JP4153607B2 - 新規な組換えアデノウイルス - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、組換えアデノウイルスに関する。
【0002】
【従来の技術】
アデノウイルスベクターは、遺伝子導入効率の高さ、高力価ウイルス液の調製の容易さ、非増殖細胞にも遺伝子導入可能などの利点から、遺伝子治療用のベクターとして有望視されている。現在汎用されているアデノウイルスベクターは、アデノウイルスの増殖に必須なE1遺伝子を欠失させた非増殖型アデノウイルスベクターであるが、ヒトや動物個体に投与した場合、アデノウイルス蛋白質が発現することが知られており、安全性の観点から、ウイルスにコードされる蛋白質がなるべく発現しない構造のベクターが望まれている。
【0003】
そのベクターの構造とは、治療用遺伝子など目的の外来遺伝子を挿入し、かつアデノウイルス由来の蛋白質をコードする遺伝子の一部もしくは全てを除いたものである。しかし、かかる性質を保持するウイルス(目的ベクターウイルス)は単独では増殖できないため、もう一つのアデノウイルス(ヘルパーウイルス)とともに宿主細胞に感染させ、ヘルパーウイルスから供給されたアデノウイルスの増殖に必須の蛋白質により、ヘルパーウイルスとともに目的ベクターウイルスも増殖させるという方法が取られている(Mitani, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.92, 3854-3858 (1995))。このヘルパーウイルスを用いた組換えアデノウイルス作製法においては、目的ベクターウイルスに対しヘルパーウイルスの量が少ない、すなわちヘルパーウイルスの増殖が抑制されているほど望ましい。
【0004】
そのための方策の一つとして、ヘルパーウイルスゲノムのパッケージング配列の両側にリコンビナーゼCre の認識配列であるloxP配列を挿入したヘルパーウイルスを目的ベクターウイルスとともにリコンビナーゼCre を発現する宿主細胞に感染させて、パッケージング配列を除き、ヘルパーウイルスのゲノムDNA がウイルス粒子にパッケージングされなくなることにより、ヘルパーウイルスの増殖を抑制する工夫(Parks, RJ. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.93, 13565-13570 (1996))がなされている。
【0005】
パッケージング配列の両側にloxP配列を挿入したヘルパーウイルスは、それ単独で増殖させる場合は、増殖が抑制されないことおよび挿入したloxP配列が欠落しないことが重要であり、特にパッケージング配列の左側、すなわちアデノウイルス左端逆方向反復配列(inverted terminal repeat: ITR)とパッケージング配列との間のloxP配列の挿入部位は重要である。なぜならば、左端ITR とパッケージング配列との間に外来遺伝子を挿入可能な領域は、わずか100 塩基足らずの範囲しかないからである。前述したヘルパーウイルスのloxP配列挿入部位は、アデノウイルス5型の塩基配列188 位である(Parks, R. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.93, 13565-13570 (1996))。また、他のloxP配列の挿入例として、アデノウイルス5型の塩基配列193 位と194 位との間が報告されている(Hardy, S. et al., J. Virol. Vol.71, 1842-1849 (1997))が、これらの挿入部位はいずれもパッケージング配列の直前であり、これらの部位がリコンビナーゼ認識配列の挿入部位として最善がどうかは明らかでない。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、遺伝子治療の分野において一層安全性の高い遺伝子治療用ベクターの作製のための材料として、アデノウイルス左端ITR とパッケージング配列との間の新たな位置にリコンビナーゼ認識配列を挿入した組換えアデノウイルスを提供することにある。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトアデノウイルス5型を用いて、左端ITR とパッケージング配列との間で、リコンビナーゼ認識配列の挿入可能な部位を検索し、新たなリコンビナーゼ認識配列の挿入部位を発見した。かかる知見に基づき、当該部位にリコンビナーゼ認識配列の一つであるloxP配列を挿入した新たな組換えアデノウイルスを作製し、かつ当該アデノウイルスを、当該部位にloxP配列が挿入されていない他の組換えアデノウイルスと同等のウイルス力価を保持させることに成功した。
