JP2002528056A - ＩＶａ２、１００Ｋ及び／又は末端前タンパク質配列における欠失型アデノウイルス - Google Patents

ＩＶａ２、１００Ｋ及び／又は末端前タンパク質配列における欠失型アデノウイルス

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Abstract

(57)【要約】 本発明は欠失型アデノウイルスベクターを提供する。この発明力のあるアデノウイルスベクターは、ＩＶａ２、１００Ｋ、ポリメラーゼ及び／又はアデノウイルスゲノムの末端前タンパク質配列を保有する。アデノウイルスは付加的に他の欠失、突然変異又は他の一時変異も含有する。特に好ましい実施例において、アデノウイルスベクターは複数に欠失され、すなわちその中に２つ又はそれ以上の欠失を保有する。本発明の欠失型アデノウイルスは、ウイルスが相補機能の非存在下に新しいウイルス粒子を複製及び生成できないという点で「増殖欠陥性」である。本発明の好ましいアデノウイルスベクターは、代謝障害と関連したタンパク質又はペプチド、さらに好ましくは、リソソーム酸アルファ−グルコシダーゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を保有する。さらに、発明力のある欠失型アデノウイルスベクターを製造するための方法が提供される。さらにまた、欠失型アデノウイルスベクターをインビボ又はインビトロで細胞に投与する方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願情報） 本出願は、１９９８年８月２８日に出願され、その全体が本明細書中において
援用される予備出願第６０／１４５，７４２号の利点を請求するものである。
【０００２】 （連邦支援） 本発明の政府支援は、国立衛生研究所からの承認第ＤＫ５２９２５−０２号に
より提供された。政府は本発明に対する一定の権利を有する。
【０００３】 （技術分野） 本発明は、アデノウイルスベクターに関し、さらに詳しくは、増殖型欠陥アデ
ノウイルスベクターに関する。
【０００４】 （背景技術） 遺伝子治療の基本は、それぞれの遺伝子活性が喪失又は欠損している組織に機
能的遺伝子を送達することである。遺伝子治療を達成する方法の中で、所望の導
入遺伝子を輸送するように遺伝子改変されている組換えウイルスベクターが用い
られている。これらのウイルスに基礎づけられたベクターは、標的組織を感染さ
せる自然能など、有利な特性を有する。しかし、現存のウイルスベクターの実行
は、いくつかの制限によって妨げられてもいる。
【０００５】 例えば、レトロウイルスに基礎づけられたベクターは、遺伝子導入の発現（常
在性の発癌遺伝子を活性化する潜在能により）を可能にする標的組織のゲノム内
に組み込む必要があるが、かかる系において生じるベクターの力価は一部の他の
系におけるよりも有意に小さい。対象ゲノム内に組み込むための必要性により、
レトロウイルスベクターは活発に分裂する組織を形質導入するためにのみ用いる
ことができる。さらに、多くのレトロウイルスは宿主組織の特異性を制限してし
まい、対象のわずかな特異的組織よりも多くを形質導入するために使用すること
ができない。
【０００６】 アデノウイルスベクターは遺伝子治療に大きな見込みを持つ。アデノウイルス
ベクターは、肝、腎、筋（骨格及び心臓）、呼吸器、及び神経系組織において認
められるものなど非分裂、分化細胞を含む、インビボの複数の種類の組織を形質
導入することができる。例えば、Askariら、Gene Ther. 3:381-388（1996）；Ba
rrら、Gene Ther. 1:51-58（1994）；Engelhardtら、Hum. Gene Ther. 4:759-76
9（1993）を参照。トランス相補パッケージング細胞系を用いることにより、第
一世代アデノウイルスベクターを増殖させ、高力価（＞１０１３）に濃縮させる
ことができ、これによりインビボ投与後に多数の標的細胞を形質導入できるよう
になる。Ragotら、Nature 361:647-50（1993）。
【０００７】 第一世代のアデノウイルスベクターは比較的大きな輸送能力（すなわち、約８
．０ｋｂまで）も有する。ベクターゲノム内に組み込むための必要なしに免疫無
能及び場合により免疫適格性動物における長時間にわたりエピソームにより形質
導入される遺伝子の発現を可能する第一世代のアデノウイルスベクター（Vincen
tら、Nat genet: 5: 130-34（1993）；Tripathyら、Nature Medicine 2:545-50
（1996））は、静止状態の細胞及び活発に分裂する細胞を有糸分裂により形質導
入することができる。最後に、生きたアデノウイルス製剤が、軍の新兵のワクチ
ン接種に用いられており、Ａｄ菌株２及び５（ベクター開発用に最も一般的に用
いられている）は重篤な疾患と関連していない。
【０００８】 上述した利点にもかかわらず、第一世代、Ｅ１欠失型アデノウイルスのウイル
スベクターは、いくつかの理由のため有力な治療的使用において限界がある。第
一に、Ｅ１欠失の大きさ及び物理的なウイルスパッケージングの束縛により、第
一世代のアデノウイルスベクターは導入遺伝子の遺伝子物質の約８．０ｋｂを保
持する限界がある。これは他のウイルスベクター系に有利に匹敵するが、大きな
導入遺伝子が必要とされる場合のベクターの有用性を制限する。第二に、パッケ
ージング細胞系統へのＥ１欠失第一世代ベクターの感染により若干の複製適格性
アデノウイルス粒子が発生するが、これはパッケージング細胞系統に常在するＥ
１配列とアデノウイルスベクターゲノムとの間の単一の組換え事象のみが野生型
ウイルスを発生できるためである。したがって、第一世代のアデノウイルスベク
ターは、有意な量の複製適格性野生型ウイルス粒子とアデノウイルスベクター系
統との組み合わせの有意な脅威を示し、これは遺伝子治療対象に投与した場合に
毒性の副作用となる。
【０００９】 アデノウイルスベクターの最も困難な問題は、免疫適格性動物におけるウイル
ス形質導入細胞を削減する宿主（hose）免疫応答に対して二次的である長期の導
入遺伝子発現を持続する能力がないことである。Gilgenkrantzら、Hum. Gene Th
er. 6: 1265-1274（1995）；Yangら、J. Virol. 69: 2004-2015（1995）；Yang
ら、proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4407-4411（1994）；Yangら、J. Immunol
. 155: 2565-2570（1995）。免疫応答は導入遺伝子タンパク質生成物に対して明
らかにされている（Tripathyら、Nat. Med. 2: 545-550（1996））、アデノウイ
ルスベクターエピトープが宿主免疫応答を引き起こす主要な因子であることも明
らかにされている。Gilgenkrantzら、Hum. Gene Ther. 6: 1265-1274（1995）；
Yangら、J. Virol. 70: 7209-7212（1996）。細菌性β−ガラクトシダーゼ遺伝
子などの導入遺伝子は、他の送達系（例えば、直接ＤＮＡ注射又はアデノ関連性
ウイルス投与）とは対照的に、アデノウイルスベクターにより形質導入すると免
疫原性が高く、その場合に免疫原性導入遺伝子に対する免疫応答が欠如し、導入
遺伝子発現が持続することも繰り返し明らかにされている。Wolffら、Hum. Mol.
Genet. 1: 363-369（1992）；Xiaoら、J. Virol. 70: 8098-8108（1996）。
【００１０】 また、Ｅ１−ベクターは、アデノウイルス早期遺伝子を発現し、ゲノム複製を
受け、インビボで利用するとＬ１−Ｌ５コード化された構造的遺伝子を発現する
ことも報告されている。例えば、Yangら、Immunity 1: 433-442（1994）。Ｅ１
欠失から完全に複製適格性ウイルスを生成するには単一の組換え事象のみが必要
であるため、免疫応答の悪化は一部の場合にベクター製剤における野生型アデノ
ウイルスの混入的存在によるものとみられる。例えば、Rich、Hum. Gene. Ther.
4: 461-476（1993）。これらの減少のいずれか（又は両方）が形質導入細胞中
のウイルスタンパク質の生成及び存在をもたらし、おそらく他の遺伝子治療ベク
ター系よりも高い抗原プロフィールを生じることがある。これらのアデノウイル
スのウイルス遺伝子生成物の存在は、宿主免疫系によるアデノウイルスベクター
感染細胞の検出及び除去を促進することにより、第一世代のアデノウイルスベク
ターのよる感染細胞における導入遺伝子発現の短い持続時間に寄与する。
【００１１】 したがって、技術上、現存系の制限に対処するアデノウイルスベクター系の改
善が必要とされている。
【００１２】 （発明の開示） 本発明は、現存の「第一世代」アデノウイルスベクターに対して利点を提供す
る新規な欠失型アデノウイルスベクターを提供する。本発明の欠失型アデノウイ
ルスベクターは異種ヌクレオチド配列の保有能力増大を有利に有し、ウイルスタ
ンパク質発現の低いレベルを示し、わずかな宿主免疫応答を誘発し、及び／又は
標的細胞内に導入したときに安定性の増大及び導入遺伝子発現の延長を示しうる
。
【００１３】 この発明力のあるアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＩＶａ
２、１００Ｋ、ポリメラーゼ及び／又は末端前タンパク質配列における1つ又は
それ以上の欠失を保有する。アデノウイルスは付加的に他の欠失、突然変異又は
他の一時変異も含有する。特に好ましい実施例において、アデノウイルスベクタ
ーは複数に欠失され、すなわちその中に２つ又はそれ以上の欠失を保有する。さ
らに好ましくは、アデノウイルスゲノムの２つ又はそれ以上の領域（例えば、Ｅ
１，Ｅ３、ポリメラーゼ、１００Ｋ、ＩＶａ２、末端前タンパク質、等）におけ
る欠失がある。アデノウイルスゲノムにおける欠失の少なくとも１つは、ウイル
スが相補機能の非存在下に新しいウイルス粒子を複製及び生成できないという点
でアデノウイルスの「増殖欠陥性」を与え、好ましくは、ベクターは増殖欠陥性
表現型となる複数（２つ又はそれ以上）の欠失を保有する。アデノウイルスゲノ
ムからの欠失機能を供給するトランス相補細胞内に導入すると、本発明の欠失型
アデノウイルスは新しいウイルス粒子が発生する増殖性感染を生成することがで
きる。
【００１４】 本発明の別の態様は、パッケージング細胞を用いた高力価の発明力のある欠失
型アデノウイルスベクターを製造するための方法である。細菌の組換えを用いた
発明力のある欠失型ベクターを製造するための方法及び欠失型ヘルパーアデノウ
イルスを用いた「破壊型」アデノウイルスベクターを製造するための方法も開示
されている。本発明による破壊型アデノウイルス系統は、安定性の増大及び従来
の製剤と比較して混入ヘルパーウイルスからのウイルスタンパク質発現の減少を
示すとみられる。
【００１５】 この発明力のあるベクターは、例えば、対象のタンパク質／ペプチド又はＲＮ
Ａを生成するインビボの細胞に投与することができる。特に、本発明による組換
え欠失型アデノウイルスベクターはインビボの細胞に投与することができ、投与
するとその細胞が異種ヌクレオチド配列を発現する。具体的な実施例において、
ヌクレオチド配列は、代謝障害及び／又はリソソーム又はグリコーゲン貯蔵障害
と関連したタンパク質又はペプチド（例えば、酵素）をコード化する。発現タン
パク又はペプチドは、例えばタンパク質置換療法のために分離することができる
。
【００１６】 他の実施例において、本発明の組換えアデノウイルスベクターは生体外の細胞
に投与することができ、対象に投与された細胞は、例えば、対象において免疫原
性又は治療反応を生じる。さらに別の実施例において、発明力のある欠失型アデ
ノウイルスベクターは対象に直接投与される。特に、本研究ではＧＡＡ遺伝子を
保有する本発明の欠失型アデノウイルスベクターのＧＡＡ欠乏動物への静脈内投
与により、肝細胞の形質導入及びその後のＧＡＡ導入遺伝子の発現が高レベルと
なったことが明らかにされた。ＧＡＡの肝発現により、ＧＡＡタンパク質の血漿
レベルの上昇及び患部組織におけるグリコーゲンレベルの有意な減少が生じた。
【００１７】 本発明は本発明の組換え欠失型アデノウイルスベクターを臓器又は組織に投与
することにより、異種ヌクレオチド配列が発現され、コード化されたタンパク質
／ペプチド又はＲＮＡが異なる臓器又は組織に送達され、例えば治療効果の免疫
原性を生じる方法も開示している。例えば、外来タンパク質をコード化するヌク
レオチド配列が肝に送達すると、これが発現され、循環系内に分泌されるととも
に標的組織（例えば筋）に送達することができる。さらに別法として、発明力の
あるアデノウイルスベクターは、外来タンパク質又はヌクレオチド配列を中枢神
経系に送達するために脳内に（例えば直接注射により）導入することができる。
【００１８】 本発明の別の態様は、遠位組織又は臓器（例えば筋組織）に送達するために肝
においてタンパク質又はペプチドを発現させ、治療効果を得る方法である。好ま
しくは、本発明の欠失型アデノウイルスを使用し、タンパク質又はペプチドをコ
ード化するヌクレオチド配列を肝内に導入する。代謝障害、さらに好ましくは、
リソソーム又は糖原病（例えば、リソソーム酸α−グルコシダーゼ）と関連した
タンパク質又はペプチドをコード化するヌクレオチド配列も好ましい。リソソー
ムタンパク質又はペプチドをコード化するヌクレオチド配列がさらに好ましい。
【００１９】 本発明のこれらの態様及び他の態様は、以下の本発明の説明にさらに詳しく記
載されている。
【００２０】 （発明の詳細な説明） 現在利用可能なアデノウイルスベクター系の制限を克服するひとつの方法は、
アデノウイルスベクターの背骨の基本的な遺伝子領域に別の欠失を導入すること
である。別の欠失の付加によりベクターの導入遺伝子輸送力が増大するとみられ
、適切に選択した場合は、ウイルス系統の増殖適格性野生型ウイルス粒子との混
入を引き起こし、これらのウイルス製剤が治療目的に不適切となる組換え事象を
減少又は除去するとみられる。
【００２１】 「第二世代」の欠失型アデノウイルスベクターの使用もアデノウイルスベクタ
ーの別の重要な問題――宿主免疫応答及び／又はプロモーターのシャットダウン
により、免疫適格性動物への導入後の導入遺伝子の長期発現を持続し得ないとい
う問題に対処しうる（Yangら、（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4407
；Yangら、（1995）J. Virol. 69: 2004； Yangら、（1995）、J. Immunol. 155
: 2564；Gilgenkranzら、（1996）Human Gene Therapy 6: 1265；Brougら、（19
97）J. Virol. 71: 9206）。第一世代Ｅ１欠失型アデノウイルスベクターによる
形質導入後の宿主免疫応答は、導入遺伝子及びアデノウイルスベクターコード化
エピトープに対して作られることが明らかにされている（Tripathyら、（1996）
Nature Medicine 2: 545；Gilgenkranzら、（1995）Human Gene Therapy 6: 126
5；Yangら、（1996）J. Virol. 70: 7209）。第一世代アデノウイルスベクター
は宿主免疫応答の悪化を誘発するように思われる。例えば、細菌性β−ガラクト
シダーゼ遺伝子のアデノウイルスに仲介された導入は、β−ガラクトシダーゼに
対する免疫応答が著しく欠如していることが明らかにされている、直接ＤＮＡ注
射又はアデノ関連性ウイルス投与など他の送達系とは対照的に、免疫適格性動物
において免疫原性が高いことが明らかにされている（Xiaoら、（1996）J. Virol
. 70: 8098；Wolffら、（1996）Hum. Mol. Genet. 1: 363）。
【００２２】 本発明の欠失型アデノウイルスベクターは、第一世代Ｅ１欠失型ベクターと比
較して標的細胞内に感染すると、ウイルスＤＮＡ複製及び／又はウイルス遺伝子
生成物の産生を減少又は除去しうる。本発明の特定の推論に固執することは望ま
しくないが、ウイルス複製の減少は本発明の欠失型アデノウイルスベクターによ
る形質導入後の導入遺伝子発現を有利に延長すると思われる。ベクター系質導入
及び導入遺伝子発現語のウイルス特異的活性の減少は、宿主細胞に対する宿主免
疫応答及び毒性影響の減少ももたらすとみられる。これらは、引き続いて、導入
遺伝子発現の持続時間を延長させるとみられる。
【００２３】 本発明のベクターの使用は、ウイルスＤＮＡ複製及びウイルス遺伝子発現のさ
らに有効な遮断を提供することにより、形質導入細胞に対する宿主免疫応答も大
幅に減少させるとみられる。これにより、アデノウイルスに基礎づけられた臨床
的遺伝子治療プロトコールにおける非特異的（及び場合により毒性の）免疫抑制
剤を投与する必要がなくなるとみなれる。アデノウイルスに基礎づけられた遺伝
子治療に対する免疫応答は被験動物の背景系統、導入遺伝子の発現を推進するた
めに利用されるプロモーター／エンハンサー要素、及びウイルスの背骨自体によ
って変動するが、本発明のベクターにおいて認められる大幅な改善は、これらの
因子にかかわらず早期発生ベクターにわたる形質導入細胞の免疫性プロフィール
を減少させることにより大幅に性能を改善するとみられる。
【００２４】 さらに、第二次世代ベクターの使用により、現在の８ｋｂの限界から９ｋｂ、
１１ｋｂ、又は１２．５ｋｂ以上にアデノウイルスベクターの導入遺伝子輸送能
が増大しうる。この輸送能の増大は、大きなｃＤＮＡミニ遺伝子作成物（例えば
、ジストロフィン）の導入、大きな組織特異的プロモーター／エンハンサー要素
（例えば、筋クレアチンキナーゼエンハンサー）の利用、及びインビボのアデノ
ウイルス感染細胞の免疫認識を最小限に抑えうるアデノウイルス遺伝子のベクタ
ー内への再導入（例えば、Ｅ４遺伝子）を考えると有利である（Coxら、（1993
）Nature 364: 725; Iianら、（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2587;
Kumarsignら、（1996）Human Molecular Genetics 5: 913）。
【００２５】 さらに、複数の欠失の導入により、複数の組換え事象は複数の欠失型ウイルス
から生ウイルスを再生する必要があるため、複製適格性ウイルスによる生成ベク
ター系等の混入の可能性を減少しうる。
【００２６】 驚いたことに、本発明の欠失型アデノウイルスベクターは不安定ではない。こ
れは破壊型アデノウイルスベクターがゲノム安定性のために末端前タンパク質活
性に依存するという報告と対照をなす（Lieberら、（1996）J. Virol. 70: 8944
; Lieberら、（1997）Nature Biotech. 15: 1383）。
【００２７】 Ｉ． 欠失型アデノウイルスベクター。
【００２８】 本発明の一部は、アデノウイルスゲノムのアデノウイルスポリメラーゼ（ｐｏ
ｌ）、末端前タンパク質（ｐＴＰ）、１００Ｋ、及びＩＶａ２領域内に欠失を含
有する新規なアデノウイルスベクターの発見に基づく。これらの新規な「第二世
代」アデノウイルスベクターは、標的細胞内に（例えば遺伝子治療のため）形質
導入したときに「漏出性」ではなく、従来記載されているＥ１欠失型アデノウイ
ルスベクターよりも大きな異種ヌクレオチド配列を輸送することができるはずで
ある。また、本発明の欠失型アデノウイルスベクターは免疫原性が低く、それに
より技術上従来周知のＥ１欠失型ベクターよりも、免疫クリアランスに対して感
受性が低いとみられる。
【００２９】 本明細書中で用いられる「アデノウイルス」という用語は、Mastadenovirus属
及びAviadenovirus属を含む、全アデノウイルスを包囲するように意図されてい
る。今日まで、アデノウイルスの少なくとも４７種類のヒト血清型が同定されて
いる（例えば、FIELDSら、VIROLOGY、第２巻、第６７章（第３版、Lippincot-Ra
ven Publishersを参照）。アデノウイルスは血清グループＣのアデノウイルスで
あることが好ましいが、アデノウイルスは血清型２（Ａｄ２）又は血清型５（Ａ
ｄ５）であることがさらに好ましい。
【００３０】 好ましい一実施例において、本発明の発明力のあるアデノウイルスは感染性あ
るが、増殖欠陥性であり、すなわち、トランス相補性の非存在下、例えばアデノ
ウイルスゲノムから欠失した機能を発現するパッケージング細胞により新しいウ
イルス粒子を複製及びパッケージングすることができない。言い換えれば、本発
明の増殖欠陥性アデノウイルスは、トランス相補性の非存在下に生産的な感染を
生じることができない。増殖欠陥性アデノウイルス粒子は、１００Ｋ、ＩＶａ２
、及び／又は末端前タンパク質領域における１つ又はそれ以上の欠失を有するア
デノウイルスゲノムを保有する。アデノウイルスゲノムの欠失は、欠失領域から
指標タンパク質の機能的形態の発現を好んで阻止し、又は実質的に阻止する。例
えば、１００Ｋ欠失は、アデノウイルスゲノムの欠失１００Ｋ領域から機能的１
００Ｋタンパク質の発現を好んで阻止し、又は実質的に阻止する。ＩＶａ２欠失
は、アデノウイルスゲノムの欠失ＩＶａ２領域から機能的ＩＶａ２タンパク質の
発現を好んで阻止し、又は実質的に阻止する。末端前タンパク質は、アデノウイ
ルスゲノムの欠失末端前タンパク質領域から機能的末端前タンパク質の発現を好
んで阻止し、又は実質的に阻止する。
【００３１】 本明細書中で用いられる「感染性」により、アデノウイルスが自然な形質導入
機序で細胞に入り、導入遺伝子を発現できることが意味されている。選択的に、
「感染性」アデノウイルスは、他の機序により細胞に入り、導入遺伝子を発現で
きるアデノウイルスである。一実施例として、アデノウイルスキャプシドにおけ
る細胞表面受容体のためのリガンド又は結合タンパク質を発現し、又は以下に記
載するように、細胞表面上の分子に対して作られる抗体を用いた後に複合体のイ
ンターナリゼーションにより、ベクターは標的細胞に入ることができる。
【００３２】 別の好ましい実施例において、増殖血管性アデノウイルスはＥ１領域における
１つ又はそれ以上の欠失及びアデノウイルスゲノムのポリメラーゼ領域における
１つ又はそれ以上の欠失を含む。ポリメラーゼ欠失は、アデノウイルスゲノムの
欠失ポリメラーゼ領域から機能的ポリメラーゼタンパク質の発現を好んで阻止し
、又は実質的に阻止する。Ｅ１欠失は少なくとも１つのＥ１タンパク質の機能的
形態の発現を好んで阻止し、又は実質的に阻止する。
【００３３】 別の好ましい実施例において、本発明はアデノウイルスゲノムのポリメラーゼ
領域における１つ又はそれ以上の欠失を含む欠失型増殖欠陥性アデノウイルスを
提供する。欠失は、欠失領域から機能的ポリメラーゼタンパク質の発現を好んで
阻止し、又は実質的に阻止する。さらに好ましい実施例において、本発明は、欠
失領域の１つがポリメラーゼ領域にある、アデノウイルスゲノムの２つ又はそれ
以上の領域における２つ又はそれ以上の欠失を保有する欠失型増殖欠陥性アデノ
ウイルスを提供する。２つの欠失領域があり、第１の欠失領域がポリメラーゼ領
域のヌクレオチド７２７４乃至７８８１での単一の欠失である特別な実施例にお
いて、第２の欠失領域はＥ３領域を除いて本明細書中で記載されるように他の領
域である。さらに好ましい実施例において、アデノウイルスはポリメラーゼ領域
における１つ又はそれ以上の欠失及びＥ１領域における１つ又はそれ以上の欠失
を有し、アデノウイルスゲノムの他の領域における１つ又はそれ以上の欠失を任
意に有する。
【００３４】 さらに別の好ましい実施例において、本発明は、リソソーム酸α−グルコシダ
ーゼ（ＧＡＡ）、さらに好ましくはヒトＧＡＡ（ｈＧＡＡ）をコード化する１つ
又はそれ以上の異種ヌクレオチド配列を含有するアデノウイルスゲノム、及び１
００Ｋ、ＩＶａ２、ポリメラーゼ及び／又は末端前タンパク質の１つ又はそれ以
上における１つ又はそれ以上欠失を含む感染性の増殖欠陥性アデノウイルスを提
供する。欠失は、それぞれ欠失領域からの機能的１００Ｋ、ＩＶａ２、ポリメラ
ーゼ及び／又は末端前タンパク質の発現を好んで阻止し、又は実質的に阻止する
。
【００３５】 本明細書中で用いられる機能的タンパク質の「発現を阻止する」という用語は
、検出可能なタンパク質活性が検出可能ではないことを意味する。この欠陥は転
写、翻訳及び／又は翻訳後プロセスのレベルであるとみられる。このため、欠失
型遺伝子の転写及び翻訳が認められる場合でも、結果として生じるタンパク質に
は検出可能な生物活性が認められない。本明細書中で用いられる機能的アデノウ
イルスタンパク質の「発現を実質的に阻止する」という用語は、タンパク質に起
因しうる生物活性のわずかな量のみが検出可能であることを意味する。例えば、
機能的タンパク質活性を検出する一つの方法は、キャプシド形成されたアデノウ
イルスの生成をモニタリングすることによるものである。機能的アデノウイルス
タンパク質の「発現を実質的に阻止する」という欠失の存在下に、新しいアデノ
ウイルス粒子のわずかな量のみが相補性の非存在下に生じることになる。発明力
のある欠失型アデノウイルスによる新しいウイルス粒子のパッケージングは、相
補性機能の非存在下に、相補性機能の存在下の野生型アデノウイルス又は欠失型
アデノウイルスで検出されるレベルの約１０％、５％、２％、１％、０．０５％
、又は０．１％以下でさえある。
【００３６】 発明力のある欠失型アデノウイルスは、欠失を代償する相補性機能、例えば、
パッケージング細胞によるトランス相補性を提供することなく増殖すること（す
なわち、新しいウイルス粒子を複製及びパッケージングすること）ができない。
以下にさらに詳しく記載されるように、パッケージング細胞は、その中の欠失の
結果としてアデノウイルスゲノムから発現しえない機能的タンパク質を典型的に
発現し供給する。トランス相補性機能の存在下に、本発明の欠失アデノウイルス
ベクターは新しいウイルス粒子を複製しパッケージングすることができる。
【００３７】 本明細書中で用いられる「欠失型」という用語は、アデノウイルスゲノムの指
標領域からの少なくとも１つのヌクレオチドの脱落を指す。欠失は約１、２、３
、５、１０、２０、１００、２００、又は５００個のヌクレオチドよりも多いこ
ともある。アデノウイルスゲノム各種領域における欠失は指標領域の少なくとも
約１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％、又
はそれ以上であるうる。選択的に、アデノウイルスゲノムの全体の領域が欠失さ
れている。欠失は領域から機能的タンパク質の発現を阻止又は実質的に阻止する
ことが好ましい。例えば、１００Ｋ領域における欠失はその領域から機能的１０
０Ｋタンパク質の発現が失われることが好ましい。換言すれば、欠失１００Ｋ領
域上に転写及び結果として生じるＲＮＡ転写の翻訳が認められる場合でも、結果
として生じるタンパク質は実質的に非機能的となり、さらに好ましくは、完全に
非機能的となる。選択的に、わずかな量の機能的タンパク質が発現される。一般
に、これらは付加的な利点があり、対象の異種ヌクレオチド配列のための欠失型
アデノウイルスの輸送能が増大するため大きな欠失が好ましい。アデノウイルス
ゲノムの各種領域はマッピングされ、当業者により理解されている（FIELDSら、
VIROLOGY、第２巻、第６７章（第３版、Lippincot-Raven Publishersを参照）。
【００３８】 発明力のあるアデノウイルスにおける欠失は温度感受性欠失ではないことが好
ましい。換言すれば、欠失により影響される複製及びパッケージングの喪失は恒
常的な突然変異であり、温度感受性突然変異ではないことが好ましい。
【００３９】 本明細書中で用いられるように、「機能的」タンパク質は、そのタンパク質と
通常関連した少なくとも１つの生物活性を保持するタンパク質である。「機能的
」タンパク質は自然に発生するタンパク質により所有される活性のすべてを保持
することが好ましい。「非機能的」タンパク質は、タンパク質と通常関連した検
出可能な生物活性を示さないタンパク質である。「実質的に非機能的」タンパク
質は、わずかな量の生物活性のみを保持する、選択的に、機能的タンパク質のわ
ずかな量のみが生じるタンパク質である。
【００４０】 複数の欠失を含有するアデノウイルスベクターは、ベクターの輸送能を増大さ
せ、複製適格性ウイルスを発生させる組換えの可能性を減少させることが好まし
い。当業者であれば、アデノウイルスが複数の欠失を含有する場合に、それぞれ
の欠失が、単独で存在する場合は、上述したように増殖欠陥性アデノウイルスで
ある必要はないことが明白であろう。欠失のひとつがアデノウイルス増殖欠陥性
を与える限り、他の目的のために、例えば、異種ヌクレオチド配列のためのアデ
ノウイルスゲノムの輸送能を増大させるために追加の欠失を含めることができる
。欠失の1つ又はそれ以上が機能的タンパク質の発現を阻止し、アデノウイルス
増殖欠陥性を与えることが好ましい。欠失のすべてがアデノウイルス増殖欠陥性
を与えることが、さらに好ましい。
【００４１】 さらに、アデノウイルスゲノム内のコード化領域の重複が周知であるため、上
述した欠失により１つ以上の機能的アデノウイルスタンパク質が失われることが
当業者には明白であろう。同様に、欠失領域からのすべての機能的遺伝子発現が
切断される必要はなく、すでに示されている１００Ｋ、ＩＶａ２、ポリメラーゼ
及び／又は末端前タンパク質の機能的発現のみである。欠失は、他の本質的な機
能と干渉しないように選択されることが好ましく、例えば、ポリメラーゼ欠失は
主要な後期プロモーター配列又は三部分からなるリーダー配列と干渉しないよう
に選択され、末端前タンパク質欠失はＶＡ−ＲＮＡ配列と干渉しないように選択
されることが好ましい。
【００４２】 他の欠失が、本明細書中に記載された発明力のある欠失と併用できることが明
白であろう。例えば、第一世代アデノウイルスベクターは典型的に、Ｅ１タンパ
ク質を発現する細胞（例えば、２９３細胞）を用いてＥ１遺伝子が欠失され、パ
ッケージングされる。Ｅ３領域も頻繁に欠失されるが、この欠失の相補性の必要
がないためである。また、Ｅ４、Ｅ２ａ、タンパク質ＩＸ、及び線維タンパク質
領域における欠失が、例えば、Armentanoら、（1997）J. Virology 71:2408、Ga
oら（1996）J. Virology 70:8934、Dedieuら、（1997）J. Virology 71:4626、W
angら、（1997）Gene Therapy 4:393、Gregoryらに対する米国特許第５，８８２
，８７７号（その開示の全体が本明細書中で援用される）により記載されている
。欠失はパッケージング細胞に対する毒性を回避すように選択されることが好ま
しい。Wangら、（1997）Gene Therapy 4:393は、パッケージング株細胞によるＥ
４及びＥ１の恒常的な同時発現からの毒性を記載している。毒性は、恒常的であ
るよりも誘発性のプロモーターによるＥ１及び／又はＥ４の発現を調節すること
により回避できる。宿主細胞に対する毒性又は他の有害な作用を回避する欠失の
組み合わせが、当業者によりルーチン的に選択できる。当業者には、典型的に、
Ｅ３遺伝子を除いて、例えばパッケージング細胞によるトランス相補性により、
追加のウイルスを増殖（複製及びパッケージング）させるために追加の欠失が相
補される必要があることが明白であろう。
【００４３】 文献（Clemensら、（1996）Gene Ther. 3:965; Hardyら、（1997）J. Virol.
