTCCCCAGGTACA-3'寡核苷酸(2)5,-GATTTTTAAACGGCGCAGACGGCAAG-3'寡核苷酸(3)5′-GTGAGCTTAGAAAACCCTTAG-3'寡核苷酸(4)5′-AGATACCCCTTTTGCACTGGTGCAAGTTAAC-3'用于PCR的反应溶液的组成(总体积20μl):
Tris-HCl(PH8.3) 10mM
KCl 50mM
MgCl2 1.5mM
dNTP混合物 0.2mM
引物 各0.2μM
模板DNA 0.1ng
Taq聚合酶 0.5单位PCR的反应条件为:
分解双链的温度为:
95℃,1.5分钟
退火温度为:
64℃,1.0分钟
链延长反应的温度为:
70℃,1.0分钟
反应循环:30次
结果示于图6中。
当使用寡核苷酸(1)和(4)作为引物时,检测到一个被假定表现393bp序列的带,表明存在缺失E2A基因的Adexd123CANLacZ。如图6中第1泳道所示。
当使用寡核苷酸(2)和(3)作为引物时,检测到一个被假定表现221bp序列的带,说明被Cre基因产物切掉的环状E2A基因的存在。如图6中第2泳道所示。
以上1和2的结果揭示出:形成了Adexd123CANLacZ,其中,位于loxP序列之间的E2A基因区已被从Adex2L3LCANLacZ切除。参考实施例1携带重组酶Cre基因和CAG启动子的重组腺病毒载体的构建(1)表达重组酶Cre基因的盒式粘粒的构建
用包含重组酶Cre基因的大肠杆菌噬菌体P1(ATCC 11303-B23)DNA作为模板。以下寡核苷酸(SEQ ID NO:9)作为5'-引物、以下寡核苷酸(SEQ ID NO:10)作为3'-引物、和VentR(由NEB制造)作为热稳定聚合酶进行PCR反应。该PCR反应在以下给出的条件下进行。该产物进行琼脂糖凝胶上的电泳,从琼脂糖凝胶上切下一个指示约1kb的带,以获得约1kb的携带重组酶Cre基因的DNA片段。5'-引物5’-CGT
CTGCAG TGCA
TCATGA GTAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGC-3’3'-引物3’-GACCTTCTACCGCTAATCGGTAAT
TCGCGAGATCT CGG-5’
下面划线的部分表示限制酶的识别位点。PCR条件缓冲液:10mM KCl、20mM Tris-HCl(PH8.8)、
10mM(NH4)2SO4、
2mM MgSO4、0.1%曲通x-100(使用NEB提供的缓冲液)聚合酶:2单位dNTP:400μM引物:1μMP1噬菌体DNA:1ng分解双链的温度为:95℃,1.5分钟退火温度为:60℃,1.5分钟链延长反应的温度为:74℃,2.0分钟反应循环:20次
在用限制酶PstI(Takara Shuzo Co.,Ltd.,)和XbaI(TakaraShuzo Co.,Ltd.)消化如此获得的各种DNA片段和pUC19(Takara Shuzo Co.,Ltd.,Japan)后,回收消化产物。将来源于DNA片段的产物与来源于pUC19的产物以约3∶1的摩尔比混合。然后用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo Co.,Ltd.)连接该混合物。用该反应混合物转化大肠杆菌JM109菌株(ATCC 53323)。将处理过的大肠杆菌细胞接种到补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上,选择生长在琼脂上的转化体,获得携带有重组酶Cre基因的质粒pUCCre。