【0008】
すなわち、本発明の要旨は、
下記配列:
(1)左端逆方向反復配列、
(2)パッケージング配列、
(3)前記左端逆方向反復配列と前記パッケージング配列の中間領域であって、ヒトアデノウイルス5型の 143 〜 148 位のいずれかに位置するリコンビナーゼ認識配列、および
(4)前記パッケージング配列の下流領域に位置する、前記リコンビナーゼ認識配列を認識するリコンビナーゼにより認識される少なくとももう1つのリコンビナーゼ認識配列、
をゲノム中に含有してなる、ヒトアデノウイルス5型の組換えアデノウイルス、
に関する。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明において、「組換えアデノウイルス」とは、アデノウイルス固有の塩基配列以外の塩基配列をそのゲノム中に含有するアデノウイルスのことをいう。アデノウイルス固有の塩基配列以外の塩基配列には特に制限はなく、蛋白質をコードする遺伝子やプロモーターやポリA配列などの調節遺伝子であってもよいし、また何ら機能を有さない塩基配列であってもよい。
【0010】
本発明において、「左端逆方向反復配列」(以下、左端ITR と略す)とは、アデノウイルスゲノムの複製開始に必須なゲノム両端の塩基配列のうち、左端(即ち、E1遺伝子の上流側) に存在する塩基配列のことをいう。その具体例として、ヒトアデノウイルス5型においては、塩基配列1 位〜103 位が挙げられる。
【0011】
本発明において、「パッケージング配列」とは、アデノウイルスゲノムDNA がアデノウイルス粒子に挿入されるために必須の塩基配列をいう。その具体例として、ヒトアデノウイルス5型においては、塩基配列195 位〜358 位が挙げられる。
【0012】
本発明において、「リコンビナーゼ認識配列」とは、特異的DNA 組換え酵素である「リコンビナーゼ」により認識される塩基配列であって、「リコンビナーゼ」存在下に二つの「リコンビナーゼ認識配列」間で、DNA 鎖の切断、DNA 鎖の交換と結合の全行程の反応が可能となる塩基配列のことをいう。
【0013】
「リコンビナーゼ」の例としては、バクテリオファージP1由来のリコンビナーゼ Cre(Sternberg et al., J. Mol. Biol. Vol.150, 467-486 (1981) )、酵母(Saccharomyces cerevisiae)の2ミクロンDNAによりコードされるFLP(Babineau et al., J. Biol. Chem. Vol.260, 12313-12319 (1985))、チゴサッカロマイセス・ルーイのpSR1プラスミド由来のR(Matsuzaki et al., Mol. Cell. Biol. Vol.8, 955-962 (1988))などが挙げられる。
【0014】
本発明において、「パッケージング配列の下流領域」とは、パッケージング配列から右端(即ち、E1遺伝子の下流側) ITR の間の領域をいう。その具体例として、ヒトアデノウイルス5型においては、塩基配列359 位以降が挙げられる。
【0015】
本発明において、「リコンビナーゼ認識配列がバクテリオファージP1由来のリコンビナーゼCre の基質となる」とは、リコンビナーゼCre により、二つの「リコンビナーゼ認識配列」間で、DNA 鎖の切断、DNA 鎖の交換と結合の全行程の反応が起きることをいう。「リコンビナーゼ認識配列」の典型的な例としては、バクテリオファージP1内の34塩基からなるloxP配列(Abremski et al., J. Biol. Chem., 1509 −1514 (1984) および Hoess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.81, 1026−1029 (1984))が挙げられる。loxP配列は下記の塩基配列からなるDNA 配列であり、以後この配列のことを野生型loxP配列という。
【0016】
5'-ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT-3' (配列番号:1)