71:1842; Kochanekら、（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5731; Kumar-S
ingh、（1996）Mol. Gen. 5:913; Parksら、（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 93: 13565）に記載された他の破壊型アデノウイルスベクター系の一部とは異
なり、本発明のベクターは高力価の増殖のためにどの型のヘルパーウイルスも必
要としない。実際に、破壊型アデノウイルスベクター系統を生成するパッケージ
ング細胞における本発明の複数の欠失型アデノウイルスの使用により、前の系の
破壊型アデノウイルスベクター系統における複製適格性ウイルスの混入を生じる
組換え事象の可能性が減少する。これは、現存の破壊型アデノウイルス製剤の全
体的な有用性を制限しうる重要な問題である（Hardyら、（1997）J. Virol. 71:
1842）。さらに、以下に詳しく述べるように、ヘルパーウイルスとしての本発明
の欠失型アデノウイルスの使用により、安定な遺伝子形質導入のためのヘルパー
ウイルス混入の存在に依存する破壊型アデノウイルスベクターによる形質導入に
有効性が増大するとみられる（Lieberら、（1997）J Virol. 70:8944; Lieberら
、（1997）Nature Biotech. 15:1383）。
【００４４】 特に好ましい実施例において、欠失型アデノウイルスは末端前タンパク質及び
Ｅ１及び／又はＥ３領域における欠失を含む。末端前タンパク質及びポリメラー
ゼ領域及びＥ１及び／又はＥ３領域における欠失を含むアデノウイルスであるこ
とも好ましい。また、１００Ｋ及びＥ１及び／又はＥ３領域における欠失を保有
するアデノウイルスが好ましい。さらに、ポリメラーゼ及びＩＶａ２並びにＥ１
及び／又はＥ３領域における欠失を含有する欠失型アデノウイルスが好ましい。
さらに、ＩＶａ２、ポリメラーゼ、末端前タンパク質、及びＥ１及び／又はＥ３
領域における欠失を含有するアデノウイルス、及び１００Ｋ、ポリメラーゼ、末
端前タンパク質、及びＥ１及び／又はＥ３領域における欠失を保有するアデノウ
イルスが好ましい。さらに、ＩＶａ２、１００Ｋ、ポリメラーゼ、末端前タンパ
ク質、及びＥ１及び／又はＥ３領域における欠失を保有するアデノウイルスが好
ましく、なお、（Ｅ１及びＥ３領域がいずれも欠失されていることが）さらに好
ましい。
【００４５】 他の特に好ましい実施例において、ＩＶａ２領域における欠失はアデノウイル
ス血清型５ゲノムの約ヌクレオチド４８３０乃至５７６６の形態であり、１００
Ｋ領域における欠失はアデノウイルス血清型５ゲノムの約ヌクレオチド２４，９
９０乃至２５，６８７の形態であり、末端前タンパク質領域における欠失はアデ
ノウイルス血清型５ゲノムの約ヌクレオチド９１９８乃至９６３０の形態であり
、ポリメラーゼ領域における欠失はアデノウイルス血清型５ゲノムの約７２７４
乃至７８８１の形態である。アデノウイルス血清型５ゲノムの約ヌクレオチド９
１９８乃至９６３０での末端前タンパク質領域及び約ヌクレオチド７２７４乃至
７８８１でのポリメラーゼ領域における欠失を含有するアデノウイルスも好まし
い。さらに、アデノウイルス５ゲノムの約ヌクレオチド７２７４乃至９６３０の
領域を包囲するポリメラーゼ及び末端タンパク質領域が好ましい。当業者であれ
ば、類似の欠失が他の血清型からのアデノウイルスゲノムの相同領域において作
成できることが明白であろう。他の特に好ましい実施例において、欠失型アデノ
ウイルスは、本明細書中で［Ｅ１−、Ｅ３−、ｐｏｌ−］Ａｄ、［Ｅ１−、Ｅ３
−、ｐｏｌ−、ＴＰ−］Ａｄ、［Ｅ１−、１００Ｋ−］Ａｄ、又は［Ｅ１−、Ｅ
３−、ＩＶａ２−、ｐｏｌ−、ｐＴＰ−、１００Ｋ−］Ａｄとして開示されてい
るものである。
【００４６】 以下にさらに詳しく述べるように、上述した発明力のあるアデノウイルスはい
ずれも対象の1つ又はそれ以上のヌクレオチド配列（例えば、２、３、４、５、
６又はそれ以上の配列）を付加的に含有することができる。
【００４７】 当業者には、発明力のあるアデノウイルスは付加的に他の突然変異を含有でき
ることが明白であろう。例えば、アデノウイルスは、Douglasら、（1996）Natur
e Biotechnology 14:1574; Royらに対する米国特許第５，９２２，３１５号；Wi
ckhamらに対する米国特許第５，７７０，４４２号；及び／又はWickhamらに対す
る米国特許第５，７１２，１３６号（それらの開示はすべて全体が本明細書中で
援用される）改変又は「標的」されうる。
【００４８】 ＩＩ． 欠失型アデノウイルスを製造するための試薬及び方法。
【００４９】 別に示されている場合を除き、本発明による組換えアデノウイルスゲノム、ヘ
ルパーアデノウイルス、及びパッケージング細胞の構成のために標準の方法を用
いることができる。かかる方法は当業者には周知である。例えば、SAMBROOKら、
MOLECULAR CLONING: 実験マニュアル（A LABORATORY MANUAL）第２版（Cold Spr
ing Harbor, NY, 1989）；F. M. AUSUBELら、分子生物学における今日のプロト
コール（CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY）（Green Publishing Assoc
iate, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York）。
【００５０】 発明力ある欠失型アデノウイルスベクターは、本明細書中に記載されているよ
うに、又は技術上周知の他の方法により生成することができる。例えば、欠失型
アデノウイルスは、対象の欠失（及び任意に異種ヌクレオチド配列）を含有する
シャトルプラスミドの同時形質移入及びアデノウイルスの残存する配列をコード
化するプラスミド又は生アデノウイルスから適切なパッケージング細胞へのウイ
ルス粒子ＤＮＡによるいずれかにより生成することができる。パッケージング細
胞への２分子の同時形質導入後の２分子（シャトルプラスミドはアデノウイルス
ゲノムと類似性の領域も含む）間の有効な組替えに事象より、対象の欠失を含み
、適切なトランス相補性細胞における増殖能を有する完全長のベクターゲノムが
生成される。
【００５１】 特別な１方法により、所望の新しい欠失及び他の所望の突然変異（好ましくは
欠失も）の実質的部分を含有するプラスミドが生成される。開始プラスミドは好
ましくは、ｍｕ０から１のアデノウイルスのほかに、制限酵素部位（例えば、Ａ
ｓｃｌ部位）、及びｍｕ９から少なくともｍｕ４０のアデノウイルスゲノムを含
む。かから開始プラスミドは技術上周知の方法を用いて操作し、所望の欠失及び
／又は所望の導入遺伝子を含めることができる。
【００５２】 次に、プラスミド及び／又は所望の導入遺伝子のアデノウイルスゲノム部分に
おける所望の突然変異を含む結果として生じるプラスミドを、ＥｃｏＲｌ、Ｂｓ
ｐＨｌ、ＮＨｅｌ、又はＡｓｅｌなど制限エンドヌクレアーゼで消化されること
で直線化される。所望の導入遺伝子及び／又は欠失を含む直線化されたプラスミ
ドＤＮＡは、以下に述べるように調製されたアデノウイルスＤＮＡを所望の欠失
とともにアデノウイルスの生産的感染の支持（トランス相補）能を有するパッケ
ージング株細胞に同時形質移入される。
【００５３】 同時形質移入に用いられるアデノウイルスゲノムＤＮＡは、Jonesら、（1978
）Cell 13:181に記載された無傷のウイルス粒子ＤＮＡ末端タンパク質複合体と
して分離することができる。ゲノムＤＮＡはすでに所望の突然変異、好ましくは
、Ｅ１、Ｅ３、ｐｏｌ、ｐＴＰ、ＩＶａ２、及び／又は１００Ｋ領域における欠
失を含むウイルスからのものであってよい。同時形質移入に使用する前に、アデ
ノウイルスゲノムＤＮＡはまず少なくとも２つの制限酵素で消化される。これら
の酵素は、組換えが望ましくない染色体の部位におけるアデノウイルスゲノムの
多数の二重鎖破断を引き起こすように選択される。組換えが望ましくない部位は
、組換え事象を引き起こさせる少なくともヌクレオチド１からヌクレオチド１０
５９０、例えばｐＡｄＡｓｃＬ−Δｐｏｌ（実施例２）のヌクレオチド１０５９
０とヌクレオチド１５６７１との間を含むことが好ましい。
【００５４】 本発明の好ましいシャトルの１つ、ｐＡｄＡｓｃＬ−Δｐｏｌ（実施例２）に
存在するようなアデノウイルスゲノムの大部分を含むシャトルプラスミドの使用
は、アデノウイルスゲノムのこのさらに遠位領域における組換えを促進する。さ
らに、複数の制限酵素、好ましくはＣｌａｌ、Ｘｂａｌ、及びＳｃａｌを用いた
ゲノムアデノウイルスＤＮＡをまず消化することにより、ゲノムアデノウイルス
ＤＮＡの生きた非組換えウイルス生成能の大幅な減少が達成される。これはかか
ら組換えに必要とされるウイルスＤＮＡの部分が複数回消化される制限酵素であ
る可能性が高いという事実のためである。したがって、いくつかの制限酵素の利
用により、消化ウイルス粒子ＤＮＡ由来の望ましくない非組換えウイルスの生成
が実質的に阻止される。
【００５５】 好ましいシャトリングプラスミドはｐＡｄＡｓｃＬ−Δｐｏｌ（実施例２）で
ある。このプラスミドは従来技術で周知のプラスミドであるｐＡｄＡｓｃｌに類
似しているが、ｐＡｄＡｓｃＬはアデノウイルスゲノムのマップ単位９から１６
のみを含むのに対して、ｐＡｄＡｓｃＬ−ｗｔはマップ単位９から４３を含む。
ｐＡｄＡｓｃＬ−ｗｔに存在する付加的なＡｄ配列が、初期ベクター構成時の直
線化されたシャトルプロモーターとの同時形質移入前に複数の制限酵素でのウイ
ルス粒子ＤＮＡの消化を可能とし、それにより望ましくない組換えウイルスの組
換えによる生成が減少する。
【００５６】 ゲノムＤＮＡは、少なくともＥ１欠失及び、任意に、所望の遺伝子特性なしに
アデノウイルスを生成する可能性をさらに低下する以前に生成された他の所望の
欠失を含むアデノウイルス系統から分離できることが好ましい。
【００５７】 このため、所望の導入遺伝子及び／又は突然変異を含む操作されたプラスミド
ＤＮＡは、直線化され（すなわち、ＢｓｐＨｌ、ＥｃｏＲｌ、又はＮｈｅｌによ
り）、複数の消化されたウイルスゲノム、好ましく実施例１に記載されたＡｄ５
アデノウイルスＥ１−系統ｄｌ７００１とともに、必要なアデノウイルス遺伝子
機能を発現するパッケージング株細胞内へ同時形質移入される。ウイルスの増殖
を可能とするのに十分な時間培養した後、形質移入された細胞を収集し、非形質
移入パッケージング細胞と混合する。この細胞混合物は組織培養クラスタープレ
ートに分布し、培養後、ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）を示すこれらのプレー
トの個々のウェルを収集する。各ウェルはウイルスの単一クローン単離物を表す
。このクローン単離物は本明細書中の他の箇所に記載されているように特徴でけ
られる。例えば、ＤＮＡ制限マッピング、機能的試験、３２Ｐプローブ及び同様
の試験が、組換え縛タンパク質／ウイルスの遺伝子型を確認、特徴づけるために
実施される。
【００５８】 本発明は、試薬（例えば、分離ヌクレオチド配列、ベクター、細胞）及び発明
力のある欠失型アデノウイルスを製造するための方法をさらに提供する。
【００５９】 さらに、分離ヌクレオチド配列、さらに好ましくは欠失型アデノウイルス１０
０Ｋタンパク質をコード化するＤＮＡ配列が本明細書中で開示されている。１０
０Ｋタンパク質をコード化するヌクレオチド配列は、欠失が（上述したように）
欠失型ヌクレオチド配列から機能的１００Ｋタンパク質の発現を実質的に阻止す
るように（欠失型アデノウイルスベクターについて上述したように）1つ又はそ
れ以上の欠失を含む。アデノウイルスゲノム内にヌクレオチド配列が含まれるこ
とが好ましく、組換えアデノウイルスゲノムが含まれることがさらに好ましい。
本発明により、欠失型１００Ｋ領域を含むアデノウイルスゲノムを保有するゲノ
ム（例えば、プラスミドベクター）も提供される。本発明による例示のプラスミ
ドは本明細書中でｐｃＤＮＡ３＋１００Ｋとして開示されているプラスミドであ
る。さらに、細菌、原虫、酵母、菌、植物及び動物（例えば、昆虫、トリ及び哺
乳動物）の細胞を含む発明力のあるベクターを含有する細胞が提供される。
【００６０】 分離ヌクレオチド配列（好ましくは、ＤＮＡ配列）、アデノウイルスゲノム、
及び1つ又はそれ以上の（欠失型アデノウイルスベクターについて上述されたよ
うに）欠失を含むアデノウイルスＩＶａ２タンパク質をコード化するベクター及
び同様のものを含む細胞も提供される。これらの試薬は、他の点では、前節で１
００Ｋについて述べたものと同じものである。欠失型ＩＶａ２遺伝子をコード化
する例示のプラスミドは、本明細書中でｐＡｄｓｃＬΔＩＶａ２（図１９；欠失
型Ｅ１及びＥ３領域に加えてＡｄ５ゲノムの約ヌクレオチド４８３０乃至５７６
６での約９４２ｂｐの欠失）、ｐＡｄＡｓｃＬΔＩＶａ２、Δｐｏｌ（図３８；
欠失型Ｅ１及びＥ３領域に加えてＡｄ５ゲノムの約ヌクレオチド４８３０乃至５
７６６での約９４２ｂｐの欠失及び約ヌクレオチド７２７４乃至７８８１での約
６０８ｂｐの欠失）、ｐＡｄＡｓｃＬΔＩＶａ２、Δｐｐ（１．６）（図３６；
欠失型Ｅ１及びＥ３領域に加えてＡｄ５ゲノムの約ヌクレオチド４８３０乃至５
７６６での約９４２ｂｐの欠失、約ヌクレオチド７２７４乃至７８８１での約６
０８ｂｐの欠失、及び約ヌクレオチド８３６１乃至９５８５での約９５５ｂｐの
欠失）、及びｐＡｄＡｓｃＬΔＩＶａ２、Δｐｐ（２．４）（図３７；欠失型Ｅ
１及びＥ３領域に加えてＡｄ５ゲノムの約ヌクレオチド４８３０乃至５７６６で
の約９４２ｂｐの欠失、約ヌクレオチド７２７４乃至７８８１での約６０８ｂｐ
の欠失、及び約ヌクレオチド７２７４乃至９５８５での約２３１２ｂｐの欠失）
として記載されたものを含む。
【００６１】 本発明は、発明力のある欠失型アデノウイルスをパッケージングするための細
胞をさらに包含する。したがって、特別な１実施例において、本発明は（上述し
た）機能的アデノウイルス１００Ｋタンパク質をコード化する分離型ヌクレオチ
ド配列を含む細胞を提供する。この細胞は細菌、原虫、酵母、菌、植物又は動物
の細胞であってもよい。
【００６２】 この細胞は動物の細胞（例えば、昆虫、トリ又は哺乳動物の細胞）であること
が好ましく、哺乳動物の細胞であることがさらに好ましい。ヌクレオチド配列は
染色体外の細胞に存在することができ、又は好ましくは、細胞のゲノム内に安定
に組み込まれる。典型的に、機能的１００Ｋタンパク質をコード化する分離型ヌ
クレオチド配列は、適切な発現制御配列（例えば、プロモーター配列）と操作的
に結合される。ヌクレオチドの発現は恒常的又は誘導性でありうる。
【００６３】 特に好ましい実施例において、機能的１００Ｋタンパク質を発現する細胞は１
００Ｋ欠失型アデノウイルスゲノムを（上述したように）トランス相補すること
ができる。換言すれば、この細胞は、それぞれ本明細書中で開示されているよう
に、アデノウイルス１００Ｋタンパク質を恒常的に発現するＫ−１６細胞又はＣ
７細胞である。
【００６４】 当業者には、欠失型アデノウイルスゲノムが１００Ｋ欠失に加えて付加的な欠
失を含みうることが明白であろう。典型的に、Ｅ３領域を除いて、新しいウイル
ス粒子をパッケージングするためにこれらの欠失をトランス相補することが必要
となる。トランス相補は技術上周知の方法、例えば、パッケージング細胞又はヘ
ルパーアデノウイルスにより達成することができる。さらに代替として、喪失し
た機能は、通常この機能を発現することがないパッケージング細胞内に一時的に
形質移入することができる。発明力あるアデノウイルスはパッケージング細胞を
トランス相補することで生成されることが好ましい。
【００６５】 別の特別な実施例において、本発明は機能的（すなわち、生物活性の）アデノ
ウイルスＩＶａ２タンパク質をコード化する分離型ヌクレオチド配列を含む細胞
を提供する。機能的ＩＶａ２タンパク質をコード化する分離型ヌクレオチド配列
を含む細胞は、機能的１００Ｋタンパク質を発現する細胞について上述したもの
である。機能的ＩＶａ２タンパク質を発現する例示の細胞は、本明細書中でＢ６
又はＣ７細胞として開示されているものである。
【００６６】 本発明は本発明の欠失型アデノウイルス粒子を製造する方法も包含する。特別
な１方法により、欠失型アデノウイルスがトランス相補性パッケージング細胞内
に（上述したように）導入される。アデノウイルスゲノムは（欠失型アデノウイ
ルスベクターについて詳細に上述されたように）アデノウイルス１００Ｋ、ＩＶ
ａ２及び／又は末端前タンパク質領域の1つ又はそれ以上における1つ又はそれ以
上の欠失を含む。アデノウイルスの細胞を形質移入する方法は当業者により公知
である。欠失型ウイルスはトランス相補性細胞（すなわち、欠失型機能を発現す
る）において複製及びパッケージングされ、欠失型アデノウイルス粒子が収集さ
れる。パッケージング細胞は動物の細胞（例えば、昆虫、トリ、哺乳動物）であ
ることが好ましく、さらに好ましくは、哺乳動物の細胞である。
【００６７】 別の実施例において、本発明は、（欠失型アデノウイルスについて上述したよ
うに）Ｅ１領域における1つ又はそれ以上の欠失及びポリメラーゼ領域における1
つ又はそれ以上の欠失を含む欠失型アデノウイルスを製造する方法を提供する。
欠失型アデノウイルスは、新しいウイルス粒子が収集した欠失型アデノウイルス
機能を発現するトランス相補性細胞において複製及びパッケージングされる。
【００６８】 別の好ましい実施例において、本発明は、欠失型領域の1つがポリメラーゼ領
域にある、アデノウイルスゲノムの1つ又はそれ以上の領域における２つ又はそ
れ以上の欠失を含む欠失型アデノウイルスを製造するための方法を提供する。２
つの欠失型領域が存在する特別な実施例において、第１の欠失型領域はポリメラ
ーゼ領域であり、第２の欠失型領域は、Ｅ３領域を除き、本明細書中に記載され
た他の領域である。さらに好ましい実施例において、アデノウイルスはポリメラ
ーゼ領域における1つ又はそれ以上の欠失及びＥ１領域における1つ又はそれ以上
の欠失、及び任意に、アデノウイルスゲノムの他の領域における1つ又はそれ以
上の欠失を有する。欠失型アデノウイルスは、新しいウイルス粒子が収集した欠
失型アデノウイルス機能を発現するトランス相補性細胞において複製及びパッケ
ージングされる。
【００６９】 さらに非限定的な代替として、本発明はＧＡＡタンパク質をコード化するヌク
レオチド配列を保有し、さらに１００Ｋ、ＩＶａ２、末端前タンパク質、及びポ
リメラーゼ領域における1つ又はそれ以上に1つ又はそれ以上の欠失を含む欠失型
アデノウイルス製造する方法を提供する。この欠失型アデノウイルスは、新しい
ウイルス粒子が収集した欠失型アデノウイルス機能を発現するトランス相補性細
胞において複製及びパッケージングされる。
【００７０】 Chamberlainらに対するＰＣＴ公報ＷＯ９８／１７７８３号は、ポリメラーゼ
領域及び／又は末端前タンパク質領域における欠失を含むアデノウイルスベクタ
ーのパッケージングを開示している。しかし、本明細書中及びAmalfitanoら、（
1988）J. Virology 72:926（９２８ページ、方法と材料の第１全パラグラフ）に
より記載されているように、ｐＢＨＧ１１プラスミドに基づくこの引例に記載さ
れた方法は、ポリメラーゼ領域及び／又は末端前タンパク質領域において欠失し
たアデノウイルスの製造を欠いていた。
【００７１】 これとは対照的に、本明細書中に記載された発明力のあるパッケージング方法
によれば、収集されたアデノウイルスは好ましくは１細胞につき少なくとも１０
０感染単位の力価を有し、さらに好ましくは、１細胞につき少なくとも１０，０
００感染単位を有する。本発明人は本明細書中に記載された発明力のある方法を
有効に用いて、Ｅ１、Ｅ３、１００Ｋ、ＩＶａ２、末端前タンパク質及び／又は
ポリメラーゼ領域における欠失を保有する高力価系統のアデノウイルスを製造し
た。
【００７２】 本発明は、細菌細胞を用いた発明力あるアデノウイルスベクターを製造する方
法を包含する。例えば、Heら、（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509は
、アデノウイルスプラスミドを用いた欠失型アデノウイルスを製造するための方
法を記載している（その開示の全体が本明細書中で援用される、Heらに対する米
国特許第５，９２２，５７６号も参照）。したがって、特別な１実施例において
、本発明は、細菌細胞内にアデノウイルスゲノムを保有する細菌プラスミドを導
入することにより本発明の感染性欠失型アデノウイルスを製造する方法を提供す
る。このアデノウイルスゲノムは、ポリメラーゼ、末端前タンパク質、１００Ｋ
、及び／又はＩＶａ２領域（欠失型アデノウイルスについて上述したように）の
1つ又はそれ以上に1つ又はそれ以上の欠失を含む。細菌プラスミドは細菌細胞中
で増幅され、回収されるとともに、直線化される。欠失型アデノウイルスゲノム
を保有する直線化されたプラスミドは（上述したように）トランス相補性パッケ
ージング細胞内に導入され、新しいウイルス粒子に複製されてパッケージングさ
れる。このアデノウイルス粒子は収集される。アデノウイルスゲノムは1つ又は
それ以上の異種ヌクレオチド配列をさらに包含することが好ましい。
【００７３】 本発明は、アデノウイルスミニ染色体を含有する破壊型アデノウイルスベクタ
ーを製造するための方法をさらに提供する。アデノウイルスミニ染色体は、Cham
berlainらに対するＷＯ９８／１７７７８３号及びKumar-Singhら、（1996）Huma
n Molecular Gentics 5:913に記載されている通りである。本発明の欠失型アデ
ノウイルスは、破壊型アデノウイルスの増殖のための最適化された欠失型アデノ
ウイルスとして用いることができる。本発明の欠失型ウイルスを用いた高力価の
系統の破壊型アデノウイルスベクターを増殖させるための方法は、破壊型アデノ
ウイルスベクター及び欠失型ベクターの増殖に許容的であるパッケージング細胞
内へ本発明の増殖欠陥性欠失型アデノウイルスを同時感染させて、結果として生
じるウイルス粒子を収集することを含む。
【００７４】 特別の好ましい１実施例によれば、少なくとも１つのアデノウイルスＩＴＲ（
好ましくは２つのＩＴＲ）、アデノウイルスパッケージング配列、及び対象の1
つ又はそれ以上の異種ヌクレオチド配列を含むプラスミドが、パッケージング細
胞内に導入される。１００Ｋ領域における1つ又はそれ以上の欠失を含有するア
デノウイルスゲノムを含むヘルパーアデノウイルスも、パッケージング細胞内に
導入される。１００Ｋ欠失型ベクターも、上述したように、他の領域における付
加的な欠失を含む。パッケージング細胞は機能的１００Ｋタンパク質を発現し、
アデノウイルスゲノムの１００Ｋ領域における欠失をトランス相補する。パッケ
ージング細胞及び１００Ｋ欠失型アデノウイルスゲノムはそれぞれ上述した通り
である。アデノウイルスミニ染色体は、ヘルパーアデノウイルス及びトランス相
補性株細胞の存在下に複製及びパッケージングすることができ、アデノウイルス
ミニ染色体を含む破壊型アデノウイルスベクターが収集される。
【００７５】 必要であれば、破壊型ベクターは技術上周知の方法、例えば、塩化セシウム遠
心分離又は他の密度勾配により欠失型アデノウイルスから分離することができる
。従来技術の分離法に加えて、ヘルパーウイルスのパッケージングを阻止するこ
とによりヘルパーウイルスの混入を減少させることができる。例えば、ヘルパー
アデノウイルスにより輸送されるアデノウイルスゲノムは、ヘルパーアデノウイ
ルスゲノムのパッケージングを阻止するアデノウイルスパッケージング配列を欠
くことがある。選択的に、ヘルパーアデノウイルスは、ヘルパーアデノウイルス
ゲノムのキャプシド形成を不可能する修飾パッケージング配列を保有する。
【００７６】 さらに非限定的な代替として、ヘルパーアデノウイルスゲノムはパッケージン
グ配列をフランキングする液化酸素部位を有し、パッケージング細胞はＣｒｅリ
コンビナーゼタンパク質を生成する。Ｃｒｅリコンビナーゼの存在は、液化酸素
介在性組換え及び液化酸素部位（例えば、パッケージング単一及び／又は他のア
デノウイルス配列）によりフランキングされる全配列の除去をもたらし、パッケ
ージングされることから液化酸素含有ＤＮＡを阻止する（Parksら、（1996）Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 93:13565）。この方法の変型において、液化酸素部位
は大量のＡｄゲノムをフランキングする複数の欠失型ベクター内に配置される。
Ｃｒｅ細胞内に配置されると、大部分の欠失型ベクターゲノムは除去される。そ
の結果として減少するヘルパーウイルスは、塩化セシウム遠心分離又は技術上周
知の他の方法を介して液化酸素を含まないベクターから離れて精製される（lieb
erら、（1996）J. Virol. 70:8944; Kochanekら、（1996）proc. Natl. Acad. S
ci. USA 93: 5731）。
【００７７】 本明細書中では、ＩＶａ２領域における1つ又はそれ以上の欠失を含むアデノ
ウイルスゲノム及び機能的ＩＶａ２タンパク質を発現することによりこの欠失を
トランス相補すうパッケージング細胞を含有するヘルパーアデノウイルスととも
にミニ染色体を保有する破壊型アデノウイルスを製造する方法も提供される。こ
れらの方法は、その他の点では、欠失型１００Ｋ領域を含有するヘルパーアデノ
ウイルスを用いた破壊型アデノウイルスのパッケージングについて上述した方法
と同様である。
【００７８】 さらに、本明細書中では、ポリメラーゼ領域及び／又は末端前タンパク質領域
における1つ又はそれ以上の欠失を含むアデノウイルスゲノム及び機能的末端前
タンパク質及び／又はポリメラーゼをそれぞれ発現することによりこの欠失をト
ランス相補するパッケージング細胞を含有するヘルパー細胞とともにミニ染色体
を保有する破壊型アデノウイルスを製造する方法が提供される。末端前タンパク
質及びポリメラーゼ欠失は、欠失型アデノウイルスベクターについて上述したと
おりである。これらの方法は、その他の点では、欠失型１００Ｋ領域を含有する
ヘルパーアデノウイルスを用いた破壊型アデノウイルスのパッケージングについ
て上述した方法と同様である。
【００７９】 本発明の欠失型アデノウイルスは、破壊型ベクターとともに本発明の欠失型ウ
イルスと標的細胞を同時感染させることで標的細胞における破壊型ベクターゲノ
ムを安定化を補助する破壊型アデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療法に用
いることもできる。ヘルパーウイルス混入（及びトランス作用活性）の欠如によ
る破壊型アデノウイルスベクターの不安定化は最近、破壊型Ａｄベクター製剤の
潜在的に重篤な制限として記載されている（Lieberら、（1996）J. Virol. 70:8
944）。本明細書中に記載された欠失型ベクターによる破壊型アデノウイルス系
統の混入は、細胞又は対象に導入されると「漏出性」であると報告されている、
第一世代のＥ１欠失型ヘルパーに好ましい。この実施例によれば、遺伝子発現に
おける複製形質転換受容性ベクター及び／又は「漏出性」を発生する組換えの可
能性を最小限に抑えるために、混入ヘルパーアデノウイルスは複数の欠失型アデ
ノウイルスであることが好ましい。
【００８０】 したがって、本発明は、ミニ染色体及び本発明による欠失型ヘルパーアデノウ
イルスを含有する破壊型アデノウイルスを含む組成物（好ましくは、医薬組成物
）を提供する。欠失型ヘルパーアデノウイルスの存在量は、組成物中の破壊型ア
デノウイルスの存在量の約５０％、３０％、２０％、１０％、５％、２．５％、
１％、０．０５％、０．０１％、０．００１％又はそれ以下であることが好まし
い。これらの組成物は、欠失型ヘルパーアデノウイルスの効果の安定化と破壊型
アデノウイルスベクターの利点を組み合わせる、本明細書中に記載されたどの方
法によっても対象に有利に投与することができる。
【００８１】 ＩＩＩ． 組換えアデノウイルスベクター。
【００８２】 本明細書中で用いられる「組換えアデノウイルスベクター」は、1つ又はそれ
以上の異種ヌクレオチド配列又は導入遺伝子（例えば、２、３、４、５つ又はそ
れ以上の異種ヌクレオチド配列又は導入遺伝子）を保有するアデノウイルスベク
ターである。本発明の欠失型アデノウイルスベクターは、インビボ及びインビト
ロの両方の細胞に核酸を送達するために有用である。特に、発明力のあるベクタ
ーは動物、さらに好ましくは哺乳動物の細胞に核酸を送達又は移入するために有
利に使用することできる。対象の核酸はペプチド及びタンパク質、好ましくは治
療（例えば、医療又は獣医用）又は免疫原性（例えば、ワクチン用）ペプチド又
はタンパク質をコード化する核酸を含む。
【００８３】 選択的に、本発明の特別な実施例において、対象の核酸はアンチセンス核酸、
リボザイム、又は「ガイド」ＲＮＡ（Gormanら、（1998）Proc. Nat. Acad. Sci
. USA 95:4929）など他の非翻訳ＲＮＡ、等をコード化しうる。
【００８４】 本発明は、ワクチンとして有用なベクターも提供する。抗原はアデノウイルス
キャプシド中に提示することができ、選択的に、抗原は組換えアデノウイルスゲ
ノム内に導入された異種核酸から発現され、発明力のあるアデノウイルスにより
輸送されることができる。対象の免疫原であれば、アデノウイルスベクターによ
り供給することができる。対象の免疫原は技術上公知であり、ヒト免疫不全ウイ
ルス（例えば、エンベロープタンパク質）、インフルエンザウイルス、ｇａｇタ
ンパク質、癌抗原、ＨＢＶ表面抗原（肝炎に対して免疫化する）、狂犬病糖タン
パク質、等を含むが、これらに限定されない。
【００８５】 さらに代替として、アデノウイルスベクターは、例えば対象のタンパク質又は
ペプチド（例えば、リソソーム酸α−グルコシダーゼ）を生成する所望の遺伝子
産物を発現する培養中の細胞を感染するために用いることができる。タンパク質
又はペプチドは培地に分泌され、そこから技術上周知のルーチンの方法を用いて
精製できることが好ましい。タンパク質の細胞外分泌を配向する単一のペプチド
配列は技術上周知であり、これをコード化するヌクレオチド配列は技術上周知の
ルーチンの方法により対象のペプチド又はタンパク質をコード化するヌクレオチ
ド配列に操作的に結合できる。選択的に、それらの細胞は溶解することができ、
発現組換えタンパク質は細胞ライセートから精製することができる。この細胞は
細菌、原虫、植物、酵母、菌、又は動物の細胞であってもよい。この細胞は動物
の細胞（例えば、昆虫、トリ又は哺乳動物）であることが好ましく、哺乳動物の
細胞であることがさらに好ましい。アデノウイルスによる形質導入に適格性であ
る細胞であることも好ましい。
【００８６】 アデノウイルスベクターのサイズは異なる。一般に、アデノウイルスゲノムは
約２８ｋｂ乃至３８ｋｂのサイズで最も安定である。（自然のゲノムサイズ約７
５％乃至１０５％）。大きな欠失及び比較的小さいな導入遺伝子を含むアデノウ
イルスベクターの場合には、「stufferＤＮＡ」を用いて、技術上周知の方法に
より所望の範囲内でベクターの総サイズを維持することができる。本発明の欠失
型ベクターはサイズが約９、１１又は１２．５ｋｂまで又はそれ以上の導入遺伝
子を送達することができる。
【００８７】 当業者には、異種ヌクレオチド配列が好ましくは適切な発現制御配列と操作的
に結合することが明白であろう。例えば、対象の組換えアデノウイルスベクター
は、標的細胞にそうだつされる異種核酸配列と操作的に結合される適切な転写／
翻訳制御シグナル及びポリアデニル化シグナルを含むことが好ましい。当業者に
は、各種のプロモーター／エンハンサー要素が所望のレベル及び組織特異的発現
によって使用できることが明白であろう。プロモーターは、所望の発現のパター
ンによって、恒常的又は誘導性（例えば、メタロチオネインプロモーター）であ
ることができる。プロモーターは天然又は外来性であってよく、天然配列又は合
成配列であることができる。外来性により、転写開始領域が、転写開始領域が導
入される野生型宿主では見出せないことが意図されている。プロモーターは、対
象の標的細胞において機能するように選択される。脳特異的、肝特異的、及び筋
特異的（骨格、心臓、平滑、及び／又は横隔膜特異的）プロモーターがさらに好
ましい。哺乳動物のプロモーターであることも好ましい。
【００８８】 異種ヌクレオチド配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要最初期プロモ
ーター、アルブミンプロモーター、伸長因子１−α（ＥＦ１−α）、ＰγＫプロ
モーター、ＭＦＧプロモーター、又はラウス肉腫ウイルスプロモーターと操作的
に結合されることがさらに好ましい。ＣＭＶプロモーターによる異種ヌクレオチ
ド転写の推進により、免疫適格性動物における発現のダウンレグレーションを来
たすことが推測されている（例えば、Guoら、（1996）Gene Therapy 3:802を参
照）。したがって、導入遺伝子発現のこのダウンレグレーションが生じることの
ない修飾ＣＭＶプロモーターと異種ヌクレオチド配列を操作的に結合することも
好ましい。
【００８９】 1つ又はそれ以上の異種ヌクレオチド配列が存在する実施例において、当業者
には、異種ヌクレオチド配列が単一の上流プロモーター及び1つ又はそれ以上の
下流内部リボソーム流入部位（ＩＲＥＳ）配列（例えば、ピコルナウイルスＥＭ
Ｃ ＩＲＥＳ配列）と操作的に結合できることが明白であろう。
【００９０】 アデノウィルス少なくとも１つのアデノウィルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配
列を含む実施例も好ましく、２つのアデノウィルスＩＴＲ配列がさらに好ましい
。さらに、導入遺伝子を保有する組換えアデノウィルスゲノムもアデノウィルス
パッケージング配列をコード化することも好ましい。例えば、特別な１実施例に