接着,用SwaI消化包含CAG启动子的盒式粘粒pAdex1CAwt。然后将1μg该消化产物与0.1μg约1kb DNA片段混合,所述DNA片段是由用PstI和XbaI消化质粒pUCCre并用克列诺酶(Takara ShuzoCo.,Ltd.)使成平端获得的。
②将乙醇加入到以上获得的混合物中以沉淀粘粒。经离心回收该沉淀,并溶解在稀释5倍的TE溶液(10mM Tris-HCl(PH7.5),补充1mM EDTA)中。
③将所形成的含有粘粒的溶液用ATP和T4 DNA连接酶在缓冲溶液中(终体积为1μl)进行连接反应过夜。将无菌水和用于SwaI反应的缓冲溶液加入其中,使总体积达48μl,然后在70℃下加热10分钟使连接酶灭活。
与质粒不同,粘粒通常可以高效地包装大分子DNA,所述DNA是由相互以线性串联形式而不是环状形式连接形成的。
④在加入2μl SwaI(Boehringer)后,在25℃下进行粘粒的消化反应1小时。下文中给出了用SwaI消化粘粒的理由。
如果盒式粘粒在其中未包含一个表达单位的情况下再连接,就会再生SwaI识别位点。这样,用SwaI消化能再切割其中未包含表达单位的粘粒,导致不形成集落。这是一种选择仅一种其中具有插入序列的盒式粘粒的可能的方法。
⑤按照Molecular Cloning,vol.3,E.34中所述的常规方法将盒式粘粒进行苯酚抽提、离心和凝胶过滤。
⑥再次用SwaI进行消化,即将5μg SwaI加入到用于SwaI反应的缓冲液中,在25℃下消化该粘粒2小时。由于以上解释的原因进行上述消化。
⑦将所形成的粘粒(1μl)进行体外包装。
即,以1/4的量使用一种入体外包装试剂盒-Gigapack XL(Stratagene Co.,Ltd.,USA),将剩下的溶液在-80℃下冷干。因为Gigapack XL对42Kb或更小的粘粒给出低的包装效率,所以该试剂盒能在某种程度上选择由于包含插入序列而变得更大的粘粒。在这一实验中,当收集10个集落时,它们中大多数包含插入序列。因此,能够容易地获得具有预期的取向(即,指从E3基因区到E1基因区的朝左侧的取向)的克隆
按照Izumu Saito et al.,JIKKEN IGAKU(ExperimentalMedicine),vol.7,183-187,1989中描述的常规方法操作粘粒。
⑧将所述包装过的粘粒转染进大肠杆菌DH1(ATCC 33849)。
即,将粘粒以1/200、1/20、1/2和剩余部分的量分别接种到三块Ap+琼脂板(补加了氨苄青霉素)的每一块上So 5ml AP+LB(池)中,接着温育过夜。
从池中抽提并制备小量制备出的DNA。按全酶消化方法检测具有插入序列的粘粒的比率。挑取连带琼脂板的集落,在1.5ml Ap+LB中培养一夜,以制备小量的DNA。
⑨用限制酶消化证实包含在粘粒中的表达单位的取向和结构。
用NruI和连接酶制备携带表达单位但缺失大多数腺病毒DNA的质粒。然后为最终证实cDNA克隆,从该质粒制备一种DNA片段。(2)腺病毒DNA-蛋白复合物(Ad5 dlX DNA-TPC)的制备
①使用载体Ad5 d1X(I.Saito et al.,
J.Virology,vol.54,711-719(1985))作为腺病毒DNA。将载体Ad5 d1X DNA转染进HeLa细胞(以10Roux管的量),接着培养。
即,以0.2ml/Roux管的量转染Ad5-d1X的病毒溶液(~109PFU/ml)。3天后将细胞去膜并离心(1500rpm,5分钟)收集。大多数腺病毒粒子不存在于培养基中而存在于细胞核中,因此,该病毒易于从感染细胞纯化。
在无菌状态下进行下列过程。