3'-TATTGAAGCATAT TACATACG ATATGCTTCAATA-5' (配列番号:2)
(前記配列中、下線部はスペーサー領域を示す)
【0017】
本発明において、「リコンビナーゼCre の基質となる『リコンビナーゼ認識配列』」とは前記野生型loxP配列に限定される必要はなく、二つの「リコンビナーゼ認識配列」がリコンビナーゼCre 基質となる限りは、野生型loxP配列の一部が他の塩基に置換されていてもよい。さらに、野生型loxP配列の塩基の置換により、野生型loxP配列との組合せではリコンビナーゼCre の基質とならないloxP配列(変異型loxP配列)であっても、二つの同じ配列の変異型loxP配列どおしではリコンビナーゼCre の基質となる、すなわちDNA 鎖の切断、DNA 鎖の交換と結合の全行程の反応が起きる配列は、リコンビナーゼCre の認識配列に含まれる。そのような変異型loxP配列の例として、野生型loxP配列のスペーサー領域の一つの塩基を置換したloxP配列(Hoess et al., Nucleic Acids Res. Vol.14, 2287-2300 (1986) )やスペーサー領域の二つの塩基を置換したloxP配列(Lee, G. et al., Gene Vol.14, 55-65 (1998) )が挙げられる。
【0018】
本発明において、「リコンビナーゼ認識配列がリコンビナーゼFLP の基質となる」とは、リコンビナーゼFLP により、二つの「リコンビナーゼ認識配列」間で、DNA 鎖の切断、DNA 鎖の交換と結合の全行程の反応が起きることをいう。「リコンビナーゼ認識配列」の典型的な例としては、酵母由来のFRT 配列(Babineau et al., J. Biol. Chem. Vol.260, 12313-12319 (1985))が挙げられる。FRT 配列は34塩基からなるDNA 配列で、本来の配列(野生型FRT 配列)は野生型loxP配列と同様に一義的に規定されているが、本発明において、「リコンビナーゼFLP の基質となる『リコンビナーゼ認識配列』」とは前記野生型FRT 配列に限定される必要はなく、二つの「リコンビナーゼ認識配列」がリコンビナーゼFLP 基質となる限りは、野生型FRT 配列の一部が他の塩基に置換されていてもよい。さらに、野生型FRT 配列の塩基の置換により、野生型FRT 配列との組合せではリコンビナーゼFLP の基質とならないFRT 配列(変異型FRT 配列)であっても、二つの同じ配列の変異型FRT 配列どおしではリコンビナーゼFLP の基質となる、すなわちDNA 鎖の切断、DNA 鎖の交換と結合の全行程の反応が起きる配列は、リコンビナーゼFLP の認識配列に含まれる。
【0019】
本発明の組換えアデノウイルスは、さらに外来遺伝子を含有していてもよく、外来遺伝子としてはヒトの治療用遺伝子や、LacZ遺伝子等のいわゆるレポーター遺伝子、リコンビナーゼ等が挙げられる。外来遺伝子の挿入位置としては、E1遺伝子欠失部位、E3遺伝子欠失部位等が挙げられる。
【0020】
本発明に用いる組換えアデノウイルスの由来は特に限定されないが、ヒト由来のアデノウイルスであることが好ましい。ヒト由来のアデノウイルスにおいては、C型に分類される2型または5型がより好ましい。以下、ヒトアデノウイルス5型を例として、また「リコンビナーゼ認識配列」の例としてloxP配列(野生型)を用いて、本発明をさらに詳細に説明する。
【0021】
組換えアデノウイルスの作製法としては、アデノウイルスゲノムDNA に目的DNA を直接連結する方法や、アデノウイルスゲノムを分割して二つのプラスミドに挿入したプラスミドの一方に、目的DNA を挿入後相同組換えにより組換えアデノウイルスを作製する方法などが知られている。しかし、本発明では、アデノウイルスゲノムの大部分を含むコスミドベクターに目的遺伝子を挿入後、このコスミドベクターと制限酵素消化したアデノウイルスDNA −末端蛋白質複合体との相同組換えによる方法(COS-TPC 法:Miyake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.93, 1320-1324 (1996)、および特開平7-298877号公報)により組換えアデノウイルスを作製することが好ましい。その理由は、かかる方法では非常に効率よく目的の組換えアデノウイルスが得られるからである。
【0022】