おいて、アデノウィルスゲノムは1つ又はそれ以上の異種配列、５’及ぶ３’ア
デノウィルスＩＴＲ、アデノウィルスパッケージング配列、及びアデノウィルス
Ｅ１Ａエンハンサー配列を含む。
【００９１】 異種ヌクレオチド配列が標的細胞に転写されて翻訳される本発明の実施例にお
いて、特異的開始シグナルが一般に挿入されたタンパク質コード配列の十分な翻
訳に必要とされる。ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含みうるこれらの外因性翻
訳制御配列は、天然及び合成の各種起源のものであることができる。
【００９２】 タンパク質及びペプチドをコード化する異種ヌクレオチド配列は、レポーター
タンパク質（例えば、酵素）をコード化するものを含む。レポータータンパク質
は技術上周知であり、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を
含むが、これらに限定されない。アデノウィルスベクターは本明細書中でＡｓＬ
ａｃＺΔｐｏｌ又はＡｄＬａｃＺΔｐｐとして開示されているベクターであるこ
とがさらに好ましい。
【００９３】 治療ペプチド及びタンパク質は、嚢胞性線維症膜貫通調節制御因子（ＣＦＴＲ
）、ジストロフィン（ジストロフィンミニ遺伝子のタンパク質生成物を含む、例
えば、Vincentら、（1993）Nature Genetics 5:130を参照）、ユートロフィン（
Tinsleyら、（1996）Nature 384:349）、凝固因子（例えば、ＸＩＩＩ因子、Ｉ
Ｘ因子、Ｘ因子、等）、エリスロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質、オ
ルニチントランスカルバモイラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリ
ン、α−アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴ
ミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ
、ホルモン、増殖因子、サイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、インタ
ーロイキン−２、インターロイキン−４、顆粒球−マクロファージコロニー刺激
因子）、自殺遺伝子生成物（例えば、チミジンキナーゼ、サイトシンデアミナー
ゼ、ジフテリア毒素、及び腫瘍ネクローシス因子）、癌療法に使用される薬剤に
対する耐性を与えるタンパク質、腫瘍抑制遺伝子生成物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ
、Ｗｔ−１）、及び治療が必要とされる対象において治療効果を有する他のペプ
チド又はタンパク質を含むが、これらに限定されない。
【００９４】 本発明の特に好ましい実施例において、異種ヌクレオチド配列は代謝障害と関
連したタンパク質又はペプチドをコード化する。「代謝障害と関連した」により
、発現タンパク質又はペプチドが代謝障害において欠乏性又は欠陥性であり、そ
の他の点では代謝障害において原因である薬剤であるものが意図されている。
【００９５】 他の特に好ましい実施例において、タンパク質又はペプチドはリソソームタン
パク質又はペプチドであり、さらに好ましくは、リソソームコンパートメントを
標的にするタンパク質に特有であるマンノース−６−リン酸残基を保持する前駆
タンパク質又はペプチドである。
【００９６】 さらに別の好ましい実施例において、異種ヌクレオチド配列は、リソソーム貯
蔵疾患と関連したペプチド又はタンパク質をコード化する。「リソソーム貯蔵疾
患と関連した」により、発現タンパク質又はペプチドがリソソーム貯蔵疾患にお
いて欠乏性又は欠陥性であり、その他の点ではリソソーム貯蔵疾患において原因
である薬剤であるものが意図されている。
【００９７】 技術上周知のように、多数のリソソーム貯蔵疾患がある。実例としてのリソソ
ーム貯蔵疾患は、ＧＭ１ガングリオシド蓄積症、黒内障性白痴、ＧＭ２ガングリ
オシド蓄積症（ＡＢ変異形）、サンドホフ病、ファブリー病、ゴシェ病、異染色
性白質萎縮症、クラッベ病、ニーマン−ピック病（Ａ−Ｄ型）、ファルバー病、
ウォルマン病、フルラー症候群（ＭＰＳ ＩＩＩ）、シャイエ症候群（ＭＰＳ IS
）、フルラー−シャイエ症候群（ＭＰＳ ＩＨ／Ｓ）、ハンター症候群（ＭＰＳ
ＩＩ）、サンフィリッポＡ症候群（ＭＰＳ ＩＩＩＡ）、サンフィリッポＢ症候
群（ＭＰ ＩＩＩＢ）、サンフィリッポＣ症候群（ＭＰ ＩＩＩＣ）、サンフィリ
ッポＤ症候群（ＭＰ ＩＩＩＤ）、マルキオＡ病（ＭＰＳ ＩＶＡ）、マルキオＢ
病（ＭＰＳ ＩＶ Ｂ）、Maroteauxlmary病（ＭＰＳ ＶＩ）、スリー症候群（Ｍ
ＰＳ ＶＩＩ）、α−マンノース症、β−マンノース症、フコース蓄積症、アス
パルチルグルコサミン尿、シアルドーシス（ムコリピドーシス）、ガラクトシア
リドーシス（ゴールドベルク症候群）、シンドラー病、ムコリピドーシスＩＩ（
Ｉ−細胞病）、ムコリピドーシスＩＩＩ（偽フルラー多ジストロフィー）、シス
チン症、サラ病、小児性シアル酸貯蔵疾患、バッテン病（小児性ニューロンセロ
イドリポフスチン沈着症）、小児性ニューロンセロイドリポフスチン沈着症、ム
コリピドーシスＩＶ、及びプロサポシンを含むが、これらに限定されない。
【００９８】 本発明によるリソソーム貯蔵疾患と関連したタンパク質又はペプチドは、β−
ガラクトシダーゼ、β−へキソサミダーゼＡ，β−へキソサミダーゼＢ、ＧＭ２ 活性化タンパク質、グルコセレブロシダ−ゼ、アリルスルファターゼＡ、ガラク
トシルセラミド、スフィンゴミエリナーゼ酸、セラミダーゼ酸、リパーゼ酸、α
−Ｌ−イズロニダーゼ、イズルネートスルファターゼ、ヘパランＮ−スルファタ
ーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼアセチル−ＣｏＡ、グルコサミ二ド
アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ
、アリルスルファターゼＢ、β−グルクロニダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−
マンノシダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、Ｎ−アスパルチル−β−グルコサミニ
ダーゼ、α−ノイラミニダーゼ、リソソーム保護タンパク質、α−Ｎ−アセチル
−ガラクトサミニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェ
ラーゼ、シスチン輸送タンパク質、シアル酸輸送タンパク質、ＣＬＮ３遺伝子酸
産物、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、サポシンＡ，サポシンＢ，サ
ポシンＣ、及びサポシンＤを含むが、これらに限定されない。
【００９９】 本発明は、糖原病と関連したタンパク質又はペプチドをコード化する導入遺伝
子を保有する欠失型組換えアデノウィルスベクターをさらに提供する。「糖原病
と関連した」により、発現タンパク質又はペプチドが糖原病において欠乏性又は
欠陥性であり、その他の点ではリソソーム貯蔵疾患において原因である薬剤であ
るものが意図されている。
【０１００】 技術上周知のように、多数の糖原病がある。実例としての糖原病は、Ｉａ型Ｇ
Ｄ I型（フォン・ギールヶ病）、Ｉｂ型ＧＳＤ、Ｉｃ型ＧＳＤ、Ｉｄ型ＧＳＤ、
ＩＩ型ＧＳＤ型（ポーンプ病又は小児性ＩＩ型ＧＳＤ）、ＩＩＩａ型ＧＳＤ、Ｉ
ＩＩｂ型ＧＳＤ、ＩＶ型ＧＳＤ、Ｖ型ＧＳＤ（マカルドル病）、ＶＩ型ＧＳＤ、
ＶＩＩ型ＧＳＤ、グリコーゲン合成欠乏症、腎ファンコーニ症候群を伴う肝糖原
病、ホスホグルコイソメラーゼ欠乏症、筋ホスホグリセリン酸キナーゼ欠乏症、
ホスホグリセリン酸ムターゼ欠乏症、及び乳酸脱水素酵素欠乏症を含むが、これ
らに限定されない。
【０１０１】 本発明による糖原病と関連したタンパク質又はペプチドは、グルコース６−ホ
スファターゼ、リソソーム酸αグルコシダーゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、脱分
枝酵素、筋ホスホリラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、筋ホ
スホフルクトキナーゼ、グリコーゲン合成酵素、ホスホグルコイソメラーゼ、筋
ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、及び乳酸脱水素酵
素を含むが、これらに限定されない。
【０１０２】 さらに好ましい実施例において、欠失型組換えアデノウィルスは、例えば、小
児性（ポーンプ病）、疾患の小児性及び成人発症型を含むＩＩ型ＧＳＤを治療す
るリソソーム酸α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコード化する導入遺伝子を保有
する。さらに好ましくは、リソソーム酸α−グルコシダーゼはヒトリソソーム酸
α−グルコシダーゼ（ｈＧＡＡ）である。導入遺伝子は、成熟ＧＡＡタンパク質
（例えば、７６ｋＤ型）又はＧＡＡ前駆体（例えば、１１０ｋＤ型）のいずれか
をコード化しうる。導入遺伝子はＧＡＡ前駆体をコード化することが好ましい。
本明細書中で用いられる「ＧＡＡ」という用語は、成熟及び前駆ＧＡＡタンパク
質並びに生物機能を保持する（すなわち、天然ＧＡＡタンパク質の少なくとも１
つの生物活性を有する、例えば、グリコーゲンを加水分解できる）修飾（例えば
、切断又は変異）ＧＡＡタンパク質を包含する。
【０１０３】 リソソーム酸α−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２０）（１，４−α
−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ）は、オリゴ糖遊離グルコースのα−１，４
及びα−１，６連鎖の両方を加水分解するエキソ−１，４−α−Ｄ−グルコシダ
ーゼである。１７染色体上の２８ｋｂ酸α−グルコシダーゼ遺伝子は、９５１ア
ミノ酸ポリペプチドを生成する３．６ｋｂ ｍＲＮＡをコード化する（Hoefsloot
ら、（1988）EMBO J. 7:1697; Martiniukら、（1990）DNA and Cell Biology 9:
85）。ポリペプチドのｃＤＮＡコードのヌクレオチド配列、及び欠失型アミノ酸
配列が、Hoefslootら（同）において提供されている。ポリペプチドの最初の２
７アミノ酸は、リソソーム及び分泌タンパク質の単一ペプチドのリーダー配列の
典型である。この酵素は、小胞体上の同時翻訳Ｎ連鎖グリコシル化を受ける。こ
れは１１０−ｋＤａ前駆形態として合成され、そのグリコシル化の過剰な修飾、
及びリン酸化とともに、最終リソソーム７６及び６７ｋＤａ形態への約９０−ｋ
Ｄａエンドソーム中間体によるタンパク質分解により成熟する（Hoefslootら、
（1988）EMBO J. 7:1697; Hoefslootら、（1990）Biochem. J. 272:485; Wissel
aarら、（1993）J. Biol. Chem. 263:2223; Hermansら、（1993）Biochem. J. 2
89:681）。
【０１０４】 Hoefslootら、（1988）EMBO J. 7:1697; 及びVan Hoveら、（1996）Proc.Natl
.Acad. Sci. USA 93:65、により記載されたヒトＧＡＡ遺伝子は、５’非翻訳配
列を含む。特に好ましい実施例において、ｈＧＡＡ導入遺伝子は、Van Hoveらに
より記載された完全な約３．８ｋｂ配列を含む。選択的に、本発明の欠失型アデ
ノウィルスは、ＧＡＡ遺伝子の５’及び３’非翻訳領域の多少をコード化しうる
。他の好ましい実施例において、異種ヌクレオチド配列は、完全長ＧＡＡ前駆体
をコード化するが、５’及び３’配列（例えば、実施例２３、ｈ５’ｓＧＡＡ配
列を参照）のすべてを実質的に欠く約３．３ｋｂヌクレオチド配列又は付加的な
５’非翻訳配列を含む３．８ｋｂ ＧＡＡ配列である。
【０１０５】 ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌ（３．８ｋｂ）、Аｄ／ＥＦ１−α／ｈＧＡＡΔｐｏｌ
（３．８ｋｂ）、ＡｄｈＧＡＡΔｐｐ（３．８ｋｂ）、Ａｄ／ＥＦ１−α／ｈＧ
ＡＡΔｐｐ（３．８ｋｂ）、Ａｄｈ５’ｓＧＡＡΔｐｏｌ（３．３ｋｂ）、Ａｄ
／ＥＦ１−α／ｈ５’ｓＧＡＡΔｐｏｌ（３．３ｋｂ）、及びＡｄ／ＥＦ１−α
／ｈ５’ｓＧＡＡΔｐｐ（３．３ｋｂ）として本明細書中で開示されているアデ
ノウィルスベクターも好ましい。
【０１０６】 ＩＶ． 遺伝子移入技術 本発明の方法は、インビボ又はインビトロの分裂細胞及び非分裂細胞の両方を
含む、広範囲の宿主細胞内に異種ヌクレオチド配列を送達する方法を提供する。
本発明のベクター、方法及び医薬組成物は、治療の方法として又はその他の点で
、それらを必要とする対象にタンパク質又はペプチドを投与する方法において相
加的に有用である。このようにして、タンパク質又はペプチドは対象のインビボ
で生成することができる。対象は、その対象がタンパク質又はペプチドの欠乏症
を有するという点で、又は対象におけるタンパク質又はペプチドの生成が、治療
の方法として又はその他の点で、及びさらに以下で説明するように、多少の治療
効果を与えるという点で、タンパク質又はペプチドを必要としているとみられる
。
【０１０７】 遺伝子移入は疾患状態の治療を理解し提供するうえで実質的に潜在的な使用法
をもつ。欠陥性遺伝子が知られ、クローン化されている多数の遺伝性疾患がある
。ある場合には、これらのクローン化遺伝子の機能が知られている。一般に、上
記の疾患状態は２つのクラスに分類される。すなわち、一般に劣性に遺伝される
通常、酵素の欠乏状態、及び優性に遺伝される少なくとも場合により調節性又は
構造タンパク質を含む不均衡な状態である。欠乏状態の疾患では、補充療法のた
めに遺伝子移入を用いて正常な遺伝子を疾患組織に導入するほか、アンチセンス
突然変異を用いて疾患の動物モデルを作ることができよう。不均衡な疾患状態で
は、遺伝子移入を用いて、モデル系における疾患状態を作り、それを疾患状態を
抑制する試みに使用できよう。このため、本発明の方法は、遺伝病の治療を可能
にする。本明細書中で用いられるように、疾患状態は、疾患を引き起こし、又は
それをさらに重篤にする欠乏又は不均衡を部分的に、又は完全に治療することに
より治療される。突然変異を引き起こし、又は欠陥を矯正する核配列の部位特異
的組み込みも可能である。
【０１０８】 一般に、本発明を使用して、遺伝子発現に関係がある障害と関連した症状を治
療又は寛解させる外来ヌクレオチド配列を送達することができる。例示の疾患状
態として、リソソーム貯蔵疾患、糖原病、血友病（例えば、血友病Ａ及び血友病
Ｂ）及び他の凝固障害、ゴーシェ病、糖尿病、嚢胞性線維症（及び他の肺疾患）
、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ、ベッカー）、神経系の疾患（例え
ば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん）、網
膜変性疾患（及び他の眼病）、固形臓器の疾患（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓
）、及び感染性又は遺伝性根拠を有する他の疾患があげられる。
【０１０９】 本発明を使用して、インビボ又はインビトロの細胞にアンチセンス核酸を供給
することもできる。標的細胞におけるアンチセンス核酸の発現は、細胞による特
定のタンパク質の発現を減少する。したがって、アンチセンス核酸を投与して、
それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を増大させることができ
る。アンチセンス核酸はインビトロで細胞に投与して、細胞生理機能を調節する
こと、例えば、細胞又は組織培養系を最適化することもできる。本発明は他の非
翻訳ＲＮＡ、例えば、リボザイム又は「ガイド」ＲＮＡ（例えば、Gormanら、（
1998）Proc. Nat. Acad. Scie. USA 95:4929）を標的細胞に送達するためにも有
用である。
【０１１０】 最後に、本発明は、対象の遺伝子が一時的又は安定に細胞培養系で発現される
、診断及びスクリーニング法の使用をさらに見出す。
【０１１１】 Ｖ． 対象、医薬組成物、ワクチン及び投与方法。
【０１１２】 本発明は獣医及び医療の用途における使用を見出す。適切な対象として、トリ
及び哺乳動物があげられ、哺乳動物が好ましい。本明細書中で用いられる「トリ
」という用語は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ及びキ
ジを含むが、これらに限定されない。本明細書中で用いられる「哺乳動物」とい
う用語は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、等を含むが
、これらに限定されない。ヒト対象が最も好ましい。ヒト対象は新生児、乳児、
小児、及び成人を含む。
【０１１３】 特別な実施例において、本発明は、薬学的に許容される担体又は他の医療薬剤
、医薬剤、担体、アジュバント、希釈剤、等での本発明のウイルス粒子を含む医
薬組成物を提供する。注射のために、担体は典型的に液体となる。他の投与方法
のために、担体は、無菌の発熱物質を含まない水又は無菌の発熱物質を含まない
リン酸緩衝生理食塩水など固体又は液体のいずれかであってよい。吸入投与のた
めに、担体は呼吸可能なものとなり、好ましくは固体又は液体の粒子性の形態と
なる。注射媒体として、滅菌剤、塩又は食塩水、及び／又は緩衝液など注射液に
有用な添加剤を含む。
【０１１４】 「薬学的に許容される」により、生物学的又はその他の点で望ましくないもの
ではない物質、すなわち、その物質が望ましくない生物学的作用を引き起こすこ
となくウイルスベクターとともに対象に投与しうることが意味される。このため
、例えば、エキソビボ細胞の形質移入又はウイルス粒子の対象への直接投与にお
いて、かかる医薬組成物を用いることができる。
【０１１５】 本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体と併用して本明細書中で開示さ
れている免疫原性量の感染性ウイルス粒子を含む。「免疫原性量」は、医薬組成
物が投与される対象における免疫応答を誘起するのに十分である感染性ウイルス
粒子の量である。治療される対象の年齢や種、及び免疫応答が望ましい免疫原に
よって、１用量につき約１０３乃至約１０７の量のウイルス粒子、及び好ましく
は約１０４乃至１０６のウイルス粒子が適切である。対象及び免疫原は上述した
通りである。
【０１１６】 本発明は、細胞内にヌクレオチド配列を送達する方法をさらに提供する。イン
ビトロでの方法のために、ウイルスは、技術上周知のように、標準のウイルス形
質導入法により細胞に投与することができる。ウイルス粒子は、特定の標的細胞
に適切な標準の形質導入法により適切な複数の感染で細胞に添加される。投与す
るウイルスの力価は、標的細胞型及び特定のウイルスベクターによって変動し、
過度の実験なしに当業者により決定できることが好ましい。好ましくは、少なく
とも約１０００感染単位、さらに好ましくは、少なくとも約１０，０００感染単
位が細胞に投与される。選択的に、本発明のアデノウィルスベクターは、以下に
記載するように、技術上周知の他の手段により達成することができる。
【０１１７】 好ましい１実施例において、本発明は、インビボ又はインビトロで細胞内に異
種ヌクレオチド配列を送達する方法を提供する。この方法により、細胞が本発明
による（詳しく上述した）少なくとも１つのアデノウィルスベクターに感染する
。この細胞はウイルス形質導入の自然なプロセスによりアデノウィルスベクター
に感染する。選択的に、ベクターは技術上周知の他の方法により細胞内に導入す
ることができる。例えば、細胞は（以下に記載される）標的アデノウィルスベク
ターと接触し、別の機序、例えば、受容体媒介性エンドサイトーシスにより吸収
される。別の実施例として、ベクターは抗体又は他の結合タンパク質を用いて内
部移行の細胞表面タンパク質を標的にしうる。
【０１１８】 発明力のあるウイルスベクターが投与される細胞は、神経細胞（末梢又は中枢
神経系）、網膜細胞、上皮細胞（皮膚、腸、呼吸器、膀胱及び乳房組織上皮を含
む）、筋細胞（心臓、平滑筋、骨格筋、及び横隔膜筋を含む）、膵細胞（島細胞
を含む）、肝細胞（例えば、実質）、線維芽細胞、内皮細胞、生殖細胞、肺細胞
（気管支細胞及び肺胞細胞を含む）、前立腺細胞、等を含むが、これらに限定さ
れないどの型でもありうる。さらに、細胞は、上記したように、どの種の起源で
もありうる。アデノウィルスにより自然に形質導入される細胞であることが好ま
しい。
【０１１９】 本発明のアデノウィルスベクターは、生体外の細胞により対象のタンパク質又
はペプチドを生成するために使用することができる。アデノウィルスは、上述し
たように、対象のタンパク質又はペプチドをコード化しうる異種ヌクレオチド配
列をコード化する。ヌクレオチド配列は、治療タンパク質又はペプチドをコード
化することが好ましい。さらに好ましい実施例において、異種ヌクレオチド配列
はＧＡＡ、さらに好ましくは、ｈＧＡＡであり、これは標準の方法を用いて細胞
から分離され、酵素補充プロトコールを用いてＧＡＡ欠乏対象に投与されうる（
例えば、Van der Ploegら、（1991）J. Clin. Invest. 87:515を参照）。
【０１２０】 選択的に、アデノウィルスベクターは、例えば、Georgeらに対する米国特許第
５，８６１，１５６号、Curielらに対する米国特許第５，５２１，２９１号に記
載され、その開示の全体が本明細書中で援用される抗体を用いたアデノウィルス
による形質導入に通常適格性ではない細胞を含む、細胞を標的にすることができ
る。選択的に、アデノウィルは、例えば、Douglasら、（1996）Nature Biotechn
ology 14:1574；Wickhamらに対する米国特許第５，７７０，４４２号；及びWick
hamらに対する米国特許第５，７１２，１３６号（その開示の全体が本明細書中
で援用される）に記載されたアデノウィルスの表面上に結合タンパク質又はリガ
ンドを発現することにより細胞表面タンパク質（例えば、受容体）を標的にする
ことができる。
【０１２１】 本発明の特別の実施例において、細胞は対象から除去され（例えば、樹状細胞
、肝細胞、中枢神経系の細胞、筋芽細胞（骨格筋芽細胞を含む）、幹細胞（骨髄
細胞）、膵細胞）、アデノウィルスベクターがその中に導入されて、細胞が対象
に戻されて置換される。生体外の治療のために対象から細胞を除去し、対象に戻
されて導入される方法は技術上周知である。実例としての実施例において、肝細
胞が対象から除去され、ＧＡＡ（例えば、ｈＧＡＡ）を発現する示強性アデノウ
ィルスがその中に導入され、異種ＧＡＡ遺伝子を発現する肝細胞が対象内に戻さ
れて再導入される。さらに代替として、操作されて対象に導入される細胞は、別
の対象又は株細胞から供給される。
【０１２２】 本発明の別の態様が、示強性アデノウィルスによるインビボで対象を治療する
方法である。それを必要するヒト対象又は動物に対する本発明のアデノウィルス
粒子の投与は、ウイルスベクターを投与するための技術上周知の手段により行う
ことができる。好ましくは、少なくとも約１０００、さらに好ましくは、少なく
とも約１０，０００感染単位が１治療につき対象に投与される。好ましくは、対
象は哺乳動物の対象であり、さらに好ましくは、ヒト対象である。リソソーム貯
蔵疾患又は糖原病と診断されている対象であることが好ましい。ＧＡＡ欠乏症と
診断されている対象がさらに好ましい。
【０１２３】 ＩＩ型ＧＳＤは、ＧＡＡの活性喪失を来たす常染色体劣性遺伝障害である。こ
の疾患はＧＡＡ遺伝子自体の突然変異により引き起こされ、骨格筋及び心筋のリ
ソソーム中にグリコーゲンの蓄積を来たし、心筋症及び骨格筋症の原因となる。
この状態は先天性（幼児期発症）形態での死亡及び小児期並びに成人期発症形態
での重篤な衰弱を来たす。
【０１２４】 ＩＩ型ＧＳＤ（一般に『ポーンプ病』と呼ばれるが、この用語は正式には疾患
の小児期発症型を指す）を有する患者において、酸α−グルコシダーゼの欠乏が
リソソーム中グリコーゲンに大量の蓄積を引き起こし、細胞機能を混乱させる（
Hirschmhorn、『遺伝性疾患の代謝及び分子的根拠』、第７版、第２巻（Scriver
, C.R.ら編集）2443-2464（McGraw-Hill、ニューヨーク、1995）。最も一般的な
小児型では、患者は進行性の筋変性及び心筋症を示し、２歳になる前に死亡する
。ヒト胎盤又はクロカビから得られる酵素の静脈内注射により、ＧＡＡ欠乏症患
者における酵素及びグリコーゲンの肝臓中のレベルは矯正されたが、筋又は心臓
中のレベルは矯正されなかった（Hugら、（1968）Clin. Res. 16:345; de Barsy
ら、『リソソーム貯蔵疾患における酵素補充療法』（Tger, J.M., Hoogwinkel,
G. J. M.&Daems, W.T.）277-279（North-Holland Publishing Co., アムステル
ダム、1974）；Hugら、（1967）Cell Biol. 35:C1）。
【０１２５】 ＧＡＡは、マンノース−６−リン酸受容体を介し、及びシグナル受容体の欠失
型切断と関連した配列によりリソソームに標的することができる（『遺伝性疾患
の代謝及び分子的根拠』、第７版、第２巻（Scriver, C.R.ら編集）2443-2464（
McGraw-Hill、ニューヨーク、1995）。ウシ精巣、ヒト尿、又は一時的に形質移
入されたＣＯＣ細胞の培地からのＧＡＡ酵素を含有するマンノース−６−リン酸
は、マンノース−６−リン酸を通じて患者の培養細胞により有効に吸収される（
Hoefslootら、（1990）Biochem. J. 272:485; Oude-Elferinkら、（1984）Eur.
J. Biochem. 139:489; Reuserら、（1984）Exp. Cell Res. 155:178; Van der P
loegら、（1988）J. Neurol. 235:392）。マウスに静脈内注射されたウシ精巣酵
素は、心臓及び筋組織における大量のマンノース−６−リン酸受容体を介してこ
れらの組織に標的される（Van der Ploegら、（1991）J. Clin. Invest. 875:51
3）。
【０１２６】 ヒトにおける治療上の使用のために、種間抗原性はヒト酵素を必要とする（Hu
gら、（1968）Clin. Res. 16:345）が、ヒト尿中の低存在量の酵素はこのソース
を非実用的にし（Oude-Elferinkら、（1984）Eur. J. Biochem. 139:489）、遺
伝子治療の方法が望ましくなる。
【０１２７】 遺伝子治療は、細菌中で作られる組換えヒト酸α−グルコシダーゼが触媒的に
活性であり（Martiniukら（1992）DNA and Cell Biology 11:701）、昆虫細胞中
のバキュロウイルスを用いて作られる組換え酵素が活性であったが、ヒト線維芽
細胞により十分に吸収されなかった（Wuら、（1993）Am. J. Hum. Genet. 53（
補遺）：963）という点で、ＧＡＡ欠乏症を治療する特に適切な方法である。こ
れとは対照的に、一時的に形質移入されたＣＯＳ細胞により分泌される酵素は活
性であり、線維芽細胞により十分に吸収される（Hoefslootら、（1990）Biochem
. J. 272:485）。
【０１２８】 このため、必要な翻訳後修飾は、活性であり所望の組織による吸収能がある費
用のかからない発現系（例えば、細菌及び昆虫系）において酵素を生成すること
を困難にすると思われる。これは、治療される生物の体外の正確に修飾された活
性酵素の製造を困難にする。患者への遺伝物質の導入により、その生物の細胞内
で実施される合成が可能となり、これらの困難が除去される。
【０１２９】 したがって、本発明の別の態様は、疾患の乳児期（ポーンプ病）、小児期及び
成人期発症型を含むＧＡＡ欠乏症対象を治療する方法である。好ましくは、対象
はヒト対象である。この方法によれば、対象は、ＧＡＡタンパク質をコード化す
る生物学的に有効な量のヌクレオチド配列を対象の非筋組織に投与される。好ま
しくは、非筋組織は臓器組織（例えば、脳、脾臓、肝臓）であり、肝臓であるこ
とが最も好ましい。ＧＡＡをコード化するヌクレオチド配列は、上述した通りで
あり、成熟及び前駆ＧＡＡタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む。
ヌクレオチド配列の「生物学的に有効」な量は、標的組織又は臓器における少な
くとも１つの細胞によりヌクレオチド配列が吸収及び発現されるのに十分である
量である。好ましくは、少なくとも約１０％の標的細胞が、ＧＡＡタンパク質を
コード化するヌクレオチド配列を吸収し、発現することであり、さらに好ましく
は、少なくとも約２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％又はそれ以
上の標的細胞がヌクレオチド配列を吸収し、発現することである。さらに好まし
い実施例において、実質的にすべての標的細胞がＧＡＡタンパク質をコード化す
るヌクレオチド配列を吸収し、発現する。好ましい実施例において、ＧＡＡをコ
ード化するヌクレオチド配列は肝臓に投与される。肝臓に対する投与様式は以下
に述べる通りである。
【０１３０】 ＧＡＡをコード化するヌクレオチド配列は、ウイルスベクター、リソソーム、
直接ＤＮＡ注射、等を含む技術上周知のどの方法によっても投与することができ
る。好ましくは、ヌクレオチドは本発明の（上述した通り）組換え欠失型アデノ
ウィルスベクターにより輸送されることである。
【０１３１】 好ましくは、細胞（例えば、肝細胞）はＧＡＡタンパク質をコード化するヌク
レオチド配列を吸収し、ＧＡＡタンパク質を発現するとともに、それを治療量で
標的組織（例えば、筋）に送達される循環系に分泌する。「治療量」により、Ｇ
ＡＡが標的組織により吸収され、対象におけるＧＡＡ欠乏症の症状の少なくとも
１つを軽減する（すなわち、減少、緩和、縮小させる）ことが意図されている。
標的組織に対してＧＡＡを送達する損害を利点がまさる限り、ＧＡＡ欠乏症の症
状が除去される必要はない。
【０１３２】 本発明人は、マンノース−６−リン酸残基を含有する、ＧＡＡタンパク質の１
１０ｋＤ前駆型を発現することが有利であることを見出した。本発明の特別な推
論により束縛されることは望ましくないが、ＧＡＡ前駆体は標的組織の表面上で
マンノース−６−リン酸受容体により吸収され、内部移行されたタンパク質がそ
の成熟型に加工され、これが標的組織に対する治療効果を生むと思われる。
【０１３３】 本発明のこの実施例を実行する点で、肝臓（又は他の臓器）によるＧＡＡ（又
は通常、分泌されない他のタンパク質）の高レベルの発現は、リソソームコンパ
ートメントにＧＡＡタンパク質を標的する肝細胞内の自然な機序が飽和すること
により、標的組織及び臓器に対する送達のための分泌経路に入る「過剰な」タン
パク質が生じると思われる点で有利である。発明力のあるアデノウィルスは、ア
デノウィルスが高感染性であり、高レベルの導入遺伝子発現を生じるため、この
目的に特に適している。
【０１３４】 したがって、これらの方法は、筋組織に対するヌクレオチド配列の直接送達に
より生じる多くの問題を克服する。筋内注射によるウイルスベクターの投与は、
ウイルスが注射部位に局在されることを明らかにした（Tsujinoら（1998）Human
Gene Therapy 9:1609 Nicolinoら、（1998）Human Molecular Genetics 7:1695
; Paulyら、（1998）Gene Therapy 5:473; Zretskyら、（1997）Hum. Gene Ther
. 8:1555）。したがって、すべての筋にＧＡＡ導入遺伝子を送達するにはＩＩ型
ＧＳＤ患者のそれぞれの筋群への直接の複数注射が必要となる。さらに、静脈内
投与後に、アデノウィルスは通常、少数の筋線維のみを形質導入する（Stratfor
d-Perricaudedら、（1992）。Clin Invest. 90:626; Kass-Eislerら、（1994）G
ene Ther. 1:395）。本発明人は、単回静脈内注射後の肝臓からのＧＡＡ発現が
、心臓及び骨格の標的細胞を直接形質導入する問題を有利に回避することを見出
した。
【０１３５】 当業者は、上述の方法を用いて１つの組織又臓器にタンパク質生成物が生じ、
それを別の標的組織に、例えば循環系を介して送達できることを理解するであろ
う。好ましくは、この方法は代謝疾患、さらに好ましくは、リソソーム貯蔵疾患
及び糖原病と関連した他のタンパク質又はペプチドが、それぞれ上述したように
生じるために用いられる。筋組織に送達するためにタンパク質又はペプチドを生
じる方法であることも好ましい。ヌクレオチド配列が発現及び他の標的組織に対
する送達のために肝臓に導入されることが、さらに好ましい。
【０１３６】 同様に、本発明は肝臓（又は他の臓器及び組織）による他のリソソームタンパ
ク質の高レベルの発現を得る方法を提供する。タンパク質は肝臓により発現及び
分泌し、全身の循環により標的組織に送達することができ、マンノース−６−リ
ン酸受容体により吸収される。
【０１３７】 選択的に、本発明は、（上述したように）ＧＡＡをコード化する異種ヌクレオ
チド配列を保有する（上述したように）示強性の欠失型アデノウィルス粒子の治
療上有効な量を対象に投与することを含むＧＡＡ欠乏症対象を治療する方法を提
供する。本明細書中で用いられる「治療上有効な」量は、ＧＡＡ欠乏症と関連し
た症状の少なくとも１つを軽減する（すなわち、減少、緩和、縮小させる）量で
ある。ＧＡＡ投与の損害を利点がまさる限り、ＧＡＡがＧＡＡ欠乏症の症状を除
去することは必要ではない。