②将如此获得的细胞悬浮在20ml 10mM Tris-HCl(PH8.0)中,用封闭型超声波发生器在200W下超声处理2分钟(30秒×4),以杀灭细胞从而释放出病毒。
为了从细胞释放病毒,当细胞悬液体积为5ml或更小时,重复冷冻-融化5次便足够了。然而,当具有大的体积时,超声波发生器对释放病毒是有利的。在这种情况下,必须使用具有专用杯的密封型超声波发生器。即使操作在安全橱中进行,普通增添型(throw-intype)也是危险的。
③在经离心(10k rpm,10分钟)除去由此获得的细胞碎片后,将上清液覆盖于装在超速离心机(SW28管)中的15ml氯化铯溶液(比重1.43)上。接着经离心(25k rpm,1小时,4℃)进行浓缩。
④将界面下紧靠界面的病毒层转移到SW50.1管中。一般来说,界面下紧靠界面的病毒层是肉眼可见的。收集5ml病毒层。同时另一支管装满氯化铯溶液(比重为1.34)。
将这些管于35k rpm、4℃下离心过夜,收集如此形成的表明病毒存在的白色层,并转移到事先形成梯度的管中。将该管进一步在35krpm,4℃下超离心4小时。
⑤收集表明病毒存在的白色层,并以相同的量与8M盐酸胍混合。此外,将4M盐酸胍饱和的氯化铯加入到混合物中。所形成的混合物装入到VTi65管中。用4M盐酸胍使颗粒蛋白变性以引起分解,从而释放出DNA-TPC复合物。在这一实验中也可以使用溴化乙锭,但还没有建立除去使用的溴化乙锭的任何方法。
⑥将以上所述的管在55k rpm于15℃下超离心一夜,接着用0.2ml分级。从每一级份中取出1μl,与1μg/ml溴化乙锭水溶液混合,用荧光染色证实DNA存在或不存在。收集含有DNA的两或三个级份。
⑦所述级份对500ml TE透析过夜两次,然后在-80℃下贮存。以测定DNA的常规方法据OD260值测定如此获得的Ad5dlX DNA-TPC复合物的量。
⑨用足量的EcoT22I消化所形成的Ad5dlX DNA-TPC复合物2小时,然后在-80℃下贮存。
同时,可将该DNA-TPC复合物进行使用限制酶的消化、透析和凝胶过滤,但不进行电泳、苯酚处理和乙醇沉淀。氯化铯平衡离心仅可作为一种浓缩方法使用。因此,在尽可能在高的浓度下保持DNA-TPC复合物。从10Roux管的感染细胞可获得约300μg的DNA-TPC复合物。
⑨收集DNA-TPC复合物溶液,向其中加入10μl用于电泳的BPB缓冲液。然后向混合物中加入1μl蛋白酶K(10mg/ml)。将所形成的混合物在37℃下温育10分钟以消化DNA-TPC复合物的末端蛋白质。在苯酚处理后,经琼脂糖上的电泳分离上清液,以证实消化完成。
在经离心凝胶过滤除去EcoT221-消化的DNA-TPC中的限制酶缓冲液后,将所形成的产物分别装入管中,并在-80℃下贮存。(3)重组病毒的分离和高滴度病毒溶液的制备
①向直径为6cm和10cm的每培养皿中装入在加有10%FCS的DME中培养过的293细胞。
②在将8μg(3μg到9μg是适宜的)pAdex1W DNA(具有导入其中的表达单位)与1μg事先用EcoT22I消化过的Ad5d1X DNA-TPC复合物混合后,用Celfect试剂盒(Pharmacia)按磷酸钙方法在6cm培养皿中进行转染。即,将混合物滴加到6cm培养皿中的培养基上,并继续培养。
在培养一夜(约16小时)后,第二天早晨交换培养基。然后在当天晚上,将含有细胞的培养基与含5%FCS的DME一起倒入到三个96-孔胶原涂覆板(未稀释的贮存液、10倍稀释液和100倍稀释液)的孔中。为了避免各板之间细胞计数上的明显差异,将从10cm培养皿收获得的293细胞的1/3加到两块稀释液板的每块上。
③3或4天和8或10天后,再向每孔中加入50μl含10%FCS的DME。当293细胞系变薄时,应将含10%FCS的DME更早地加入到孔中。