まず、アデノウイルスE1及びE3遺伝子以外のアデノウイルス5型ゲノムの大部分を含むコスミドベクターpAxcw (図1、特開平8-308585号公報、15頁のpAdex1cwはpAxcw と同一である)の左端ITR とパッケージング配列との間に位置する、塩基配列147 位と148 位との間にloxP配列を挿入したコスミドベクターpAxcw15Lを作製する。その際、塩基配列143 位〜148 位に認識配列が存在する制限酵素AflIIIでアデノウイルスゲノムを含むDNA を切断し、さらにKlenow酵素による平滑化処理後loxP配列を含む65塩基の合成DNA を連結する。この操作によりAflIII消化により突出した4塩基が重複してloxP挿入部位に存在することになる。従って、塩基配列147 位と148 位との間への挿入とは、実際には143 位〜148 位のいずれかの位置にloxP配列を挿入したことになる。
【0023】
また、従来知られている挿入部位(塩基配列188 位または193 位)と比較するため、これらの挿入部位の間に位置する塩基配列191 位と192 位との間にloxP配列を挿入したコスミドベクターpAxcw19Lも作製する。この場合も、塩基配列186 位〜193 位に認識配列が存在する制限酵素SgrAI でアデノウイルスゲノムを含むDNA を切断し、さらにKlenow酵素による平滑化処理後loxP配列を含む65塩基の合成DNA を連結するため、SgrAI 消化により突出した4塩基が重複してloxP挿入部位に存在することになる。従って、塩基配列191 位と192 位との間への挿入とは、実際には187 位〜192 位のいずれかの位置にloxP配列を挿入したことになる。
【0024】
次いで、コスミドベクターpAxcw15LのE1遺伝子欠失部位に、loxP配列/EF1 αプロモーター/LacZ/ポリA配列を挿入したコスミドベクターpAxLEFLacZ15L を作製する。同様に、コスミドベクターpAxcw19 にloxP配列/EF1 αプロモーター/LacZ/ポリA配列を挿入したコスミドベクターpAxLEFLacZ19L も作製する。これらのコスミドベクターを用い、前述したCOS-TPC 法により目的の組換えアデノウイルスAxLEFLacZ15LおよびAxLEFLacZ19L(図4)を作製する。本発明者らが開発したCOS-TPC 法は非常に効率よく目的の組換えアデノウイルスが得られる方法であり、制限酵素消化したアデノウイルスDNA −末端蛋白質複合体と目的ウイルスの構造を有するコスミドベクターとで形質転換した細胞をクローン化後、任意のクローンを選ぶとその半数以上が目的組換えウイルスである(Miyake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.93, 1320-1324 (1996))。
【0025】
組換えアデノウイルスAxLEFLacZ15L作製時の目的クローンの出現頻度は、例えば、6クローン中4クローンであり、本発明者らによる組換えアデノウイルス作製時に通常得られる目的クローンの出現頻度とほぼ同じである。一方、AxLEFLacZ19L作製時の目的クローンの出現頻度は、例えば、12クローン中3クローンと明らかに低い。さらに、AxLEFLacZ15Lは通常の組換えアデノウイルスとほぼ同程度の力価を保持している。この目的組換えウイルスの出現頻度の差は、ITR とパッケージング配列との間に挿入したloxP配列が、アデノウイルスの増殖に及ぼす影響を反映するものである。すなわち、塩基配列143 位〜148 位への挿入(AxLEFLacZ15L)は、アデノウイルスの増殖にほとんど影響しないが、塩基配列187 位〜192 位への挿入は、アデノウイルスDNA のウイルス粒子へのパッケージング過程を含めたウイルスの増殖サイクルに負の影響を及ぼすことが明らかとなった。従って、本発明者らが新たに発見した塩基配列143 位〜148 位への挿入部位は、従来知られていた挿入部位(塩基配列188 位または193 位)よりも、アデノウイルスの増殖に好適な挿入部位であることが判明した。
【0026】