【０１３８】 実例としての投与様式は、経口、直腸、経粘膜、局所、経皮、吸入、非経口（
例えば、静脈内、皮下、皮内、筋内、及び関節内）投与、等、及び直接組織（例
えば、筋）又は臓器投与（例えば、中枢神経系に送達するための肝内、脳内）、
選択的に、くも膜下腔内、直接筋内、脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、又は眼
内注射を含む。注射剤は、液体溶液又は懸濁液としてのいずれかの在来形態で、
注射前の液体中の溶液又は懸濁液の適した形態、又は乳濁液として調製すること
ができる。選択的に、全身ではなく局所的に、例えば、デポー又は持効性製剤で
ウイルスを投与することができる。
【０１３９】 本明細書中で開示されたアデノウィルスは、選択的に適切な手段により対象の
肺に投与することができるが、対象が吸引する発明力のあるアデノウィルスベク
ターからなる呼吸可能な粒子のエアロゾル懸濁剤を投与することにより投与され
ることが好ましい。本発明のアデノウィルスベクターを含む液体粒子のエアロゾ
ルは、当業者には周知の通り、圧力推進エアロゾルネブライザー又は超音波ネブ
ライザーなど、適切な手段により生成しうる。例えば、米国特許第４，５０１，
７２９号を参照。発明力のあるウイルスベクターを含む固体粒子のエアロゾルは
同様に、製薬技術で周知の方法により、固体の粒子性薬物エアロゾル発生装置に
より生成しうる。
【０１４０】 本発明の特に好ましい実施例において、対象のヌクレオチド配列は対象の肝臓
に送達される。肝臓への投与は、静脈内投与、門脈内投与、胆道内投与、動脈内
投与、及び肝実質内への直接注射を含むが、これらに限定されない、技術上周知
の方法により達成することができる。
【０１４１】 投与量は、投与様式、疾患又は治療される状態、個々の対象の状態、特定のウ
イルスベクター、及び送達される遺伝子によって決まり、ルーチン的に決定する
ことができる。少なくとも約１０，０００感染単位の示強性アデノウィルスベク
ターが対象に投与されることが好ましい。治療効果を達成するための実例として
の投与量は、１０８〜１０１４粒子、好ましくは、１０１０〜１０１３粒子、さ
らに好ましくは１０１２粒子のウイルス力価である。
【０１４２】 本発明の特別な実施例において、１回以上の投与（例えば、２、３、４回又は
それ以上の投与）を行って、遺伝子発現の治療レベルを達成することができる。
【０１４３】 本発明を説明したところで、以下、いくつかの実施例を参考にして例示するが
、これらは例示を目的としてのみ本明細書中に含まれるものであり、本発明の制
限が意図されるものではない。
【０１４４】 （実施例） 実施例１Ｅ２ｂ−ポリメラーゼ遺伝子の欠失されたＡｄベクターの作成 Ａｄ Ｅ２Ｂ領域を含むｐＢＨＧ１１（Microbix、トロント）の〜２０ｋｂ X
ｂａ−ＢａｍＨ１細断片をｐBluescriptＫＳＩＩ＋（Stragene、La Jolla、CA）
にサブクローニングし、ｐＡＸＢを得た。ｐＡＸＢプラスミドをＢｓｐＥ１、Ｔ
４ ＤＮＡポリメラーゼ末端充填、ＢａｍＨｌ消化で消化し、〜９．０キロベー
ス対（ｋｂ）断片を分離した。プラスミドｐＡＸＢもＢｓｐＥ１、Ｔ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼ末端充填、ＢａｍＨｌ消化で消化し、〜１３．７ｋｂ断片を前に分
離した９．０ｋｂ断片に結合し、ｐＡＸＢ−Δｐｏｌを生成した。このサブクロ
ーニング法は、ポリメラーゼ遺伝子のアミノ終端内の６０８塩基対（Δｐｏｌ：
Ａｄ５ヌクレオチド７２７４−７８８１）を欠失した。この欠失は、Ａｄゲノム
のこの領域における右方向への読み鎖上に存在する、ＯＲＦ９．４も有効に除去
した。ｐＡＸＢ−ΔｐｏｌのＸｂａ−ＢａｍＨｌ細断片をＸｂａ−ＢａｍＨｌ消
化ｐＢＨＧ１１に再導入し、ｐＢＨＧ１１−デルタｐｏｌを生成した（図１、パ
ネルＡ）。
【０１４５】 理論的に、ｐＢＨＧ１１−Δｐｏｌは在来のＡｄシャトルプラスミド（Bett,J
.J.ら、（1994）PNAS USA 91:8802-8806）とポリメラーゼトランス相補性細胞の
同時形質移入後の組換え［Ｅ１−Δｐｏｌ］Ａｄベクターの発生能があるとされ
ているが、残念ながらわれわれはこの方法でかかるベクターを発生させることが
できなかった。ｐＢＨＧ１１のわれわれのバージョンは生ベクター分離を禁止す
る潜在性の点突然変異を獲得したことが考えられる。したがって、われわれは、
株細胞Ｃ−７を発現するポリメラーゼ内にＳｃａｌ消化ｄｌ７００１由来ゲノム
ＤＮＡとｐＢＨＧ１１−Δｐｏｌを同時形質移入した（図１、パネルＢ）．Ａｄ
ｄｌ７００１ゲノムＤＮＡはＡｄ染色体のＥ３領域内に〜３．０ｋｂ欠失を有
し、Joensら、Cell 13: 181-88（1978）に記載された通り、無傷の生ＤＮＡ末端
タンパク質複合体として分離された。Ｃ７株細胞は以前に記載されている（Amal
fitanoら、（1996）PNAS USA 93:3352-56）。簡単に言えば、これらの細胞は、
［Ｅ１−］Ａｄ、及びポリメラーゼ及び末端前タンパク質遺伝子の両方において
欠陥性の温度感受性Ａｄ突然変異をトランス相補する能力がある。この株細胞は
、ヒト２９３細胞内にポリメラーゼ及び末端前タンパク質遺伝子を恒常的に発現
する導入遺伝子の安定な同時導入により達成された。
【０１４６】 同時形質移入法により、ｄｌ７００１背景におけるΔｐｏｌ欠失（ＡｄΔｐｏ
ｌ）及びｐＢＨＧ１１背景におけるΔｐｏｌ欠失（ＡｄΔｐｏｌ／ｐＢＨＧ１１
）の２つ生ウイルスが分離された。両方のウイルスは生存可能であったが、ｄｌ
７００１由来ウイルスは優れた増殖特性を示し、したがって後の研究のために選
択した。
【０１４７】 実施例２［Ｅ１−、Δｐｏｌ、Ｅ３−］及び［Ｅ１−、Δｐｏｌ、ΔｐＴＰ、Ｅ３−］Ａ
ｄベクターの作成 ＡｄΔｐｏｌウイルスを高力価に増殖させ、ウイルスＤＮＡを以前に記載され
たように（Amalfitanoら、（1996）PNAS USA 93:3352-56）分離し、Ａｓｃｌ、
末端充填Ｔ４ポリメラーゼ、及び消化Ｂｓｔ１１０７１で消化した。断片を含有
する〜９．３ｋｂの平滑断端にしたΔｐｏｌをＢｓｔ１１０７１消化シャトルプ
ラスミドｐＡｄＡｓＬにサブクローニングした。このサブクローニング法により
、Ａｄ Ｅ１及びポリメラーゼ遺伝子が欠失される組換えＡｄベクターの迅速分
離のために特別にデザインされた新しいシャトルプラスミド、ｐＡｄＡｓｃＬ−
Δｐｏｌが得られた。ｐＡｄＡｓｃＬ−Δｐｏｌプラスミドは、Ａｄ５ゲノムの
左末端のヌクレオチド1−１５，６７１を含有したが、Ｅ１遺伝子（Ａｓｃｌ部
位により置換されたＡｄ ｎｔ３５８−３３２８）のために有効に欠失され、６
０８ｂｐΔ欠失のためにも欠失された。最小サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プ
ロモーター／エンハンサー要素、ＭＩＮＸイントロン（Niwa, M.ら、Genes Dev
4:1552-1559（1990）及びサルウイルス４０（ＳＶ−４０）由来ポリアデニル化
シグナルによりフランキングされた核標的細菌α−ガラクトシダーゼ導入遺伝子
（ＬａｃＺ）をｐＡdｓｃｌ−ΔｐｏｌのＡｓｃｌ部位にサブクローニングし、
シャトルプラスミドｐＡｄＣＭＶ／ＬａｃＺ／Δｐｏｌを生成した（図１、パネ
ルＣ）。ＢｓｐＨｌ（Ａｄウイルスの左末端の６０ｂｐ内の制限部位）で直線化
されたｐＡｄＣＭＶ／ＬａｃＺ／Δｐｏｌの１０マイクログラムを、Ｃ−７細胞
を発現する２×１０６Ａｄ−ポリメラーゼを含有する６０ｍｍのシャーレ３枚上
に、５００ｎｇのＸｂａｌ、Ｃｌａｌ、及びＳｃａｌ消化ｄｌ７００１−ＴＰウ
イルス粒子ＤＮＡとＣａＰＯ４同時形質導入した（図１、パネルＣ）。ｄｌ７０
００１−ＴＰウイルス粒子ＤＮＡの複数の制限酵素消化により、形質移入後の非
組換えウイルスの分離が大幅に減少した。形質移入後１６時間後に細胞を収集し
、〜８×１０６Ｃ−細胞（非形質移入）と混合した。細胞混合液を９つの２４ウ
ェル培養クラスタープレートに分配し、５〜９日間３７．０℃でインキュベート
した。ウイルスＣＰＥを示した個々のウェルを収集し、分離ウイルスをＢ−６細
胞又はＢ−７細胞のいずれかの反復感染により増幅させた。その後、（１）ベク ターにより形質導入された細胞における染色体基質Ｘｇａｌのα−ガラクトシダ ーゼ変換（２）ベクターゲノムのＤＮＡ制限マッピング、及び（３）複数の機能 的試験により、ＡｄＬａｃΔｐｏｌ組換えベクターの分離を確認した。
【０１４８】 ポリメラーゼ領域及び末端前タンパク質領域の両方における欠失を含有するＡ
ｄベクターを作成するために、シャトルプラスミドｐＡｄＣＭＶ／Ｌａｃ／Δｐ
ｐを生成した。ｐＡｄＣＭＶ／Ｌａｃ／ΔｐｏｌシャトルプラスミドをＢｓｐＥ
１（ｐＴｐ遺伝子の３’末端をコード化する〜２．０ｋｂ細断片を放出する）で
消化した。ｐＴＰコード領域内に欠失を含有したｐＴＰ遺伝子の以前に改変した
ＢｓｐＥ１細断片をＢｓｐＥ１消化プラスミドに結合した。この方法により、ｐ
Ｔｐ遺伝子の３’末端内に４３３ｂｐ欠失をも含有した点を除きｐＡｄＣＭＶ／
Ｌａｃ／Δｐｏｌと類似した、シャトルプラスミドｐＡｄＣＭＶ／Ｌａｃ／Δｐ
ｐが分離された。欠失はＡｄ５ゲノムのヌクレオチド９１９８乃至９６３０に及
んだ（配列決定により確認された欠失）。それぞれの欠失は、Ａｄゲノムの５’
末端に結合するｐＴＰに必要とされる重要なセリン残基、及び他の重要なｐＴＰ
機能をコード化するｐＴＰ遺伝子の３’部分に及んだ。
【０１４９】 １０μｇのｐＡｄＣＭＶ／Ｌａｃ／ΔｐｐをＢｓｐＨｌ（Ａｄウイルスの左末
端の６０ｂｐ内の制限部位）で直線化し、５００ｎｇのＸｂａｌ、Ｃｌａｌ、及
びＳｃａｌ消化ｄｌ７００１−ＴＰウイルス粒子ＤＮＡとＣ−７細胞にＣａＰＯ ４ 同時形質導入し、一晩インキュベートした。その後、形質移入された細胞を１
０枚の２４ウェルシャーレに分配し、組換えベクターのクローン分離を可能にし
た。いくつかのウェルは、β−ガラクトシダーゼをコード化する組換えベクター
を含有し、同時にＥ１、Ｅ３、ｐｏｌ及びｐＴＰが欠失されたことが確認された
。その後、（１）ベクターにより形質導入された細胞における染色体基質Ｘｇａ
ｌのβ−ガラクトシダーゼ変換；（２）ベクターゲノムのＤＮＡ制限マッピング
、及び（３）複数の機能的試験により複数の欠失型、ＡｄＬａｃＺ／Δｐｐ組換
えベクターの分離も確認された。
【０１５０】 実施例３ＡｄΔｐｏｌ、ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ及びＡｄＬａｃＺΔｐｐベクターゲノム複
製試験 それぞれの株細胞を、ＡｄΔｐｏｌ、Ａｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺ（Ｅ１欠失の
み）、ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ（Ｅ１欠失＋ポリメラーゼ欠失）又はＡｄＬａｃＺ
Δｐｐ（Ｅ１欠失、ポリメラーゼ欠失、及びｐＴＰ遺伝子欠失）のいずれかで図
２及び図３に示した複数の感染（ＭＯｌ）で感染させ、表示した時間、３７．０
℃でインキュベートした。次に、感染細胞を収集し、以前に記載されているよう
にＤＮＡを調製、分析した（Amalfitanoら、（1996）PNAS USA 93:3352-56）。
図２及び図３の結果は、高レベルのＥ１活性の存在下でもΔｐｏｌ修飾がベクタ
ー上に激しい複製遮断を伝達することを示している。この遮断は、第一世代のＡ
ｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺベクターにより示されたもの（図３）よりも大幅に大き
かった。図２及び図３は、感染後１２〜２４時間までに実質的に検出不可能であ
るいわゆる「破壊型」ベクターを用いた報告とは対照的に、入力ゲノムが２４時
間で入力ウイルスレベルの少なくとも７５％及び４８時間で少なくとも５０％ま
で持続することを示す。
【０１５１】 実施例４Ａｄベクター動態及び一段階バーストアッセイ 動態アッセイ ： ２×１０６２９３細胞（Ｅ１タンパク質を発現）、Ｂ−６細
胞（Ｅ１及びポリメラーゼタンパク質を発現）、又はＣ−７細胞（Ｅ１、ポリメ
ラーゼ、及びｐＴＰタンパク質を発現）を含有する組織培養シャーレ（６０ｍｍ
）を、１細胞につき０．０１β−ガラクトシダーゼ形成単位（ＢＦＵ）のＭＯｌ
でのＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ又は１細胞につき０．５β−ガラクトシダーゼ形成単
位（ＢＦＵ）のＭＯｌでのＡｄＬａｃＺΔｐｐに感染させた。細胞及び培地を図
４及び図５に示した時間、３７．０℃でインキュべーション後にシャーレから収
集した。次に、Ｃ−７細胞又はＬＰ−２９３細胞の限界希釈感染により、生成し
たＢＦＵの数を測定した。１８時間後に感染細胞をβ−ガラクトシダーゼ活性に
ついて染色し、形質導入粒子の数を青色染色細胞の視覚的検査で定量化した。さ
らに、最初のライセート中に発生したＢＦＵを適切な希釈により染色核の数を増
加することで測定した。Ａｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺと２９３細胞の同一の感染を
含めて、第一世代のＡｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺベクターとのＡｄＬａｃＺΔｐｐ
の増殖の動態を比較した。結果は図４及び図５に示されている。
【０１５２】 一段階バーストアッセイ ： ２×１０６２９３細胞、Ｂ−６細胞又はＣ−７細
胞を、それぞれＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ、Ａｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺ又はＡｄＬａ
ｃＺΔｐｐに５のＭＯｌで感染させ（三通り）、４０時間（２９３細胞のＡｄｓ
ｕｂ３６０ＬａｃＺ感染及びＢ−６細胞のＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ）又は６０時間
‘Ｃ−７細胞のＡｄＬａｃＺΔｐｐ感染）、３７．０℃でインキュベートし、動
態アッセイについて前述したように、限界希釈アッセイにより発生した総ＢＦＵ
を測定した。
【０１５３】 実施例５ Ａｄベクター後期遺伝子発現試験 ＬＰ−２９３細胞、Ｂ−６細胞、又はＨｅＬａ細胞を図６、図７及び図８に示
したＭＯｌでＡｄΔｐｏｌ、Ａｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺ、ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ
又はＡｄＬａｃＺΔｐｐに感染させ、４０〜４８時間、３７．０℃でインキュベ
ートした。感染細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、ＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ６．８）、
４％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％グリセロール、及び１０％Ｂ−メルカプト
エタノール中に溶解した。タンパク質抽出物を３回凍結融解し、ＤＮＡを剪断し
、クーマシープラス染色試薬（Pierce、Rockford、IL）を用いたブラッドフォー
ドアッセイによりタンパク質濃度を測定した。等量の各タンパク質ライセートを
２分間１００．０℃に加熱し、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で電気泳
動的に分離した。分離タンパク質をバイオトレース（Biotrace）ＮＴ膜（Gelman
Science、Ann Arbor、MI）に湿導入し、６６ｋＤ Ａｄ線維タンパク質モノマー
のノブ部分に対して作成されたウサギポリクローナル抗体（R. Gerard、テキサ
ス南西大学、ダラス、ＴＸより提供）で探索した。結合抗体をＥＣＬ検出装置（
Amersharm Life Science、Arlington Heights、IL）により検出した。
【０１５４】 実施例６ ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌのインビボ投与 〜２．５×１０７Ｃ−７細胞を含有する６０枚の１５０ｍｍ組織培養プレート
を約５のＭＯｌでＡｄＬａｃＺΔｐｏｌウイルスに感染させ、４０時間、３７．
０℃でインキュベートした。感染細胞を収集し、１０ｍｍＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ８
．０）中に再懸濁し、超音波処理し、２回の塩化セシウム密度遠心分離により精
製した。バンドを含有するウイルスをセファデックスＣＬ−６Ｂカラム（Pharma
cia Biotec, Piscataway, NJ）上で脱塩し、１２％の濃度までグリセロールを添
加し、アリコートを−８０℃で保存した。この保存液の力価は、１ｍｌにつき６
×１０１０ＢＦＵであった。この保存液中の粒子の総数は１．２×１０１２であ
ることが、ＳＤＳ溶解後のウイルスのＯ．Ｄ．２６０のアリコートの測定により
確認され（Mitterederら、（1996）J. Virol. 70:7498）、したがって、調製液
の生物活性は最小０．０５、（６×１０１０／１．２×１０１２）で、第一世代
のＡｄベクター（同上）分離後に達成された値とほぼ同じであった。７週乃至９
週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに対し左前脛骨筋又は尾静脈を介して１×１０９ＢＦ
ＵのＡｄＬａｃＺｐｏｌを含有するＰＢＳ溶液を注射した。注射後５〜６日に、
マウスを屠殺し、筋又は肝の試料を除去し、ＯＣＴ化合物中に凍結した。凍結切
片を得て、３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液中に短時間固定し、β−ガラ
クトシダーゼ活性について一晩染色し、ＰＢＳ中で洗浄するとともに、ＰＢＳ中
の３．７％ホルムアルデヒド、０．５％グルタルアルデヒド中で短時間、後固定
した。次に、各切片をエオシン対比染色し、写真を撮った。結果は図９に示し、
実施例１１で説明されている。
【０１５５】 実施例７ Δｐｏｌベクター Ａｄ−ポリメラーゼ温度感受性（ｔｓ）−突然変異の増殖支持能に基づくＡｄ
Ｅ１遺伝子及びポリメラーゼ遺伝子を同時発現するパッケージング株細胞の分
離は以前に記載されている（Amalfitanoら、（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 93:3352-3356）。本明細書中に記載され、図１に示されたように作成される
ウイルスＡｄΔｐｏｌは、ポリメラーゼ遺伝子内に６０８ｂｐ欠失を含有する（
図１、パネルＢ）。実施例１に記載されたΔｐｏｌ欠失もＯＲＦ９．４を効率的
に欠失し、結果として生じるウイルスの増殖可能性に関する結果は認められなか
った。ＡｄΔｐｏｌゲノム構造の確認は、制限酵素の消化により達成された（図
１０）。ＡｄΔｐｏｌは、Ａｄポリメラーゼを発現する細胞中で増殖されないと
激しい複製欠陥を有し、導入された６０８ｂｐ欠失に続発するポリメラーゼ活性
の欠如が確認された（図４）。高レベルのＥ１活性（ＡｄΔゲノム及び２９３細
胞を発現するＥ１の両方からの）にもかかわらず、ＡｄΔｐｏｌはＣ７株細胞以
外の細胞中では有意な複製はできない。これは、おそらく非許容宿主及び標的細
胞においても有意に漏出性であるインビボ及びインビトロでの第一世代のＡｄベ
クターの挙動と対照をなす（lieber, A.ら、（1996）Journal of Virology 70:8
944-8960, Yang, Y.ら、（1994）Nat Genet 7:362-369）。
【０１５６】 実施例８ ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌの分離及び増殖の動態 ［Ｅ１−、Ｅ３−、Δｐｏｌ］Ａｄベクターの生成を促進するために、シャト
ル系の構成を操作した（図１、パネルＣ）。複数の消化ｄｌ７００１ＤＮＡ−Ｔ
Ｐ複合体による直線化されたｐＡｄＣＭＶ／Ｌａｃ／Δｐｏｌの同時形質導入に
より、ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌの分離に成功した。ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌのゲノム
構造は制限酵素分析により確認された（図１１）。ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ増殖の
動態は、２９３細胞及びＢ−６細胞中で測定された（図１２）。この株細胞にお
ける高レベルのＥ１活性の存在にもかかわらず、ＬＰ−２９３細胞中の感染性の
ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌの生成の大幅な欠如に注意されたい。さらに、ＡｄＬａｃ
ＺΔｐｏｌ又はＡｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺに感染したＢ−６細胞の一段階バース
ト分析は、ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌベクターが、Ａｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺベクタ
ーと同じほどの高さ（又はそれ以上に高い）力価に生成しうることを明らかに示
した。例えば、２×１０６Ｂ−６細胞を、それぞれＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ又はＡ
ｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺに５のＭＯｌで感染（それぞれ三通り）させると、感染
４０時間後に放出される総ＢＦＵは、ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌでは１．１８×１０ ８ ±４．２×１０７であり、Ａｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺでは１．７８×１０７±
８．９×１０６であった。Ｂ−６株細胞におけるＡｄＬａｃＺΔｐｏｌの高力価
の増殖は、低コスト及び高効率の臨床的な段階的生成だけではなく、修飾Ａｄベ
クターの増殖を可能にするようにデザインされた以前に記載されたパッケージン
グ株細胞が、同時発現されたＡｄ遺伝子の毒性により、場合により非効率的であ
るという点でも本発明の重要な特性である（Zhou, H. S.ら、（1996）Journal o
f Virology 70:7030-7038）。
【０１５７】 実施例９ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌは複製中に遮断される Ｂ−６細胞の感染はＡｄＬａｃＺΔｐｏｌゲノムの高レベルの複製を可能にし
たが、しかし、２９３細胞の同一の感染は複製の大幅な遮断を示した（図２）。
この結果により、高レベルのＥ１活性の存在下であっても、本発明のΔｐｏｌ修
飾がベクターに対して激しい複製遮断を伝達することが確認された。有意な複製
の欠如にもかかわらず、ＡｄΔｐｏｌゲノム及びＡｄＬａｃＺΔｐｏｌゲノムは
依然として、２９３細胞中に感染後２４時間に入力レベル近くで存在し、感染後
４８時間にのみ減少した。これらの所見を裏づけるように、ＡｄＬａｃＺΔｐｏ
ｌとのＨｅＬａ細胞の高力価の感染（Ｅ１及びポリメラーゼ活性を欠く）は、第
一世代のＡｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺベクターより示されたものよりも大幅に大き
な複製を示した（図３）。
【０１５８】 上で示された複製の欠如にもかかわらず、ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌはＨｅＬａ細
胞感染の２４時間以内に入力ウイルスレベルの少なくとも７５％まで持続し、感
染後４８時間に入力ウイルスの５０％まで降下した（図３）。この結果は、Ａｄ
ゲノムの多くがない「破壊型Ａｄベクター」を利用した報告（Lieberら、（1996
）J. Virol. 70:8944-60）とは対照的である。後者の報告では、「破壊型Ａｄベ
クター」ゲノム５０％がインビトロ及びインビボでの細胞の形質導入の５時間以
内に分解し、形質導入後１２〜２４時間に実質的に検出不可能であった（同上）
。したがって、早期に大量に欠失した「破壊型」Ａｄベクターとは異なり、本発
明のΔｐｏｌＡｄベクターは（過剰なレベルのＥ１活性の存在下でも）その複製
能を激しく遮断したが、破壊型Ａｄベクターとは異なり。この遮断により同時に
そのゲノムが急速に喪失（不安定化）することはない。
【０１５９】 実施例１０ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ後期遺伝子発現は非相補性株細胞において遮断される 細胞型２９３及びＢ−６をＡｄＬａｃＺΔｐｏｌに感染させ、線維タンパク質
の蓄積によりウイルス後期遺伝子発現について評価した。図６に示したように、
ポリメラーゼ相補性Ｂ−６株細胞の感染に対して、２９３細胞の感染後にＡｄＬ
ａｃＺΔｐｏｌベクターの線維タンパク質生成能には少なくとも１０，０００倍
の減少が認められる。さらに、ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌウイルスに感染したときの
ＨｅＬａ細胞は、検出可能な線維タンパク質を生成することがない（図７）。こ
れとは対照的に、Ａｓｕｂ３６０ＬａｃＺとのＨｅＬａ細胞の感染後には、線維
発現が容易に検出される。それと共に、これらの結果はＡｄＬａｃＺΔｐｏｌベ
クターの別の利点は、修飾ベクターにおけるΔｐｏｌの存在により影響される激
しい複製遮断に続発する、ウイルス後期遺伝子の発現の大幅な減少である。線維
タンパク質などＡｄ後期遺伝子生成物はインビボで有力な抗原エピトープであり
、したがって、後期、Ｅ１、及びポリメラーゼ遺伝子生成物の発現の減少により
、インビボでのＡｄΔｐｏｌベクターの効力が大きくなるとみられる。
【０１６０】 実施例１１ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌベクターによるインビボ形質導入 １×１０９ＢＦＵのＡｄＬａｃＺΔｐｏｌを７〜９週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウス
の静脈内（肝形質導入用）又は左前脛骨筋に注射した。５乃至６日後に、それぞ
れの組織を切除し、β−ガラクトシダーゼ活性について染色した。図９に示した
ように、ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌベクターは肝組織中の細菌性β−ガラクトシダー
ゼの過剰な形質導入及び発現能がある。同じ結果はＡｄＬａｃＺΔｐｏｌの筋内
投与後に達成された。したがって、ＡｄＬａｃＺΔポリメラーゼにおけるＥ１及
びポリメラーゼ遺伝子の欠失により示される付加的な複製遮断にもかかわらず、
効率的な形質導入及び導入遺伝子発現がこれらの組織において生じた。これはま
た、有意な導入遺伝子発現が生じる前に、その修飾ミニゲノムがインビボで迅速
に除去される最近記載されたヘルパーウイルス依存性Ａｄベクター系の一部と対
照をなす（Lieber, Aら、（1996）Journal of Virology 70:8944-8960）。
【０１６１】 実施例１２複数の欠失型ΔｐＴＰ Ａｄベクターの作成 ｐＡｄＣＭＶ／ＬａｃＺ／Δｐｏｌシャトルプラスミド及びＥ１、Ｅ３、及び
ポリメラーゼ欠失型ベクターＡｄＬａｃＺΔｐｏｌの作成が実施例１及び実施例
２に記載されている。末端前タンパク質領域におけるシャトルプラスミドを作成
するために、ｐＡｄＣＭＶ／ＬａｃＺ／ΔｐｏｌシャトルプラスミドはＢｓｐＥ
１（ｐＴＰ遺伝子の３’をコード化する〜２．０ｋｂ細断片を放出する）で消化
し、ｐＴＰコード領域内に欠失を含む以前に修飾したＢｓｐＥ１細断片に再挿入
する。結果として生じるシャトルプラスミドｐＡｄＣＭＶ／ＬａｃＺ／Δｐｐを
分離した。このプラスミドは、ｐＴＰ遺伝子の３’末端内に４３３ｂｂ欠失をも
含む点を除き、ｐＡｄＣＭＶ／ＬａｃＺΔｐｏｌとほぼ同じである（図１３）。
４３３ｂｐ ｐＴＰ欠失はＡｄ５ゲノムのヌクレオチド９１９８〜９６３０に及
ぶ。このことは欠失上の配列決定により確認された。ｐＡｄＣＭＶ／ＬａｃＺΔ
ｐｐの作成により、ｐＴＰコード領域の大部分の欠失を来たし、Ａｄゲノムの５
’末端に結合するｐＴＰに必要とされる重要なセリン残基、及び他の重要なｐＴ
Ｐ機能をコード化するｐＴＰ遺伝子の３’部分に及んだ（Schaac J.ら、（1990
）Gene Dev 4:1197-208、Webster Aら、（1997）Journal of Virology; 71:6381
-9）。
【０１６２】 ＢｓｐＨｌ（Ａｄウイルスの左末端の６０ｂｐ内の制限部位）で直線化された
ｐＡｄＣＭＶ／ＬａｃＺ／Δｐｐの１０マイクログラムを、５００ｎｇのＸｂａ
ｌ、Ｃｌａｌ、及びＳｃａｌ消化ｄｌ７００１−ＴＰウイルス粒子ＤＮＡとＣａ
ＰＯ４同時形質導入し、上記の実施例の通り加工した。複数の欠失型ＡｄＬａｃ
Δｐｐ組換えベクターの分離を（１）ベクターにより形質導入された細胞におけ
る染色体基質Ｘｇａｌのα−ガラクトシダーゼ変換（２）ベクターゲノムのＤＮ
Ａ制限マッピング、及び（３）複数の機能的試験により確認した（以下参照）。
【０１６３】 本発明の複数欠失型Ａｄベクターを増殖させるために、ベクターにおいて欠失
される本質的な遺伝子機能のすべてをトランス相補することができるパッケージ
ング細胞が必要である。われわれは、分離され、温度感受性ポリメラーゼ（Ｂ−
６及びＣ−７）及びｐＴＰ突然変異（Ｃ−７）Ｂ−６及びＣ−７株細胞の相補能
について特徴づけられるＢ−６及びＣ−７株細胞（Amalfitano A.ら、（1996）P
NAS USA 93:3352-3356）がポリメラーゼ、ＩＶａ２及び／又はｐＴＰ欠失突然変
異も相補することを明らかにした。
【０１６４】 実施例１３Ｃ−７細胞によるΔｐｐ Ａｄベクターのトランス相補性 この調査では、ΔＴＰ及びΔｐｏｌ Ａｄベクターはポリメラーゼ遺伝子又は
ｐＴＰ遺伝子、例えば、Ｃ−７株細胞内の温度感受性（ｔｓ）突然変異を有する
アデノウィルス系統の増殖を支持する能力のために選択された株細胞において増
殖するとパッケージングできることが明らかにされた、（Amaffitanoら、（1997
）Gene Ther. 45:258）。
【０１６５】 Ａｄ E１、Ｅ３、ポリメラーゼ、及びｐＴＰ遺伝子活性を同時に欠くＡｄベク
ターは、好ましいＣ−７系統など、かかる系統上で高レベルの増殖能がある。複
数の欠失型Ａｄベクターの生成を促進するシャトル系が開発された。直線化され
たｐＡｄＣＭＶ／ＬａｃＺ／Δｐｐシャトルプラスミドの複数の欠失型ｄｌ７０
０１ＤＮＡとの同時形質移入後の標的相同組換えにより、Ｅ１、Ｅ３，ポリメラ
ーゼ、及びｐＴＰ遺伝子活性について同時に欠失した、ＡｄＬａｃＺΔｐｐとし
て示される独特なＡｄベクターの生成に成功した（図１３）。制限酵素分析を利
用してＡｄＬａｃＺΔｐｐのゲノム構造が確認された（図１４）。ＡｄＬａｃＺ
Δｐｏｌベクター（Ｅ１、Ｅ３，及びポリメラーゼ遺伝子の部分が欠失）との比
較において、ＡｄＬａｃＺΔｐｐベクターゲノムは付加的な４３３ｂｐ欠失を含
み、ｐＴＰ特異的欠失の位置を示したことに注意されたい（図１５）。ｐＴＰ翻
訳領域内の欠失は、正常な機能に絶対的に必要とされるタンパク質の重要な部分
を除去し、この欠失を含有する結果として生じるベクターにおけるｐＴＰ活性を
完全に不活性化する。
【０１６６】 この不活性化を明らかにするために、２９３、Ｂ−６、又はＣ−７細胞におい
てトランス相補性を試みたときに、ＡｄＬａｃＺΔｐｐの増殖動態を評価した（
図５）。２９３株細胞における高レベルのＥ１活性、又はＢ−６株細胞における
Ｅ１及びポリメラーゼ遺伝子活性の存在にもかかわらず、インキュべーション時
間を延長した後でも、いずれかの株細胞における感染後に感染性ＡｄＬａｃＺΔ
ｐｐは生成されなかった。この結果は、ポリメラーゼ及びｐＴＰ遺伝子機能がＡ
ｄＬａｃＺΔｐｐベクターにおいて無能力であり、この遮断はベクターが複数の
トランス相補性Ｃ−７細胞株において増殖したときのみ軽減されることを示した
。Ｃ−７株細胞におけるＡｄＬａｃＺΔｐｐの増殖動態は、２９３細胞における
第一世代のベクターＡｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺの増殖と比較すると、わずかに遅
延した。例えば、５のＭＯｌでＡｄＬａｃＺΔｐｐに感染したＣ−７細胞の一段
階バーストアッセイでは、２９３細胞（ｎ＝３）における２．０×１０８±３．
７×１０７ＢＦＵのＡｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺベクターの力価生成と比較して、
１．０×１０８±３．３×１０７ＢＦＵ（ｎ＝３）の力価を生成した。Ｃ−７パ
ッケージング株細胞における高力価のＡｄＬａｃＺΔｐｐベクターの増殖は極端
に有意であった。この結果は、本発明のベクターが混入、トランス相補性ヘルパ
ーウイルスの必要なしに高力価に生成できることを示す。
【０１６７】 ２９３細胞又はＢ−６細胞のＡｄＬａｃＺΔｐｐとの感染は、Δｐｐがそれぞ
れの株細胞におけるＡｄＬａｃＺΔｐｐゲノムの複製に大幅な遮断を導入するこ
とを示した（図１６）。しかし、Ｃ−７細胞の同一の感染は、ＡｄＬａｃＺΔｐ
ｐゲノムの高レベルの複製を可能にした。実施例は、２９３細胞におけるＥ１活
性、又はＢ−６細胞におけるＥ１及びポリメラーゼ活性の存在下でも、Δｐｐ欠
失がベクターに激しい複製遮断を伝達したことを示す。これは、ｐＴＰタンパク
質のアミノ末端内の枠内アミノ酸添加により温度感受性である、ｔｓｐＴＰ突然
変異ｓｕｂ−１００による以前に報告された試験と対照をなす（Amalfitano A.
ら、（1997）Gene Ther., 4:258）。この以前の試験において、ｓｕｂ−１００
突然変異は、ポリメラーゼタンパク質の存在により効率的にトランス相補された
複製欠陥を示した（同上）。明らかに、４３３ｂｐ ｐＴＰ欠失の存在は、重要
なｐＴＰ機能の完全な除去により、ＡｄＬａｃＺΔｐｐゲノム複製を大きく抑制
した。また、入力ＡｄＬａｃＺΔｐｐゲノムは、２９３細胞又はＢ−６細胞にお
ける感染後２４時間の入力レベル近くで存在し続けた。同じ結果は、ＨｅＬａ細
胞（Ｅ１、ポリメラーゼ、及びｐＴＰ活性を欠く）のＡｄＬａｃＺΔｐｐとの感
染後にも確認された（図１７）。ＨｅＬａ細胞の第一世代ベクターＡｄｓｕｂ３
６０ＬａｃＺとの感染後に確認された有意な複製とは対照的に、ＡｄＬａｃＺΔ
ｐｐ入力ゲノムは、ＨｅＬａ細胞感染後４８時間までの間に入力レベルの近くで
複製を欠き、持続した（図１７）。この結果は、本発明の複数の欠失型Ａｄベク
ターにおけるｐＴＰ遺伝子活性の非存在（及び複製の完全な欠如）により、複数
の欠失型ベクターゲノムの不安定化及び／又は急速な喪失を来たすことがないこ
とを示す。
【０１６８】 実施例１４ΔＴＰ欠失はＡｄ後期遺伝子発現を阻止する 多くのＤＮＡウイルス（ポリオーマ、サルウイルス−４０、Ａｄ）は、早期及
び後期により強調される生活環を有する。通常、早期はウイルスゲノムの複製に
必要とされるウイルス遺伝子の発現を反映する。後期は、ウイルスゲノム複製が
開始された後のウイルス構造タンパク質の高レベルの発現を反映する。アデノウ
ィルスでは、後期遺伝子の発現は、ｓｉｓにおいて作用してウイルスの主要な後
期プロモーター（ＭＬＰ）を活性化する事象であるゲノムの物理的複製に依存す
る（Thomasら、（1980）Cell 22:523）。
【０１６９】 本明細書中に記載された結果は、ΔＴＰ欠失突然変異もＡｄ遺伝子発現を阻止
することを示す。後期遺伝子発現遮断は、ＨｅＬａ細胞がＡｄＬａｃＺΔｐｐベ
クターに感染した後に明らかにされた（図８）。線維タンパク質発現（線維ｍＲ
ＮＡはＭＬＰでの開始に由来した）は、以前に２９３細胞における複製能が示さ
れた、Ａｓｕｄ３６０ＬａｃＺベクターとのＨｅＬａ細胞の感染後に迅速に検出
された。これとは対照的に、ＨｅＬａ細胞のＡｄＬａｃＺΔｐｐベクターとの感
染による線維発現は検出可能とはならなかった。
【０１７０】 実施例１５ＡｄＬａｃＺΔｐｐのインビボ投与 〜２．５×１０７Ｃ−７細胞を含有する６０枚の１５０ｍｍ組織培養プレートを
約５のＭＯｌでＡｄＬａｃＺΔｐｏｌウイルスに感染させ、４８時間、３７．０
℃でインキュベートした。感染細胞からのウイルスを実施例１１に記載したよう
にＣｓＣｌ２バンド形成により分離した。得られた感染性ウイルスの量は、第一
世代のＡｄベクターで得られた量と実質的に等しかった。濃縮ウイルスを４．０
℃でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に一晩透析後に脱塩し、グリセロールを添加
し、−２０℃でアリコート保存した。７乃至９週齢の重篤な複合免疫不全（ＳＣ
ＩＤ）又はＣ５７Ｂｌ／６マウスに対しそれぞれのベクターの４×１０９ＢＦＵ
を含有するＰＢＳ溶液（典型的に１５０〜２００ｕＬ）を静脈内注射した。動物
実験はすべて、デューク大学動物治療使用委員会により以前に承認された通りに
実施した。感染後３日にマウスを屠殺し、肝試料をＯＣＴ化合物中に凍結した。
凍結切片を得て、３．７％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ溶液中に短時間固定し、
β−ガラクトシダーゼ活性について一晩染色し、実施例１１に記載したように写
真を撮った。
【０１７１】 実施例１６ＡｄＬａｃＺΔｐｐのインビボ投与の結果 本発明の複数の欠失型Ａｄベクターは、修飾Ａｄベクターによるインビボ形質
導入能がある。ＡｓＬａｃＺΔｐｐの４×１０９β−ガラクトシダーゼ形成単位
（ＢＦＵｓ）をそれぞれ７乃至９週齢の重篤な複合免疫不全（ＳＣＩＤ）又はＣ
５７Ｂｌ／６雌マウスに（肝形質導入のために）静脈内注射した。同様の注射を
第一世代のベクターＡｓｕｂ３６０ＬａｃＺ、及びＡｄＬａｃＺΔｐｏｌでも実
施した。３日後に肝組織を切除してβ−ガラクトシダーゼ活性について染色した
。図１８に示したように、ＡｄＬａｃＺΔｐｐベクターは、注射したＳＣＩＤマ
ウス（Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいても、データは示さず）の肝組織における細
菌性β−ガラクトシダーゼ遺伝子の過剰な形質導入及び発現能がある。形質導入
のレベルは、他の広範囲にではなく修飾されたベクターを使用して示されたレベ
ルと実質的に等しかった（図１８）。したがって、ＡｄＬａｃＺΔｐｐベクター
におけるＥ１、ポリメラーゼ及びｐＴＰ遺伝子の欠失にもかかわらず、本発明に
よるベクターを使用した肝組織において、効率的な形質導入及び導入遺伝子発現
が生じた。
【０１７２】 第一世代Ａｄベクターが免疫適格性宿主の形質導入後に持続できないことは、
Ａｄ仲介型遺伝子治療パラダイムに対する主要な障壁であった。われわれは、免
疫適格性マウスを利用した新抗原形質導入の肝モデルにおける独特なＡｄベクタ
ーを分析した。Ｅ１及びポリメラーゼ活性の欠失したＡｄを介した細菌性β−ガ
ラクトシダーゼの肝遺伝子導入により、２か月以上（実験期間）にベクターゲノ
ムの持続が延長した。比較において、同じ導入遺伝子をコード化する伝統的な［
Ｅ１−１］Ａｄベクターの使用により、形質導入の１か月以内に形質導入された
すべての細胞が迅速に喪失した。修飾ベクターの持続の延長は以下を含む多くの
所見により実証される：ｉ）７５〜１００％の肝細胞における形質導入された細
菌性Ｕ−ガラクトシダーゼ酵素活性の持続期間の延長（＞１か月）、ｉｉ）導入
遺伝子からの転写持続期間の延長（＞１か月）、及びｉｉｉ）２８及び５６ｄｐ
ｉでの有意な量のベクターゲノム（４．４ベクターゲノム／肝細胞）の持続の延
長。また、修飾ベクターの利用は、３ｄｐｉでのＡＳＴの血清レベル減少により
示されるように、Ａｄベクターによる肝形質導入と通常関連した肝毒性を有意に
減少させた。われわれは、２８及び５６ｄｐｉでの肝組織中の修飾ベクターゲノ
ムの広範囲な持続が実際に、感染後３時間で存在したわずかな入力ベクターゲノ
ムのみを表した（＜１４％）ことも示したが、これはＡｄがインビボで持続可能
となる後に他のグループにより示された結果、すなわち免疫適格性動物のＡｄ仲
介型形質導入である。（Broughら、（1997）J. Virol. 71:9206; Worgallら、（
1997）Hum. Gene Ther. 8.37）。最後に、これらの改善のそれぞれは、細菌性β
−ガラクトシダーゼ新抗原に対して耐性でもなく、非特異的に免疫系を鈍化する
潜在的に毒性薬剤で治療もされていない成体動物において達成された。
【０１７３】 いくつかの最近の報告は、Ａｄベクターによりコード化された導入遺伝子の免
疫原性は主にインビボでのＡｄベクターの一時性の原因であることを示唆してい
る（Chenら、（1997））Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1645）；Clemensら、
（1996）Gene Ther. 3:965； Morralら、（1997）Hum. Gene Ther. 8.1275； Lu
skyら（1998）J. Virol. 72:2022； Gaoら、（1996）J. Virol. 70:8934； Trip
athyら、（1996）Nature Med. 2:545）。この見解は、相同導入遺伝子をコード
化するヌルＡｄベクター及びＡｄべクターが免疫適格性動物において持続できる
という所見により実証される（Morralら（1997）Hum. Gene Ther. 8:1275；Trip
athyら、（1996）Nature Med. 2:545；Gaoら、（1996）J. Virol. 70:8934）。
われわれは、したがって特に選択して、［Ｅ１−、ポリメラーゼ−］Ａｄベクタ
ーのＣ５７ＢＬ／６マウスへの高免疫原性細菌性βｍ−ガラクトシダーゼ導入遺
伝子の導入能を評価した。いくつかのグループは、細菌性β−ガラクトシダーゼ
遺伝子のＡｄ仲介型形質導入により、Ｃ５７ＢＬ／６組織におけるＡｄベクター
の持続が欠如する（１か月で除去）ことを以前に示した。（Morralら（1997）Hu
m. Gene Ther. 8:1275；Mcclaneら、（1997）Pancreas 15:236；Michouら、（19
97）Gene ther. 4:473；Dedieuら、（1997）J. Virol. 71:4626；Gaoら、（1996
）J. Virol. 70:8934；Muhlhausenら、（1996）Gene Ther. 3:145；Demattateo
ら、（1996）Gene Ther. 3:4）。大幅に修飾した［Ｅ１−、ポリメラーゼ−］Ａ
ｄベクターがこのモデルにおける新抗原形質導入に対する障壁を克服するという
実証は、導入遺伝子がインビボでのＡｄベクター持続の主要な（又は唯一の）決
定因子であるという仮説を検証するものである。遺伝子導入（ＡＡＶ又は直接Ｄ
ＮＡ導入など）の他のモデルも免疫適格性動物における（細菌性β−ガラクトシ
ダーゼを含む）新抗原導入遺伝子の持続を可能にできるという事実は、われわれ
の所見とは無関係に、この見解をさらに実証するものである。（Xiaoら、（1996
）J. Virol. 70:8098；Wolffら、（1992）Gene ther. 1:363）。
【０１７４】 ベクター及び導入遺伝子コード化されたエピトープがＡｄベクター除去に寄与
するということを認めることにより、われわれは、Ａｄ仲介型形質導入後に開始
される２つの異なる免疫応答が認められることを仮定し、これを“ｈｉｔ＃１”
又は“ｈｉｔ＃２”のいずれかで呼ぶことにする。特に、第一世代のＡｄベクタ
ー由来遺伝子発現は“ｈｉｔ＃１”の原因であるが、免疫適格性、非耐性動物に
おける（Ａｄ仲介型形質導入後の）新抗原発現は“ｈｉｔ＃２”の原因である。
Ａｄベクター投与後早期の両方の“ｈｉｔ”の同時存在により、宿主免疫応答の
“２−ｈｉｔ”高刺激を来たし、これが全Ａｄ形質導入細胞の完全な除去をもた
らし、ある場合には、自己抗原に対する耐性を破壊することにもある。（Tripat
hyら、（1996）Nature Med. 2:545）。したがって、“２−ｈｉｔ”仮説は、修
飾Ａｄベクターが形質導入新抗原の免疫原性を克服できるというわれわれの所見
に適応するとともに、これらの状態のそれぞれにおいて、Ａｄ感染細胞を除去す
るために必要とされる“２−ｈｉｔ”のうちひとつの“ｈｉｔ”のみが誘発され
るため、相同導入遺伝子をコード化するヌルＡｄベクター及びＡｄベクターが免
疫適格性動物においても持続する理由するものである。“２−ｈｉｔ”現象は、
Ａｄベクターが効率的に抗原提示細胞（ＡＰＣ）を感染させると思われるが、Ａ
ＶＶに基礎づけられたベクターはそうではないという最近の実証を含む、正常な
Ａｄ生物物学に独特であるいくつかの特徴によるものとみられる（Joossら、（1
998）J. Virol. 72:4212）。最後に、この仮説は、Ａｄベクター（ｈｉｔ＃１）
刺激が、Ａｄベクター形質導入が場合により自己抗原に対する耐性をも破壊する
という所見と類似の状態である、おそらく相同導入遺伝子（ある場合において）
に対する免疫応答を刺激するのに十分に有力であるという可能性を排除するもの
ではない。（Tripathyら、（1996）Nature Med. 2:545）。
【０１７５】 実施例１７ＩＶａ２ベクターの作成 Ｃ７アデノウィルスパッケージング株細胞は、領域をコード化する全長ポリメ
ラーゼだけではなく、ＩＶａ２遺伝子の全長バージョンをも含むアデノウィルス
ゲノムの部分を用いて作成した。導入されたＤＮＡにおいて、ＩＶａ2遺伝子は
その５’末端上の有力なＣＭＶポロモーター／エンハンサー及び３’末端上のポ
リアデニル化シグナルによりフランキングされるようにしても存在した（Amalfi
tanoら、（1997）gene Therapy 4:258-263）。したがって、株細胞は、Ａｄ Ｉ
Ｖａ2欠失変異体のトランス相補性を可能にする十分な量のＩＶａ２タンパク質
の発現能もあると考えられた。われわれは、これは実際に該当することを、かか
る欠失変異体の作成及びそれらをＣ７細胞上に高力価に増殖させることにより確
認した。したがって、現在、本発明の方法により、ヘルパーウイルスなしに、Ｉ
Ｖａ2欠失を含有するＡｄベクターを作成し増殖させることが可能である。かか
るベクターは本明細書中で考察したＥ１、ポリメラーゼ及び他の欠失における欠
失も有し、Ｃ７パッケージング株細胞上で高力価の増殖能もあると考えられる。
【０１７６】 Ａｄ ＩＶａ２欠失ベクターを作成するために、アデノウィルス左末端、Ａｓ
ｃｌ部位の実質的にヌクレオチド０〜３５８を含有するアデノウィルスシャトル
プラスミドに欠失を導入した後、アデノウィルスゲノムのマップ単位９乃至４３
のアデノウィルス配列を導入した。次にシャトルプラスミドを、ポリメラーゼ遺
伝子の３’末端だけではなく、ＩＶａ２遺伝子の実質的部分をも包囲するアデノ
ウィルスＤＮＡ配列から欠失させることにより再加工した。これは制限酵素の消
化及びサブクローニングし（Ａｃｃｌ部位とＢｓｔ１１０７１部位との間のＡｄ
５ゲノムのｎｔ４８３０〜５７６０を効率的に除去する）、ｐＡｄＡｓｃＬΔＩ
Ｖａ2、Δｐｏｌと呼ばれる最終シャトルプラスミドを生成した（図３６）。ｐ
ＡｄＡｓｃＬΔＩＶａ2、Δｐｏｌは、約ヌクレオチド４８３０乃至５７６６で
９４２ｂｐの欠失及び約ヌクレオチド７２７４乃至７８８１（及び欠失されたＥ
１領域及びＥ３領域）での約６０８ヌクレオチドの第２の欠失を含有し、ＩＶａ
2及びポリメラーゼ機能を効率的にノックアウトする。
【０１７７】 次に、このシャトルプラスミドをＣ７パッケージング株細胞に同時形質移入し
た。かかるウイルスを生成する唯一の方法であることは、結果として生じるベク
ターにおける欠如したＩＶａ２遺伝子をトランス相補する十分なＩＶａ２遺伝性
生成物をパッケージング株細胞が生成すれば明らかである。われわれは、［Ｅ１
−、Ｅ３−、ＩＶａ２−、ｐｏｌ−］Ａｄと呼ばれ、制限酵素の消化によりその
ゲノムが実際にＩＶａ２領域が欠失していることが示されたかかるウイルスを分
離した。このウイルスは、遺伝子のＩＶａ２領域が欠失したウイルスをトランス
相補する株細胞の可能性を示す独特なベクターである。
【０１７８】 ＩＶａ２領域における欠失及び他の欠失を保有する他の欠失型アデノウィルス
は、［Ｅ１−、Ｅ３−、ＩＶａ２−、ｐｏｌ−］Ａｄを生成する上述した方法の
ルーチンの変法により本発明の他のシャトルベクターを用いて生成することがで
きる。
【０１７９】 シャトルプラスミドｐＡｄＡｓｃＬΔＩＶａ２（図１９；欠失したＥ１及びＥ
３領域に加えてＡｄ５ゲノムの約ヌクレオチド４８３０乃至５７６６での約９４
２ｂｐの欠失）、ｐＡｄＡｓｃＬΔＩＶａ２、Δｐｐ（１．６）（図３６；欠失
したＥ１及びＥ３領域に加えてＡｄ５ゲノムの約ヌクレオチド４８３０乃至５７
６６での約９４２ｂｐの欠失、及び約ヌクレオチド８６３１乃至９５８５での約
９５５ｂｐの欠失）、及びｐＡｄＡｓｃＬΔＩＶａ２、Δｐｐ（２．４）（図３
７；欠失したＥ１及びＥ３領域に加えてＡｄ５ゲノムの約ヌクレオチド７２７４
乃至５７６６での約９４２ｂｐの欠失、及び約ヌクレオチド７２７４乃至９５８
５での約２３１２ｂｐの欠失）が作成されている。これらのシャトルプラスミド
を用いて、技術上周知の方法、例えば、［Ｅ１−、Ｅ３−、ＩＶａ２−、ｐｏｌ
−］Ａｄを生成する上述した方法を用いて対応する欠失型アデノウィルスを作成
した。ベクター［Ｅ１−、Ｅ３−、ＩＶａ２−、］Ａｄは、ｐＡｄＡｓｃＬΔＩ
Ｖａ２（このベクターもポリメラーゼ機能を欠く）から生成した。［Ｅ１−、Ｅ
３−、ＩＶａ２−、ｐｏｌ−、ｐＴＰ−（１．６）］Ａｄ及び［Ｅ１−、Ｅ３−
、ＩＶａ２−、ｐｏｌ−、ｐＴＰ−（２．４）］Ａｄは、それぞれ、技術上周知
のルーチンの方法又は本明細書中に開示されている方法を用いて、ｐＡｄＡｓｃ
ＬΔＩＶａ２、Δｐｐ（１．６）ｐＡｄＡｓｃＬΔＩＶａ２、Δｐｐ（２．４）
から生成した。
【０１８０】 現在、遺伝子の全体のＩＶａ２の単一の欠失によるアデノウィルスベクターの
保有能を増大することが可能である。これは、潜在的な遺伝子治療の応用のため
に多数の遺伝子作成物の保有能の増大を提供するＡｄベクターの多能性を大幅に
増大する。多数の遺伝子作成物が望ましいのは、調節要素、特異的エンハンサー
プロモーター要素、及び／又は多数の遺伝子が十分な物理的保有能を有するアデ
ノウィルスベクターによってのみ達成可能であるためである。
【０１８１】 実施例１８１００Ｋ欠失 ある場合においても付加的な導入遺伝子保有能が望ましい。さらに、ウイルス
特異的タンパク質の遺伝子物質コードの欠失が、ベクターの抗原プロフィールを
さらに削減し、インビボ効率の増大を促進するとみられる。かかる欠失が可能で
あることが証明された１領域は、アデノウィルスゲノムの１００Ｋ領域として知
られている。
【０１８２】 アデノウィルスゲノムのこの領域は、タンパク質電気泳動ゲル中で観察すると
その明らかな分子量により１００Ｋとして知られたタンパク質をコード化する。
アデノウィルスによりコード化された１００Ｋタンパク質は、宿主細胞における
最終ウイルス粒子構築時に足場タンパク質として作用する。１００Ｋタンパク質
は最終ウイルス粒子内には組み込まれない。最後に、１００Ｋタンパク質は、細
胞質から宿主細胞の核内への他のウイルス構造タンパク質の輸送を含む多数の他
の機能を有する。この輸送機能は、ウイルスヘクソンタンパク質の輸送を含む。
ヘクソンタンパク質はウイルスキャプシドの主要な構造サブユニットである。過
去の文献では、１００Ｋ活性の欠如が感染細胞における検出可能な１００Ｋタン
パク質の欠如だけではなく、ヘクソンの不安定をも来たし、これが細胞質におけ
る急速な変性も来たすことが明らかにされている。これら以前の所見がヘクソン
（温度感受性）変異体を用いて得られた点を認識することが重要である。これら
は、変異ウイルスを３２℃でのみ生存可能にし、３９℃の温度で変異誘発する１
００Ｋタンパク質のヌクレオチド配列内で単一点を有する変異ウイルスである。
【０１８３】 欠失した１００Ｋ遺伝子によりアデノウィルスを作成する利点は多い。１００
Ｋ遺伝子の欠失は、この欠失を多く含む（おそらく１０％まで）結果として生じ
るベクターの保有能を増大し、アデノウィルスベクターにおけるおよそ付加的な
３０００塩基対の保有能に翻訳する。また、本明細書中の他の箇所に記載したよ
うに、１００Ｋ欠失をアデノウィルスのゲノム他の領域が欠失されているアデノ
ウィルスベクターに含めることができる。これらの付加的な欠失の添加はウイル
スのインビボ遺伝子導入の生物学的プロフィールを大幅に増大する。これは、１
００Ｋの欠失を含む複数の遺伝子欠失により修飾される結果として生じるウイル
スベクターが、１００Ｋ活性の欠如によりヘクソンモノマーの不安定化に続発す
るヘクソンタンパク質の発現の欠如を含む、複数のウイルス遺伝子の発現能の低
下を示すためである。最後に、１００Ｋの欠失したベクターは複製適格性アデノ
ウィルスを生成する可能性の低下を示す。これは、複数の組換え事象は野生型ア
デノウィルスを再生する必要があるためである。これは、野生型アデノウィルス
を生成するヒト２９３細胞中に存在するアデノウィルスと常在性Ｅ１配列との間
で生じる単一の組換え事象のみ必要とする在来のＥ１欠失型アデノウィルスベク
ターと対照的である。
【０１８４】 １００Ｋ発現株細胞が、１００Ｋ導入遺伝子カセットを作成するために、ＣＭ
Ｖエンハンサープロモーター要素とポリアデニル化配列との間にサブクローニン
グされたアデノウィルスの１００Ｋコード配列を含有するプラスミドを構成する
ことで作成された。結果として生じるプラスミドｐｃＤＮＡ３＋１００Ｋ（Invi
trogen Corp.より得たｐｃＤＮＡ３）は制限消化により直線化され、リン酸カル
シウム形質移入法を用いてヒト２９３細胞内に形質移入した。ｐｃＤＮＡ３＋１
００Ｋプラスミドは１００Ｋ導入遺伝子カセットだけではなく、Ｇ−４１８Ｒ抵
抗をコード化する導入遺伝子カセットをもコード化した。したがって、形質移入
後に、細胞を細胞破壊的薬剤Ｇ４１８へ曝露し、Ｇ４１８に対して抵抗性である
細胞クローンをサブクローニングして増殖させた。これらのサブクローンはそれ
らのゲノム内に１００Ｋ発現プラスミドを組み込んでいた細胞を提示し、高レベ
ルのＧ４１８抵抗性導入遺伝子も発現していた。Ｇ４１８抵抗性であっておよそ
２０〜２５のクローンをサブクローニングして増殖させた。
【０１８５】 その後、それぞれのクローンをＨ５ｔｓ１１６（コロンビア大学のGinsburg博
士の研究室から得た）として知られるウイルスへ曝露した。このウイルスは、温
度感受性である１００Ｋ遺伝子領域における突然変異を含有する。それは３２℃
の温度でのみ高レベルに増殖するが、３９℃では増殖しないウイルスである。１
００Ｋの温度感受性変異ウイルスを用いて、以下のようにそれぞれのＧ−４１８
抵抗性株細胞をスクリーニングした。それぞれの株細胞は３９℃の非許容的温度
でＨ５ｔｓ１１６ウイルスに感染させた。理論上、高レベルの１００Ｋタンパク
質を生成しうるすべての株細胞は、３９℃の非許容的温度でも変異ウイルスを増
殖させる。Ｋ−１６と呼ばれる１つのＧ４１８抵抗性細胞クローンが、３９℃の
非許容的温度でウイルスＨ５ｔｓ１１６を増殖させることがわかった。
【０１８６】 株細胞、Ｋ−１６を増殖させてさらに徹底的に調査した。Ｋ−１６株細胞はそ
のゲノムである１００Ｋ配列内に組み込まれており、実際に機能的１００Ｋタン
パク質の発現能があることを確認した。また、Ｋ−１６細胞はきわめて高量の１
００Ｋタンパク質特異的ＲＮＡ分子を生成していた。これはまた、この株細胞が
きわめて高レベルの１００Ｋを生成していること示すとともに、非許容的温度で
ウイルスＨ５ｔｓ１１６の増殖能があることを確認するものであった（図２０）
。図２０は、１００Ｋ特異的プライマーを用いたゲノムＫ−１６ＤＮＡのＰＣＲ
増幅の結果を示す（パネルＡ）。２９３細胞及びＫ−１６株からの等量のｍＲＮ
Ａを最初に電気泳動し、形質移入した（図２０、パネルＢ）。しかしパネルＣに
より示されるように、Ｋ−１６細胞由来ｍＲＮＡのみが１００Ｋに特異的な配列
を含有した。パネルＣは、１００Ｋに特異的な３２−Ｐ標識ＤＮＡ断片によるプ
ロービング後のＫ−１６におけるｍＲＮＡバンドの存在を示す。
【０１８７】 最後に、以下の表Ｉは、Ｋ−１６株細胞のみが、１００Ｋタンパク質の遺伝子
コードにおける温度感受性突然変異を含むアデノウィルスＨ５ｔｓ１１６の拘束
性温度で細胞変性増殖を許すことを示す。また、Ｋ−１６はアデノウィルスＥ１
遺伝子生成物を恒常的に生成するヒト２９３細胞由来であったため、われわれは
Ｅ１遺伝子及び１００Ｋ遺伝子の同時発現が細胞毒性ではないことを確認した。
この後者の事実は、アデノウィルスＥ１遺伝子だけではなくアデノウィルス１０
０Ｋ遺伝子も同時に欠失されているベクターの、本発明の方法による生成を可能
にするため有利である。
【０１８８】
【０１８９】 われわれは、ノーザンブロット分析により、われわれがＣ７細胞における１０
０Ｋ遺伝子の高レベルの発現を達成できることを明らかにした。図２１は、１０
０Ｋプラスミドが導入されたＣ７細胞の４つの分離物からの細胞ｍＲＮＡの３２
−Ｐ標識１００ＫＤＮＡプローブを示す。各レーンは個々の株細胞を表している
。各株細胞からの総ＲＮＡを電気泳動し、ブロットするとともに３２−Ｐ標識１
００Ｋ特異的ＤＮＡでプローブした。１００Ｋ遺伝子を発現するＣ７細胞を用い
て、Ｅ１、Δｐｏｌ、ΔｐＴＰ，ＩＶａ２及び／又は１００Ｋ欠失を組み合わせ
たベクターを生成した。これらの領域のすべてが欠失したベクターは、ウイルス
が保有能の増大、複製適格性アデノウィルスの生成能の低下、及び最後に、複数
のウイルス遺伝子生成物の発現能を欠くためインビボ生物プロフィールの改善を
示すため、遺伝子治療の応用における利用性の特性を改善したと考えられる。
実施例１９Ａｄ Δｐｏｌベクターのインビボ投与 Ａｄ Δｐｏｌベクター投与： 修飾ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌベクター（Ｅ１及
びポリメラーゼ活性が欠失）並びにＡｓｕｂ３６０ＬａｃＺ、及びそれらの高力
価生成は実施例１及び２に記載されている通りである。６〜８週齢の免疫適格性
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Jackson Labaratory, Bar Harbor, ME）に対し、ＡｄＬ
ａｃＺｓｕｂ３６０又はＡｓＬａｃＺΔｐｏｌのいずれかの４×１０９β−ガラ
クトシダーゼ形成単位（ＢＦＵｓ）を含有するＰＢＳ溶液２００μｌを静脈内（
ｉｖ）注射し、その後に表示した時点で屠殺した。感染後（ｄｐｉ）５６日でＡ
ｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺを投与した、ｎ＝２を除く、少なくとも３匹の動物を時
点ごとに分析した。全動物の処置及びその後の分析は、デューク大学動物治療使
用委員会により以前に承認された通りに実施した。動物から収集した肝臓及び血
漿の試料を以下に記載したように加工した。
【０１９０】 インサイツ細菌性β−ガラクトシダーゼ測定： 肝検体をＯＣＴ化合物中に包
埋し、液体窒素冷却イソペンタン中に急速凍結した。１０μｍ凍結切片をライカ
クリオスタットで得、５分間、０．５％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ溶液中に短
時間クロスリンクした。次に固定切片を２０分間、１ｍＭ ＭｇＣｌ２ＰＢＳ中
に配置し、５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、１
ｍＭ MｇＣｌ２及び１ｍｇ／ｍｌの色素生産性Ｘガル基質を含有する溶液中に３
７．０℃で一晩インキュベートした。染色切片をエオシンで対比染色し、脱水し
、Permoutに配置するとともに、写真を撮った。
【０１９１】 細菌性Ｂ−ガラクトシダーゼ活性の測定： 液体窒素中で凍結することにより
肝組織から全タンパク質を抽出した後、溶解緩衝液（１００ｍＭリン酸カリウム
ｐＨ７．８、０．２％トリトンＸ−１００、０．５ｍＭ ＤＴＴ）中でホモジナ
イズし、１４，０００ＲＰＭで遠心分離した。肝抽出物中のタンパク質濃度をＢ
ＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce: Rockford, Illionis）により測定した
。各試料から２５マイクログラムのタンパク質を１ｍＭ ＭｇＣｌ２、４５ｍＭ
β−メルカプトエタノール、０．０２６４μｇのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、及びｐＨ７．５での５０ｍＭリン酸ナトリウム
溶液とともに１時間３７℃でインキュべートした。反応を０．５Ｍ ＮａＣＯ３
で停止し、各試料の吸光度を波長４２０ｎｍで測定した。溶解緩衝液中に希釈し
た細菌性β−ガラクトシダーゼ標準物質（Sigma, St. Louis, MO）を用いて標準
曲線を生成し、各抽出物中に検出されたβ−ガラクトシダーゼレベルを標準曲線
と比較することで測定した。
【０１９２】 ＲＮＡの分離及び分析： マウス肝の全ＲＮＡをＲＮＡ分離キットＲ−５５０
０（PGC Scientific, Frederick, MD）を用いてメーカーの指示通りに抽出した
。各試料のおよそ２０マイクログラムを０．８％ホルムアルデヒド−アガロース
ゲル中に分離し、ナイロン膜に移し、いずれかのベクター由来の細菌性β−ガラ
クトシダーゼｍＲＮＡへのハイブリッド形成能のある［α−３２Ｐ］ｄＣＰＴ標
識ＤＮＡプローブでプローブした。ブローブした膜を洗浄し、Ｘ線撮影用フィル
ムへ曝露した。全曝露フィルムの濃度測定分析をＮＩＨ画像ソフトウェアパッケ
ージングで行った。発現レベルの量的比較を、各試料の負荷された全ＲＮＡ（１
８ｓ γＲＮＡ定量化により測定）に対する検出されたＬａｃＺ ｍＲＮＡの比を
比較することで行った。
【０１９３】 ＤＮＡの分離及び分析： 多少の修正とともに、以前に記載された通りＤＮＡ
を抽出した（Amalfitanoら、（1996）Muscle Nerve 19:1549）。簡単に言えば、
１００ｍｇの細かく切ったマウス肝組織を６００μｌのＴＥＮＳ緩衝液（１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＣｌｐＨ７．５、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ及
び０．６％ＳＤＳ）及び１７．５μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）と
混合した。３７℃で一晩インキュべート後、１６７μｌの５Ｍ ＮａＣｌを添加
し、試料を１４，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。上清液をＲＮａｓｅＡ
（５μｇ／ｍｌ）で処理し、フェノール−クロロホルムで抽出した。全ＤＮＡを
９５％エタノールで沈降し、７０％エタノール中で洗浄し、空気乾燥するととも
にＴＥ緩衝液中に再懸濁した。各マウスからの全肝ＤＮＡの２４マイクログラム
をＥｃｏＲＩで消化し、０．７％アガロースゲル中で電気泳動的に分離し、ナイ
ロン膜上に移した。１又は１０コピーのＡｄＬａｃＺΔｐｏｌウイルスゲノム／
肝細胞ゲノムのいずれかでスパイクした非感染動物から抽出した肝ＤＮＡの２０
μｇの対照試料も内標準として含めた。膜をクロスリンクし、いずれかのベクタ
ーの検出能のある［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識ＤＮＡプローブに（ＡｄＬａｃＺ
Δｐｏｌの〜６ｋｂ ＥｃｏＲＩ細断片）ハイブリッド形成した。膜を洗浄した
後、以前に記載された（Amalfitanoら、（1998）J. Virol. 72:926）ようにＸ線
撮影用フィルムへ曝露した。
【０１９４】 組織病理学的検査： マウス肝組織を１０％中性ホルマリン中に固定し、パラ
フィン中に包埋した。５μｍ厚のパラフィン切片をヘマトキシリン−エオシンで
染色し、顕微鏡下に観察し、代表的な切片を等倍で写真撮影した。
【０１９５】 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の検出： 感染マウスの
それぞれからの血液試料を眼球後放血により収集し、短時間の遠心分離後に血漿
を分離した。血漿ＡＳＴレベルをメーカーの指示に従いＳｉｇｍａ（登録商標）
ＡＳＴ診断キット５０５を用いて二重に測定した。６歳の対応させた非感染Ｃ５
７ＢＬ／６マウスから収集した血漿試料も分析し描写した。
【０１９６】 実施例２０免疫適格性、非耐性マウスの肝形質導入後の細菌性β−ガラクトシダーゼ活性の
持続 実施例１に記載したように、われわれは、高い免疫原性導入遺伝子、細菌性β
−ガラクトシダーゼをコード化する修飾Ａｄベクター（Ｅ１及びポリメラーゼ活
性の欠失した−“ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ”）の高レベルの増殖を指示するパッケ
ージング株細胞を分離した。細菌性β−ガラクトシダーゼ由来酵素活性の持続的
形質導入を可能にするＡｄＬａｃＺΔｐｏｌの能力を第一世代、［Ｅ１−］Ａｄ
ベクターの能力と比較した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、細菌性β−ガラクトシダ
ーゼ導入遺伝子の非耐性であることが繰り返し明らかにされているマウスの免疫
適格性系統である（Morralら、（1997）Hum. Gene Ther. 8:125；MaClaneら、（
1997）pancreas 15:236；Michouら、（1997）Gene ther. 4:473）。ＡｄＬａｃ
Ｚｓｕｂ３６０（Ｅ１欠失）の４×１０９β−ガラクトシダーゼ形成単位（ＢＦ
Ｕ）の静脈内投与後に、肝細胞ほぼ１００％の形質導入が達成され、Ｘｇａｌ色
素原による広範囲な染色で視覚化された（図２２、パネルＡ）．劇的に、感染後
（ｄｐｉ）２８まで残存したＸｇａｌ染色細胞はなかった（図２２、パネルＣ）
．予想したように、同じ結果は５６ｄｐｉで認められた（図２２、パネルＧ）。
これらの結果は、新抗原」をコード化する［Ｅ−］ＡｄベクターによるＣ５７Ｂ
Ｌ／６マウス肝細胞の形質導入が最初の投与の１か月以内に迅速に除去されるこ
とを明らかにした以前の報告と一致した（例えば、Morralら、（1997）Hum. Gen
e Ther. 8:1275；MaClaneら、（1997）Pancreas 15:236；Michouら、（1997）Ge
ne ther. 4:473を参照）。
【０１９７】 これとは対照的に、ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌベクター（Ｅ１及びポリメラーゼ欠
失）とのＣ５７ＢＬ／６マウスの同一の感染により、３ｄｐｉ（図２２、パネル
Ｂ）及び２８ｄｐｉ（図２２、パネルＤ〜Ｆ）での細菌性β−ガラクトシダーゼ
高レベルかつ広範囲の発現が生じた。後者のパネルのそれぞれは個別の試験動物
を表した。複数の切片の検討により、７５〜１００％の肝細胞が２８ｄｐｉで依
然としてＸｇａｌ染色されていたことが明らかにされ、実際に各切片で染色され
ていない唯一の細胞は門脈周囲の炎症性細胞であった（以下参照）。この結果は
、修飾Ａｄベクターの利用が、免疫適格性動物における新抗原をコード化するＡ
ｄベクターにより形質導入される細胞の大部分を通常除去する免疫応答の回避を
可能にしたことを示した。しかし、５６ｄｐｉでのＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ形質導
入肝のＸｇａｌ染色は、標的群の動物のそれぞれにおける全肝切片におけるＸｇ
ａｌ染色の欠如を示した（図２２、パネルＨ）。
【０１９８】 Ｘｇａｌ染色データは、実験動物セットのそれぞれからの肝由来タンパク質抽
出物における細菌性β−ガラクトシダーゼ活性の直接測定により定量化された（
図２３）。また、２８ｄｐｉで実質的な量の細菌性β−ガラクトシダーゼ活性が
、ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌベクターの使用でのみ検出された。細菌性β−ガラクト
シダーゼ活性の絶対的レベルは、ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ投与動物における３と２
８ｄｐｉとの間で有意に減少し（〜９２％低下）、これは細菌性β−ガラクトシ
ダーゼｍＲＮＡ発現の量の減少と直接相関した減少である（以下参照）。さらに
、５６ｄｐｉからの肝組織における細菌性β−ガラクトシダーゼ活性の欠如によ
り、以前のインサイツ結果が確認された。したがって、ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ投
与動物における５６ｄｐｉでの細菌性β−ガラクトシダーゼ活性の発現の欠如が
さらに探索された。
【０１９９】 実施例２１５６ｄｐｉでの導入遺伝子活性の欠如は修飾ベクターゲノム持続の欠如による それぞれの実験動物由来の肝切片から抽出した全ＲＮＡを分離し、細菌性β−
ガラクトシダーゼ特異的プローブで分析した（図２４及び図２５）。各動物にお
いて、Ｘｇａｌ染色の欠如は検出可能な細菌性β−ガラクトシダーゼｍＲＮＡ発
現の欠如と相関した。特に、２８ｄｐｉのみでＡｄｌａｃＺΔ投与動物は細菌性
β−ガラクトシダーゼ特異的ＲＮＡの有意なレベルを示したままであった。存在
するが、２８ｄｐｉでのＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ投与動物における細菌性β−ガラ
クトシダーゼ特異的ＲＮＡの平均量は３ｄｐｉで確認されたレベルの約８６％で
あり、これは２８ｄｐｉで確認された酵素活性における約９２％の低下と相関す
る減少であった（図２３）。特に、５６ｄｐｉでのＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ投与動
物には細菌性β−ガラクトシダーゼ特異的ＲＮＡが完全に存在せず、これは酵素
活性の完全な欠如と相関する結果であった。
【０２００】 ５６ｄｐｉでの導入遺伝子特異的ＲＮＡ発現の欠如がＡｄＬａｃＺΔｐｏｌゲ
ノム抵抗性によるものであるかどうかを確認するために、それぞれの実験動物か
ら全ＤＮＡを抽出し、Ａｄ特異的プローブでプローブした（図２６）。予想した
通り、Ａｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺ ＤＮＡは２８又は５６ｄｐｉで検出可能では
なかった。しかし、われわれは２８及び５６ｄｐｉでＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ投与
動物におけるベクター特異的ＤＮＡ配列の有意な量を容易に検出することができ
た。１００％までのＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ形質導入肝細胞が２８ｄｐｉでＸｇａ
ｌ染色され、２８及び５６ｄｐｉで検出されたベクターＤＮＡの量は持続及び広
範囲な肝形質導入の反映であった。したがって、５６ｄｐｉでのＸｇａｌ染色、
細菌性β−ガラクトシダーゼ酵素活性、及び細菌性β−ガラクトシダーゼｍＲＮ
Ａ発現の欠如はベクター持続の欠如によるものではなく、むしろ持続性ベクター
ゲノムからの導入遺伝子由来ＲＮＡ発現の欠如によるものであった。濃度測定に
よる定量化は、２８及び５６ｄｐｉで検出されるベクターＤＮＡの絶対レベルの
平均が、１肝細胞につきＡｄＬａｃＺΔｐｏｌゲノムの〜４．４コピーであり、
これは図２２、パネルＤ〜Ｆに示した広範囲なＸｇａｌ染色データと一致する結
果であった。興味深いことに、このＤＮＡは感染後３時間で認められた入力ベク
ターＤＮＡの最大１４％で示し（データは示さず）、これは免疫適格性マウスみ
おける以前の所見と一致する結果であった。後者の研究では、有意な量の入力Ａ
ｄベクターゲノムが、ベクター又は導入遺伝子に対する免疫応答と無関係に、感
染の２４時間以内に肝に存在する生得的な機序により明らかにされる。（Brough
ら、（1997）J. Virol. 71:9206；Worgallら、（1997）Hum. Gene Ther. 8:37）
。
【０２０１】 実施例２２修飾Ａｄベクターに対する炎症反応 組織病理学評価により、有意な細胞炎症性浸潤が、２８及び５６ｄｐｉで両セ
ットの投与動物において明らかであった（図２７）。両方のベクターは２８及び
５６ｄｐｉで同様の反応を誘発するため、炎症性浸潤は両方のベクター製剤に対
する一般的な刺激に方向づけられてたとみられる。浸潤にはリンパ球、マクロフ
ァージ、及び場合により血漿細胞が含まれた。これとは対照的に、３ｄｐｉでは
、血清ＡＳＴ（損傷血球より放出）のレベルが、第一世代のＡｄベクターに感染
した動物におけるよりもＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ投与動物において有意に低かった
（ｐ＝０．０１）（図２８）。しかし、２８ｄｐｉ後、両方の実験動物セットは
ベースラインの血清ＡＳＴ血清に戻った。３ｄｐｉでは、ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ
肝形質導入後に認められた血清ＡＳＴレベルの低下が、２８及び５６ｄｐｉで認
められたＡｄＬａｃＺΔｐｏｌ形質導入肝細胞の除去の欠如と正に相関した。
【０２０２】 実施例２３ＧＡＡ導入遺伝子の分離 酸α−グルコシダーゼ全長ｃＤＮＡ（Hoefsloot, L.H.ら（1988）EMBO Jounal
7,1697-1704）をＥｃｏＲｌでｐＳＨＡＧ２ベクター（hoefsloot, L.H.ら（199
0）Biochem. J. 272, 485-492）から切除し、アガロースゲル上に分離し、広く
使用され市販の哺乳動物の発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen, Sangiego,
CA）のマルチクローニング部位に結合した。ＥｃｏｌＲｌはクローニング部位と
して用いられているため、反対方向の２つの可能な結合生成物がある。ＣＭＶプ
ロモーターの制御下の宝庫にＧＡＡ転写を示すプラスミドは、予測されるマップ
に従い制限酵素消化により選択された。結果として生じるプラスミドはｐｃＤＮ
Ａ３−ＧＡＡと呼ばれ、ＣＭＶプロモーターを含む。
【０２０３】 ｃＤＮＡはｐＭＴ２ベクター（Kaufman, R.J.、（1990）Methods Enzymol. 18
5, 537-566；Kaufman, R.J.、（1990）Methods Enzymol. 185, 487-511）のＥｃ
ｏＲｌ制限部位における多シストロン性の作成物としてクローニングもされ、ｐ
ＭＴ２−ＧＡＡと呼ばれる。アデノウィルス主要後期プロモーターの制御下のＤ
ＨＦＲ遺伝子、ＴＰＬ（アデノウィルスの三部分からなるリーダー）介在配列（
ＩＶＳ）およびＳＶ４０ポリＡ部位を含むが、ＳＶ４０エンハンサーは含まない
１７４４塩基対断片をＢａｍＨｌにより切除し、アガロースゲル上に分離した。
この断片は、ｐｃＤＮＡ３−ＧＡＡプラスミドの適合性のＢｇＩＩＩに結合され
た。ｐＪＷ５５と呼ばれる、この選択プラスミドにおいて、ＧＡＡ及びＤＨＦＲ
の転写の方向は同じである。
【０２０４】 ＡＴＧ開始コドンの１８ｂｐ５’から開始し、酸α−グルコシダーゼのコード
配列の５２９ｂｐに終わるＧＡＡｃＤＮＡの５６７ｂｐ断片を、センスオリゴヌ
クレオチドプライマーＧＡＡ２２４（＋）ＴＣＣ ＡＧＧ ＣＣＡ ＴＣＴ ＣＣＡ
ＡＣＣ ＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びアンチセンスオリゴヌクレオチドプ
ライマーＧＡＡ７５１（−）ＴＣＴ ＣＡＧ ＴＣＴ CCＡ ＴＣＡ ＴＣＡ ＴＣＡ
ＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を用いたＰＣＲ増幅により調製した。この断片
は、酸α−グルコシダーゼコード配列の３２０ｂｐに部位が生じるＧＡＡ ｃＤ
ＮＡの天然ＳａｃＩＩ部位を含む。５６７ｂｐ断片は、ＴＡクローニング法を用
いるとともに供給元（Invitrogen, San Diego, CA）の指示に従い、ｐＣＲＩＩ
に結合した。これにより反対方向の２つの可能なクローニング生成物が得られる
。われわれは、最初のＰＣＲＩＩプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ部位に近いＧＡ２
２４（＋）部位を有するプラスミドを選ぶ。このプラスミドはｐＣＲＩＩ−１と
呼ばれる。方向及びＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定及び制限酵素消化マッピングに
より確認された。ｐＣＲＩＩ−１はＡＴＧ開始コドンに対するＨｉｎｄＩＩＩ部
位５’及び酸α−グルコシダーゼのコード配列の３２０ｂｌでの天然ＳａｃＩＩ
部位を含んでいた。
【０２０５】 ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩＩでのｐＣＲＩＩ−１の消化の後、ヌクレオチド
８９２〜１４９６を含有する断片をアガロースゲル上に分離する。この断片は最
初のＧＡＡ ｃＤＮＡのヌクレオチド２７９〜６７０を含有する。ＡＳＣＩＩ部
位はＡＴＧ開始部位の下流の３１４ヌクレオチドである。ＨｉｎｄＩＩＩ部位は
最初のプラスミドベクターｐＣＲＩＩ及びｐｃＤＮＡ３の多クローニング由来で
ある。
【０２０６】 ｐｃＤＮＡ３−ＧＡＡベクターは同様にＨｉｎｄＩＩＩ及びＡＳＣＬＬで消化
し、大きなプラスミド断片をアガロースゲル上に分離する。小さいプラスミドは
、ＡＴＧ開始コドン前の全体の非翻訳配列を含む酸α−グルコシダーゼ遺伝子の
開始を含み、遺伝子配列のｂｐ６７０である、ＳａｃＩＩ切断部位の３’末端を
通って延びる。この小さい断片は放出される。大きい断片は、ｂｐ６７１でのＳ
ａｃＩＩ切断部位の５’末端上の酸α−グルコシダーゼ遺伝子配列の部分を含み
、プラスミド背骨に付着したままである遺伝子の最終ｂｐを通って延びる。
【０２０７】 ｐＣＲＩＩ−１消化から分離された最初のＧＡＡ ｃＤＮＡのヌクレオチド２
７９から６７０を含む断片はここでｐｃＤＮＡ３−ＧＡＡ消化から分離された大
きなプラスミド断片に結合され、ＧＡＡの５’短縮バージョンを含むプラスミド
ベクターｐｃＤＮＡ３−５’ｓＧＡＡを作成する。
【０２０８】 この新しく作成された短縮ｃＤＮＡを含む断片を制限酵素Ｋｐｎｌ及びＸｈｏ
ｌでの消化によるｐｃＤＮＡ３−５’ｓＧＡＡから切除する。ｐＪＷ５５におけ
る全長ＧＡＡ ｃＤＮＡ挿入をＫｐｎｌ及びＸｈｏ１（ヌクレオチド２６１１〜
６３５５）での消化により除去し、プラスミド背骨をアガロースゲル上に分離す
る。次にｐｃＤＮＡ３−５’ｓＧＡＡから分離された短縮ｃＤＮＡをｐＪＷ−５
’ｓＧＡＡを作成するこのプラスミド背骨の適合性Ｋｐｎ１−Ｘｈｏ１に結合す
る。Ｋｐｎ１部位及びＸｈｏ１部位は最初のｐｃＤＮＡ３プラスミド多クローニ
ング部位由来であり、ｐＪＷ５５及びｐｃＤＮＡ３−５’ｓＧＡＡにおいて独特
である。結果として生じるｐＪＷ−５’ｓＧＡＡプラスミドは、ＣＭＶプロモー
ター下の５’短縮非翻訳配列及びアデノウィルス主要後期プロモーター下のＤＨ
ＦＲ遺伝子を有する。ｃＤＮＡ挿入はヌクレオチド２６１１で開始し、ヌクレオ
チド６１５３で終わる。
【０２０９】 実施例２４ｈＧＡＡ導入遺伝子によるＡｄベクターの作成 プラスミドｐｃＤＮＡ３ＧＡＡをＸｍｎｌにより消化し、導入遺伝子カセット
を含有するおよそ４．５ｋｂ断片をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑断端にし、
Ｅ１、Ｅ３及びポリメラーゼ遺伝子機能の欠失したＡｄベクターの構成のために
デザインされた本発明のシャトルプラスミド、ｐＡｄｓｃＬΔポリメラーゼ（実
施例２）にサブクローニングした。結果として生じるプラスミドｐＡｄｓｃＬΔ
ｐｏｌｈＧＡＡをリン酸カルシウム法（Jonesら、（1978）Cell 13:181；Mitter
ederら、（1996）J. Virol. 70:7498）により、同時にｄｌ７００１からのアデ
ノウィルスビリオンＤＮＡのＸｂａｌ、Ｃｌａｌ及びＳｃａｌ消化とともに、ア
デノウィルスパッケージング株細胞Ｃ−７に同時形質移入した。組換えベクター
クローンを増殖させ、ベクター由来ＤＮＡの制限酵素消化（Jonesら（1978）Cel
l 13:181）及び多機能分析（以下の実施例を参照）によりｈＧＡＡ遺伝子を含む
ことを確認した。塩化セシウム精製ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌベクターをＣ−７細胞
（アデノウィルスＥ１、ポリメラーゼ、及び末端前タンパク質を発現）を含有す
る６０、１５０ｍｍ組織培養プレートの感染（ＭＯｌは〜１０であった）後に生
成した。全ベクター力価をＣ−７細胞のベクター調製液の連続希釈のプラーク形
成単位（ＰＦＵ）アッセイで確認した。
【０２１０】 実施例２５ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌのインビボ投与 静脈内投与： １×１０９ｐｆｕのＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌベクターを６．５月
齢Ｃ５７ＢＬ／６（野生型）マウス又は２月齢ＧＡＡ−ＫＯマウス（６neo／６n eo ）に（眼窩後洞を介して）静脈内投与した。（Clemensら、（1996）Gene Ther
. 3:965）。それぞれの注射後時点で、血漿又は組織試料を得、以下のように加
工した。全動物の処置はデューク大学動物治療使用委員会の指針に従って行った
。
【０２１１】 組織／血漿ＧＡＡ活性及び糖蓄積の測定： 組織を液体窒素中で急速凍結し、
水中でホモジナイズし、不溶性のタンパク質を遠心分離により除去した。結果と
して生じるライセートのタンパク質含量をブラッドフォードアッセイにより定量
化した。血漿ＧＡＡ活性検出のために、血液試料を眼窩後サンプリングにより収
集しヘパリン化キャピラリー管に入れた後、血漿を分離した。それぞれの組織又
は血漿中のＧＡＡ活性を、以前に記載された通り（Amalfitanoら、（1997）Gene
Ther. 4.258）、４−メチルーウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコシド切断ｐＨ
４．３により評価した。グリコーゲン含量は、Ａ．ｎｉｇｅｒアミログルコシダ
ーゼによる組織抽出物の処置及び放出されるグルコースの測定により測定した。
全抽出物は背景グルコース放出について、すなわちＡ．ｎｉｇｅｒアミログルコ
シダーゼの非存在下でも評価した。次に最終グリコーゲン含量値は、未処置グル
コールレベルをそれぞれのアミログルコシダーゼ処置組織抽出物（Ｃ５７Ｂｌ／
６マウスのｎ＝４、ＧＡＡ−ＫＯマウスのｎ＝３、Ａｄ投与ＧＡＡ−ＫＯマウス
のｎ＝３）から減じた後に測定した。
【０２１２】 組織の形態学的評価： 切片を包埋化合物に配置し、液体窒素冷却イソペンタ
ン中に急速凍結した。１０ミクロンの組織切片をライカクリオミクロトームで収
集し、ＰＡＳ染色するとともに、ライカ顕微鏡及びデジタルカメラで視覚化した
。
【０２１３】 ＲＮＡ分析： 全ＲＮＡを４．０Ｍチオシアン酸グアニジニウム及び塩化セシ
ウム精製中でホモジナイズ後にマウス組織の部分から分離した。各組織からの１
２．５μｇの全ＲＮＡを１％ホルムアルデヒド−アガロースゲル中で電気泳動的
に分離し、ナイロン膜上にブロットし、ＵＶクロスリンクするとともに、ｈＧＡ
Ａ ｃＤＮＡを含有する３２Ｐ標識３．３ｋｂ断片でプローブした。プローブし
た膜を洗浄し、Ｘ線撮影用フィルムへ曝露し、写真を撮った。
【０２１４】 ｈＧＡＡの免疫ブロット： それぞれのマウス組織を凍結、ホモジナイズし、
遠心分離して不溶性タンパク質を除去し、上清液のタンパク質含量をブラッドフ
ォードアッセイにより測定した。等量のタンパク質を１０％ポリアクリルアミド
−ＳＤＳゲル中で電気泳動的に分離し、ナイロン膜に移すとともに、ウサギ抗ヒ
トＧＡＡ多くローン抗体でプローブした。結合抗ｈＧＡＡの検出をＥＣＬ検出装
置（Amersham）で視覚化した。血漿中ｈＧＡＡ前駆体の直接検出のために、各試
料の２．５μＬを電気泳動的に分離した後、上述したように免疫ブロットの抗ｈ
ＧＡＡ抗体探索を行った。
【０２１５】 実施例２６ＡｄｈΔｐｏｌベクターの作成−結果 ＡｄＥ１及びポリメラーゼ遺伝子がずれも欠失した修飾Ａｄベクターの生成及
びクローン精製は以前に記載されている（Jonesら、（1978）Cell 13:181）。こ
れらのベクターは、新抗原遺伝子導入にもかかわらず、肝細胞感染後に持続性の
延長を可能にする能力を有する（Ilanら、（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94:2587）。ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌベクターの作成は、実施例２４に記載した通
り実施し、図２９に示されている。精製ベクター由来のＤＮＡの制限酵素マッピ
ングにより、このベクターはＣＭＶ−ｈＧＡＡ導入遺伝子カセットを含むことが
確認された（データは示さず）。別の分析により、ＡｄｈＧＡＡベクターは、培
養ヒト２９３細胞の感染後にｈＧＡＡ酵素活性の高レベルの発現能があることが
明らかにされた（４−メチルーウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコシドの切断に
より評価）。重要なことは、感染ヒト細胞を覆う上清が時間と共にｈＧＡＡ活性
の増加性量を蓄積したことであり、これはＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌ感染により、活
性ｈＧＡＡ酵素の高レベルの発現及び持続的な分泌が生じたことを示している。
【０２１６】 実施例２７ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌベクター及びＧＡＡ分泌の肝ターゲティング Ａｄベクターは静脈内投与後に肝細胞に形質導入することが好ましい。Ａｄベ
クターの肝ターゲティングを利用するＧＳＤ−ＩＩ治療の仮説モデルを以下のよ
うに調査した：血漿中ｈＧＡＡの高レベルの生成及び分泌が、ＡｄｈＧＡＡΔｐ
ｏｌの１×１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）の野生型マウスへの静脈内注射後
に明らかにされた（図３１）。ＧＡＡ活性のきわめて高いレベルが感染後早くも
２日の血漿中に検出されたが、そのレベルは時間と共に減少した。肝細胞におい
て、ＣＭＶエンハンサー活性の急速なダウンレギュレーションが起き、血漿中に
検出されたＧＡＡ活性の減少に原因があるとみられたが、ヒト酵素に対するマウ
ス抗体の生成も存在していたと考えられる（Ilanら、（1997）Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 94:2587；Kaplanら、（1997）Hum. Gene Ther. 8:45；Kayら、（199
5）Nat. Gnet. 11.191）。
【０２１７】 ＧＡＡ−ＫＯマウスへのＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌの静脈内投与は、患部骨格や心
筋におけるグリコーゲンの蓄積を減少させる分泌ｈＧＡＡの有効性を確認するた
めに行った。ＧＡＡ−ＫＯマウスをマウスＧＡＡ遺伝子の標的ノックアウトによ
り以前に生成され、心筋及び骨格筋の全身グリコーゲン蓄積のほか、進行性の臨
床的筋障害を含む表現型を有する。（Clemesら、（1996）Gene Ther. 3:965）。
ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌベクターの静脈内注射後、ＧＡＡ−ＫＯマウスの血漿中に
高レベルの酵素活性が明らかにされた（図３２）。重要なことは、血漿のタンパ
ク質免疫ブロット分析により、感染後（ｄｐｉ）３日に投与した動物で検出され
たｈＧＡＡの主な型の分子量が〜１１０ｋＤであり、ｈＧＡＡの前駆体（未加工
）型と同等のサイズであった（図３２）（Kochanekら、（1996）proc. Natl. ac
ad. Sci. USA 93:5731）。また、酵素の有意な量（〜７７ｋＤ）の加工型も血漿
中に検出された。これは血漿中の成熟ＧＡＡのタンパク質分解、又は感染肝細胞
からのｈＧＡＡの成熟形態の放出の結果とみられる。
【０２１８】 実施例２８ＧＡＡ−ＫＯマウスにおけるｈＧＡＡ分布の評価 ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌベクターによる治療後、ＧＡＡ−ＫＯマウスを屠殺し、
ＧＡＡ活性の存在について組織を分析した。予備試験では、４ｄｐｉでＧＡＡ活
性がＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌ投与ＧＡＡ−ＫＯマウスの複数の筋組織中に検出され
た、グリコーゲンレベルは最小に減少し始めただけであった（データは示さず）
。１２ｄｐｉでは、Ａｄ処置ＧＡＡ−ＫＯマウスの四頭筋、腓腹筋、及び心筋に
おけるＧＡＡ活性が、未処置ＧＡＡ−ＫＯマウスで検出された酵素レベルに比べ
て、すべて有意に上昇した（図３３）。さらに劇的なことは、処置動物で検出さ
れた筋ＧＡＡ酵素活性レベルが、野生型マウスで検出されたレベルを上回り（ズ
３３）、処置動物の筋で検出されるＧＡＡ活性が、筋におけるＧＡＡの新規の生
合成によるものではなかったことである。各種組織由来のＲＮＡも分析した（図
３４）。ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌ処置ＧＡＡ−ＫＯマウスは高レベルのＧＡＡ活性
を含んでいたという事実にもかかわらず、ＧＡＡ特異的ＲＮＡ転写が肝でのみ検
出され、筋組織のいずれでも検出されなかった。野生型マウスにおいてＧＡＡ
ｍＲＮＡは筋組織で容易に検出されたが、これらの組織における酵素活性はＡｄ
ｈＧＡＡΔｐｏｌ処置動物において低かった点に注意されない。Ａｄ処置ＧＡＡ
−ＫＯマウスの肝臓、心筋、四頭筋由来のタンパク質抽出物の免疫ブロット分析
では、肝臓が高レベルで存在するｈＧＡＡの前駆体型を示すが、心筋及び四頭筋
は示さないことも明らかにされた（データは示さず）。これらの所見に基づき、
われわれはＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌ処置動物の筋組織中で検出される酵素活性が外
因的に由来す可能性がきわめて高く、すなわち、肝臓により分泌さえる前駆体Ｇ
ＡＡの摂取を介したものであると結論づけた。
【０２１９】 実施例２９ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌ後のＧＡＡ−ＫＯマウスにおける筋のグリコーゲン蓄積の
全身的逆転 この試験は、Ａｄ処置ＧＡＡ−ＫＯマウスの筋で検出される酵素活性が酵素の
正しいリソソームターゲッティングを来たしたことを確認するために行った。以
前の研究では、外因的に投与された前駆ＧＡＡがリソソームを標的にし、ＡＭＤ
ウズラ、及びＧＡＡ−ＫＯマウスの両方におけるリソソーム内グリコーゲン蓄積
を減少させるように作用しうることが明らかにされた（Amalfitanoら、（1997）
Gene Ther. 4:258；Armentanoら、（1997）J.Virol. 71:2408）。肝細胞分泌ｈ
ＧＡＡの正しいリソソームターゲティングは、ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌ処置ＧＡＡ
−ＫＯマウスにおける多数の筋のグリコーゲン蓄積の減少も来たすべきである。
未処置及びＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌベクター処置ＧＡＡ−ＫＯマウスの複数の筋に
置けるグリコーゲン蓄積のためのインサイツ過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＤ）染色を
評価した（図３５）。それぞれの筋組織のそれぞれにおいて、グリコーゲン蓄積
の顆粒型及び拡散型（これらの染色パターンはそれぞれ、リソソーム及び細胞質
におけるグリコーゲンの蓄積を表した）が、未処置ＧＡＡ−ＫＯマウスで観察さ
れた染色に比べて、ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌベクター処置ＧＡＡ−ＫＯマウスにお
いて有意に減少した。この結果は、処置マウス由来の各種組織における細胞内グ
リコーゲンレベルの定量化の後にも確認された（表ＩＩ）。心臓及び横隔膜の筋
は特にＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌ治療に対して反応であると思われるが、これは心臓
及び／又は呼吸器の筋の関与がさまざまな型のＧＳＤ−ＩＩにおける死亡率の主
な原因であるため重要な所見である。また注意すべきは、ｈＧＡＡの乳房 mile
由来型の外因的投与が治療開始後６か月までにＧＡＡ−ＫＯマウスの筋で確認さ
れたグリコーゲン蓄積を有意に修正することはなく、肝臓から分泌されるｈＧＡ
Ａが酵素のより有力な型であることを示した（Coxら、（1993）Nature 364:725
）。これらの結果により、ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌベクター処置ＧＡＡ−ＫＯマウ
スにおける複数の筋で認められたＧＡＡ活性の増大が酵素のリソソームターゲテ
ィングとなり、ＧＳＤ−ＩＩの主な欠陥の表現型を矯正、すなわち筋細胞のグリ
コーゲン蓄積が有意に減少することが確認された。
【０２２０】 さらに、ＧＡＡノックアウトマウスにおいて、野生型レベルのＧＡＡの２％未
満が分析したさまざまな筋組織に存在し、外因的に生成されるｈＧＡＡの検出を
促進することが確認された。また、高レベルのｈＧＡＡ活性が、静脈内投与後の
感染ＧＡＡ−ＫＯ動物の血清中に確認された。野生型マウスの感染後に確認され
たものとほぼ同じレベルである。さらに、血清中に検出された酵素のアイソフォ
ームは、免疫ブロッティング結果に基づき、加工された７６ｋＤアイソフォーム
に加えて、ｈＧＡＡの未過去工の１１０ｋＤ前駆体の実質的な量からなっていた
（図３２）。重要なことは、骨格筋細胞及び心筋細胞に存在するマンノース−６
−リン酸摂取機序を受け入れられることが予測されるＧＡＡの前駆型であるとい
うことである。このデータの別の実証では、ＧＡＡ活性はＧＡＡノックアウト動
物における各種組織において有意に減少した（野生型レベルの９０％未満）が、
本発明のＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌベクターを投与した動物は、分析した全組織にお
いて（野生型動物で検出される活性を上回る）きわめて高いレベルのＧＡＡ活性
を示した（図３３）。これらの結果は、ｈＧＡＡ発現の拡大を可能にする修飾Ａ
ｄベクターの単回静脈内投与後に、主にポーンプ病で影響される筋組織に対する
ｈＧＡＡの全身分布が達成できることを示している。
【０２２１】 ＡｄｈＧＡＡ処置動物の血清における前駆ｈＧＡＡ酵素の有意な量の存在は、
ｈＧＡＡの受容体介在摂取（マンノース−６−リン酸又はその他）及び細胞内、
リソソームターゲティングにつながるとわれわれは考えている。酵素活性アッセ
イにより測定された組織のグリコーゲン含量の定量的測定により、処置動物が処
置後１２日にグリコーゲン蓄積を大幅に減少させたことが確認された（図３５）
。１２ｄｐｉでの処置動物の血清中前駆酵素の存在が減少したにもかかわらず（
図３２）、組織のグリコーゲン含量は依然として有意に減少し、１２ｄｐｉでの
同じ組織における持続的なＧＡＡ酵素活性に随伴したことは重要である。したが
って、このデータにより、修飾Ａｄベクターの静脈内投与が全身の循環に放出さ
れるリソソーム酵素の持続的なレベルを可能にし、その後に酵素が組織病理を矯
正するように作用しうる標的組織に摂取されることが確認された。
【０２２２】 これらの結果は、肝臓が外分泌腺として役立ちうること、本発明のアデノウィ
ルスベクターが単回静脈内投与語に肝細胞の１００％感染しうること、また十分
な量のｈＧＡＡが感染肝細胞より分泌され、動物の血清中の７６ｋＤ及び１１０
ｋＤの酵素アイソフォームの酵素レベルを大幅に増大すること、そして最後に、
酵素が動物の骨格筋細胞及び心筋細胞により容易に吸収され、グリコーゲン蓄積
の劇的な減少を来たすことを示している。
【０２２３】
【０２２４】 Heらにより最初に記載されたように、ｐＡｄＥａｓｙ系は［Ｅ１−、Ｅ３−、
及び／又はＥ４−］Ａｄベクターのみを生成することができる。われわれは、Ｅ
１、Ｅ３及び／又はＥ４ゲノムだけではなく、ポリメラーゼ、ｐＴＰ、１００Ｋ
、及び／又はＩＶａ２遺伝子をも欠失したＡｄベクターの構成を可能にするため
に、Heらの方法を改善した。
【０２２５】 欠失のクローニングを促進するために、われわれはすでにＡｄ５においてｐＡ
ｄＥａｓｙ１を生成したが、このプラスミドはＢａｍＨＩで消化されてプラスミ
ドを大まかに半分に分割する。２つのＢａｍ ＨＩ断片のうち大きい方は自己に
再連結してｐＡｄΔＢａｍＨＩ（Δ２１６９６−３３４２２）を形成する。ｐＡ
ｄΔＢａｍＨＩ（Δ２１６９６−３３４２２）プラスミドは、ｐＡｄＥａｓｙ１
配列２１６９６−３３４２２を除くｐＡｄＥａｓｙ１由来配列を含む。２つのＢ
ａｍ ＨＩ断片のうち小さい方は、Ｅ３欠失を含むｐＡｄＥａｓｙ１由来配列２
１６９６−３３４２２を含み、われわれはｐｃＤＮＡ３（ＢａｍＨＩ部位を含み
、抗菌性マーカーがこのステップで利用可能であり、ｐｃＤＮＡ３がこの場合に
利用された）のＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ｐＡｄ（２１６９６−３３４
２２）を形成した。最終娘プラスミドｐＡｄΔＢａｍＨＩ（Δ２１６９６−３３
４２２）及びｐＡｄ（２１６９６−３３４２２）は、他の欠失のＡｄゲノムへの
導入のテンプレートとして用いられる。欠失が２つのプラスミドのいずれかに導
入されると、（以下参照）各プラスミドからのｐＡｄＥａｓｙ由来配列は（Ｂａ
ｍＨＩ制限酵素の消化、ＤＮＡの適切な細断片の分離、及び結合により）再連結
し、Heらの生成物に存在するオリジナルのＥ１及びＥ３欠失のほかに、所望の欠
失をすべて含む新しい親ｐＡｄベクターを形成する。複数の欠失型ｐＡｄはHeら
により記載されたシャトルプラスミドのいずれによっても組換え能があり、Ｅ１
、Ｅ３のほか、ポリメラーゼ、末端前タンパク質、ＩＶａ２、及び／又は１００
Ｋ遺伝子が別個に、又は同時に欠失された完全なＡｄベクターゲノムを生成する
。
【０２２６】 実施例３１親ｐＡｄプラスミド内のポリメラーゼ欠失の生成及び後のベクター製造 ｐＡｄΔＢａｍＨＩ（Δ２１６９６−３３４２２）をＭｕｎｌで消化し、ヌク
レオチド４０３６−９１５８間のＤＮＡの細断片をｐＡｄｓｃＬΔｐｏｌ（実施
例２）のＭｕｎｌ部分消化由来のＤＮＡの相同細断片と置換し、ポリメラーゼ欠
失型Ａｄベクターの生成に成功した。ｐＡｄｓｃＬΔｐｏｌの部分Ｍｕｎｌ Ｄ
ＮＡは、ポリメラーゼ遺伝子の以前に記載された欠失を含む（Ａｄ５ゲノムのヌ
クレオチド７２７４−７８８２）。結果として生じるプラスミドｐＡｄΔＢａｍ
ＨＩ（Δ２１６９６−３３４２２）ΔｐｏｌはＢａｍＨＩで消化し、ｐＡｄ（２
１６９６−３３４２２）のＢａｍＨＩ消化後の〜１２ｋｂＢａｍＨＩ細断片（Ａ
ｄ配列２１６９６−３３４２２を包囲する）を方向性にｐＡｄΔＢａｍＨＩ（Δ
２１６９６−３３４２２）Δｐｏｌに結合し、ｐＡｄΔｐｏｌを生成する。この
プラスミドは、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター、又は伸長因子１−αエンハ
ンサー／プロモーターのいずれかによりフランキングされるマーカー遺伝子（例
えば、細菌性β−ガラクトシダーゼ）及びいくつかのバージョンのヒトリソソー
ムα−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）遺伝子（例えば、３．３、例えば、実施例２３
に記載したｈ５’ｓＧＡＡ配列、及び３．８ｋｂ、実施例２３のｐｃＤＮＡ３−
ＧＡＡからのＧＡＡ配列、Van Hoveら、（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
3:65に記載された、５’フランキング配列を有さない及び有するヒトＧＡＡ前駆
体をコード化するバージョン）を含有するシャトルプラスミド（Heら、（1988）
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509により記載された）と組換えられている。
ｐＡｄΔｐｏｌとそれぞれのシャトルプラスミドとの間の相同組換えにより、そ
れぞれの遺伝子を含む全長複数の欠失型［Ｅ１−、Ｅ３−、ｐｏｌ−］Ａｄベク
ターゲノムの分離に成功する。プラスミドを含むベクターゲノムのＰａｃｌ消化
の後、株細胞を発現するＥ１及びポリメラーゼに形質移入することで、それぞれ
トランス相補性株細胞においてのみ、所望の複数の欠失型Ａｄベクターの生成及
び増殖に成功した。
【０２２７】 実施例３２親ｐＡｄプラスミド内のポリメラーゼ及び末端前タンパク質欠失の生成及び後の
ベクター製造 ｐＡｄΔＢａｍＨＩ（Δ２１６９６−３３４２２）ΔｐｏｌをＢｓｐＥＩで消
化し、効率的にプラスミドを３つの細断片に切断し、最大のプラスミドを分離し
てプラスミドｐＡｄＡｓｃＬΔｐｏｌΔｐＴＰ（ｐＡｄＡｓｃＬΔｐｐ（１．６
）とも呼ぶ）の２０５０ｂｐ ＢｓｐＥｌ細断片に結合した。ｐＡｄＡｓｃＬΔ
ｐｐ、ΔｐＴＰの２０５０ｂｐ細断片はｐＴＰ欠失（ヌクレオチド８６３１−９
１９７）を包囲する。結果として生じるプラスミドｐＡｄΔＢａｍＨＩ（Δ２１
６９６−３３４２２）Δｐｏｌ、ΔｐｏｌをＢａｍＨＩで消化し、ｐＡｄ（２１
６９６−３３４２２）のＢａｍＨＩ消化に存在する〜１２ｋｂＢａｍＨＩ細断片
（Ａｄ配列２１６９６−３３４２２を包囲する）を方向性にｐＡｄΔＢａｍＨＩ
（Δ２１６９６−３３４２２）Δｐｏｌ、ΔｐＴＰに結合し、ｐＡｄΔｐｏｌ、
でるたＴＰを生成する。このプラスミドは、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター
、又は伸長因子１−αエンハンサー／プロモーターのいずれかによりフランキン
グされるマーカー遺伝子（例えば、細菌性β−ガラクトシダーゼ）及びいくつか
のバージョンのヒトリソソームα−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）遺伝子（例えば、
３．３、例えば、実施例２３に記載したｈ５’ｓＧＡＡ配列、及び３．８ｋｂ、
実施例２３のｐｃＤＮＡ３−ＧＡＡからのＧＡＡ配列、Van Hoveら、（1996）Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 93:65に記載された、５’フランキング配列を有さな
い及び有するヒトＧＡＡ前駆体をコード化するバージョン）を含有するシャトル
プラスミド（Heら、（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509により記載さ
れた）と組換えられている。ｐＡｄΔｐｏｌ、ΔｐＴＰとそれぞれのシャトルプ
ラスミドとの間の相同組換えにより、それぞれの遺伝子を含む全長複数の欠失型
［Ｅ１−、Ｅ３−、ｐｏｌ−、ｐＴＰ−］Ａｄベクターゲノムの分離に成功する
。プラスミドを含むベクターゲノムのＰａｃｌ消化の後、株細胞（例えば、Ｃ７
）を発現するＥ１及びポリメラーゼに形質移入することで、それぞれトランス相
補性株細胞においてのみ、所望の複数の欠失型Ａｄベクターの生成及び増殖に成
功した。
【０２２８】 実施例３３ 親ｐＡｄプラスミド内のＩＶａ２、ポリメラーゼ、及び末端前タンパク質欠失
の生成 ｐＡｄΔＢａｍＨＩ（Δ２１６９６−３３４２２）をＭｕｎｌで消化し、ヌク
レオチド４０３６−９１５８間のＤＮＡの細断片をｐＡｄｓｃＬΔＩＶａ２、Δ
ｐｏｌ、ΔｐＴＰ（ｐＡｄｓｃＬΔＩＶａ２、Δｐｐ（１．６）とも呼ぶ；図３
６）のＭｕｎｌ部分消化由来のＤＮＡの相同細断片と置換し、Ｅ１、ポリメラー
ゼ、ｐＴＰ、及びＩＶａ２欠失型Ａｄベクターをうまく生成した。ｐＡｄｓｃＬ
ΔＩＶａ２、Δｐｏｌ、ΔｐＴＰの部分Ｍｕｎｌ ＤＮＡは、ポリメラーゼ遺伝
子（Ａｄ５ゲノムのヌクレオチド７２７４−７８８２）末端前タンパク質遺伝子
（Ａｄ５ゲノムのヌクレオチド８６３１−９１９７）の以前に記載された欠失、
及びＩＶａ２欠失（Ａｄ５ゲノムのヌクレオチド４８３０−５７６６）を含む。
結果として生じるプラスミドｐＡｄΔＢａｍＨＩ（Δ２１６９６−３３４２２）
ΔＩＶａ２、Δｐｏｌ、ΔｐＴＰはＢａｍＨＩで消化し、ｐＡｄ（２１６９６−
３３４２２）のＢａｍＨＩ消化後の〜１２ｋｂＢａｍＨＩ細断片（Ａｄ配列２１
６９６−３３４２２を包囲する）を方向性にｐＡｄΔＢａｍＨＩ（Δ２１６９６
−３３４２２）ΔＩＶａ２、Δｐｏｌ、ΔｐＴＰに結合し、ｐＡｄΔＩＶａ２、
Δｐｏｌ、でるたｐＴＰを生成する。ベクター［Ｅ１−、Ｅ３−、ＩＶａ２−、
ｐｏｌ−、ｐＴＰ−（１．６）］Ａｄは本明細書中で提供されている方法又は技
術上周知の他の方法に従って生成される。
【０２２９】 このプラスミドは、以前に記載されたシャトルプラスミド（例えば、マーカー
遺伝子、ＧＡＡ遺伝子、又は他のＤＮＡ配列）と組換えられ、適切なトランス相
補性株細胞におけるそれぞれ欠失したＡｄベクターを生成する。
【０２３０】 前パラグラフに記載した方法のルーチンの変型を用いて、シャトルプラスミド
ｐＡｄＡｓｃＬΔＩＶａ２（図１９）、ｐＡｄＡｓｃＬΔＩＶａ２、Δｐｏｌ（
図３８）、及びｐＡｄＡｓｃＬΔＩＶａ２、Δｐｐ（２．４）（図３７）からそ
れぞれ［Ｅ１−、Ｅ３−、ＩＶａ２−］Ａｄ、［Ｅ１−、Ｅ３−、ＩＶａ２−、
ｐｏｌ−］Ａｄ、及び［Ｅ１−、Ｅ３−、ＩＶａ２−、ｐｏｌ−、ｐＴＰ−（２
．４）］Ａｄを生成する。
【０２３１】 実施例３４親ｐＡｄプラスミド内の１００Ｋ欠失の生成及び後のベクター製造 全体の１００Ｋ遺伝子をも包囲するＡｄ由来配列を含む１７．１ｋｂプラスミ
ド、ｐＡｄΔＢａｍＨＩ（Δ２１６９６−３３４２２）をＮｈｅＩで消化し、３
つのＤＮＡ細断片を生成した。ＮｈｅＩ制限消化はＡｄ５ゲノムの配列２４９９
９乃至２５６８６間の１００Ｋ遺伝子内部の６８７ｂｐ細断片を除去する。Ａｄ
５ゲノムの配列３１５０９での付加的なＮｈｅＩ部位は、ｐＡｄ（２１６９６−
３３４２２）プラスミドの３１４３ｂｐ細断片及び残りの１３，３０２ｂｐ細断
片を遊離する。注意を払い、６８７ｂｐ欠失が、１００Ｋを覆う又は１００Ｋの
反対側のコード鎖上にある潜在的な他の読み枠と干渉しないようにする。ｐＡｄ
（２１６９６−３３４２２）Δ１００Ｋを生成するために、１３，３０２ｂｐ
ＮｈｅＩ消化ｐＡｄ（２１６９６−３３４２２）細断片を３１４３ｂｐ Ｎｈｅ
Ｉ断片に結合した。このプラスミドはＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡ細断片をＢａ
ｍＨＩ消化ｐＡｄΔＢａｍＨＩ（Δ２１６９６−３３４２２）の正しい方向に結
合し、ｐＡｄΔ１００Ｋを生成した。ｐＡｄΔ１００Ｋは、マーカー遺伝子（例
えば、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターによりフランキングされる細菌性β−
ガラクトシダーゼ）を含むシャトルプラスミドと組換えられている。
【０２３２】 ｐＡｄΔ１００Ｋとそれぞれのシャトルプラスミド間の相同組換えにより、そ
れぞれの導入遺伝子を含む全長複数の欠失された［Ｅ１−、１００Ｋ−］Ａｄベ
クターゲノムの分離に成功した。プラスミドを含むベクターゲノムのＰａｃｌ消
化の後、Ｅ１、及び１００Ｋ発現株細胞に形質移入することにより、所望の複数
の欠失型Ａｄベクターの生成と増殖に成功した。これらのウイルスは、Ｅ１遺伝
子のみを発現する細胞と比べて、Ｅ１及び１００Ｋ発現株細胞における感染性形
質導入単位を増殖し生成する能力の増大が５０倍であることがわかり、１００Ｋ
欠失がこれを含むベクターを不能にする重要な欠失であることが確認された。
【０２３３】 このプラスミドは、以前に記載されたシャトルプラスミド（例えば、マーカー
遺伝子、ＧＡＡ遺伝子、又は他のＤＮＡ配列）と組換えられ、適切なトランス相
補性株細胞におけるそれぞれ欠失したＡｄベクターを生成する。
【０２３４】 実施例３５後のベクター製造のための親ｐＡｄプラスミド内のＩＶａ２、ポリメラーゼ、末
端前タンパク質、及び１００Ｋ欠失の生成 ｐＡｄΔＢａｍＨＩ（Δ２１６９６−３３４２２）ΔＩＶａ２、Δｐｏｌ、Δ
ｐＴＰをＢａｍＨＩで消化した。ポリメラーゼ、末端前タンパク質、及びＩＶａ
２欠失を１００Ｋ欠失を包囲するｐＡｄ（２１６９６−３３４２２）Δ１００Ｋ
のＢａｍＨＩ細断片に結合し、ｐＡｄΔＩＶａ２、Δｐｏｌ、ΔｐＴＰ，Δ１０
０Ｋを生成した。ベクター［Ｅ１−、Ｅ３−、ＩＶａ２−、ｐｏｌ−、ｐＴＰ（
１．６）−、１００Ｋ−］Ａｄは本明細書中で提供されている方法又は技術上周
知の他の方法に従って生成される。
【０２３５】 このプラスミドは、以前に記載されたシャトルプラスミド（例えば、マーカー
遺伝子、ＧＡＡ遺伝子、又は他のＤＮＡ配列）と組換えられ、適切なトランス相
補性株細胞におけるそれぞれ欠失したＡｄベクターを生成する。
【０２３６】 実施例３６Ａｄｈ５’ｓＧＡＡΔｐｏｌ、Ａｄ／ＥＦ１−α／ｈＧＡＡΔｐｏｌ、及びＡｄ
／ＥＦ１−α／ｈ５’ｓＧＡＡΔｐｏｌ 細菌性相同組換えを用いたアデノウィルスベクターの製造に関して実施例３０
に記載した方法のルーチンの変型を用いて、ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌ（ＣＭＶプロ
モーター）、Ａｄｈ５’ｓＧＡＡΔｐｏｌ（ＣＭＶプロモーター）、及びＡｄ／
ＥＦ１−α／ｈＧＡＡΔｐｏｌ（ＥＦ−αプロモーター）が生成されている。Ａ
ｄｈ５’ｓＧＡＡ配列は、ｈＧＡＡ遺伝子の５’非翻訳配列のほとんどを欠くｐ
ｃＤＮＡ３−５’ｓＧＡＡの配列である（実施例２３）。また、本明細書中に記
載された方法のルーチンの変型を用いて、ＥＦ１−α／ｈ５’ｓＧＡＡΔｐｏｌ
（ＥＦ−α及び短縮ｈＧＡＡ遺伝子）が生成される。
【０２３７】 これらのベクターは、哺乳動物の対象、特に、ヒト対象を含むマウス又は他の
対象にインビボ投与される。特に、これらのベクターは（上述通り）治療効果を
達成するＧＡＡ欠乏症患者に投与される。
【０２３８】 特に、これらのベクターは野生型又はＧＡＡ−ＫＯマウスに投与され、組織／
血漿ＧＡＡ活性及びグリコーゲン蓄積／欠失が実施例２５に記載されているよう
にモニタリングされる。
【０２３９】 実施例３７ ＡｄｈＧＡＡΔｐｐ、Ａｄｈ５’ｓＧＡＡΔｐｐ、Ａｄ／ＥＦ１−α／ｈＧＡＡ
Δｐｐ、及びＡｄ／ＥＦ１−α／ｈ５’ｓＧＡＡΔｐｐ 細菌性相同組換えを用いたアデノウィルスベクターの製造に関して実施例３０に
記載した方法のルーチンの変型を用いて、ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌ（ＣＭＶプロモ
ーター）及びＡｄｈ５’ｓＧＡＡΔｐｏｌ（ＣＭＶプロモーター）が生成されて
いる。Δｐｏｌ、ΔｐＴＰ欠失はＡｄＬａｃＺΔｐｐ（Ａｄ５ゲノムの約ヌクレ
オチド７２７４乃至７８８１及び約ヌクレオチド９１９８乃至９６３０）につい
て実施例３に記載されている通りである。５’ｓＧＡＡ配列は、ｈＧＡＡ遺伝子
の５’非翻訳配列のほとんどを欠くｐｃＤＮＡ３−５’ｓＧＡＡの配列である。
また、本明細書中に記載された方法のルーチンの変型を用いて、Ａｄ／ＥＦ１−
α／ｈＧＡＡΔｐｐ（ＥＦ１−αプロモーター）及びＡｄ／ＥＦ１−α／ｈ５’
ｓＧＡＡΔｐｏｌ（ＥＦ−α及び短縮ｈＧＡＡ遺伝子）が生成される。
【０２４０】 これらのベクターは、哺乳動物の対象、特に、ヒト対象を含むマウス又は他の
対象にインビボ投与される。特に、これらのベクターは（上述通り）治療効果を
達成するＧＡＡ欠乏症患者に投与される。
【０２４１】 特に、これらのベクターは野生型又はＧＡＡ−ＫＯマウスに投与され、組織／
血漿ＧＡＡ活性及びグリコーゲン蓄積／欠失が実施例２５に記載されているよう
にモニタリングされる。
【０２４２】 本明細書中に引用された全特許刊行物は、それぞれ個別の刊行物が援用される
ことが特別に、また個別に示された場合は、その全体がこれにより援用される。
【０２４３】 発明が属する当業者には明らかであるように、本発明は発明の精神又は本質的
な特徴から逸脱することなく上記に特に開示されたもの以外の形態で実施するこ
とができる。したがって、上述した発明の具体的な実施例は例示として考えられ
るものであり、制限するものではない。本発明の範囲は、添付のクレームに記載
された通りであり、前述の説明に含まれる実施例に制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 パネルＡ：ｐＢＨＧ１１Δｐｏｌ、パネルＢ：ＡｄΔｐｏｌ及びＡｄΔｐｏｌ
／ｐＢＨＧ１１、及びパネルＣ：ＡｄＬａｃＺΔｐｏｌをそれぞれ分離するため
に利用されるステップを示す線図である。
【図２】 感染後０、２０及び４８時間における１．５ＢＦＵのＭＯｌでの２９３細胞の
感染後のＡｄＬａｃＺΔｐｏｌＤＮＡ複製を示す図である。
【図３】 感染後０、１０、２４及び４８時間における各種ＭＯｌでのＢ−６細胞の感染
後のＡｄＬｃＺΔｐｏｌＤＮＡを示す図である。
【図４】 ２９３、Ｂ−６及びＣ−７細胞におけるＡｄＬｃＺΔｐｏｌの増殖の動態を示
す図である。
【図５】 細胞系統２９３、Ｂ−６及びＣ−７及び系統２９３におけるＡｄｓｕｂ３６０
ＬａｃＺの増殖の動態を示す図である。
【図６】 １．５ＢＦＵのＭｏｌでの２９３細胞の感染後のＡｄＬｃＺΔｐｏｌ線維タン
パク質合成を示す図である。
【図７】 １．５ＢＦＵのＭｏｌでのＢ−６細胞の感染後のＡｄＬｃＺΔｐｏｌ線維タン
【図８】 Ａｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺと比較したＡｄＬｃＺΔｐｏｌ及びＡｄＬｃＺΔｐ
ｐに感染させたＨｅＬａ細胞における、アデノウイルス後期遺伝子、生成物、線
維タンパク質の発現の欠如を示す図である。
【図９】 偽感染対照と比較した（Ｂ）ＢＡＬＢ／マウスの感染後のインビボのｌａｃＺ
遺伝子（Ａ）の発現を示す図である。
【図１０】 各指標アデノウイルスのＨｉｎｄｌｌｌ制限酵素分析を示す図である。
【図１１】 Ｎｏｔｌ及びＥｃｏＲｌ消化ｄｌ７００１ＤＮＡと比較したＡｄＬｃＺΔｐｏ
ｌ感染Ｂ−細胞のＮｏｔｌ及びＥｃｏＲｌ消化を示す図である。
【図１２】 ２９３細胞（Ｅ１供給）及びＢ−６細胞（Ｅ１及びｐｏｌ供給）内に０．０１
のＭＯｌで感染したときのＡｄＬｃＺΔｐｏｌの相対的増殖を示す図である。
【図１３】 ＡｄＬｃＺΔｐｐを分離するために用いられるステップを示す線図である。
【図１４】 Δｐｏｌ、ΔｐＴＰ（ＡｄＬｃＺΔｐｐと呼ぶ）のゲノム構造を確認し、それ
を既知のゲノム構造の他のアデノウイルスベクターと比較する制限酵素分析を示
す図である。
【図１５】 ポリメラーゼ及び末端前タンパク質オープンリーディングフレームをコード化
し、ＡｄＬｃＺΔｐｐベクターにおける欠失部位を示す、アデノウイルスゲノム
の部分を示す概略図である。
【図１６】 パッケージング細胞系統２９３（Ｅ１のみを供給）及びＢ−６（Ｅ１及びｐｏ
ｌを供給）と比較したＥ１、ｐｏｌ及びｐＴＰ遺伝子活性を供給するパッケージ
ング細胞系統Ｃ−７において増殖したときのＡｄＬｃＺΔｐｐにおける制限レベ
ルを示す図である。
【図１７】 Ｅ１、ポリメラーゼ、及びｐＴＰ活性を欠く、ＨｅＬａ細胞において増殖した
ときのＡｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺ、ＡｄＬｃＺΔｐｏｌ、又はＡｄＬｃＺΔｐｐ
の複製レベルを示す図である。ＡｄＬｃＺΔｐｏｌゲノム及びＡｄＬｃＺΔｐｐ
ゲノムは感染後４８時間持続した。
【図１８】 Ａｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺ（パネルＢ）、ＡｄＬｃＺΔｐｐ（パネルＣ）又は
ＡｄＬｃＺΔｐｏｌ（パネルＤ）若しくは偽感染（パネルＡ）の７乃至９週齢Ｓ
ＤＩＤ又はＣ５７Ｂ１／６免疫不全マウスへの導入後のインビボＬａｃＺ遺伝子
の発現を示す図である。
【図１９】 シャトルプラスミドｐＡｄＡｓｃＬ−ΔＩＶａ２の構造を示す図である。
【図２０】 １００Ｋ領域に対して特異的なプライーを用いたＫ−１６及び２９３（パネル
Ａ）ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅の結果を示す図である。パネルＢは増幅ＤＮＡの
等価量が各レーンに位置したことを示す。パネルＣは１００Ｋ特異的プローブを
用いた２９３及びＫ−１６総ＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。
【図２１】 １００Ｋ遺伝子（レーン１〜４）を恒常的に発現するＣ７細胞、及びＥ１のみ
（レーン６）又はＥ１及びＥ１並びに１００Ｋ（ランド５）を発現する細胞系統
から分離されたＲＮＡの１００Ｋ特異的プローブを用いたノーザンブロットを示
す図である。
【図２２】 感染後各種日日でＡｄＬｃＺΔｐｏｌ形質導入後のＬａｃＺ新抗原の持続を示
す図である。各パネルは個々の動物を表す。形質導入はパネルａ、ｃ及び９にお
けるＡｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺ及びパネルｂ、ｄ、ｅ、ｆ及びｈにおけるＡｄＬ
ｃＺΔｐｏｌにより達成される。
【図２３】 本発明の第一世代のアデノウイルスＬａｃＺベクター及びＡｄ ＬａｃＺベク
ターによる形質導入後の形質導入肝細胞における細菌性β−ガラクトシダーゼの
定量化を示す図である。
【図２４】 Ａｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺ又はＡｄＬｃＺΔｐｏｌに感染させた動物の組織に
おけるβ−ガラクトシダーゼＲＮＡ発現を示す図である。
【図２５】 Ａｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺ又はＡｄＬｃＺΔｐｏｌに感染させた組織における
β−ガラクトシダーゼＲＮＡ発現の定量化を示す図である。
【図２６】 Ａｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺと比較したＡｄＬｃＺΔｐｏｌのベクターゲノムＤ
ＮＡの大きな持続を示す図である。
【図２７】 ヘマトキシリン及びエオシン染色切片によるＡｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺ又はＡ
ｄＬｃＺΔｐｏｌのいずれかによる肝形質導入後の炎症レベルを示す図である。
【図２８】 Ａｄｓｕｂ３６０ＬａｃＺベクター又はＡｄＬｃＺΔｐｏｌベクターが投与さ
れ、第一世代ベクターと比較したΔｐｏｌベクターにおけるＡＳＴレベルの低下
を表す、マウスの肝細胞の血漿アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳ
Ｔ）を示す図である。
【図２９】 ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌベクターの構造を示す図である。
【図３０】 ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌによる２９３細胞の感染後のｈＧＡＡ活性を示す図であ
る。
【図３１】 ｃ５７Ｂ１／６マウス（野生型）のＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌ感染後のｈＧＡＡ酵
素レベルを示す図である。
【図３２】 ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌによるＧＡＡノックアウト（ＫＯ）マウスの感染後のＧ
ＡＡの各種アイソフォームのｈＧＡＡ免疫ブロット検出を示す図である。
【図３３】 ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌによる治療後１２日のＧＡＡノックアウトマウスの各種
組織におけるＧＡＡ活性を示す図である。
【図３４】 ＧＡＡ特異的プローブを用いたd.p.i１２日にＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌを投与し
た野生型及びＧＡＡ−ＫＯ動物の各種組織から分離したＲＮＡのノーザンブロッ
ト分析を示す図である。
【図３５】 ＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌによる動物の治療後１２日のＧＡＡノックアウトマウス
の各種組織におけるＰＤＡ染色によるグリコーゲンレベルを示す図である。
【図３６】 シャトルプラスミドｐＡｄＡｓｃＬ−ΔＩＶａ２、Δｐｐ−１．６ｋｂの構造
を示す図である。
【図３７】 シャトルプラスミドｐＡｄＡｓｃＬ−ΔＩＶａ２、Δｐｐ−２．４ｋｂの構造
を示す図である。
【図３８】 シャトルプラスミドｐＡｄＡｓｃＬ−ΔＩＶａ２、Δｐｏｌの構造を示す図で
ある。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１２月１日（２０００．１２．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１８６
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１８７
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１８８
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】 アデノウイルスベクターの最も困難な問題は、免疫適格性動物におけるウイル
ス形質導入細胞を削減する宿主（host）免疫応答に対して二次的である長期の導
入遺伝子発現を持続する能力がないことである。Gilgenkrantzら、Hum. Gene Th
er. 6: 1265-1274（1995）；Yangら、J. Virol. 69: 2004-2015（1995）；Yang
ら、proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4407-4411（1994）；Yangら、J. Immunol
. 155: 2565-2570（1995）。免疫応答は導入遺伝子タンパク質生成物に対して明
らかにされている（Tripathyら、Nat. Med. 2: 545-550（1996））、アデノウイ
ルスベクターエピトープが宿主免疫応答を引き起こす主要な因子であることも明
らかにされている。Gilgenkrantzら、Hum. Gene Ther. 6: 1265-1274（1995）；
Yangら、J. Virol. 70: 7209-7212（1996）。細菌性β−ガラクトシダーゼ遺伝
子などの導入遺伝子は、他の送達系（例えば、直接ＤＮＡ注射又はアデノ関連性
ウイルス投与）とは対照的に、アデノウイルスベクターにより形質導入すると免
疫原性が高く、その場合に免疫原性導入遺伝子に対する免疫応答が欠如し、導入
遺伝子発現が持続することも繰り返し明らかにされている。Wolffら、Hum. Mol.
Genet. 1: 363-369（1992）；Xiaoら、J. Virol. 70: 8098-8108（1996）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７３】 本発明は、アデノウイルスミニ染色体を含有する破壊型アデノウイルスベクタ
ーを製造するための方法をさらに提供する。アデノウイルスミニ染色体は、Cham
berlainらに対するＷＯ９８／１７７７８３号及びKumar-Singhら、（1996）Huma
n Molecular Gentics 5:913に記載されている通りである。本発明の欠失型アデ
ノウイルスは、破壊型アデノウイルスの増殖のための最適化された欠失型アデノ
ウイルスとして用いることができる。本発明の欠失型ウイルスを用いた高力価の
系統の破壊型アデノウイルスベクターを増殖させるための方法は、破壊型アデノ
ウイルスベクター及び欠失型ベクターの増殖に許容的であるパッケージング細胞
内へ本発明の増殖欠陥性欠失型アデノウイルスを同時感染させて、結果として生
じるウイルス粒子を収集することを含む。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１月１５日（２００２．１．１５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１３】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３３】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３７】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:92） 7/00 7/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:92） 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/54 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 チェン ユアン ツォン アメリカ合衆国 ノースカロライナ州 27514 チャペル ヒル セダー ヒルズ ドライヴ 114 (72)発明者 フー フイミン アメリカ合衆国 テネシー州 38104 メ ンフィス ノース ソマーヴィル ストリ ート 57 アパートメント 704 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA80 CA05 CA07 DA03 DA20 EA02 FA02 FA15 GA11 HA01 HA17 4B065 AA90X AA93X AA95X AA95Y AB01 AC20 BA02 CA24 CA27 CA44 4C084 AA02 AA03 AA13 BA44 DC22 MA13 MA52 MA56 MA63 MA66 NA06 ZC192 ZC352

Claims (230)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 1つ又はそれ以上の領域における1つ又はそれ以上の欠失を含
    むアデノウイルスゲノムを含む増殖欠陥性アデノウイルスであって、前記領域が
    、 ａ）前記欠失が前記欠失領域から機能的１００Ｋのタンパク質の発現
    を実質的に阻止する１００Ｋ領域と、 ｂ）前記欠失が前記欠失領域から機能的ＩＶａ２タンパク質の発現を
    実質的に阻止し、さらに前記欠失の少なくとも１つがアデノウイルス血清型５ゲ
    ノムの約ヌクレオチド４８３０乃至５７６６での欠失又は他の血清型のアデノウ
    イルスのゲノムの相同領域である領域と、 ｃ）前記欠失が前記欠失領域から機能的末端前タンパク質の発現を実
    質的に阻止する末端前タンパク質領域と、からなる群より選択されるアデノウイ
    ルス。
  2. 【請求項２】 前記アデノウイルスが前記アデノウイルスゲノムにおける前
    記欠失をトランス相補する細胞中で増殖できる、請求項１のアデノウイルス。
  3. 【請求項３】 前記アデノウイルスがヘルパーの非存在下にトランス相補細
    胞中で増殖できる、請求項１のアデノウイルス。
  4. 【請求項４】 前記アデノウイルスゲノムがＥ１領域における1つ又はそれ
    以上の欠失をさらに含む、請求項１のアデノウイルス。
  5. 【請求項５】 前記アデノウイルスがＥ３領域における1つ又はそれ以上の
    欠失をさらに含む、請求項１のアデノウイルス。
  6. 【請求項６】 前記アデノウイルスゲノムがＩＶａ２領域における1つ又は
    それ以上の欠失を含む、請求項１のアデノウイルス。
  7. 【請求項７】 前記欠失がＩＶａ２領域の欠失を含み、さらに前記ＩＶａ２
    領域の欠失がアデノウイルス血清型５ゲノムの約ヌクレオチド４８３０乃至５７
    ６６での単一の欠失又は他の血清型のアデノウイルスのゲノムの相同領域を含む
    、請求項６のアデノウイルス。
  8. 【請求項８】 前記アデノウイルスゲノムがポリメラーゼ領域の１つ又はそ
    れ以上の欠失をさらに含む、請求項６のアデノウイルス。
  9. 【請求項９】 前記アデノウイルスゲノムがＥ１における1つ又はそれ以上
    の欠失及びＥ３領域における1つ又はそれ以上の欠失をさらに含む、請求項６の
    アデノウイルス。
  10. 【請求項１０】 前記アデノウイルスが本明細書中において［Ｅ１−、Ｅ３ − 、ＩＶａ２−、ｐｏｌ−］Аｄとして開示されている、請求項９のアデノウイ
    ルス。
  11. 【請求項１１】 前記アデノウイルスが1つ又はそれ以上の異種ヌクレオチ
    ド配列を含む、請求項１０のアデノウイルス。
  12. 【請求項１２】 前記アデノウイルスゲノムが１００Ｋ領域における1つ又
    はそれ以上の欠失を含む、請求項１のアデノウイルス。
  13. 【請求項１３】 前記欠失がアデノウイルス血清型５ゲノムの約ヌクレオチ
    ド２４，９９０乃至２５，６８７での１００Ｋにおける欠失を含む、請求項１２
    のアデノウイルス。
  14. 【請求項１４】 前記アデノウイルスがＥ１領域における1つ又はそれ以上
    の欠失をさらに含む、請求項１２のアデノウイルス。
  15. 【請求項１５】 前記アデノウイルスが本明細書中において［Ｅ１−、１０
    ０Ｋ−］Аｄとして開示されている、請求項１４のアデノウイルス。
  16. 【請求項１６】 前記アデノウイルスが1つ又はそれ以上の異種ヌクレオチ
    ド配列を含む、請求項１５のアデノウイルス。
  17. 【請求項１７】 前記アデノウイルスゲノムが末端前タンパク質領域におけ
    る1つ又はそれ以上の欠失を含む、請求項１のアデノウイルス。
  18. 【請求項１８】 前記欠失がアデノウイルス血清型５ゲノムの約ヌクレオチ
    ド９１８０乃至９６３０での末端前タンパク質領域における欠失又は他の血清型
    のアデノウイルスのゲノムの対応する領域を含む、請求項１７のアデノウイルス
    。
  19. 【請求項１９】 前記アデノウイルスゲノムがＥ１領域における1つ又はそ
    れ以上の欠失をさらに含む、請求項１７のアデノウイルス。
  20. 【請求項２０】 前記アデノウイルスゲノムがポリメラーゼ領域における1
    つ又はそれ以上の欠失をさらに含む、請求項１７のアデノウイルス。
  21. 【請求項２１】 前記末端前タンパク質領域における前記欠失がアデノウイ
    ルス血清型５ゲノムの約ヌクレオチド９１８０乃至９６３０での末端前タンパク
    質領域における欠失又は他の血清型のアデノウイルスのゲノムの対応する領域を
    含み、前記ポリメラーゼ領域における前記欠失がアデノウイルス血清型５ゲノム
    の約ヌクレオチド７２７４乃至７８８１での欠失又は他の血清型のアデノウイル
    スのゲノムの対応する領域を含む、請求項２０のアデノウイルス。
  22. 【請求項２２】 前記アデノウイルスがＥ１における1つ又はそれ以上の欠
    失又はＥ３領域における1つ又はそれ以上の欠失をさらに含む、請求項２０のア
    デノウイルス。
  23. 【請求項２３】 前記アデノウイルスが本明細書中において［Ｅ１−、Ｅ３
    −、ｐｏｌ−、ｐＴＰ−］Аｄとして開示されている、請求項２２のアデノウイ
    ルス。
  24. 【請求項２４】 前記アデノウイルスが1つ又はそれ以上の異種ヌクレオチ
    ドを含む、請求項２３のアデノウイルス。
  25. 【請求項２５】 1つ又はそれ以上の異種ヌクレオチドをさらに含む請求項
    １のアデノウイルス。
  26. 【請求項２６】 前記異種ヌクレオチド配列が発現制御配列と操作的に結合
    している、請求項２５のアデノウイルス。
  27. 【請求項２７】 前記発現制御配列がポロモーターを含有する、請求項２６
    のアデノウイルス。
  28. 【請求項２８】 前記プロモーターが肝特異的、筋特異的、及び脳特異的プ
    ロモーターからなる群より選択される、請求項２７のアデノウイルス。
  29. 【請求項２９】 前記プロモーターがＣＭＶプロモーター、アルブミンプロ
    モーター、ＥＦ１−αプロモーター、ＰγＫプロモーター、ＭＦＧプロモーター
    及びラウス肉腫ウイルスプロモーターからなる群より選択される、請求項２７の
    アデノウイルス。
  30. 【請求項３０】 前記アデノウイルスゲノムが５‘及び３’アデノウイルス
    逆位末端反復配列、アデノウイルスパッケージング配列、及びアデノウイルスＥ
    １Ａエンハンサー配列をさらに含む、請求項２５のアデノウイルス。
  31. 【請求項３１】 前記異種ヌクレオチド配列がタンパク質又はペプチドをコ
    ード化する、請求項２５のアデノウイルス。
  32. 【請求項３２】 前記タンパク質又はペプチドが治療タンパク質又はペプチ
    ドである、請求項３１のアデノウイルス。
  33. 【請求項３３】 前記タンパク質又はペプチドが免疫原性タンパク質又はペ
    プチドである、請求項３１のアデノウイルス。
  34. 【請求項３４】 前記タンパク質又はペプチドがレポータータンパク質又は
    ペプチドである、請求項３１のアデノウイルス。
  35. 【請求項３５】 前記異種ヌクレオチド配列がアンチセンスヌクレオチド配
    列をコード化する、請求項３１のアデノウイルス。
  36. 【請求項３６】 前記タンパク質又はペプチドがリソソームタンパク質であ
    る、請求項３１のアデノウイルス。
  37. 【請求項３７】 前記タンパク質又はペプチドが代謝障害と関連がある、請
    求項３１のアデノウイルス。
  38. 【請求項３８】 前記タンパク質又はペプチドがリソソーム貯蔵疾患と関連
    がある、請求項３７のアデノウイルス。
  39. 【請求項３９】 前記タンパク質又はペプチドがβ−ガラクトシダ−ゼ、β
    −へキソサミダーゼＡ，β−へキソサミダーゼＢ、ＧＭ２活性化タンパク質、グ
    ルコセレブロシダ−ゼ、アリルスルファターゼＡ、ガラクトシルセラミド、スフ
    ィンゴミエリナーゼ酸、セラミダーゼ酸、リパーゼ酸、α−Ｌ−イズロニダーゼ
    、イズルネートスルファターゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチ
    ルグルコサミニダーゼアセチル−ＣｏＡ、グルコサミ二ドアセチルトランスフェ
    ラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、アリルスルファター
    ゼＢ、β−グルクロニダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、α−
    Ｌ−フコシダーゼ、Ｎ−アスパルチル−β−グルコサミニダーゼ、α−ノイラミ
    ニダーゼ、リソソーム保護タンパク質、α−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニダー
    ゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、シスチン輸送
    タンパク質、シアル酸輸送タンパク質、ＣＬＮ３遺伝子酸産物、パルミトイルタ
    ンパク質チオエステラーゼ、サポシンＡ，サポシンＢ，サポシンＣ、及びサポシ
    ンＤからなる群より選択される、請求項３８のアデノウイルス。
  40. 【請求項４０】 前記タンパク質又はペプチドが糖原病と関連がある、請求
    項３７のアデノウイルス。
  41. 【請求項４１】 前記タンパク質又はペプチドがグルコース６−ホスファタ
    ーゼ、リソソーム酸αグルコシダーゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、脱分枝酵素、
    筋ホスホリラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、筋ホスホフル
    クトキナーゼ、グリコーゲン合成酵素、ホスホグルコイソメラーゼ、筋ホスホグ
    リセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、及び乳酸脱水素酵素からな
    る群より選択される、請求項４０のアデノウイルス。
  42. 【請求項４２】 前記タンパク質又はペプチドがリソソーム酸α−グルコシ
    ダーゼである、請求項４１のアデノウイルス。
  43. 【請求項４３】 前記タンパク質又はペプチドがヒトリソソーム酸α−グル
    コシダーゼである、請求項４２のアデノウイルス。
  44. 【請求項４４】 ａ）Ｅ１領域における1つ又はそれ以上の欠失であって、
    該欠失が前記領域から1つ又はそれ以上の機能的Ｅ１タンパク質の発現を実質的
    に阻止する欠失と、 ｂ）ポリメラーゼ領域における1つ又はそれ以上の欠失であって、該
    欠失が前記欠失領域から機能的ポリメラーゼタンパク質の発現を実質的に阻止す
    る欠失とを含むアデノウイルスゲノムを含む増殖欠陥性アデノウイルス。
  45. 【請求項４５】 前記アデノウイルスが前記アデノウイルスのいける前記欠
    失をトランス相補する細胞中で増殖できる、請求項４４のアデノウイルス。
  46. 【請求項４６】 前記アデノウイルスがヘルパーの非存在下にトランス相補
    細胞中で増殖できる、請求項１のアデノウイルス。
  47. 【請求項４７】 前記アデノウイルスゲノムがＥ３領域における1つ又はそ
    れ以上の欠失をさらに含む、請求項４４のアデノウイルス。
  48. 【請求項４８】 前記アデノウイルスが本明細書中において［Ｅ１−、Ｅ３
    −、ｐｏｌマイナス］Аｄとして開示されている、請求項４７のアデノウイルス
    。
  49. 【請求項４９】 前記アデノウイルスが1つ又はそれ以上の異種ヌクレオチ
    ド配列を含む、請求項４８のアデノウイルス。
  50. 【請求項５０】 前記アデノウイルスゲノムが１００Ｋ領域における1つ又
    はそれ以上の欠失をさらに含む、請求項４４のアデノウイルス。
  51. 【請求項５１】 前記アデノウイルスがＩＶａ２領域における1つ又はそれ
    以上の欠失をさらに含む、請求項４４のアデノウイルス。
  52. 【請求項５２】 前記アデノウイルスゲノムが末端前タンパク質領域におけ
    る1つ又はそれ以上の欠失を皿の含む、請求項４４のアデノウイルス。
  53. 【請求項５３】 前記アデノウイルスゲノムがＥ３領域における1つ又はそ
    れ以上の欠失又はＩＶａ２領域における1つ又はそれ以上の欠失をさらに含む、
    請求項５２のアデノウイルス。
  54. 【請求項５４】 前記アデノウイルスゲノムがＥ３領域における1つ又はそ
    れ以上の欠失又は１００Ｋ領域における1つ又はそれ以上の欠失をさらに含む、
    請求項５２のアデノウイルス。
  55. 【請求項５５】 前記アデノウイルスゲノムがＥ３領域における1つ又はそ
    れ以上の欠失、ＩＶａ２領域における1つ又はそれ以上の欠失、及び１００Ｋ領
    域における1つ又はそれ以上の欠失をさらに含む、請求項５２のアデノウイルス
    。
  56. 【請求項５６】 前記アデノウイルスゲノムがアデノウイルス血清型５ゲノ
    ムの約ヌクレオチド７２７４乃至７８８１でのアデノウイルスポリメラーゼ領域
    における欠失又は他の血清型のアデノウイルスのゲノムの対応する領域をさらに
    含む、請求項４４のアデノウイルス。
  57. 【請求項５７】 前記アデノウイルスが1つ又はそれ以上の異種ヌクレオチ
    ド配列をさらに含む、請求項４４のアデノウイルス。
  58. 【請求項５８】 前記アデノウイルスが本明細書中においてＡｄＬａｃＺΔ
    ｐｏｌ又はＡｄＬａｃＺΔｐｐとして開示されている、請求項５７のアデノウイ
    ルス。
  59. 【請求項５９】 リソソーム酸α−グルコシダ−ゼをコード化する異種ヌク
    レオチド配列又は1つ又はそれ以上の領域における1つ又はそれ以上の欠失を含む
    増殖欠陥性アデノウイルスであって、前記領域が、 ａ）前記欠失が前記欠失領域から機能的ポリメラーゼの発現を実質的
    に阻止するポリメラーゼ領域と、 ｂ）前記欠失が前記欠失領域から機能的末端前タンパク質の発現を実
    質的に阻止する末端前タンパク質領域と、 ｃ）前記欠失が前記欠失領域から機能的１００Ｋタンパク質の発現を
    実質的に阻止する１００Ｋ領域と、 ｄ）前記欠失が前記欠失領域から機能的ＩＶａ２タンパク質の発現を
    実質的に阻止し、さらに前記欠失の少なくとも１つがアデノウイルス血清型５ゲ
    ノムの約ヌクレオチド４８３０乃至５７６６での欠失又は他の血清型のアデノウ
    イルスのゲノムの相同領域であるＩＶａ２領域と、からなる群より選択されるア
    デノウイルス。
  60. 【請求項６０】 前記アデノウイルスゲノムがアデノウイルス血清型５ゲノ
    ムの約ヌクレオチド７２７４乃至７８８１でのポリメラーゼ領域における欠失又
    は他の血清型のアデノウイルスのゲノムの対応する領域を含む、請求項５９のア
    デノウイルス。
  61. 【請求項６１】 前記アデノウイルスがアデノウイルス血清型５ゲノムの約
    ヌクレオチド９１９８乃至９６３０での末端前タンパク質領域における欠失又は
    他の血清型のアデノウイルスのゲノムの対応する領域を含む、請求項５９のアデ
    ノウイルス。
  62. 【請求項６２】 前記アデノウイルスゲノムがポリメラーゼ領域における1
    つ又はそれ以上の欠失及び末端前タンパク質領域における1つ又はそれ以上の欠
    失を含む、請求項５９のアデノウイルス。
  63. 【請求項６３】 前記異種ヌクレオチド配列がプロポーターと操作的に結合
    している、請求項５９のアデノウイルス。
  64. 【請求項６４】 前記プロモーターが肝特異的及び筋特異的プロモーターか
    らなる群より選択される、請求項６３のアデノウイルス。
  65. 【請求項６５】 前記プロモーターがＣＭＶプロモーター、アルブミンプロ
    モーター、ＥＦ１−αプロモーター、ＰγＫプロモーター、ＭＦＧプロモーター
    及びラウス肉腫ウイルスプロモーターからなる群より選択される、請求項６３の
    アデノウイルス。
  66. 【請求項６６】 前記アデノウイルスがＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌ、Аｄ／ＥＦ
    １−α／ｈＧＡＡΔｐｏｌ、Ａｄｈ５’ｓＧＡＡΔｐｏｌ、Ａｄ／ＥＦ１−α／
    ｈ５’ｓＧＡＡΔｐｏｌ、ＡｄｈＧＡＡΔｐｐ、Ａｄ／ＥＦ１−α／ｈＧＡＡΔ
    ｐｐ、Ａｄｈ５’ｓＧＡＡΔｐｐ、Ａｄ／ＥＦ１−α／ｈ５’ｓＧＡＡΔｐｐか
    らなる群より選択される、請求項５９のアデノウイルス。
  67. 【請求項６７】 前記アデノウイルスゲノムがアデノウイルス血清型５ゲノ
    ムの約ヌクレオチド２４，９９０乃至２５，６８７での１００Ｋにおける欠失又
    は他の血清型のアデノウイルスのゲノムの対応する領域を含む、請求項５９のア
    デノウイルス。
  68. 【請求項６８】 前記アデノウイルスゲノムがアデノウイルス血清型５ゲノ
    ムの約ヌクレオチド４８３０乃至５７６６での欠失又は他の血清型のアデノウイ
    ルスのゲノムの対応する領域を含む、請求項５９のアデノウイルス。
  69. 【請求項６９】 請求項１のアデノウイルスを含む細胞。
  70. 【請求項７０】 前記アデノウイルスがタンパク質又はペプチドをコード化
    する1つ又はそれ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、請求項６９の細胞。
  71. 【請求項７１】 前記細胞が哺乳動物の細胞である、請求項６９の細胞。
  72. 【請求項７２】 請求項４４のアデノウイルスを含む細胞。
  73. 【請求項７３】 前記アデノウイルスがタンパク質又はペプチドをコード化
    する1つ又はそれ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、請求項７２の細胞。
  74. 【請求項７４】 前記細胞が哺乳動物の細胞である、請求項７２の細胞。
  75. 【請求項７５】 請求項５９のアデノウイルスを含む細胞。
  76. 【請求項７６】 前記アデノウイルスがタンパク質又はペプチドをコード化
    する1つ又はそれ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、請求項７５の細胞。
  77. 【請求項７７】 前記細胞が哺乳動物の細胞である、請求項７５の細胞。
  78. 【請求項７８】 アデノウイルス１００Ｋタンパク質をコード化するヌクレ
    オチド配列を含む分離型ＤＮＡを含む細胞。
  79. 【請求項７９】 前記細胞が哺乳動物の細胞である、請求項７８の細胞。
  80. 【請求項８０】 前記細胞が機能的１００Ｋタンパク質の発現を実質的に欠
    くアデノウイルスゲノムを増殖できる、請求項７８の細胞。
  81. 【請求項８１】 前記ヌクレオチド配列がパッケージング細胞のゲノムに安
    定に組み込まれる、請求項７８の細胞。
  82. 【請求項８２】 前記細胞がＫ−１６細胞である、請求項８１の細胞。
  83. 【請求項８３】 前記ヌクレオチド配列が前記アデノウイルス１００Ｋタン
    パク質をコード化する配列と操作的に結合している構成プロモーターをさらにコ
    ード化する、請求項７８の細胞。
  84. 【請求項８４】 前記細胞が１００Ｋタンパク質を恒常的に発現するＣ７細
    胞である、請求項８３の細胞。
  85. 【請求項８５】 前記ヌクレオチド配列が前記１００Ｋタンパク質をコード
    化する配列と操作的に結合している誘導性プロモーターをコード化する、請求項
    ７８の細胞。
  86. 【請求項８６】 前記アデノウイルスゲノムが１００Ｋ領域における1つ又
    はそれ以上の欠失を含み、さらに前記欠失が前記１００Ｋ領域から機能的１００
    Ｋタンパク質の発現を実質的に阻止するアデノウイルスゲノムをさらに含む、請
    求項７８の細胞。
  87. 【請求項８７】 前記アデノウイルス１００Ｋタンパク質をコード化するヌ
    クレオチド配列において1つ又はそれ以上の欠失が認められる、アデノウイルス
    １００Ｋタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む分離型ＤＮＡ。
  88. 【請求項８８】 前記分離型ＤＮＡが欠失型アデノウイルス１００Ｋタンパ
    ク質をコード化するヌクレオチド配列を含むアデノウイルスゲノムを含む、請求
    項８７の分離型ＤＮＡ。
  89. 【請求項８９】 １００Ｋ領域における前記欠失がアデノウイルス血清型５
    ゲノムの約ヌクレオチド２４，９９０乃至２５，６８７での欠失又は他の血清型
    のアデノウイルスのゲノムの対応する領域を含む、請求項８８の分離型ＤＮＡ。
  90. 【請求項９０】 請求項８８の分離型ＤＮＡを含むベクター。
  91. 【請求項９１】 前記ベクターがプラスミドである、請求項９０のベクター
    。
  92. 【請求項９２】 前記ベクターが本明細書中においてｐｃＤＮＡ３＋１００
    Ｋとして開示されている、請求項９１のベクター。
  93. 【請求項９３】 アデノウイルスＩＶａ２タンパク質をコード化するヌクレ
    オチド配列を含み、前記アデノウイルスＩＶａ２タンパク質をコード化するヌク
    レオチド配列において1つ又はそれ以上の欠失が認められ、さらに前記欠失の少
    なくとも１つがアデノウイルス血清型５ゲノムの約ヌクレオチド４８３０乃至５
    ７６６での欠失又は他の血清型のアデノウイルスのゲノムの相同領域を含む、分
    離型ＤＮＡ。
  94. 【請求項９４】 前記分離型ＤＮＡが欠失型アデノウイルスＩＶａ２領域を
    コード化するヌクレオチド配列を含む、請求項９３の分離型ＤＮＡ。
  95. 【請求項９５】 前記ＩＶａ２領域における前記欠失がアデノウイルス血清
    型５ゲノムの約ヌクレオチド４８３０乃至５７６６での欠失又は他の血清型のア
    デノウイルスのゲノムの対応する領域を含む、請求項９４の分離型ＤＮＡ。
  96. 【請求項９６】 請求項９３の分離型ＤＮＡを含むベクター。
  97. 【請求項９７】 前記ベクターがプラスミドである、請求項９６のベクター
    。
  98. 【請求項９８】 前記プラスミドが、 ａ）ｐＡｄＡｓｃＬΔＩＶａ２ ｂ）ｐＡｄＡｓｃＬΔＩＶａ２、Δｐｏｌ ｃ）ｐＡｄＡｓｃＬΔＩＶａ２、Δｐｐ（１．６）；及び ｄ）ｐＡｄＡｓｃＬΔＩＶａ２、Δｐｐ（２．４） からなる群より選択される、請求項９７のベクター。
  99. 【請求項９９】 アデノウイルスゲノムにおける1つ又はそれ以上の欠失を
    含む増殖欠陥性アデノウイルス粒子を生成する方法であって、 アデノウイルスを哺乳動物の細胞に導入することを含み、導入される
    アデノウイルスが1つ又はそれ以上の領域における1つ又はそれ以上の欠失を含む
    アデノウイルスゲノムを含み、該領域が、 ａ）欠失が欠失領域から機能的１００Ｋタンパク質の発現を実質的に
    阻止する、１００Ｋ領域と、 ｂ）欠失が欠失領域から機能的ＩＶａ２タンパク質の発現を実質的に
    阻止し、さらに前記欠失の少なくとも１つがアデノウイルス血清型５ゲノムの約
    ヌクレオチド４８３０乃至５７６６での欠失又は他の血清型のアデノウイルスの
    ゲノムの相同領域である、ＩＶａ２領域と、 ｃ）欠失が欠失領域から機能的末端前タンパク質の発現を実質的に阻
    止する、末端前タンパク質領域と、からなる群より選択され、 哺乳動物の細胞がアデノウイルスゲノムから欠失された機能をトラン
    ス相補するととのに、 増殖欠陥性アデノウイルス粒子を収集することを含む方法。
  100. 【請求項１００】 収集されたアデノウイルスが１細胞につき少なくとも１
    ００感染単位の力当を有する、請求項９９の方法。
  101. 【請求項１０１】 アデノウイルスゲノムがＥ１領域における1つ又はそれ
    以上の欠失をさらに含むとともに哺乳動物の細胞がさらに欠失をトランス相補す
    る、請求項９９の方法。
  102. 【請求項１０２】 アデノウイルスゲノムがＥ３領域における1つ又はそれ
    以上の欠失をさらに含む、請求項９９の方法。
  103. 【請求項１０３】 アデノウイルスゲノムがポリメラーゼ領域における1つ
    又はそれ以上の欠失をさらに含み、哺乳動物の細胞が欠失をさらにトランス相補
    する、請求項９９の方法。
  104. 【請求項１０４】 アデノウイルスゲノムがアデノウイルス１００Ｋ領域に
    おける1つ又はそれ以上の欠失を含む、請求項９９の方法。
  105. 【請求項１０５】 １００Ｋ領域における欠失がアデノウイルス血清型５ゲ
    ノムの約ヌクレオチド２４，９９０乃至２５，６８７での欠失又は他の血清型の
    アデノウイルスのゲノムの対応する領域を含む、請求項１０４の方法。
  106. 【請求項１０６】 導入されるアデノウイルスが本明細書中において［Ｅ１ − 、１００Ｋ−］Аｄとして開示されている、請求項１０５の方法。
  107. 【請求項１０７】 哺乳動物の細胞が哺乳動物の細胞のゲノムに安定に組み
    込まれる機能的１００Ｋタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む、請
    求項１０４の方法。
  108. 【請求項１０８】 哺乳動物の細胞がＫ−１６細胞である、請求項１０７の
    方法。
  109. 【請求項１０９】 哺乳動物の細胞が機能的１００Ｋタンパク質を恒常的に
    発現する、請求項１０４の方法。
  110. 【請求項１１０】 哺乳動物の細胞が１００Ｋタンパク質を恒常的に発現す
    るＣ７細胞である、請求項１０９の方法。
  111. 【請求項１１１】 アデノウイルスゲノムがアデノウイルスＩＶａ２領域に
    おける1つ又はそれ以上の欠失を含む、請求項９９の方法。
  112. 【請求項１１２】 欠失がアデノウイルス血清型５ゲノムの約ヌクレオチド
    ４８３０乃至５７６６でのＩＶａ２領域における欠失又は他の血清型のアデノウ
    イルスのゲノムの対応する領域を含む、請求項１１１の方法。
  113. 【請求項１１３】 アデノウイルスゲノムがポリメラーゼ領域における1つ
    又はそれ以上の欠失をさらに含み、哺乳動物の細胞が欠失をさらにトランス相補
    する、請求項１１１の方法。
  114. 【請求項１１４】 アデノウイルスゲノムがＥ１領域における1つ又はそれ
    以上の欠失及びＥ３における1つ又はそれ以上の欠失をさらに含み、哺乳動物の
    細胞がＥ１欠失をさらにトランス相補する、請求項１１３の方法。
  115. 【請求項１１５】 アデノウイルスが本明細書中において［Ｅ１−、Ｅ３− 、ＩＶａ２−、ｐｏｌ−］Аｄとして開示されている、請求項１１４の方法。
  116. 【請求項１１６】 哺乳動物の細胞が哺乳動物の細胞のゲノムに安定に組み
    込まれる機能的ＩＶａ２タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む、請
    求項１１１の方法。
  117. 【請求項１１７】 哺乳動物の細胞がＢ６細胞又はＣ７細胞である、請求項
    １１６の方法。
  118. 【請求項１１８】 哺乳動物の細胞が機能的ＩＶａ２タンパク質を恒常的に
    発現する、請求項１１６の方法。
  119. 【請求項１１９】 アデノウイルスがアデノウイルス末端前タンパク質領域
    における1つ又はそれ以上の欠失を含む、請求項９９の方法。
  120. 【請求項１２０】 末端前タンパク質領域における欠失がアデノウイルス血
    清型５ゲノムの約ヌクレオチド９１９８乃至９６３０での欠失又は他の血清型の
    ゲノムの対応する領域を含む、請求項１１９の方法。
  121. 【請求項１２１】 導入されるアデノウイルスが本明細書中において［Ｅ１
    −、Ｅ３−、ｐｏｌ−、ｐＴＰ−］Аｄとして開示されている、請求項１１９の
    方法。
  122. 【請求項１２２】 哺乳動物の細胞が哺乳動物の細胞のゲノムに安定に組み
    込まれる機能的末端前タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む、請求
    項１１９の方法。
  123. 【請求項１２３】 哺乳動物の細胞がＣ７細胞である、請求項１２２の方法
    。
  124. 【請求項１２４】 哺乳動物の細胞が機能的末端前タンパク質を恒常的に発
    現する、請求項１１９の方法。
  125. 【請求項１２５】 アデノウイルスゲノムがポリメラーゼ領域における1つ
    又はそれ以上の欠失をさらに含み、哺乳動物の細胞が欠失をさらにトランス相補
    する、請求項１１９の方法。
  126. 【請求項１２６】 アデノウイルスゲノムが1つ又はそれ以上の異種ヌクレ
    オチド配列をさらに含む、請求項９９の方法。
  127. 【請求項１２７】 請求項９９の方法により生成される増殖欠陥性アデノウ
    イルス粒子。
  128. 【請求項１２８】 ポリメラーゼ領域における1つ又はそれ以上の欠失及び
    Ｅ１における1つ又はそれ以上の欠失を含む増殖欠陥性アデノウイルス粒子を生
    成する方法であって、 哺乳動物の細胞にアデノウイルスを導入することを含み、導入される
    アデノウイルスが、 ａ）欠失が欠失領域から機能的ポリメラーゼの発現を実質的に阻止す
    る、ポリメラーゼ領域における1つ又はそれ以上の欠失と、 ｂ）欠失が前記欠失領域から1つ又はそれ以上の機能的Ｅ１タンパク
    質の発現を実質的に阻止し、さらに哺乳動物の細胞がアデノウイルスゲノムにお
    ける欠失機能をトランス相補する、Ｅ１における1つ又はそれ以上の欠失とを含
    むとともに、 増殖欠陥性アデノウイルス粒子を収集することを含む方法。
  129. 【請求項１２９】 収集されたアデノウイルスが１細胞につき少なくとも１
    ００感染単位の力当を有する、請求項１２８の方法。
  130. 【請求項１３０】 ポリメラーゼ領域における欠失がアデノウイルス血清型
    ５ゲノムの約ヌクレオチド７２７４乃至７８８１での欠失又は他の血清型のアデ
    ノウイルスのゲノムの対応する領域を含む、請求項１２８の方法。
  131. 【請求項１３１】 アデノウイルスが本明細書中において［Ｅ１−、Ｅ３−
    、ｐｏｌ−］Аｄとして開示されている、請求項１２８の方法。
  132. 【請求項１３２】 機能的ポリメラーゼタンパク質をコード化するヌクレオ
    チド配列が哺乳動物の細胞のゲノムに安定に組み込まれる、請求項１２８の方法
    。
  133. 【請求項１３３】 哺乳動物の細胞がＢ６又はＣ７細胞である、請求項１３
    ２の方法。
  134. 【請求項１３４】 哺乳動物の細胞が機能的ポリメラーゼタンパク質を恒常
    的に発現する、請求項１２８の方法。
  135. 【請求項１３５】 アデノウイルスがアデノウイルスＥ３領域における1つ
    又はそれ以上の欠失をさらに含む、請求項１２８の方法。
  136. 【請求項１３６】 導入されるアデノウイルスが末端前タンパク質領域にお
    ける1つ又はそれ以上の欠失をさらに含み、哺乳動物の細胞がアデノウイルスゲ
    ノムにおける欠失末端前タンパク質機能をトランス相補する、請求項１２８の方
    法。
  137. 【請求項１３７】 アデノウイルスゲノムが1つ又はそれ以上の異種ヌクレ
    オチド配列をさらに含む、請求項１２８の方法。
  138. 【請求項１３８】 前記導入されるアデノウイルスがＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌ
    、Аｄ／ＥＦ１−α／ｈＧＡＡΔｐｏｌ、Ａｄｈ５’ｓＧＡＡΔｐｏｌ、Ａｄ／
    ＥＦ１−α／ｈ５’ｓＧＡＡΔｐｏｌ、ＡｄｈＧＡＡΔｐｐ、Ａｄ／ＥＦ１−α
    ／ｈＧＡＡΔｐｐ、Ａｄｈ５’ｓＧＡＡΔｐｐ、Ａｄ／ＥＦ１−α／ｈ５’ｓＧ
    ＡＡΔｐｐからなる群より選択される、請求項１３７の方法。
  139. 【請求項１３９】 請求項１２８の方法により生成される増殖欠陥性アデノ
    ウイルス粒子。
  140. 【請求項１４０】 増殖欠陥性アデノウイルス粒子を生成する方法であって
    、 アデノウイルスゲノムを含む細菌のプラスミドを細菌の細胞に導入す
    ることを含み、前記アデノウイルスゲノムが1つ又はそれ以上の領域における1つ
    又はそれ以上の欠失を含み、該領域が、 ａ）前記欠失が前記欠失領域から機能的ポリメラーゼの発現を実質的
    に阻止する、ポリメラーゼ領域と、 ｂ）前記欠失が前記欠失領域から機能的末端前タンパク質の発現を実
    質的に阻止する、ポリメラーゼ領域と、 ｃ）前記欠失が前記欠失領域から機能的１００Ｋタンパク質の発現を
    実質的に阻止する、１００Ｋ領域と、 ｄ）前記欠失が前記欠失領域から機能的ＩＶａ２タンパク質の発現を
    実質的に阻止し、さらに前記欠失の少なくとも１つがアデノウイルス血清型５ゲ
    ノムの約ヌクレオチド４８３０乃至５７６６での欠失又は他の血清型のアデノウ
    イルスのゲノムの相同領域であるＩＶａ２領域と、からなる群より選択され、 細菌の細胞における細胞のプラスミドを増幅すること、 細菌の細胞から増幅された細菌のプラスミドを回収すること、 回収された細菌のプラスミドを直線化すること、 直線化されたプラスミドをアデノウイルスゲノムにおける欠失機能を
    トランス相補する哺乳動物の細胞内に導入すること、 増殖欠陥性アデノウイルス粒子を収集することを含む方法。
  141. 【請求項１４１】 アデノウイルスゲノムが1つ又はそれ以上の異種ヌクレ
    オチド配列をさらに含む、請求項１４０の方法。
  142. 【請求項１４２】 異種ヌクレオチド配列がリソソーム酸α−グルコシダー
    ゼをコード化する、請求項１４１の方法。
  143. 【請求項１４３】 ヌクレオチド配列を細胞内に送達する方法であって、異
    種ヌクレオチド配列を含むアデノウイルス及び1つ又はそれ以上の領域における1
    つ又はそれ以上の欠失を含む増殖欠陥性アデノウイルスを細胞内に導入すること
    を含み、該領域が、 ａ）欠失が欠失領域から機能的１００Ｋタンパク質の発現を実質的に
    阻止する、１００Ｋ領域と、 ｂ）欠失が欠失領域から機能的ＩＶａ２タンパク質の発現を実質的に
    阻止し、さらに前記欠失の少なくとも１つがアデノウイルス血清型５ゲノムの約
    ヌクレオチド４８３０乃至５７６６での欠失又は他の血清型のアデノウイルスの
    ゲノムの相同領域である、ＩＶａ２領域と、 ｃ）欠失が欠失領域から機能的末端前タンパク質の発現を実質的に阻
    止する、末端前タンパク質領域と、からなる群より選択される方法。
  144. 【請求項１４４】 アデノウイルスの少なくとも約１０，０００感染単位が
    細胞に投与される、請求項１４３の方法。
  145. 【請求項１４５】 アデノウイルスゲノムがポリメラーゼ領域における1つ
    又はそれ以上の欠失をさらに含む、請求項１４３の方法。
  146. 【請求項１４６】 アデノウイルスゲノムが２つの異種ヌクレオチド配列を
    含む、請求項１４３の方法。
  147. 【請求項１４７】 ヌクレオチド配列がタンパク質又はペプチドをコード化
    する、請求項１４３の方法。
  148. 【請求項１４８】 ヌクレオチド配列が治療タンパク質又はペプチドをコー
    ド化する、請求項１４７の方法。
  149. 【請求項１４９】 ヌクレオチド配列が免疫原性タンパク質又はペプチドを
    コード化する、請求項１４７の方法。
  150. 【請求項１５０】 前記タンパク質又はペプチドがリソソームタンパク質で
    ある、請求項１４７の方法。
  151. 【請求項１５１】 前記タンパク質又はペプチドが代謝障害と関連がある、
    請求項１４７の方法。
  152. 【請求項１５２】 前記タンパク質又はペプチドがリソソーム貯蔵疾患と関
    連がある、請求項１５１の方法。
  153. 【請求項１５３】 前記タンパク質又はペプチドが糖原病と関連がある、請
    求項１５１の方法。
  154. 【請求項１５４】 前記タンパク質又はペプチドがグルコース６−ホスファ
    ターゼ、リソソーム酸αグルコシダーゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、脱分枝酵素
    、筋ホスホリラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、筋ホスホフ
    ルクトキナーゼ、グリコーゲン合成酵素、ホスホグルコイソメラーゼ、筋ホスホ
    グリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、及び乳酸脱水素酵素から
    なる群より選択される、請求項１５３の方法。
  155. 【請求項１５５】 前記タンパク質又はペプチドがヒトリソソーム酸α−グ
    ルコシダ−ゼである、請求項１５４の方法。
  156. 【請求項１５６】 細胞がニューロン細胞、網膜細胞、上皮細胞、筋細胞、
    膵細胞、肝細胞、線維芽細胞、内皮細胞、生殖細胞、及び前立腺細胞からなる群
    より選択される、請求項１４３の方法。
  157. 【請求項１５７】 異種ヌクレオチド配列が発現制御配列と操作的に結合し
    ている、請求項１４３の方法。
  158. 【請求項１５８】 異種ヌクレオチド配列がプロモーターと操作的に結合し
    ている、請求項１５７の方法。
  159. 【請求項１５９】 プロモーターが肝特異的、筋特異的、及び脳特異的プロ
    モーターからなる群より選択される、請求項１５８の方法。
  160. 【請求項１６０】 プロモーターがＣＭＶプロモーター、アルブミンプロモ
    ーター、ＥＦ１−αプロモーター、ＰγＫプロモーター、ＭＦＧプロモーター及
    びラウス肉腫ウイルスプロモーターからなる群より選択される、請求項１５８の
    方法。
  161. 【請求項１６１】 アデノウイルスゲノムが１００Ｋ領域における1つ又は
    それ以上の欠失を含む、請求項１４３の方法。
  162. 【請求項１６２】 １００Ｋ領域における欠失がアデノウイルス血清型５ゲ
    ノムの約ヌクレオチド２４，９９０乃至２５，６８７での欠失又は他の血清型の
    アデノウイルスの相同領域を含む、請求項１６１の方法。
  163. 【請求項１６３】 アデノウイルスが本明細書中において［Ｅ１−、１００
    Ｋ−］Аｄとして開示されている、請求項１６１の方法。
  164. 【請求項１６４】 アデノウイルスゲノムがアデノウイルスＩＶａ２領域に
    おける1つ又はそれ以上の欠失を含む、請求項１４３の方法。
  165. 【請求項１６５】 ＩＶａ２領域における欠失がアデノウイルスの約ヌクレ
    オチド４８３０乃至５７６６での欠失又は他の血清型の相同領域アデノウイルス
    を含む、請求項１６４の方法。
  166. 【請求項１６６】 アデノウイルスが本明細書中において［Ｅ１−、Ｅ３− 、ＩＶａ２−、ｐｏｌ−］Аｄとして開示されている、請求項１６４の方法。
  167. 【請求項１６７】 アデノウイルスゲノムが末端前タンパク質領域における
    1つ又はそれ以上の欠失を含む、請求項１４３の方法。
  168. 【請求項１６８】 欠失がアデノウイルス血清型５ゲノムの約ヌクレオチド
    ９１８０乃至９６３０での末端前タンパク質領域における欠失又は他の血清型の
    アデノウイルスのゲノムの対応する領域を含む、請求項１６７の方法。
  169. 【請求項１６９】 アデノウイルスゲノムがアデノウイルスポリメラーゼ領
    域における1つ又はそれ以上の欠失をさらに含む、請求項１４３の方法。
  170. 【請求項１７０】 ポリメラーゼ領域における欠失がアデノウイルス血清型
    ５ゲノムの約ヌクレオチド７２７４乃至７８８１での欠失又は他の血清型のアデ
    ノウイルスのゲノムの対応する領域をさらに含む、請求項１６９の方法。
  171. 【請求項１７１】 ヌクレオチド配列を対象に投与する方法であって、1つ
    又はそれ以上の領域における異種ヌクレオチド配列及び1つ又はそれ以上の欠失
    を含むアデノウイルスゲノムを含む増殖欠陥性アデノウイルス粒子の生物学的に
    有効な量を対象に投与することを含み、該領域が、 ａ）欠失が欠失領域から機能的１００Ｋタンパク質の発現を実質的に
    阻止する、１００Ｋ領域と、 ｂ）欠失が欠失領域から機能的ＩＶａ２タンパク質の発現を実質的に
    阻止し、さらに前記欠失の少なくとも１つがアデノウイルス血清型５ゲノムの約
    ヌクレオチド４８３０乃至５７６６での欠失又は他の血清型のアデノウイルスの
    ゲノムの相同領域である、ＩＶａ２領域と、 ｃ）欠失が欠失領域から機能的末端前タンパク質の発現を実質的に阻
    止する、末端前タンパク質領域と、からなる群より選択される方法。
  172. 【請求項１７２】 アデノウイルスゲノムがポリメラーゼ領域における1つ
    又はそれ以上の欠失をさらに含む、請求項１７１の方法。
  173. 【請求項１７３】 アデノウイルスの少なくとも約１０，０００感染単位が
    対象に投与される、請求項１７１の方法。
  174. 【請求項１７４】 異種ヌクレオチド配列がペプチド又はタンパク質をコー
    ド化する、請求項１７３の方法。
  175. 【請求項１７５】 タンパク質又はペプチドがリソソーム酸α−グルコシダ
    ーゼである、請求項１７４の方法。
  176. 【請求項１７６】 対象がトリ対象及び哺乳動物の対象からなる群より選択
    される、請求項１７１の方法。
  177. 【請求項１７７】 対象がヒト対象である、請求項１７６の方法。
  178. 【請求項１７８】 ヒト対象がリソソーム酸α−グルコシダーゼ欠乏で診断
    されている、請求項１７７の方法。
  179. 【請求項１７９】 ヒト対象がリソソーム酸α−グルコシダーゼ欠乏で診断
    されている、請求項１７８の方法。
  180. 【請求項１８０】 アデノウイルスが経口、直腸、経粘膜、経皮、吸入、静
    脈内、皮下、皮内、筋内、及び関節内投与からなる群より選択される経路により
    投与される、請求項１７１の方法。
  181. 【請求項１８１】 アデノウイルスが静脈内投与、門脈内投与、胆道内投与
    、動脈内投与、及び肝実質内への直接注射からなる群より選択される方法により
    送達される、請求項１７１の方法。
  182. 【請求項１８２】 ヌクレオチド配列を細胞内に送達する方法であって、異
    種ヌクレオチド配列及び ａ）欠失が欠失領域から1つ又はそれ以上の機能的Ｅ１タンパク質の
    発現を実質的に阻止する、Ｅ１領域における1つ又はそれ以上の欠失と、 ｂ）欠失が欠失領域から機能的ポリメラーゼの発現を実質的に阻止す
    る、ポリメラーゼ領域における1つ又はそれ以上の欠失と、を含むアデノウイル
    スゲノムを含む増殖欠陥性アデノウイルスを細胞内に導入することを含む方法。
  183. 【請求項１８３】 アデノウイルスの少なくとも約１０，０００感染単位が
    細胞に投与される、請求項１８２の方法。
  184. 【請求項１８４】 対象にヌクレオチド配列を投与する方法であって、異種
    ヌクレオチド配列及び ａ）欠失が欠失領域から1つ又はそれ以上の機能的Ｅ１タンパク質の
    発現を実質的に阻止する、Ｅ１領域における1つ又はそれ以上の欠失と、 ｂ）欠失が欠失領域から機能的ポリメラーゼの発現を実質的に阻止す
    る、ポリメラーゼ領域における1つ又はそれ以上の欠失と、を含むアデノウイル
    スゲノムを含む増殖欠陥性アデノウイルスの生物学的に有効な量を対象に投与す
    ることを含む方法。
  185. 【請求項１８５】 アデノウイルスの少なくとも約１０，０００感染単位が
    対象に投与される、請求項１８４の方法。
  186. 【請求項１８６】 対象の肝にリソソーム酸α−グルコシダーゼをコード化
    するヌクレオチド配列の生物学的に有効な量を投与することを含むリソソーム酸
    α−グルコシダーゼで対象を治療する方法。
  187. 【請求項１８７】 肝が、治療に有効な量で筋組織に輸送されるコード化さ
    れたリソソーム酸α−グルコシダーゼを発現するとともに分泌する、請求項１８
    ６の方法。
  188. 【請求項１８８】 リソソーム酸α−グルコシダーゼをコード化するヌクレ
    オチド配列を含むアデノウイルスベクターが対象に投与される、請求項１８６の
    方法。
  189. 【請求項１８９】 ヌクレオチド配列がリソソーム酸α−グルコシダーゼ前
    駆タンパク質である、請求項１８８の方法。
  190. 【請求項１９０】 アデノウイルスベクターがＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌ、Аｄ
    ／ＥＦ１−α／ｈＧＡＡΔｐｏｌ、Ａｄｈ５’ｓＧＡＡΔｐｏｌ、Ａｄ／ＥＦ１
    −α／ｈ５’ｓＧＡＡΔｐｏｌ、ＡｄｈＧＡＡΔｐｐ、Ａｄ／ＥＦ１−α／ｈＧ
    ＡＡΔｐｐ、Ａｄｈ５’ｓＧＡＡΔｐｐ、Ａｄ／ＥＦ１−α／ｈ５’ｓＧＡＡΔ
    ｐｐからなる群より選択される、請求項１８８の方法。
  191. 【請求項１９１】 ヌクレオチド配列が静脈内投与、門脈内投与、胆道内投
    与、動脈内投与、及び肝実質内への直接注射からなる群より選択される方法によ
    り肝に投与される、請求項１８６の方法。
  192. 【請求項１９２】 対象が哺乳動物の対象である、請求項１８６の方法。
  193. 【請求項１９３】 対象がヒト対象である、請求項１９２の方法。
  194. 【請求項１９４】 リソソーム酸α−グルコシダーゼ欠乏の対象を治療する
    方法であって、リソソーム酸α−グルコシダーゼをコード化する異種ヌクレオチ
    ド配列及び1つ又はそれ以上の領域における1つ又はそれ以上の欠失を含むアデノ
    ウイルスゲノムを含む増殖欠陥性アデノウイルスの治療に有効な量を対象に投与
    することを含み、該領域が、 ａ）欠失が欠失領域から機能的１００Ｋタンパク質の発現を実質的に
    阻止する、１００Ｋ領域と、 ｂ）欠失が欠失領域から機能的ＩＶａ２タンパク質の発現を実質的に
    阻止し、さらに前記欠失の少なくとも１つがアデノウイルス血清型５ゲノムの約
    ヌクレオチド４８３０乃至５７６６での欠失又は他の血清型のアデノウイルスの
    ゲノムの相同領域である、ＩＶａ２領域と、 ｃ）欠失が欠失領域から機能的末端前タンパク質の発現を実質的に阻
    止する、末端前タンパク質領域と、 ｄ）欠失がアデノウイルスゲノムから機能的ポリメラーゼタンパク質
    の発現を実質的に阻止する、アデノウイルスポリメラーゼ領域と、からなる群よ
    り選択される方法。
  195. 【請求項１９５】 アデノウイルスがＡｄｈＧＡＡΔｐｏｌ、Аｄ／ＥＦ１
    −α／ｈＧＡＡΔｐｏｌ、Ａｄｈ５’ｓＧＡＡCｐｏｌ、Ａｄ／ＥＦ１−α／ｈ
    ５’ｓＧＡＡΔｐｏｌ、ＡｄｈＧＡＡΔｐｐ、Ａｄ／ＥＦ１−α／ｈＧＡＡΔｐ
    ｐ、Ａｄｈ５’ｓＧＡＡΔｐｐ、Ａｄ／ＥＦ１−α／ｈ５’ｓＧＡＡΔｐｐから
    なる群より選択される、請求項１９４の方法。
  196. 【請求項１９６】 リソソーム酸α−グルコシダーゼがヒトリソソーム酸α
    −グルコシダーゼである、請求項１９４の方法。
  197. 【請求項１９７】 対象がトリ対象及び哺乳動物の対象からなる群より選択
    される、請求項１９４の方法。
  198. 【請求項１９８】 対象がヒト対象である、請求項１９７の方法。
  199. 【請求項１９９】 アデノウイルスが経口、直腸、経粘膜、経皮、吸入、静
    脈内、皮下、皮内、筋内、及び関節内投与からなる群より選択される方法により
    投与される、請求項１９７の方法。
  200. 【請求項２００】 アデノウイルスが静脈内投与、門脈内投与、胆道内投与
    、動脈内投与、及び肝実質内への直接注射からなる群より選択される方法により
    肝に送達される、請求項１９４の方法。
  201. 【請求項２０１】 ミニ染色体を含有する破壊型（gutted）アデノウイルス
    を生成する方法であって、 機能的１００Ｋタンパク質を発現する哺乳動物の細胞内に、 アデノウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）、アデノウイルスパッケージ
    ング配列、及び異種ヌクレオチド配列を含むプラスミド、及び 欠失が欠失領域から機能的タンパク質の発現を阻止する、アデノウイ
    ルス１００Ｋ領域における1つ又はそれ以上の欠失を含むアデノウイルスゲノム
    を含むヘルパーアデノウイルスを導入することを含む方法。
  202. 【請求項２０２】 １００Ｋ領域における欠失がアデノウイルス血清型５ゲ
    ノムの約ヌクレオチド２４，９９０乃至２５，６８７での欠失又は他の血清型の
    アデノウイルスの相同領域を含む、請求項２０１の方法。
  203. 【請求項２０３】 導入されるヘルパーアデノウイルスが本明細書中におい
    て［Ｅ１−、１００Ｋ−］Аｄとして開示されている、請求項201の方法。
  204. 【請求項２０４】 アデノウイルスゲノムがＩＶａ２領域における1つ又は
    それ以上の欠失をさらに含み、哺乳動物の細胞が機能的ＩＶａ２タンパク質を発
    現する、請求項２０１の方法。
  205. 【請求項２０５】 アデノウイルスゲノムがポリメラーゼにおける1つ又は
    それ以上の欠失をさらに含み、哺乳動物の細胞が機能的ポリメラーゼタンパク質
    を発現する、請求項２０１の方法。
  206. 【請求項２０６】 アデノウイルスゲノムが末端前タンパク質領域における
    1つ又はそれ以上の欠失をさらに含み、哺乳動物の細胞が機能的末端前タンパク
    質を発現する、請求項２０１の方法。
  207. 【請求項２０７】 機能的１００Ｋタンパク質をコード化するヌクレオチド
    配列が哺乳動物の細胞のゲノム内に安定に組み込まれる、請求項２０１の方法。
  208. 【請求項２０８】 哺乳動物の細胞がＫマイナス１６細胞である、請求項20
    7の方法。
  209. 【請求項２０９】 哺乳動物の細胞が機能的１００Ｋタンパク質を恒常的に
    発現する、請求項２０１の方法。
  210. 【請求項２１０】 哺乳動物の細胞が１００Ｋタンパク質を恒常的に発現す
    るＣ７細胞である、請求項２０９の方法。
  211. 【請求項２１１】 ヘルパーアデノウイルスがパッケージング配列を欠く、
    請求項２０１の方法。
  212. 【請求項２１２】 ヘルパーアデノウイルスがヘルパープラスミドのキャプ
    シド形成を促進することがない修飾パッケージングシグナルを有する、請求項２
    ０１の方法。
  213. 【請求項２１３】 ヘルパーアデノウイルスがパッケージング配列をフラン
    キングする液化酸素部位を含み、哺乳動物の細胞がｃｒｅリコンビナーゼタンパ
    ク質を生成する、請求項２０１の方法。
  214. 【請求項２１４】 請求項２０１の複数の破壊型アデノウイルス粒子を含む
    組成物を細胞内に導入することを含む細胞内にヌクレオチド配列を争奪する方法
    。
  215. 【請求項２１５】 前記導入することがインビボで実施される、請求項２１
    ４の方法。
  216. 【請求項２１６】 破壊型アデノウイルスをヘルパーアデノウイルスを含有
    することから分離するステップをさらに含む、請求項２０１の方法。
  217. 【請求項２１７】 ミニ染色体を含有する破壊型アデノウイルスを生成する
    方法であって、 機能的ＩＶａ２を発現する哺乳動物の細胞内に、 アデノウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）、アデノウイルスパッケー
    ジング配列、及び異種ヌクレオチド配列を含むプラスミド、及び 欠失が機能的タンパク質の発現を阻止し、さらに前記欠失の少なくと
    も１つがアデノウイルス血清型５ゲノムの約ヌクレオチド４８３０乃至５７６６
    での欠失又は他の血清型のアデノウイルスのゲノムの相同領域である、アデノウ
    イルスＩＶａ２領域における１つ又はそれ以上の欠失で含むアデノウイルスゲノ
    ムを含むヘルパーアデノウイルスを導入すること、 哺乳動物の細胞からミニ染色体を含有する破壊型アデノウイルスを収
    集することを含む方法。
  218. 【請求項２１８】 欠失がアデノウイルス血清型５ゲノムの約ヌクレオチド
    ４８３０乃至５７６６又は他の血清型のアデノウイルスのゲノムの対応する領域
    である、請求項２１７の方法。
  219. 【請求項２１９】 アデノウイルスゲノムがアデノウイルスポリメラーゼ領
    域における１つ又はそれ以上の欠失を含み、哺乳動物の細胞が機能的ポリメラー
    ゼタンパク質を発現する、請求項２１７の方法。
  220. 【請求項２２０】 アデノウイルスゲノムが末端前タンパク質領域における
    １つ又はそれ以上の欠失をさらに含み、哺乳動物の細胞が機能的末端前タンパク
    質を発現する、請求項２１７の方法。
  221. 【請求項２２１】 機能的ＩＶａ２タンパク質をコード化するヌクレオチド
    配列が哺乳動物の細胞のゲノム内に安定に組み込まれる、請求項２１７の方法。
  222. 【請求項２２２】 前記アデノウイルスが本明細書中において［Ｅ１−、Ｅ
    ３−、ＩＶａ２−、ｐｏｌ−］Аｄとして開示されている、請求項２２１の方法
    。
  223. 【請求項２２３】 哺乳動物の細胞がＣ７細胞である、請求項２２１の方法
    。
  224. 【請求項２２４】 哺乳動物の細胞が機能的ＩＶａ２タンパク質を恒常的に
    発現する、請求項２１７の方法。
  225. 【請求項２２５】 ヘルパーアデノウイルスがパッケージング配列を欠く、
    請求項２１７の方法。
  226. 【請求項２２６】 ヘルパーアデノウイルスがヘルパープラスミドのキャプ
    シド形成を促進することがない修飾パッケージングシグナルを有する、請求項２
    １７の方法。
  227. 【請求項２２７】 ヘルパーアデノウイルスがパッケージング配列をフラン
    キングする液化酸素部位を含み、哺乳動物の細胞がｃｒｅリコンビナーゼタンパ
    ク質を生成する、請求項２１７の方法。
  228. 【請求項２２８】 請求項２１７のアデノウイルスミニ染色体を含有する破
    壊型アデノウイルスを細胞内に導入することを含む細胞内にヌクレオチド配列を
    送達する方法。
  229. 【請求項２２９】 前記導入することがインビボで実施される、請求項２２
    ８の方法。
  230. 【請求項２３０】 破壊型アデノウイルスをヘルパーアデノウイルスを含有
    することから分離するステップをさらに含む、請求項２２８の方法。
JP2000567725A 1998-08-28 1999-08-27 ＩＶａ２、１００Ｋ及び／又は末端前タンパク質配列における欠失型アデノウイルス Pending JP2002528056A (ja)

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