在7-15天可观察到孔中病毒已增殖且细胞死亡。用无菌的巴氏吸管将含有死细胞的培养基从细胞完全死亡的每孔中转移到1.5ml无菌管中。将该管迅速在-80℃下冷冻干燥并贮存。
④在15到18天结束观察。从装有培养基的管中挑选出约10支管,所述培养基含有相对较晚的阶段死亡的细胞。在重复6次冷冻-融化后,在5k rpm下离心10分钟。在-80℃下贮存所形成的上清液,用作第一种子。
在较早的阶段病毒已开始增殖的孔预示由多种病毒株混合感染的较高的可能性。
⑤将293细胞系装入24-孔板中,并将5%FCS-DME(0.4ml/孔)和10μl第一病毒种子加入到孔中。设置二个重复。
⑥在约3天细胞完全死亡时,用类似于上述制备第一病毒种子的方法经重复六次冷冻-融化和离心处理从重复试验孔之一获得上清液。将如此获得的上清液在-80℃下贮存,用作第二种子。第二病毒溶液的滴度为约107到108PFU/ml。将重复试验孔另一孔中的死亡细胞在5000rpm下离心5分钟,弃去上清液。将单独的细胞在-80℃下贮存(细胞团)。收集10种病毒株的所述细胞团,按以下方法从感染细胞抽提全DNA。向每一细胞团中加入400μl细胞DNA TNE(50mM Tris-HCl,PH7.5,100mM NaCl、10mM EDTA)、4μl蛋白酶K(10mg/ml)和4μl 10%SDS。
⑦在50℃下处理1小时后,用苯酚-氯仿抽提两次,并用氯仿抽提两次,然后用乙醇沉淀。将用乙醇沉淀重新获得的核酸溶解在含有20μg/ml核糖核酸酶的50μl TE中。
在用能识别含GC的位点的XhoI将15μl溶液消化后,将消化产物与表达粘粒盒的XhoI表达产物在琼脂糖凝胶(有约15cm长)上电泳一夜。比较由此获得的电泳带型。选择显示表示从表达单位中切割位点到腺病毒基因组左端的精确DNA序列的克隆。弃去给出表示未确定DNA序列的许多带的克隆,因为有可能克隆被有缺失的病毒沾污。
腺病毒一般以10,000拷贝/细胞水平上增殖。因此,可以抽提包含天然细胞DNA和腺病毒DNA的整DNA,并用限制酶消化,然后进行电泳,由此,观察表示得自腺病毒DNA片段的带。对含CG的位点特异性的限制酶(例如XhoI)几乎不消化细胞DNA。结果是,当上样进行电泳时,其模式是易于观察和辨认的。当使用其它酶时,需要以非感染293细胞系DNA为对照。在这种情况下,有得自人细胞的重复序列的一个带。
⑧将由XhoI消化证实的第二种子溶液以0.1ml的量转染进293细胞系,所述细胞系装在盛有25ml培养基的150cm2的胶原涂覆瓶中。
当三天内细胞死亡时,用密封型超声波发生器以200W的最大输出功率无菌处理含死亡细胞的培养基2分钟(30秒×4),以释放病毒。
经在3k rpm于4℃离心10分钟除去沉淀,并将获得的上清液以2ml的量装入13支5ml冷冻管的每支中。用干冰迅速冷冻各管,并在-80℃下贮存,以制备第三种子溶液。包含本发明的重组腺病毒载体的第三种子溶液表现出高达109PFU/ml的滴度。
在将5μl第三种子溶液转移到24孔板上的包含293细胞系的一个孔中后,用限制酶消化增殖的病毒DNA,然后进行电泳。用以上描述的方法证实所形成的带型。当对所述病毒混有缺失病毒或亲代病毒有任何怀疑时,就弃去所有的第三种子。这是因为缺失病毒(已存在于第二病毒溶液中)有以高得可感觉到的水平迅速增殖的可能性。因此,用另一个第二种子溶液再次进行上述步骤。另一种可选择方法,经按照有限稀释的方法处理第一种子溶液而纯化所述病毒溶液。
本发明提供了重组DNA病毒,使用该病毒,可将一种外源基因以稳定的形式转导进各种动物细胞中。本发明也提供了一种产生重组DNA病毒的简单方法。特别是,本发明的重组腺病毒对治疗遗传病是有效的。