このようにして得られた塩基配列143 位〜148 位へloxP配列を挿入した組換えアデノウイルスは、パッケージング配列より右側の任意に位置にもう一つのloxPを挿入することにより、ヘルパーウイルスとして作用させることができる。その方法は、前記したように、ヘルパーウイルスゲノムのパッケージング配列の両側にリコンビナーゼCre の認識配列であるloxP配列を挿入したヘルパーウイルスを目的ベクターウイルスとともにリコンビナーゼCre を発現する宿主細胞に感染させて、パッケージング配列を除き、ヘルパーウイルスのゲノムDNA がウイルス粒子にパッケージングされなくなることにより、ヘルパーウイルスの増殖を抑制する方法である(Parks, RJ. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.93, 13565-13570 (1996))。その際、パッケージング配列右側のもう一つのloxP配列の挿入位置に制限はなく、その例の一つとしてアデノウイルスE1A 遺伝子の欠失部位が挙げられる。本発明の組換えアデノウイルスAxLEFLacZ15Lは、その一例である。
【0027】
さらに、本発明の組換えアデノウイルスは前述した変異型loxP配列と組み合わせることにより、遺伝子置換型組換えアデノウイルスの作製にも応用できる。ここにいう「遺伝子置換型組換えアデノウイルスの作製」とは、例えば外来遺伝子Aを有する組換えアデノウイルスの遺伝子Aを、リコンビナーゼCre の存在下にプラスミドなど他のDNA 分子に存在する遺伝子Bに置換する方法のことである。その方法の一例を以下に説明する。
【0028】
遺伝子Aを有する遺伝子置換用組換えアデノウイルスとして、左端ITR /野生型loxP配列(塩基配列143 位〜148 位に挿入)/パッケージング配列/野生型loxP配列/遺伝子A/変異型loxP配列、の順に野生型loxP配列および変異型loxP配列を挿入した組換えアデノウイルスを作製する。ここに野生型loxP配列/遺伝子Aの断片はE1欠失部位に挿入される。遺伝子Bを有するプラスミドとしては、野生型loxP配列(塩基配列143 位〜148 位に挿入)/パッケージング配列/遺伝子B/変異型loxP配列の構造を有するプラスミドが挙げられる。遺伝子Aを有する組換えアデノウイルスと遺伝子Bを有するプラスミとを同時にまたは順次、Cre 蛋白質を発現する293 細胞などの細胞に導入すると、遺伝子導入用組換えアデノウイルスでは2つの野生型loxP配列に挟まれたパッケージング配列が除かれるとともに、野生型loxP配列/遺伝子A/変異型loxP配列の部分がプラスミド由来の野生型loxP配列/パッケージング配列/遺伝子B/変異型loxP配列に置換された組換えアデノウイルスが生成する。遺伝子置換されなかった遺伝子導入用組換えアデノウイルスは、二つの野生型loxP配列に挟まれたパッケージング配列が除去されるため、ウイルスDNA は複製するものの感染粒子にパッケージングされずウイルスとしては増殖しない。一方、遺伝子置換されたアデノウイルスはプラスミドから導入されたパッケージング配列を有するため、感染粒子にパッケージングされて増殖し、「遺伝子A」が「遺伝子B」に置換された組換えアデノウイルスが高頻度に得られる。
【0029】
さらに、遺伝子導入用組換えアデノウイルスの変異型loxP配列の挿入位置を変えることにより、アデノウイルス由来の蛋白質をコードする遺伝子の一部または全てを除いた組換えアデノウイルスを作製することもできる。この場合の変異型loxP配列の挿入位置の例として、アデノウイルスL3遺伝子とE2A 遺伝子との間の非翻訳領域、E3遺伝子の欠失部位、E4遺伝子の上流域と右端ITR との間などが挙げられる。これらの位置に変異型loxP配列を挿入して遺伝子置換を行う場合、生成するアデノウイルスDNA が感染粒子に効率よくパッケージングされるように、遺伝子Bを有するプラスミドの野生型loxP配列−変異型loxP配列間のDNA のサイズを調節する必要があるが、生成した組換えアデノウイルスは遺伝子置換「遺伝子A」が「遺伝子B」に置換されるだけでなく、野生型loxP配列/遺伝子A/変異型loxP配列間のDNA がプラスミドの野生型loxP配列−(遺伝子B)−変異型loxP配列間のDNA に置換されるため、遺伝子A/変異型loxP配列間に存在するアデノウイルス遺伝子を欠失した組換えアデノウイルスを作製することができる。
【0030】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではなく、本発明の技術分野における通常の変更ができることは言うまでもない。なお、実施例中のファージ、プラスミド、DNA、各種酵素、大腸菌、培養細胞等を取り扱う諸操作は、特に断らない限り、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T. Maniatis ら編、第2版 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory」に記載の方法に準じて行なった。