日本专利申请7-84891号和7-276335号全部公开的内容在此一并作为参考。
序列表SEQ ID NO:1
长度:34个碱基对
类型:核酸
链型:双链
拓扑结构:线性
分子类型:基因组DNA
假设:否
反义:否
原始来源:大肠杆菌噬菌体P1 DNA
特征
识别方法:S
序列描述:SEQ ID NO:1
ATAACTTCGT ATAGCATACA TTATACGAAG TTATSEQ ID NO:2
长度:27个碱基对
类型:核酸
链型:双链
拓扑结构:线性
分子类型:其它核酸(可以是合成DNA)
假设:是
反义:否
特征
识别方法:S
序列描述:SEQ ID NO:2
CGATTTAAAT CGATTGTCGA CTCGCGASEQ ID NO:3
长度:36个碱基对
类型:核酸
链型:双链
拓扑结构:线性
分子类型:其它核酸(可以是合成DNA)
假设:是
反义:否
特征
识别方法:S
序列描述:SEQ ID NO:3
ATCGATTCTA GACTAGTTTA ATTAATTTAA ATCGATSEQ ID NO:4
长度:52个碱基对
类型:核酸
链型:双链
拓扑结构:线性
分子类型:其它核酸(可以是含有部分基因组DNA的DNA)
假设:是
反义:否
原始来源:大肠杆菌噬菌体P1 DNA
特征
识别方法:S
序列描述:SEQ ID NO:4CGAACGCGTA TAACTTCGTA TAGCATACAT TATACGAAGT TATCTCGAGTCGSEQ ID NO:5
长度:30个碱基对
类型:核酸
链型:单链
拓扑结构:线性
分子类型:其它核酸(可以是包含部分基因组DNA的DNA)
假设:是
反义:否
特征
识别方法:S
序列描述:SEQ ID NO:5
CAACTCCATG CTCAACAGTC CCCAGGTACASEQ ID NO:6
长度:26个碱基对
类型:核酸
链型:单链
拓扑结构:线性
分子类型:其它核酸(可以是含部分基因组DNA的DNA)
假设:是
反义:否
特征
识别方法:S
序列描述:SEQ ID NO:6
GATTTTTAAA CGGCGCAGAC GGCAAGSEQ ID NO:7
长度:21个碱基对
类型:核酸
链型:单链
拓扑结构:线性
分子类型:其它核酸(可以是包含部分基因组DNA的DNA)
假设:是
反义:否
特征
识别方法:S
序列描述:SEQ ID NO:7
GTGAGCTTAG AAAACCCTTA GSEQ ID NO:8
长度:31个碱基对
类型:核酸
链型:单链
拓扑结构:线性
分子类型:其它核酸(可以是包含部分基因组DNA的DNA)
假设:是
反义:否
特征
识别方法:S
序列描述:SEQ ID NO:8
AGATACCCCT TTTGCACTGG TGCAAGTTAA CSEQ ID NO:9
长度:53个碱基对
类型:核酸
链型:单链
拓扑结构:线性
分子类型:其它核酸(可以是包含部分基因组DNA的DNA)
假设:是
反义:否
原始来源:大肠杆菌噬菌体P1 DNA
特征
识别方法:S
序列描述:SEQ ID NO:9
CGTCTGCAGT GCATCATGAG TAATTTACTG ACCGTACACC AAAATTTGCC
TGCSEQ ID NO:10
长度:38个碱基对
类型:核酸
链型:单链
拓扑结构:线性
分子类型:其它核酸(可以是包含部分基因组DNA的DNA)
假设:是
反义:否
原始来源:大肠杆菌噬菌体P1 DNA
特征
识别方法:S
序列描述:SEQ ID NO:10
GGCTCTAGAG CGCTTAATGG CTAATCGCCA TCTTCCAGSEQ ID NO:11
长度:119个碱基对
类型:核酸
链型:双链
拓扑结构:线性
分子类型:其它核酸(可以是包含部分基因组DNA的DNA)
假设:是
反义:否
原始来源:大肠杆菌噬菌体P1 DNA
特征
识别方法:S
序列描述:SEQ ID NO:11
CATGTAATTT AAATCTCGAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATACGCGT
ATTTAAATGT AAAAATAATG TACTAGAGAC ACTTTCAATA AAGGCAAATG CTTTTATTTSEQ ID NO:12
长度:115个碱基对
类型:核酸
链型:双链
拓扑结构:线性
分子类型:其它核酸(可以是包含部分基因组DNA的DNA)
假设:是
反义:否
原始来源:大肠杆菌噬菌体P1 DNA
特征
识别方法:S
序列描述:SEQ ID NO:12
GTACACTCTC GGGTGATTAT TTACCCCCAC CCTTGCCGTC TGCGCCGATT TAAATCTCGA
GATAACTTCG TATAATGTAT GCTATACGAA GTTATACGCG TATTTAAATC CGTTT
Claims (36)
1.一种用于转染动物细胞的重组DNA病毒,该病毒携带有外源基因的调节所述外源基因表达的启动子,其中E2A基因的功能被全部缺失。
2.按照权利要求1的重组DNA病毒,其中所说的DNA病毒是腺病毒。
3.按照权利要求1或2的重组DNA病毒,其中E2A基因区的部分或全部被缺失。
4.按照权利要求1-3的任一重组DNA病毒,其中所说的外源基因和所说的调节所述外源基因表达的启动子以朝左侧的方向被插入。
5.按照权利要求2-4的任一重组DNA病毒,其中所述腺病毒基因组已被缺失包含E1A基因区在内的1.3到9.3%的区段。
6.按照权利要求5的重组DNA病毒,其中所说的外源基因和所说的调节所述外源基因表达的启动子被插入在所述的区段已被缺失的位点。
7.按照权利要求6的重组DNA病毒,其中所说的腺病毒基因组已被进一步缺失包含E3基因区在内的79.6到84.8%的区段。
8.按照权利要求1-7的任一重组DNA病毒,其中所说的调节外源基因表达的启动子是包含巨细胞病毒增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、兔β-珠蛋白剪接受体和聚(A)序列的杂交启动子(CAG启动子)。
9.一种用于转染动物细胞的重组DNA病毒,该病毒以相同的方向携带位于E2A基因区两侧的两个重组酶识别序列。
10.按照权利要求9的重组DNA病毒,其中所说的DNA病毒是一种腺病毒。
11.按照权利要求9和10的重组DNA病毒,其中所说的两个重组酶识别序列之一位于E2A基因的和L3基因的终止密码子之间,而不缺失两种基因聚(A)附加信号的功能。
12.按照权利要求11的重组DNA病毒,其中两个重组酶识别序列的另一个位于腺病毒基因组的从79.6到84.4%的读框内。
13.按照权利要求9-12的任一重组DNA病毒,其中所说的重组酶是得自大肠杆菌P1噬菌体的重组酶Cre。
14.按照权利要求9-13的任一重组DNA病毒,其中所说的重组酶序列的每一种是作为重组酶Cre底物的loxP的DNA序列(SEQ ID NO:1)。
15.按照权利要求9-14的任一重组DNA病毒,该病毒携带外源基因。
16.按照权利要求15的重组DNA病毒,该病毒携带调节所述外源基因表达的启动子。
17.按照权利要求16的重组DNA病毒,其中所说的外源基因和所说的调节所述外源基因表达的启动子以朝左侧的方向被插入。