【0031】
実施例1
アデノウイルス5型ゲノムの塩基配列 147 位と 148 位との間に loxP 配列を挿入した組換えアデノウイルス作製用のコスミドベクターの作製
▲1▼ アデノウイルスE1及びE3遺伝子以外のアデノウイルス5型ゲノムの大部分を含み、かつE1遺伝子欠失部位にポリリンカーのみが挿入されたコスミドベクターpAxcw (図1、特開平8-308585号公報、15頁のpAdex1cwはpAxcw と同一である)をSalIで消化後自己ライゲーションさせ、アデノウイルゲノム左端約0.4kb を含むプラスミドpxcw(3.1kb )を得た。
【0032】
次にプラスミドpxcwをAflIIIで消化し、さらにKlenow酵素により両端を平滑化した後、loxP配列を含む66塩基の合成DNA (塩基配列:5'-GCTCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATACGCGTTCGCTCGGTACCCGCCATG-3'(配列番号:3)およびその相補鎖、図2参照)を連結し、アデノウイルスゲノムの147 位と148 位との間にloxP配列が挿入されたプラスミドpycw15L (3.2kb )を得た。プラスミドpycw15L 中のアデノウイルス5型ゲノムの左端から521 bpまでの塩基配列を図2と配列番号:4に示す。
【0033】
▲2▼ コスミドベクターpAxcw をSwaIおよびCsp45Iで同時に消化し、アデノウイルスゲノムの大部分を含む約28kbの断片(a) を得た。また、コスミドベクターpAxcw をCsp45IおよびPstIで同時に消化し、アデノウイルスゲノムを含まない約13kbの断片(b) を得た。さらに、プラスミドpycw15L をSwaIおよびPstIで同時に消化し、アデノウイルスゲノム左端を含む約1.2kb の断片(c) を得た。次いで、(a)(b)(c) の3断片をライゲーションし、アデノウイルスゲノムの大部分を含み、かつ147 位と148 位の間にloxP配列が挿入されたコスミドベクターpAxcw15Lを得た。
【0034】
▲3▼ プラスミドpUC119の制限酵素Ecl136II部位に、野生型loxP配列/制限酵素SwaI部位/野生型loxP配列が挿入されたプラスミドpuLwL( Lee G. et. al. Gene Vol.14, 55-65 (1998)) を制限酵素XhoIで消化後、変異型loxP配列および制限酵素NheI部位を含む60塩基の合成DNA (配列番号:5および配列番号:6)を連結し、SwaI部位とアンピシリン耐性遺伝子との間に位置する野生型loxP配列を変異型loxP配列に置換したプラスミドpuLwM を得た。
5'-TCGAGTCCGGAATAACTTCGTATAACGTATACTATACGAAGTTATGCTAGCATTTAAATG-3'( 配列番号:5)
3'-CAGGCCTTATTGAAGCATATTGCATATGATATGCTTCAATACGATCGTAAATTTACAGCT-5'(配列番号:6)
【0035】
▲4▼ EF1 αプロモーターからLacZ遺伝子を発現するプラスミドpEFLacZ (特開平7-298877号公報、11頁)をHindIII で消化後末端を平滑化し、プロモーター/LacZ/ポリA配列を含む断片を得た。この断片を、プラスミドpUC119のEcl136II部位にloxP配列/SwaI部位/変異型loxP配列が挿入された前記▲3▼で得られたプラスミドpULwM のSwaI部位に挿入し、プラスミドpULEFLacZM(9.1kb 、図3)を得た。次いで、プラスミドpULEFLacZMをNheIおよびAsp718で同時に消化後末端を平滑化し、loxP配列/プロモーター/LacZ/ポリA配列を含む断片を得た。さらに、この断片をコスミドpAxcw15LのSwaI部位に挿入したコスミドpAxLEFLacZ15L を得た。
【0036】
実施例2
アデノウイルス5型ゲノムの塩基配列 191 位と 192 位との間に loxP 配列を挿入した組換えアデノウイルス作製用のコスミドベクターの作製
▲1▼ 実施例1の▲1▼で作製したプラスミドpxcwをSgrAI で消化し、さらにKlenow酵素により両端を平滑化した後、loxP配列を含む68塩基の合成DNA (塩基配列:5'-GTACTCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATACGCGTTCGCTCGGTACCCGGCCGG-3'、(配列番号:7)およびその相補鎖、図2参照)を挿入し、アデノウイルスゲノムの191 位と192 位との間にloxP配列が挿入されたプラスミドpycw19L (3.2kb )を得た。プラスミドpycw19L 中のアデノウイルス5型ゲノムの左端から523 bpまでの塩基配列を図2と配列番号:8に示す。
【0037】
▲2▼ プラスミドpycw19L をSwaIおよびPstIで同時に消化して得たアデノウイルスゲノム左端を含む約1.2kb の断片と、実施例1▲2▼で調製したpAxcw をSwaIおよびCsp45Iで同時に消化した断片(a) 、ならびにpAxcw をCsp45IおよびPstIで同時に消化した断片(b)の3断片をライゲーションし、アデノウイルスゲノムの大部分を含み、かつ191 位と192 位との間にloxP配列が挿入されたコスミドベクターpAxcw19Lを得た。
【0038】
▲3▼ 実施例1▲4▼で調製したプラスミドpULEFLacZMより得たloxP配列/プロモーター/LacZ/ポリA配列を含む断片を、コスミドpAxcw19LのSwaI部位に挿入し、コスミドpAxLEFLacZ19L を得た。
【0039】
実施例3
アデノウイルス5型ゲノムの塩基配列 147 位と 148 位との間、または 191 位と 192 位との間に loxP 配列を挿入し、かつ LacZ 遺伝子の発現単位を有する組換えアデノウイルスの作製
▲1▼ 組換えアデノウイルスの作製
実施例1、2で作製したコスミドベクター(pAxLEFLacZ15L 、pAxLEFLacZ19L )を用い、アデノウイルス5型由来の非増殖型アデノウイルスベクター(E1及びE3遺伝子を欠失)のITR とパッケージング配列との間にloxP配列を挿入し、かつE1遺伝子欠失部位にloxP配列/EF1 αプロモーター/LacZ/ポリA配列を挿入した組換えアデノウイルスを作製した。組換えアデノウイルスの作製法、ならびにウイルスDNA の制限酵素消化による目的組換えアデノウイルスの同定法は既存の方法(Miyake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.93, 1320-1324 (1996)、及び特開平7-298877号公報)に従った。
【0040】
E3遺伝子を欠失したヒトアデノウイルス5型由来株であるAd5-dlX (Saito, I. et al., J. Virol. Vol.54, 711-719 (1985))のウイルスDNA −末端蛋白質複合体を制限酵素EcoT22I で消化した。このウイルスDNA −末端蛋白質複合体と、コスミドベクターpAxLEFLacZ15L (実施例1で作製)もしくはコスミドベクターpAxLEFLacZ19L (実施例2で作製)とで、リン酸カルシウム共沈法により6cm シャーレで培養した293 細胞を形質転換した。翌日、形質転換した細胞を希釈後、96穴マイクロプレートにまき直し、2〜3週間培養した。ウイルスの増殖により細胞変成が起こった任意のウェルを選びウイルス液(一次ウイルス液)を調製し、24穴マイクロプレートで培養した293 細胞に2ウェルずつ感染させ、細胞変成が生じた後に片方のウェルから既存の方法によりウイルスDNA を調製した。ウイルスDNA をXhoI消化後、電気泳動によりウイルスのゲノム構造を解析し、目的組換えアデノウイルス(AxLEFLacZ15LまたはAxLEFLacZ19L、図4)クローンを同定した。
【0041】
通常、この方法で作製した組換えアデノウイルスは、任意に選んだウイルスクローンの半数以上が目的ウイルスクローンである。AxLEFLacZ15Lの場合は6クローン中4クローンが目的クローンであり、その出現頻度は、本発明者らによる組換えアデノウイルス作製時に通常得られる目的クローンの出現頻度とほぼ同じであった。一方、AxLEFLacZ19Lの場合は12クローン中3クローンが目的クローンであり、その出現頻度はAxLEFLacZ15Lの場合よりも低かった。
【0042】
ウイルスDNA の解析に用いなかったウェルより、AxLEFLacZ15Lは#3クローンの、AxLEFLacZ19Lは#3クローンのウイルス液(二次ウイルス液)を調製し、さらに順次スケールアップしてウイルスを継代し、最終的に四次ウイルス液を得た。
【0043】
▲2▼ AxLEFLacZ15LならびにAxLEFLacZ19Lの力価測定
AxLEFLacZ15LならびにAxLEFLacZ19Lの四次ウイルス液の力価を293 細胞を用いて測定した。力価測定は、既存の方法(特開平7-298877号公報)に従い、96穴マイクロプレートを用いた限界希釈法にて行った。
【0044】
その結果、AxLEFLacZ15Lの力価は3.4 x 108 PFU/ml、AxLEFLacZ19Lの力価は3.4 x 108 PFU/mlであり、両ウイルスとも通常の非増殖型組換えアデノウイルスとほぼ同等の力価を有していた。すなわち、ITR とパッケージング配列との間へのloxP配列を含む外来遺伝子の挿入は、アデノウイルスの増殖に致命的な欠陥を与えるものではないことが判明した。
【0045】
【発明の効果】
本発明により、遺伝子治療の分野において一層安全性の高い遺伝子治療用ベクターを作製するための材料となる、組換えアデノウイルスが提供される。本発明により、アデノウイルスの増殖に必須の遺伝子を欠失した組換えアデノウイルスベクターの製造、および遺伝子置換型組換えアデノウイルスベクターの製造が効率的に行なわれ、遺伝子治療の分野で利用可能な組換えアデノウイルスベクターの供給が容易になる。
【0046】
【配列表】
【0047】
【0048】
【0049】
【0050】
【0051】
【0052】
【0053】
【0054】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、コスミドベクターpAxcw の構造を示す模式図である。図中、斜線部分はアデノウイルスゲノムを、C 、Sw、S 、N はそれぞれ、制限酵素ClaI、SwaI、SalI、NruI部位を示す。また、ApR はアンピシリン耐性遺伝子、丸印はプラスミドの複製起点を示す。
【図2】図2は、ヒトアデノウイルス5型の1番目から455 番目までの塩基配列、ならびにITR とパッケージング配列との間に挿入したloxP配列を含む合成DNA (66bpおよび68bp)の塩基配列を示す。図中、上向きおよび下向きの三角はloxP配列を含むDNA の挿入位置を示し、下線を引いた塩基は制限酵素の認識配列を示す。また、挿入DNA 中の太字の塩基配列は34塩基のloxP配列を、小文字の塩基配列は制限酵素の認識配列を示す。
【図3】図3は、プラスミドpULEFLacZMの構造を示す模式図である。図中、EFはEF1 αプロモーター、LacZは大腸菌LacZ遺伝子、pAはポリA配列、斜線を引いた部分はloxP配列、黒塗り部分は変異型loxP配列を示す。ApR はアンピシリン耐性遺伝子、oriはプラスミドの複製起点を示す。
【図4】図4は、組換えアデノウイルス(AxLEFLacZ15LならびにAxLEFLacZ19L)の構造を示す模式図である。図中、太線部分はアデノウイルスゲノム、黒塗り三角は、欠失したアデノウイルス遺伝子、白抜き三角はloxP配列、EFはEF1 αプロモーター、LacZは大腸菌LacZ遺伝子、pAはポリA配列、Ψはアデノウイルスのパッケージング配列を示す。
Claims (5)
- 下記配列:
(1)左端逆方向反復配列、
(2)パッケージング配列、
(3)前記左端逆方向反復配列と前記パッケージング配列の中間領域であって、ヒトアデノウイルス5型の 143 〜 148 位のいずれかに位置するリコンビナーゼ認識配列、および
(4)前記パッケージング配列の下流領域に位置する、前記リコンビナーゼ認識配列を認識するリコンビナーゼにより認識される少なくとももう1つのリコンビナーゼ認識配列、
をゲノム中に含有してなる、ヒトアデノウイルス5型の組換えアデノウイルス。 - リコンビナーゼ認識配列がバクテリオファージP1由来のリコンビナーゼCre の基質である、請求項1記載の組換えアデノウイルス。
- リコンビナーゼ認識配列がloxP配列である、請求項2記載の組換えアデノウイルス。
- リコンビナーゼ認識配列が酵母由来のリコンビナーゼFLP の基質である、請求項1記載の組換えアデノウイルス。
- リコンビナーゼ認識配列がFRT 配列である、請求項4記載の組換えアデノウイルス。
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