18.按照权利要求10-17的任一重组DNA病毒,其中所说的腺病毒基因组已被缺失包含E1A基因区在内的1.3到9.3%的区段。
19.按照权利要求18的重组DNA病毒,其中所说的外源基因和所说的调节所述外源基因表达的启动子被插入在所述的区段已被缺失的位点。
20.按照权利要求19的重组DNA病毒,其中所说的腺病毒基因组已被进一步缺失包含E3基因区在内的79.6到84.8%的区段。
21.按照权利要求16-20的任一重组DNA序列,其中所说的调节外源基因表达的启动子是包含巨细胞病毒增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、兔β-珠蛋白剪接受体和聚(A)序列的杂交启动子(CAG启动子)。
22.一种构建完全缺失E2A基因功能的重组DNA病毒的方法,该方法包括以下步骤:
将一种载体(a)和一种重组DNA柄毒(b)转导到动物细胞系中,所说的载体(a)是有插入其中的启动子、重组酶基因和聚(A)序列,所说的重组DNA病毒(b)携带位于E2A基因区两侧相同方向的重组酶识别序列,和
切掉位于两个重组酶识别序列之间的E2A基因区。
23.按照权利要求22的构建重组DNA病毒的方法,其中所说的重组DNA病毒(b)是一种腺病毒。
24.按照权利要求23的构建重组DNA病毒的方法,其中所说的载体(a)是一种腺病毒。
25.按照权利要求22-24的任一构建重组DNA病毒的方法,其中所说的两个重组酶识别序列之一位于E2A基因的和L3基因的终止密码子之间,而不缺失两种基因聚(A)附加信号的功能。
26.按照权利要求22-25的任一构建重组DNA病毒的方法,其中所说的重组酶是得自大肠杆菌P1噬菌体的重组酶Cre。
27.按照权利要求22-26的任一构建重组DNA病毒的方法,其中所说的重组酶识别序列的每一种是作为重组酶Cre底物的loxPDNA序列(SEQ ID NO:1)。
28.按照权利要求22-27的任一构建重组DNA病毒的方法,其中所说的重组DNA病毒(b)携带外源基因。
29.按照权利要求28的构建重组DNA病毒的方法,其中所说的重组DNA病毒(b)还携带调节所述外源基因表达的启动子。
30.按照权利要求29的构建重组DNA病毒的方法,其中所说的外源基因和所说的调节所述外源基因表达的启动子以朝左侧方向被插入。
31.按照权利要求24-30的构建重组DNA病毒的方法,其中所说的载体(a)和重组DNA病毒(b)的腺病毒基因组已被缺失包含E1A基因区在内的1.3到9.3%的区段。
32.按照权利要求31的构建重组DNA病毒的方法,其中所说的外源基因和所说的调节重组DNA病毒(b)的外源基因表达的启动子在所述的区段已被缺失的位点被插入。
33.按照权利要求32的构建重组DNA病毒的方法,其中所说的重组DNA病毒(b)的腺病毒基因组已被进一步缺失包含E3基因区在内的79.6到84.8%的区段。
34.按照权利要求29-33的任一构建重组DNA病毒的方法,其中所说的调节外源基因表达的启动子是包含细胞病毒增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、兔β-珠蛋白剪接受体和聚(A)序列的杂交启动子(CAG启动子)。
35.按照权利要求22的构建重组DNA病毒的方法,其中E1A基因在载体(a)和重组DNA病毒(b)两者中的功能已被缺失,其中动物细胞系是表达E1A基因的动物细胞系。
36.一种用于转染动物细胞的重组DNA病毒,该病毒携带有插入E2A基因的和L3基因终止密码子之间的外源基因。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |