JP2001086986A - 組換えアデノウイルスベクターの作製方法 - Google Patents
組換えアデノウイルスベクターの作製方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 組換えアデノウイルスベクターを簡便かつ高
効率で作製することのできる新しい方法を提供する。 【解決手段】 E1領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠
失させたアデノウイルスゲノムＤＮＡのいずれかの欠失
部位に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコスミ
ド配列と発現カセットとを挿入結合して組換えコスミド
アデノウイルスベクターを作製し、この組換えコスミド
アデノウイルスベクターとレコンビナーゼ発現ベクター
とをアデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にコトラン
スフェクションし、細胞中において組換えコスミドアデ
ノウイルスベクターからコスミドベクター配列を除去す
ることによって、アデノウイルスゲノムＤＮＡおよび発
現カセットからなるＤＮＡ配列を有する組換えアデノウ
イルスベクターを製造する。
効率で作製することのできる新しい方法を提供する。 【解決手段】 E1領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠
失させたアデノウイルスゲノムＤＮＡのいずれかの欠失
部位に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコスミ
ド配列と発現カセットとを挿入結合して組換えコスミド
アデノウイルスベクターを作製し、この組換えコスミド
アデノウイルスベクターとレコンビナーゼ発現ベクター
とをアデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にコトラン
スフェクションし、細胞中において組換えコスミドアデ
ノウイルスベクターからコスミドベクター配列を除去す
ることによって、アデノウイルスゲノムＤＮＡおよび発
現カセットからなるＤＮＡ配列を有する組換えアデノウ
イルスベクターを製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、組換えア
デノウイルスベクターの作製方法に関するものである。
さらに詳しくは、この出願の発明は、哺乳動物細胞への
遺伝子導入に有用な組換えアデノウイルスベクターの作
製方法と、この方法に用いる遺伝子操作材料に関するも
のである。
デノウイルスベクターの作製方法に関するものである。
さらに詳しくは、この出願の発明は、哺乳動物細胞への
遺伝子導入に有用な組換えアデノウイルスベクターの作
製方法と、この方法に用いる遺伝子操作材料に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】近年、分子生物学や分子遺伝学等におけ
る知識の蓄積や様々な技術開発により生命科学は大きく
発展し、生命現象に関して多くの情報が得られるように
なってきている。種々の分野において活発な研究開発が
行われているが、中でも、遺伝子機能の解析は大きな比
重を占めており、単離した遺伝子を細胞や生物個体に導
入するための様々な技術やそのためのベクターが開発さ
れている。
る知識の蓄積や様々な技術開発により生命科学は大きく
発展し、生命現象に関して多くの情報が得られるように
なってきている。種々の分野において活発な研究開発が
行われているが、中でも、遺伝子機能の解析は大きな比
重を占めており、単離した遺伝子を細胞や生物個体に導
入するための様々な技術やそのためのベクターが開発さ
れている。
【０００３】哺乳類の細胞への遺伝子導入に用いられる
ベクターも数多く開発されているが、最近はウイルスを
利用したベクター（ウイルスベクター）が注目されてい
る。特に、アデノウイルスベクターは分裂する細胞だけ
でなく、非分列細胞にも感染し、高いウイルス価に調製
することができ、しかも様々な組合せのエンハンサーお
よびプロモーターの制御下で目的の遺伝子を発現させる
ことができるため、遺伝子治療への応用も検討されてい
る。
ベクターも数多く開発されているが、最近はウイルスを
利用したベクター（ウイルスベクター）が注目されてい
る。特に、アデノウイルスベクターは分裂する細胞だけ
でなく、非分列細胞にも感染し、高いウイルス価に調製
することができ、しかも様々な組合せのエンハンサーお
よびプロモーターの制御下で目的の遺伝子を発現させる
ことができるため、遺伝子治療への応用も検討されてい
る。
【０００４】これまでに、組換えアデノウイルスベクタ
ーの作製法として、in vivo相同組換えを利用した方法
やin vitroでライゲーションする方法など、多くの方法
が開発されている。また、アデノウイルスゲノムのＥ１
領域を欠損させたベクターを用いると、導入した遺伝子
は発現するが感染性ウイルス粒子は産生されないため、
特に遺伝子治療等における有用な遺伝子導入手段として
利用されている。
ーの作製法として、in vivo相同組換えを利用した方法
やin vitroでライゲーションする方法など、多くの方法
が開発されている。また、アデノウイルスゲノムのＥ１
領域を欠損させたベクターを用いると、導入した遺伝子
は発現するが感染性ウイルス粒子は産生されないため、
特に遺伝子治療等における有用な遺伝子導入手段として
利用されている。
【０００５】このように、他のウイルスベクターと比較
して多くの利点を持つアデノウイルスベクターではある
が、ウイルスゲノムが36kbと長いため、実際の組換えベ
クターの構築においては、手順が複雑であったり作製効
率が低いといった問題がある。例えば、Ｅ１領域を置き
換えた組換えアデノウイルスベクターの作製方法として
は、２つのプラスミド間での哺乳動物細胞（例えば２９
３細胞）におけるin vivo相同組換えを利用した方法
（例えば、Virology 163:614-617, 1988；NucleicAcids
Res. 26:3687-3693, 1998）が知られている。これらの
方法の場合、第１のプラスミドはアデノウイルスゲノム
の５’端ＩＴＲ（inverted terminal repeat）、パッケ
ージングシグナル、目的の遺伝子およびウイルスゲノム
の任意部分を含み、第２のプラスミドは、第１プラスミ
ドと重なるウイルスゲノム部分と３’端ＩＴＲを含む残
りのウイルスゲノムを保有している。しかしながら、哺
乳動物細胞における相同組換えの起こる頻度はかなり低
いため、これらの方法では哺乳動物細胞への両プラスミ
ドのトランスフェクションを大量に行う必要がある。
して多くの利点を持つアデノウイルスベクターではある
が、ウイルスゲノムが36kbと長いため、実際の組換えベ
クターの構築においては、手順が複雑であったり作製効
率が低いといった問題がある。例えば、Ｅ１領域を置き
換えた組換えアデノウイルスベクターの作製方法として
は、２つのプラスミド間での哺乳動物細胞（例えば２９
３細胞）におけるin vivo相同組換えを利用した方法
（例えば、Virology 163:614-617, 1988；NucleicAcids
Res. 26:3687-3693, 1998）が知られている。これらの
方法の場合、第１のプラスミドはアデノウイルスゲノム
の５’端ＩＴＲ（inverted terminal repeat）、パッケ
ージングシグナル、目的の遺伝子およびウイルスゲノム
の任意部分を含み、第２のプラスミドは、第１プラスミ
ドと重なるウイルスゲノム部分と３’端ＩＴＲを含む残
りのウイルスゲノムを保有している。しかしながら、哺
乳動物細胞における相同組換えの起こる頻度はかなり低
いため、これらの方法では哺乳動物細胞への両プラスミ
ドのトランスフェクションを大量に行う必要がある。
【０００６】また、別の方法として、ＣＯＳ−ＴＰＣ法
が提案されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13
20-1324, 1996）。これは、全長のアデノウイルスゲノ
ムと目的遺伝子の発現ユニットとを含むコスミドベクタ
ーと、制限酵素で消化したウイルスＤＮＡ−ＴＰＣ（te
rminal protein complex）を同時に哺乳動物細胞にトラ
ンスフェクションする方法である。この方法は、ウイル
スＤＮＡ−ＴＰＣを用いることによって、目的の組換え
アデノウイルスベクターを効率よく回収することができ
る。しかしながら、この方法の場合には、アデノウイル
スゲノムを制限酵素で消化することによってアデノウイ
ルス親株の出現を防止してはいるものの、その除去は完
全でなく、安全性の点で問題がある。
が提案されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13
20-1324, 1996）。これは、全長のアデノウイルスゲノ
ムと目的遺伝子の発現ユニットとを含むコスミドベクタ
ーと、制限酵素で消化したウイルスＤＮＡ−ＴＰＣ（te
rminal protein complex）を同時に哺乳動物細胞にトラ
ンスフェクションする方法である。この方法は、ウイル
スＤＮＡ−ＴＰＣを用いることによって、目的の組換え
アデノウイルスベクターを効率よく回収することができ
る。しかしながら、この方法の場合には、アデノウイル
スゲノムを制限酵素で消化することによってアデノウイ
ルス親株の出現を防止してはいるものの、その除去は完
全でなく、安全性の点で問題がある。
【０００７】さらに別の方法としては、Ｃre−loxＰ組
換えシステムを応用した組換えアデノウイルスベクター
の作製法が報告されてもいる（J. Virol. 71:1842-184
9, 1997）。この方法は、Ｃreレコンビナーゼが働くこ
とによって、ドナーとなるアデノウイルスと、発現カセ
ットを持つシャトルプラスミドとの間での分子間組換え
を生じさせる方法であり、効率よく組換えアデノウイル
スベクターを作製することができる。しかしながら、こ
の発明の場合には、ドナーウイルスを用意する必要があ
り、またドナーウイルスが最終的なウイルス試料に残存
する可能性がある。
換えシステムを応用した組換えアデノウイルスベクター
の作製法が報告されてもいる（J. Virol. 71:1842-184
9, 1997）。この方法は、Ｃreレコンビナーゼが働くこ
とによって、ドナーとなるアデノウイルスと、発現カセ
ットを持つシャトルプラスミドとの間での分子間組換え
を生じさせる方法であり、効率よく組換えアデノウイル
スベクターを作製することができる。しかしながら、こ
の発明の場合には、ドナーウイルスを用意する必要があ
り、またドナーウイルスが最終的なウイルス試料に残存
する可能性がある。
【０００８】その他にも、コスミドベクターを用いてin
vitroで全アデノウイルスゲノムを再構築する試みがな
されているが、哺乳動物細胞へのトランスフェクション
の前に複雑なＤＮＡ作製過程が必要であり、実用的なも
のではない。
vitroで全アデノウイルスゲノムを再構築する試みがな
されているが、哺乳動物細胞へのトランスフェクション
の前に複雑なＤＮＡ作製過程が必要であり、実用的なも
のではない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】前記のとおりの組換え
アデノウイルスベクターの作製法に関する様々な報告や
提案より以前に、Grahamは、アデノウイルス５型のＥ１
領域に１カ所のみ存在する制限酵素ＸbaＩサイトに小さ
なプラスミドを挿入して構築した環状ＤＮＡを哺乳動物
細胞（２９３細胞）にトランスフェクションすると、こ
の環状ＤＮＡはウイルスＤＮＡと同様の効率で感染性ウ
イルスを産生することを報告している（EMBO J. 3:2917
-2922, 1984）。
アデノウイルスベクターの作製法に関する様々な報告や
提案より以前に、Grahamは、アデノウイルス５型のＥ１
領域に１カ所のみ存在する制限酵素ＸbaＩサイトに小さ
なプラスミドを挿入して構築した環状ＤＮＡを哺乳動物
細胞（２９３細胞）にトランスフェクションすると、こ
の環状ＤＮＡはウイルスＤＮＡと同様の効率で感染性ウ
イルスを産生することを報告している（EMBO J. 3:2917
-2922, 1984）。
【００１０】この報告は、環状アデノウイルスＤＮＡの
Ｅ１領域あるいはＥ３領域を外来性遺伝子に置き換える
ことによって、組換えアデノウイルスベクターが簡単に
作製できることを示しているが、実際にこの方法で組換
えアデノウイルスベクターを構築するに当たっては２つ
の問題が存在した。一つは、アデノウイルスゲノムＤＮ
Ａを含む非常に大きなプラスミドに発現カセットを組み
込む効率の低さであり、もう一つの問題は、作製された
アデノウイルスベクターにプラスミドＤＮＡ部分が残る
ことである。
Ｅ１領域あるいはＥ３領域を外来性遺伝子に置き換える
ことによって、組換えアデノウイルスベクターが簡単に
作製できることを示しているが、実際にこの方法で組換
えアデノウイルスベクターを構築するに当たっては２つ
の問題が存在した。一つは、アデノウイルスゲノムＤＮ
Ａを含む非常に大きなプラスミドに発現カセットを組み
込む効率の低さであり、もう一つの問題は、作製された
アデノウイルスベクターにプラスミドＤＮＡ部分が残る
ことである。
【００１１】この出願の発明は、以上のとおりの従来技
術の現状に鑑みてなされたものであって、組換えアデノ
ウイルスベクターを簡便かつ高効率で作製することので
きる新しい方法と、この発明を実施するための遺伝子操
作材料を提供することを課題としている。
術の現状に鑑みてなされたものであって、組換えアデノ
ウイルスベクターを簡便かつ高効率で作製することので
きる新しい方法と、この発明を実施するための遺伝子操
作材料を提供することを課題としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決するため、以下の(1)から(12)の発明を提供す
る。 (1) Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失させ
たアデノウイルスゲノムＤＮＡのいずれかの欠失部位
に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコスミド配
列と発現カセットとを挿入結合して組換えコスミドアデ
ノウイルスベクターを作製し、この組換えコスミドアデ
ノウイルスベクターとレコンビナーゼ発現ベクターとを
アデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にコトランスフ
ェクションし、細胞中において組換えコスミドアデノウ
イルスベクターからコスミドベクター配列を除去するこ
とによって、アデノウイルスゲノムＤＮＡおよび発現カ
セットからなるＤＮＡ配列を有する組換えアデノウイル
スベクターを作製することを特徴とする組換えアデノウ
イルスベクターの作製方法。 (2) レコンビナーゼがCreレコンビナーゼであり、その
認識配列がloxＰ配列である前記(1)の作製方法。 (3) レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼであり、
その認識配列がＦＲＴ配列である前記(1)の作製方法。 (4) アデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞が、ヒト
胎児腎細胞由来２９３細胞である前記(1)から(3)のいず
れかの作製方法。 (5) Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失させ
たアデノウイルスゲノムＤＮＡのいずれかの欠失部位
に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコスミド配
列と発現カセットとを挿入結合して組換えコスミドアデ
ノウイルスベクターを作製し、この組換えコスミドアデ
ノウイルスベクターを、レコンビナーゼおよびアデノウ
イルスＥ１タンパク質産生細胞にトランスフェクション
し、細胞中において組換えコスミドアデノウイルスベク
ターからコスミドベクター配列を除去することによっ
て、アデノウイルスゲノムＤＮＡおよび発現カセットか
らなるＤＮＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクタ
ーを作製することを特徴とする組換えアデノウイルスベ
クターの作製方法。 (6) レコンビナーゼがCreレコンビナーゼであり、その
認識配列がloxＰ配列である前記(5)の作製方法。 (7) レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼであり、
その認識配列がＦＲＴ配列である前記(5)の作製方法。 (8) レコンビナーゼおよびアデノウイルスＥ１タンパ
ク質産生細胞が、レコンビナーゼを産生するヒト胎児腎
細胞由来２９３細胞である前記(5)から(7)のいずれかの
作製方法。 (9) Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失させ
たアデノウイルスゲノムＤＮＡの欠失部位に、レコンビ
ナーゼ認識配列を両端に有するコスミド配列が挿入結合
されていることを特徴とするコスミドアデノウイルスベ
クター。 (10) レコンビナーゼがCreレコンビナーゼであり、そ
の認識配列がloxＰ配列である前記(9)のコスミドアデノ
ウイルスベクター。 (11) レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼであり、
その認識配列がＦＲＴ配列である前記(9)のコスミドア
デノウイルスベクター。 (12) ＦＬＰレコンビナーゼを産生するヒト胎児腎細胞
由来２９３細胞。
を解決するため、以下の(1)から(12)の発明を提供す
る。 (1) Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失させ
たアデノウイルスゲノムＤＮＡのいずれかの欠失部位
に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコスミド配
列と発現カセットとを挿入結合して組換えコスミドアデ
ノウイルスベクターを作製し、この組換えコスミドアデ
ノウイルスベクターとレコンビナーゼ発現ベクターとを
アデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にコトランスフ
ェクションし、細胞中において組換えコスミドアデノウ
イルスベクターからコスミドベクター配列を除去するこ
とによって、アデノウイルスゲノムＤＮＡおよび発現カ
セットからなるＤＮＡ配列を有する組換えアデノウイル
スベクターを作製することを特徴とする組換えアデノウ
イルスベクターの作製方法。 (2) レコンビナーゼがCreレコンビナーゼであり、その
認識配列がloxＰ配列である前記(1)の作製方法。 (3) レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼであり、
その認識配列がＦＲＴ配列である前記(1)の作製方法。 (4) アデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞が、ヒト
胎児腎細胞由来２９３細胞である前記(1)から(3)のいず
れかの作製方法。 (5) Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失させ
たアデノウイルスゲノムＤＮＡのいずれかの欠失部位
に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコスミド配
列と発現カセットとを挿入結合して組換えコスミドアデ
ノウイルスベクターを作製し、この組換えコスミドアデ
ノウイルスベクターを、レコンビナーゼおよびアデノウ
イルスＥ１タンパク質産生細胞にトランスフェクション
し、細胞中において組換えコスミドアデノウイルスベク
ターからコスミドベクター配列を除去することによっ
て、アデノウイルスゲノムＤＮＡおよび発現カセットか
らなるＤＮＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクタ
ーを作製することを特徴とする組換えアデノウイルスベ
クターの作製方法。 (6) レコンビナーゼがCreレコンビナーゼであり、その
認識配列がloxＰ配列である前記(5)の作製方法。 (7) レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼであり、
その認識配列がＦＲＴ配列である前記(5)の作製方法。 (8) レコンビナーゼおよびアデノウイルスＥ１タンパ
ク質産生細胞が、レコンビナーゼを産生するヒト胎児腎
細胞由来２９３細胞である前記(5)から(7)のいずれかの
作製方法。 (9) Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失させ
たアデノウイルスゲノムＤＮＡの欠失部位に、レコンビ
ナーゼ認識配列を両端に有するコスミド配列が挿入結合
されていることを特徴とするコスミドアデノウイルスベ
クター。 (10) レコンビナーゼがCreレコンビナーゼであり、そ
の認識配列がloxＰ配列である前記(9)のコスミドアデノ
ウイルスベクター。 (11) レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼであり、
その認識配列がＦＲＴ配列である前記(9)のコスミドア
デノウイルスベクター。 (12) ＦＬＰレコンビナーゼを産生するヒト胎児腎細胞
由来２９３細胞。
【００１３】すなわち、この出願の前記発明において
は、「コスミド配列」とは、両端に同方向のレコンビナ
ーゼ認識配列を有する直鎖状のコスミドベクター配列を
意味する。また、「コスミドアデノウイルスベクター」
とは、Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失した
アデノウイルスゲノムＤＮＡと前記コスミド配列とから
なる環状ＤＮＡコンストラクトを意味する。さらに、
「組換えコスミドアデノウイルスベクター」とは、前記
コスミドアデノウイルスベクターに発現カセットを組み
込んだ環状ＤＮＡコンストラクトを意味する。さらにま
た、「組換えアデノウイルスベクター」とは、前記組換
えコスミドアデノウイルスベクターからコスミド配列が
除去された直鎖状ＤＮＡ配列を感染性粒子内に組み込ん
だアデノウイルスを意味する。
は、「コスミド配列」とは、両端に同方向のレコンビナ
ーゼ認識配列を有する直鎖状のコスミドベクター配列を
意味する。また、「コスミドアデノウイルスベクター」
とは、Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失した
アデノウイルスゲノムＤＮＡと前記コスミド配列とから
なる環状ＤＮＡコンストラクトを意味する。さらに、
「組換えコスミドアデノウイルスベクター」とは、前記
コスミドアデノウイルスベクターに発現カセットを組み
込んだ環状ＤＮＡコンストラクトを意味する。さらにま
た、「組換えアデノウイルスベクター」とは、前記組換
えコスミドアデノウイルスベクターからコスミド配列が
除去された直鎖状ＤＮＡ配列を感染性粒子内に組み込ん
だアデノウイルスを意味する。
【００１４】以下、この出願の発明について、その実施
の形態を詳しく説明する。
の形態を詳しく説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】この出願の前記(1)および(5)の組
換えアデノウイルスベクターの作製方法においては、前
記(9)のコスミドアデノウイルスベクターを使用する。
このコスミドアデノウイルスベクターの調製において、
アデノウイルスゲノムＤＮＡ（約36kb）は公知のクロー
ン（例えば、実施例で使用したｐＦＧ１４０等）を利用
することができる。そして、このゲノムＤＮＡを適当な
制限酵素やヌクレアーゼ等で処理することによって、そ
のＥ１領域（約2.0kb）もしくはＥ１領域とＥ３領域
（約3.0kb）の両方を欠失させたＤＮＡ断片（約31〜34k
b）を得ることができる。このＤＮＡ断片を、開裂して
直鎖状にしたコスミド配列とライゲーションし、環状Ｄ
ＮＡコンストラクトを形成する。コスミドベクターは大
腸菌λファージのcos部位を有するプラスミドであり、3
0〜42kbの外来ＤＮＡを挿入することができるため、前
記の約34kbのＤＮＡ断片を収納することができる。この
コスミド配列はまた、両端にレコンビナーゼ認識配列を
有している。この認識配列は、使用するレコンビナーゼ
の種類によって決定され、例えば、Ｃreレコンビナーゼ
の場合にはloxＰ配列を、また、ＦＬＰレコンビナーゼ
の場合にはＦＲＴ配列を用いることができる。例えば、
loxＰ配列は34bpの配列であり、公知のクローン（例え
ば、実施例で使用したｐＢＳ246：GIBCO BRL社製等）か
ら切り出して用いることができる。また、ＦＲＴ配列は
公知のクローンｐＮＥＯβＧＡＬ（Stratagene社製等）
から切り出して用いることができる。さらに、コスミド
配列のレコンビナーゼ認識配列の外側には、アデノウイ
ルスゲノムＤＮＡ接続部位以外に、少なくとも１カ所の
クローニングサイト（制限酵素部位）を有するＤＮＡ配
列を延長させるのが好ましい。
換えアデノウイルスベクターの作製方法においては、前
記(9)のコスミドアデノウイルスベクターを使用する。
このコスミドアデノウイルスベクターの調製において、
アデノウイルスゲノムＤＮＡ（約36kb）は公知のクロー
ン（例えば、実施例で使用したｐＦＧ１４０等）を利用
することができる。そして、このゲノムＤＮＡを適当な
制限酵素やヌクレアーゼ等で処理することによって、そ
のＥ１領域（約2.0kb）もしくはＥ１領域とＥ３領域
（約3.0kb）の両方を欠失させたＤＮＡ断片（約31〜34k
b）を得ることができる。このＤＮＡ断片を、開裂して
直鎖状にしたコスミド配列とライゲーションし、環状Ｄ
ＮＡコンストラクトを形成する。コスミドベクターは大
腸菌λファージのcos部位を有するプラスミドであり、3
0〜42kbの外来ＤＮＡを挿入することができるため、前
記の約34kbのＤＮＡ断片を収納することができる。この
コスミド配列はまた、両端にレコンビナーゼ認識配列を
有している。この認識配列は、使用するレコンビナーゼ
の種類によって決定され、例えば、Ｃreレコンビナーゼ
の場合にはloxＰ配列を、また、ＦＬＰレコンビナーゼ
の場合にはＦＲＴ配列を用いることができる。例えば、
loxＰ配列は34bpの配列であり、公知のクローン（例え
ば、実施例で使用したｐＢＳ246：GIBCO BRL社製等）か
ら切り出して用いることができる。また、ＦＲＴ配列は
公知のクローンｐＮＥＯβＧＡＬ（Stratagene社製等）
から切り出して用いることができる。さらに、コスミド
配列のレコンビナーゼ認識配列の外側には、アデノウイ
ルスゲノムＤＮＡ接続部位以外に、少なくとも１カ所の
クローニングサイト（制限酵素部位）を有するＤＮＡ配
列を延長させるのが好ましい。
【００１６】この出願の前記(1)および(5)の組換えアデ
ノウイルスベクター作製方法においては、以上のとおり
に調製した環状のコスミドアデノウイルスベクターに、
外来遺伝子を含む発現カセットを挿入結合し、組換えコ
スミドアデノウイルスベクターを調製する。発現カセッ
トは、プロモーター配列、外来遺伝子（ｃＤＮＡ）およ
びポリAシグナル等からなるＤＮＡ断片である。
ノウイルスベクター作製方法においては、以上のとおり
に調製した環状のコスミドアデノウイルスベクターに、
外来遺伝子を含む発現カセットを挿入結合し、組換えコ
スミドアデノウイルスベクターを調製する。発現カセッ
トは、プロモーター配列、外来遺伝子（ｃＤＮＡ）およ
びポリAシグナル等からなるＤＮＡ断片である。
【００１７】なお、この出願の前記(1)および(5)の方法
発明においては、予めコスミドベクター配列と発現カセ
ットを連結し、これと前記アデノウイルスＤＮＡ断片と
をライゲーションして組換えコスミドアデノウイルスベ
クターとすることもできる。あるいは、外来遺伝子（ｃ
ＤＮＡ）を含まない発現カセットを挿入したコスミドア
デノウイルスベクターを作製し、この発現カセット内に
外来遺伝子（ｃＤＮＡ）を組み込んで組換えコスミドア
デノウイルスベクターとすることもできる。
発明においては、予めコスミドベクター配列と発現カセ
ットを連結し、これと前記アデノウイルスＤＮＡ断片と
をライゲーションして組換えコスミドアデノウイルスベ
クターとすることもできる。あるいは、外来遺伝子（ｃ
ＤＮＡ）を含まない発現カセットを挿入したコスミドア
デノウイルスベクターを作製し、この発現カセット内に
外来遺伝子（ｃＤＮＡ）を組み込んで組換えコスミドア
デノウイルスベクターとすることもできる。
【００１８】この出願の前記(1)の発明方法は、次い
で、これらの組換えコスミドアデノウイルスベクター
を、レコンビナーゼ発現ベクターとともに、アデノウイ
ルスＥ１タンパク質産生細胞にコトランスフェクトす
る。レコンビナーゼ発現ベクターとしては、例えば、Ｃ
reレコンビナーゼまたはＦＬＰレコンビナーゼ発現ベク
ターを使用することができる。Ｃreレコンビナーゼはlo
xＰ配列を認識し、２つのloxＰ配列に挟まれたDNA配列
を切り出す（Nucleic Acids Res. 17:147-161, 198
9）。また、ＦＬＰレコンビナーゼはＦＲＴ配列を認識
し、２つのＦＲＴ配列に挟まれたＤＮＡ配列を切り出す
（Teends Genet. 9:413-421, 1993）。従って、これら
のレコンビナーゼ発現ベクターと前記の組換えコスミド
アデノウイルスベクターとを共にホスト細胞に導入する
と、レコンビナーゼの作用によって環状ＤＮＡのloxＰ
配列またはＦＲＴ配列に挟まれたコスミドベクター配列
が切り出され、アデノウイルスゲノムＤＮＡと発現カセ
ットとからなる直鎖状ＤＮＡ配列を有する組換えアデノ
ウイルスベクターが作製される。
で、これらの組換えコスミドアデノウイルスベクター
を、レコンビナーゼ発現ベクターとともに、アデノウイ
ルスＥ１タンパク質産生細胞にコトランスフェクトす
る。レコンビナーゼ発現ベクターとしては、例えば、Ｃ
reレコンビナーゼまたはＦＬＰレコンビナーゼ発現ベク
ターを使用することができる。Ｃreレコンビナーゼはlo
xＰ配列を認識し、２つのloxＰ配列に挟まれたDNA配列
を切り出す（Nucleic Acids Res. 17:147-161, 198
9）。また、ＦＬＰレコンビナーゼはＦＲＴ配列を認識
し、２つのＦＲＴ配列に挟まれたＤＮＡ配列を切り出す
（Teends Genet. 9:413-421, 1993）。従って、これら
のレコンビナーゼ発現ベクターと前記の組換えコスミド
アデノウイルスベクターとを共にホスト細胞に導入する
と、レコンビナーゼの作用によって環状ＤＮＡのloxＰ
配列またはＦＲＴ配列に挟まれたコスミドベクター配列
が切り出され、アデノウイルスゲノムＤＮＡと発現カセ
ットとからなる直鎖状ＤＮＡ配列を有する組換えアデノ
ウイルスベクターが作製される。
【００１９】Creレコンビナーゼ発現ベクターとして
は、公知のクローン（例えば、実施例で使用したMC1-cr
eプラスミド等）を使用することができる。また、ＦＬ
Ｐレコンビナーゼ発現ベクターとしては、ｐＯＧ４４
（Stratagene社製）等を用いることができる。
は、公知のクローン（例えば、実施例で使用したMC1-cr
eプラスミド等）を使用することができる。また、ＦＬ
Ｐレコンビナーゼ発現ベクターとしては、ｐＯＧ４４
（Stratagene社製）等を用いることができる。
【００２０】アデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞と
してはヒト胎児腎細胞由来２９３細胞が好ましいが、こ
れに限定されるものではなく、例えば、予めＥ１タンパ
ク質遺伝子を導入したHeLa細胞や正常細胞等を用いるこ
とができる。あるいはまた、Ｅ１タンパク質遺伝子を導
入したトランスジェニック動物から単離した細胞を用い
ることもできる。
してはヒト胎児腎細胞由来２９３細胞が好ましいが、こ
れに限定されるものではなく、例えば、予めＥ１タンパ
ク質遺伝子を導入したHeLa細胞や正常細胞等を用いるこ
とができる。あるいはまた、Ｅ１タンパク質遺伝子を導
入したトランスジェニック動物から単離した細胞を用い
ることもできる。
【００２１】一方、この出願の前記(5)の発明方法にお
いては、前記のとおりに作製した組換えコスミドアデノ
ウイルスベクターを、レコンビナーゼおよびアデノウイ
ルスＥ１タンパク質産生細胞にトランスフェクトする。
すなわち、この方法では、ホスト細胞がレコンビナーゼ
を恒常的に産生しているために、組換えコスミドアデノ
ウイルスベクターのみをトランスフェクションすること
によって、ホスト細胞が産生するレコンビナーゼの作用
により環状ＤＮＡのレコンビナーゼ認識配列に挟まれた
コスミドベクター配列が切り出され、アデノウイルスゲ
ノムＤＮＡと発現カセットとからなる直鎖状ＤＮＡ配列
を有する組換えアデノウイルスベクターが作製される。
なお、レコンビナーゼおよびＥ１タンパク質産生細胞と
しては、例えば、文献公知のCreレコンビナーゼ産生２
９３細胞（J. Virol. 71:1842-1849, 1997; Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 93:13565-13570, 1996）や、後記
する実施例に示した方法によって作製されるＣreレコン
ビナーゼ産生２９３細胞を用いることができる。また、
この出願によって新たに提供される前記(12)のＦＬＰレ
コンビナーゼ産生２９３細胞を用いることができる。さ
らには、予めE1タンパク質遺伝子とレコンビナーゼ遺伝
子とを導入したHeLa細胞や正常細胞、あるいはE1タンパ
ク質遺伝子とレコンビナーゼ遺伝子とを導入したトラン
スジェニック動物から単離した細胞等を用いることもで
きる。
いては、前記のとおりに作製した組換えコスミドアデノ
ウイルスベクターを、レコンビナーゼおよびアデノウイ
ルスＥ１タンパク質産生細胞にトランスフェクトする。
すなわち、この方法では、ホスト細胞がレコンビナーゼ
を恒常的に産生しているために、組換えコスミドアデノ
ウイルスベクターのみをトランスフェクションすること
によって、ホスト細胞が産生するレコンビナーゼの作用
により環状ＤＮＡのレコンビナーゼ認識配列に挟まれた
コスミドベクター配列が切り出され、アデノウイルスゲ
ノムＤＮＡと発現カセットとからなる直鎖状ＤＮＡ配列
を有する組換えアデノウイルスベクターが作製される。
なお、レコンビナーゼおよびＥ１タンパク質産生細胞と
しては、例えば、文献公知のCreレコンビナーゼ産生２
９３細胞（J. Virol. 71:1842-1849, 1997; Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 93:13565-13570, 1996）や、後記
する実施例に示した方法によって作製されるＣreレコン
ビナーゼ産生２９３細胞を用いることができる。また、
この出願によって新たに提供される前記(12)のＦＬＰレ
コンビナーゼ産生２９３細胞を用いることができる。さ
らには、予めE1タンパク質遺伝子とレコンビナーゼ遺伝
子とを導入したHeLa細胞や正常細胞、あるいはE1タンパ
ク質遺伝子とレコンビナーゼ遺伝子とを導入したトラン
スジェニック動物から単離した細胞等を用いることもで
きる。
【００２２】このようにして作製した組換えアデノウイ
ルスベクターの全長は、野生型アデノウイルスと同様の
36kb前後であり、様々な動物細胞に対して高い感染力を
有している。
ルスベクターの全長は、野生型アデノウイルスと同様の
36kb前後であり、様々な動物細胞に対して高い感染力を
有している。
【００２３】なお、この前記発明(12)のＦＬＰコンビナ
ーゼ産生293細胞は、公知の方法によって作製すること
ができる。例えば、ＦＬＰレコンビナーゼをコードする
ＤＮＡ断片を動物細胞用発現ベクターに組込み、このベ
クターを293細胞に導入することによって、ＦＬＰレコ
ンビナーゼ産生293細胞を作製することができる。ＦＬ
ＰレコンビナーゼをコードするＤＮＡ断片は、公知の発
現ベクターpOG44（Stratagene社製）等から切り出して
使用することができる。また、動物細胞用発現ベクター
には、前記のベクターpOG44を直接使用することができ
る他、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）
付加部位等を有する公知のベクターを使用することがで
きる。発現ベクターを293細胞に導入するには、電気穿
孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデ
キストラン法など公知の方法を用いることができる。さ
らに、ＦＬＰレコンビナーゼ発現ベクターには、ピュー
ロマイシン等の薬剤耐性遺伝子を併せて組み込み、ベク
ターが導入された細胞の選択マーカーとすることもでき
る。
ーゼ産生293細胞は、公知の方法によって作製すること
ができる。例えば、ＦＬＰレコンビナーゼをコードする
ＤＮＡ断片を動物細胞用発現ベクターに組込み、このベ
クターを293細胞に導入することによって、ＦＬＰレコ
ンビナーゼ産生293細胞を作製することができる。ＦＬ
ＰレコンビナーゼをコードするＤＮＡ断片は、公知の発
現ベクターpOG44（Stratagene社製）等から切り出して
使用することができる。また、動物細胞用発現ベクター
には、前記のベクターpOG44を直接使用することができ
る他、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）
付加部位等を有する公知のベクターを使用することがで
きる。発現ベクターを293細胞に導入するには、電気穿
孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデ
キストラン法など公知の方法を用いることができる。さ
らに、ＦＬＰレコンビナーゼ発現ベクターには、ピュー
ロマイシン等の薬剤耐性遺伝子を併せて組み込み、ベク
ターが導入された細胞の選択マーカーとすることもでき
る。
【００２４】以下、実施例を示してこの出願の発明を詳
細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例
によって限定されるものではない。
細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例
によって限定されるものではない。
【００２５】
【実施例】実施例１：コスミドアデノウイルスベクター
の構築 コスミドベクターSuperCos１はStragene社(La Jolla,Ｃ
Ａ）より、loxＰ配列を含むプラスミドｐＢＳ246はGIBC
O BRL社（Rockville, MD）より購入した。ｐＢS246のlo
xＰで挾まれる領域中のHind lllサイトをXba Ｉへ、Bam
HＩサイトをSwa lへ変更した。これをNot lで切断し、
２個のloxＰを持つ260bpの断片を分離した。SuperCos l
に１か所あるXba Ｉサイトは予め破壊しておき、Not l
で切断したところに２個のloxＰを持つ260bpの断片を挿
入し、コスミドベクター配列（ｐＬＣコスミド）を調製
した。
の構築 コスミドベクターSuperCos１はStragene社(La Jolla,Ｃ
Ａ）より、loxＰ配列を含むプラスミドｐＢＳ246はGIBC
O BRL社（Rockville, MD）より購入した。ｐＢS246のlo
xＰで挾まれる領域中のHind lllサイトをXba Ｉへ、Bam
HＩサイトをSwa lへ変更した。これをNot lで切断し、
２個のloxＰを持つ260bpの断片を分離した。SuperCos l
に１か所あるXba Ｉサイトは予め破壊しておき、Not l
で切断したところに２個のloxＰを持つ260bpの断片を挿
入し、コスミドベクター配列（ｐＬＣコスミド）を調製
した。
【００２６】アデノウイルスゲノムＤＮＡはｐＦＧ140
から調製した。ｐＦＧ140はアデノウイルス５dl309の全
ゲノムが環状に連結しており、そのＥ１領域のXba Ｉサ
イトに2.2kbのベクター部分を持つプラスミドである
が、このＥ１領域の681〜2559bp（ゲノム５‘端より）
をBal31ヌクレアーゼによって欠失させ、そこにXba Ｉ
サイトを再構築した。
から調製した。ｐＦＧ140はアデノウイルス５dl309の全
ゲノムが環状に連結しており、そのＥ１領域のXba Ｉサ
イトに2.2kbのベクター部分を持つプラスミドである
が、このＥ１領域の681〜2559bp（ゲノム５‘端より）
をBal31ヌクレアーゼによって欠失させ、そこにXba Ｉ
サイトを再構築した。
【００２７】Ｅ１領域を欠失したアデノウイルスＤＮＡ
と前記ｐＬＣコスミドをそれぞれXba Ｉ切断し、ライゲ
ーションした後、in vitroパッケージングによりバクテ
リオファージラムダの頭部に収容し、41kbのコスミドア
デノウイルスベクター（ｐＡＬＣコスミド）を作製した
（図１参照）。 実施例２：組換えコスミドアデノウイルスベクターの構
築 様々なタイプの細胞で強く働くことが知られているＣＡ
Ｇプロモーター（サイトメガロウイルス初期エンハンサ
ー・ニワトリβアクチンプロモーターのハイブリッド）
の下流にマウスインターロイキン５（mlL-5）、ＥＭＣ
ウイルス由来ｌＲＥＳ（lnternal ribosome entry sit
e）、ｐＥＧＦＰ−ＮＩプラスミド由来ＥＧＦＰ（enhan
ced green fluorescent protein）ｃＤＮＡを結合し、
その両端にSwa Ｉサイトを付加してＤＮＡ断片を調製
し、このＤＮＡ断片をカナマイシン耐性のｐＨＳＧ２９
８由来のベクターに組み込んだのち、この組換えベクタ
ーからSwa Ｉ断片を切り出して発現カセット（4.2kb）
を調製した。
と前記ｐＬＣコスミドをそれぞれXba Ｉ切断し、ライゲ
ーションした後、in vitroパッケージングによりバクテ
リオファージラムダの頭部に収容し、41kbのコスミドア
デノウイルスベクター（ｐＡＬＣコスミド）を作製した
（図１参照）。 実施例２：組換えコスミドアデノウイルスベクターの構
築 様々なタイプの細胞で強く働くことが知られているＣＡ
Ｇプロモーター（サイトメガロウイルス初期エンハンサ
ー・ニワトリβアクチンプロモーターのハイブリッド）
の下流にマウスインターロイキン５（mlL-5）、ＥＭＣ
ウイルス由来ｌＲＥＳ（lnternal ribosome entry sit
e）、ｐＥＧＦＰ−ＮＩプラスミド由来ＥＧＦＰ（enhan
ced green fluorescent protein）ｃＤＮＡを結合し、
その両端にSwa Ｉサイトを付加してＤＮＡ断片を調製
し、このＤＮＡ断片をカナマイシン耐性のｐＨＳＧ２９
８由来のベクターに組み込んだのち、この組換えベクタ
ーからSwa Ｉ断片を切り出して発現カセット（4.2kb）
を調製した。
【００２８】この発現カセットを、実施例１で構築した
ｐＡＬＣコスミドのSwa Ｉサイトに挿入した後、in vit
roパッケージングによりバクテリオファージラムダの頭
部に組み込み、組換えコスミドアデノウイルスベクター
（ｐＡＬＣ−ＩＬ−５）を構築した。このベクターを大
腸菌ＤＨ１０Ｂを用いて大量調整・精製し、回収した。 実施例３：組換えアデノウイルスベクターの構築 実施例２で構築した組換えコスミドアデノウイルスベク
ター（ｐＡＬＣ−ＩＬ−５）とＣreレコンビナーゼ発現
ベクター（ＭＣ１−creプラスミド）とを、恒常的にア
デノウイルスＥ１タンパク質を産生しているヒト胎児腎
細胞由来の２９３細胞にコトランスフェクションした。
２９３細胞の培養液は非働化10％ウシ胎仔血清（ＦＢ
Ｓ）を含むＭＥＭ（Minimum Essential Medium）を用
い、ゼラチンで表面をコートしたシャーレ、あるいはマ
ルチプレートを使用した。
ｐＡＬＣコスミドのSwa Ｉサイトに挿入した後、in vit
roパッケージングによりバクテリオファージラムダの頭
部に組み込み、組換えコスミドアデノウイルスベクター
（ｐＡＬＣ−ＩＬ−５）を構築した。このベクターを大
腸菌ＤＨ１０Ｂを用いて大量調整・精製し、回収した。 実施例３：組換えアデノウイルスベクターの構築 実施例２で構築した組換えコスミドアデノウイルスベク
ター（ｐＡＬＣ−ＩＬ−５）とＣreレコンビナーゼ発現
ベクター（ＭＣ１−creプラスミド）とを、恒常的にア
デノウイルスＥ１タンパク質を産生しているヒト胎児腎
細胞由来の２９３細胞にコトランスフェクションした。
２９３細胞の培養液は非働化10％ウシ胎仔血清（ＦＢ
Ｓ）を含むＭＥＭ（Minimum Essential Medium）を用
い、ゼラチンで表面をコートしたシャーレ、あるいはマ
ルチプレートを使用した。
【００２９】１μgのｐＡＬＣ−ＩＬ−５と、0.1μgの
ＭＣ１−creプラスミドを１２穴マルチプレートにまい
た２９３細胞にLIPOFECTAMINE（GIBCO BRL社製）を用い
てコトランスフェクションした（図２参照）。
ＭＣ１−creプラスミドを１２穴マルチプレートにまい
た２９３細胞にLIPOFECTAMINE（GIBCO BRL社製）を用い
てコトランスフェクションした（図２参照）。
【００３０】細胞変性効果（ＣＰＥ）はプラーク形成に
より10日以内で観察された。ＣＰＥの観察されたプレー
トの培養上清を2,000rpm、５分間、４℃で遠心し、その
上清を75cm2のフラスコにまいた２９３細胞に加え感染
させた。数日後、全面にＣＰＥが確認できたフラスコに
ついて、細胞を集め凍結・融解を６回繰り返したものを
3,500rpm、10分間、４℃で遠心し、その上清中に含まれ
る組換えアデノウイルスベクターの力価を測定した。測
定は、ゼラチンコートした９６穴マルチプレートに播い
た２９３細胞に段階希釈したウイルス懸濁液を加え培養
し、ＣＰＥの有無を観察した結果から算定した。
より10日以内で観察された。ＣＰＥの観察されたプレー
トの培養上清を2,000rpm、５分間、４℃で遠心し、その
上清を75cm2のフラスコにまいた２９３細胞に加え感染
させた。数日後、全面にＣＰＥが確認できたフラスコに
ついて、細胞を集め凍結・融解を６回繰り返したものを
3,500rpm、10分間、４℃で遠心し、その上清中に含まれ
る組換えアデノウイルスベクターの力価を測定した。測
定は、ゼラチンコートした９６穴マルチプレートに播い
た２９３細胞に段階希釈したウイルス懸濁液を加え培養
し、ＣＰＥの有無を観察した結果から算定した。
【００３１】また、コントロールとして、ｐＡＬＣ−Ｉ
Ｌ−５のみを２９３細胞にトランスフェクションし、同
様にプラーク形成を観察した。
Ｌ−５のみを２９３細胞にトランスフェクションし、同
様にプラーク形成を観察した。
【００３２】その結果、Ｃreレコンビナーゼが存在しな
いコントロール条件の場合、別々にトランスフェクショ
ンした８穴の２９３細胞のいずれにもプラークは認めら
れなかった。これはｐＡＬＣ−ＩＬ−５ＤＮＡはその長
さが45kbであり、感染性アデノウイルス粒子が収容でき
る長さを超えているため、ウイルスが産生されなかった
ことを示している。一方、Ｃreレコンビナーゼ発現ベク
ターと共にトランスフェクションした場合には、８日以
内に８穴の２９３細胞のすべてにおいてＣＰＥが認めら
れた。それぞれについて繰り返し検討した結果、Ｃｒｅ
が共存する場合、合計２２穴の細胞のすべてでプラーク
を確認した。
いコントロール条件の場合、別々にトランスフェクショ
ンした８穴の２９３細胞のいずれにもプラークは認めら
れなかった。これはｐＡＬＣ−ＩＬ−５ＤＮＡはその長
さが45kbであり、感染性アデノウイルス粒子が収容でき
る長さを超えているため、ウイルスが産生されなかった
ことを示している。一方、Ｃreレコンビナーゼ発現ベク
ターと共にトランスフェクションした場合には、８日以
内に８穴の２９３細胞のすべてにおいてＣＰＥが認めら
れた。それぞれについて繰り返し検討した結果、Ｃｒｅ
が共存する場合、合計２２穴の細胞のすべてでプラーク
を確認した。
【００３３】以上の結果により、一過性に発現するＣre
レコンビナーゼによってｐＡＬＣ−ＩＬ−５のコスミド
配列が効率よく除去され、その結果形成される発現カセ
ットを含む38kbの環状アデノウイルスベクターゲノムか
ら、感染性の組換えアデノウイルスベクターが産生され
たことが確認された。 実施例４：ウイルスＤＮＡの解析 実施例３で構築した組換えアデノウイルスベクターから
コスミド配列が除かれているかどうかを確かめるため、
そのＤＮＡの構造を解析した。
レコンビナーゼによってｐＡＬＣ−ＩＬ−５のコスミド
配列が効率よく除去され、その結果形成される発現カセ
ットを含む38kbの環状アデノウイルスベクターゲノムか
ら、感染性の組換えアデノウイルスベクターが産生され
たことが確認された。 実施例４：ウイルスＤＮＡの解析 実施例３で構築した組換えアデノウイルスベクターから
コスミド配列が除かれているかどうかを確かめるため、
そのＤＮＡの構造を解析した。
【００３４】ウイルス懸濁液を１％ＳＤＳ、0.2mg/mlプ
ロテアーゼＫ、10mM ＥＤＴＡで37℃、３時間消化し、
フェノール、フェノール／クロロホルム抽出、エタノー
ル沈殿したものをアガロースゲルで電気泳動し、ゲルか
らウイルスＤＮＡを抽出・精製した。ウイルスＤＮＡを
Xba Ｉで消化し、0.4％および0.9％のアガロースゲルを
用いて電気泳動した。
ロテアーゼＫ、10mM ＥＤＴＡで37℃、３時間消化し、
フェノール、フェノール／クロロホルム抽出、エタノー
ル沈殿したものをアガロースゲルで電気泳動し、ゲルか
らウイルスＤＮＡを抽出・精製した。ウイルスＤＮＡを
Xba Ｉで消化し、0.4％および0.9％のアガロースゲルを
用いて電気泳動した。
【００３５】図３Ａは組換えアデノウイルスベクターゲ
ノムの構造とその中のXba Ｉサイトを示す。組換えアデ
ノウイルスベクターの懸濁液から精製したウイルスＤＮ
ＡをXba Ｉで消化し、0.4％アガロースゲル（図３Ｂ、
レーン１、２）、あるいは0.9％ゲル（図３Ｃ、レーン
１、２）で電気泳動した。レーン１、２のウイルスＤＮ
Ａは別々にトランスフェクションした細胞から調製し
た。次にｐＡＬＣ−ＩＬ−５ＤＮＡをXba Ｉで消化し同
様に電気泳動した。loxP配列で挟まれたコスミド配列を
含むXba Ｉ断片は9.1kbとして認められるが（図３Ｂ、
Ｃ、レーン４）、組換えアデノウイルスベクターのＤＮ
Ａにおいては2.1kbの断片として認められ（図３Ｃ、レ
ーン１、２）、その差はｐＡＬＣ中のloxＰで挟まれた
コスミド配列（約７kb）に相当する。この結果により、
ｐＡＬＣ−ＩＬ−５中のコスミド配列はＣreレコンビナ
ーゼの一過性発現によって効率よく除去され、その結果
形成された発現カセットを含む３８ｋｂの環状アデノウ
イルスゲノムが増幅してウイルス粒子に収容され、感染
性の組換えアデノウイルスベクターが産生されたことが
確認された。予想される大きさ以外のＤＮＡ断片は認め
られず、この方法による組換えアデノウイルスベクター
構築過程においては、異常な組換えはほとんど起こらな
いことも確認された。コントロールとして、アデノウイ
ルスゲノムのクローンｐＦＧ140をトランスフェクショ
ンした２９３細胞のＤＮＡをXba Ｉで消化した場合は、
予想された34.6kb、2.2kbおよび1.3kbの各断片が認めら
れた（図３Ｂ、Ｃ、レーン３）。 実施例５：発現カセットに含まれる遺伝子の発現 ＩＬ−５の発現を確認するため、感染細胞の培養液を回
収、遠心し、その上清中のＩＬ−５活性をＥＬＩＳＡ法
で検討した。また、ＥＧＦＰの発現は蛍光顕微鏡で観察
することにより検討した。
ノムの構造とその中のXba Ｉサイトを示す。組換えアデ
ノウイルスベクターの懸濁液から精製したウイルスＤＮ
ＡをXba Ｉで消化し、0.4％アガロースゲル（図３Ｂ、
レーン１、２）、あるいは0.9％ゲル（図３Ｃ、レーン
１、２）で電気泳動した。レーン１、２のウイルスＤＮ
Ａは別々にトランスフェクションした細胞から調製し
た。次にｐＡＬＣ−ＩＬ−５ＤＮＡをXba Ｉで消化し同
様に電気泳動した。loxP配列で挟まれたコスミド配列を
含むXba Ｉ断片は9.1kbとして認められるが（図３Ｂ、
Ｃ、レーン４）、組換えアデノウイルスベクターのＤＮ
Ａにおいては2.1kbの断片として認められ（図３Ｃ、レ
ーン１、２）、その差はｐＡＬＣ中のloxＰで挟まれた
コスミド配列（約７kb）に相当する。この結果により、
ｐＡＬＣ−ＩＬ−５中のコスミド配列はＣreレコンビナ
ーゼの一過性発現によって効率よく除去され、その結果
形成された発現カセットを含む３８ｋｂの環状アデノウ
イルスゲノムが増幅してウイルス粒子に収容され、感染
性の組換えアデノウイルスベクターが産生されたことが
確認された。予想される大きさ以外のＤＮＡ断片は認め
られず、この方法による組換えアデノウイルスベクター
構築過程においては、異常な組換えはほとんど起こらな
いことも確認された。コントロールとして、アデノウイ
ルスゲノムのクローンｐＦＧ140をトランスフェクショ
ンした２９３細胞のＤＮＡをXba Ｉで消化した場合は、
予想された34.6kb、2.2kbおよび1.3kbの各断片が認めら
れた（図３Ｂ、Ｃ、レーン３）。 実施例５：発現カセットに含まれる遺伝子の発現 ＩＬ−５の発現を確認するため、感染細胞の培養液を回
収、遠心し、その上清中のＩＬ−５活性をＥＬＩＳＡ法
で検討した。また、ＥＧＦＰの発現は蛍光顕微鏡で観察
することにより検討した。
【００３６】２９３細胞に組換えコスミドアデノウイル
スベクターｐＡＬＣ−ＩＬ−５とｐＭＣｌ−creをコト
ランスフェクションすると、多くの細胞がＥＧＦＰ陽性
となり、ウイルスのプラークが発達するに従い、すべて
のプラークの周辺に強いＥＧＦＰ蛍光が認められた（図
４Ａ、Ｃ）。
スベクターｐＡＬＣ−ＩＬ−５とｐＭＣｌ−creをコト
ランスフェクションすると、多くの細胞がＥＧＦＰ陽性
となり、ウイルスのプラークが発達するに従い、すべて
のプラークの周辺に強いＥＧＦＰ蛍光が認められた（図
４Ａ、Ｃ）。
【００３７】次に実施例３で構築した組換えアデノウイ
ルスベクターの懸濁液を希釈し、２９３細胞に感染させ
プラークを形成させた。30個以上のプラークを調べ、そ
のすべてがＥＧＦＰ陽性細胞で囲まれていることを観察
した（図４Ｂ、Ｄ）。ＩＬ−５とＥＧＦＰはＣＡＧプロ
モーターによってbicistronicに転写されることを考え
ると、ＥＧＦＰを発現するアデノウイルスベクターはＩ
Ｌ−５もまた発現することが予想される。そこでＩＬ−
５の発現を確かめるために、９６穴マルチプレートにま
いた２９３細胞に限界希釈したウイルス懸濁液を加え、
別々のウイルスクローンを増殖させた。10個のウイルス
クローンについて調べたところ、すべてＥＧＦＰは陽性
であった。その培養上清のＩＬ−５活性をＥＬＩＳＡ法
を用いて検討した結果、それぞれ高い価を示した（＞10
μg/ml）。
ルスベクターの懸濁液を希釈し、２９３細胞に感染させ
プラークを形成させた。30個以上のプラークを調べ、そ
のすべてがＥＧＦＰ陽性細胞で囲まれていることを観察
した（図４Ｂ、Ｄ）。ＩＬ−５とＥＧＦＰはＣＡＧプロ
モーターによってbicistronicに転写されることを考え
ると、ＥＧＦＰを発現するアデノウイルスベクターはＩ
Ｌ−５もまた発現することが予想される。そこでＩＬ−
５の発現を確かめるために、９６穴マルチプレートにま
いた２９３細胞に限界希釈したウイルス懸濁液を加え、
別々のウイルスクローンを増殖させた。10個のウイルス
クローンについて調べたところ、すべてＥＧＦＰは陽性
であった。その培養上清のＩＬ−５活性をＥＬＩＳＡ法
を用いて検討した結果、それぞれ高い価を示した（＞10
μg/ml）。
【００３８】以上の結果は、この出願の発明方法が、き
わめて均一な組換えアデノウイルスベクターを産生する
ことが可能であり、このベクターにより動物細胞中で導
入遺伝子を確実に発現させることが可能であることを示
している。 実施例６：Ｃreレコンビナーゼ産生２９３細胞の作製 Ｃreレコンビナーゼ遺伝子とＥＭＣウイルス由来のＩＲ
ＥＳ（Internal ribosome entry site）配列およびヒュ
ーロマイシン耐性遺伝子をｐＣＡＧＧＳ（Gene108(2):1
93-199, 1991）のＥcoＲＩサイトに挿入してＣreレコン
ビナーゼ発現プラスミドｐCAGGS−cre−puroを構築し、
２９３細胞にトランスフェクトし、２μgのヒューロマ
イシン／ml含有培地で培養した。ヒューロマイシン耐性
コロニーを単離し、２９３細胞にレポータープラスミド
ｐＣＡＧ−ＣＡＴ−Ｚをトランスフェクションすること
によってＣreレコンビナーゼ活性をテストした。すなわ
ちこのレポータープラスミドは、ＣＡＧプロモーターと
lacＺ遺伝子の間に、loxＰ配列で挟まれたクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子
が挿入されており、Ｃreレコンビナーゼの作用によって
ＣＡＴ遺伝子が切り出されるとlacＺが発現されるた
め、２９３細胞のＣreレコンビナーゼ産生をテストする
ことができる（Biochem. Biophys. Res. Commun. 17
(2):393-401, 1995）。このテストによって、Ｃreレコ
ンビナーゼ産生能を有する細胞株２９３cre15を得た。 実施例７：２９３cre15における組換えアデノウイルス
ベクターの作製 実施例２で構築した組換えコスミドアデノウイルスベク
ター（ｐＡＬＣ−ＩＬ−５）１μg/wellを、実施例６で
作製した２９３cre15にトランスフェクションした。９
ウェルのトランスフェクション細胞の全てにおいてＣＰ
Ｅが観察され、ＣＰＥの全スポットには強いＥＧＦＰが
観られた。
わめて均一な組換えアデノウイルスベクターを産生する
ことが可能であり、このベクターにより動物細胞中で導
入遺伝子を確実に発現させることが可能であることを示
している。 実施例６：Ｃreレコンビナーゼ産生２９３細胞の作製 Ｃreレコンビナーゼ遺伝子とＥＭＣウイルス由来のＩＲ
ＥＳ（Internal ribosome entry site）配列およびヒュ
ーロマイシン耐性遺伝子をｐＣＡＧＧＳ（Gene108(2):1
93-199, 1991）のＥcoＲＩサイトに挿入してＣreレコン
ビナーゼ発現プラスミドｐCAGGS−cre−puroを構築し、
２９３細胞にトランスフェクトし、２μgのヒューロマ
イシン／ml含有培地で培養した。ヒューロマイシン耐性
コロニーを単離し、２９３細胞にレポータープラスミド
ｐＣＡＧ−ＣＡＴ−Ｚをトランスフェクションすること
によってＣreレコンビナーゼ活性をテストした。すなわ
ちこのレポータープラスミドは、ＣＡＧプロモーターと
lacＺ遺伝子の間に、loxＰ配列で挟まれたクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子
が挿入されており、Ｃreレコンビナーゼの作用によって
ＣＡＴ遺伝子が切り出されるとlacＺが発現されるた
め、２９３細胞のＣreレコンビナーゼ産生をテストする
ことができる（Biochem. Biophys. Res. Commun. 17
(2):393-401, 1995）。このテストによって、Ｃreレコ
ンビナーゼ産生能を有する細胞株２９３cre15を得た。 実施例７：２９３cre15における組換えアデノウイルス
ベクターの作製 実施例２で構築した組換えコスミドアデノウイルスベク
ター（ｐＡＬＣ−ＩＬ−５）１μg/wellを、実施例６で
作製した２９３cre15にトランスフェクションした。９
ウェルのトランスフェクション細胞の全てにおいてＣＰ
Ｅが観察され、ＣＰＥの全スポットには強いＥＧＦＰが
観られた。
【００３９】これらの結果から、レコンビナーゼ産生２
９３細胞を用いることにより、レコンビナーゼ発現ベク
ターを使用せずとも、組換えコスミドアデノウイルスベ
クターから効率よく組換えアデノウイルスベクターが作
製可能であることが確認された。 実施例８：ＦＬＰコンビナーゼ産生293細胞の作製 ＦＬＰレコンビナーゼ遺伝子とＥＭＣウイルス由来のＩ
ＲＥＳ（Internal ribosome entry site）配列およびヒ
ューロマイシン耐性遺伝子をpgK（phosphoglycerate ki
nase）プロモーターの下流に挿入してＦＬＰレコンビナ
ーゼ発現プラスミドpgK-FLP-puroを構築し、293細胞に
トランスフェクトし、２μgのヒューロマイシン／ml含
有培地で培養した。ヒューロマイシン耐性コロニーを単
離し、293細胞にレポータープラスミドpＮＥＯβＧＡＬ
をトランスフェクションすることによってＦＬＰレコン
ビナーゼ活性をテストした。すなわちこのレポータープ
ラスミドは、ＳＶ40プロモーターの下流のlacＺ遺伝子
の途中に、ＦＲＴ配列で挟まれたネオマイシン耐性遺伝
子が挿入されており、ＦＬＰレコンビナーゼの作用によ
ってネオマイシン耐性遺伝子が切り出されるとlacＺが
発現されるため、293細胞のＦＬＰレコンビナーゼ産生
をテストすることができる。このテストによって、ＦＬ
Ｐレコンビナーゼ産生能を有する細胞株293ＦＬＰを得
た。
９３細胞を用いることにより、レコンビナーゼ発現ベク
ターを使用せずとも、組換えコスミドアデノウイルスベ
クターから効率よく組換えアデノウイルスベクターが作
製可能であることが確認された。 実施例８：ＦＬＰコンビナーゼ産生293細胞の作製 ＦＬＰレコンビナーゼ遺伝子とＥＭＣウイルス由来のＩ
ＲＥＳ（Internal ribosome entry site）配列およびヒ
ューロマイシン耐性遺伝子をpgK（phosphoglycerate ki
nase）プロモーターの下流に挿入してＦＬＰレコンビナ
ーゼ発現プラスミドpgK-FLP-puroを構築し、293細胞に
トランスフェクトし、２μgのヒューロマイシン／ml含
有培地で培養した。ヒューロマイシン耐性コロニーを単
離し、293細胞にレポータープラスミドpＮＥＯβＧＡＬ
をトランスフェクションすることによってＦＬＰレコン
ビナーゼ活性をテストした。すなわちこのレポータープ
ラスミドは、ＳＶ40プロモーターの下流のlacＺ遺伝子
の途中に、ＦＲＴ配列で挟まれたネオマイシン耐性遺伝
子が挿入されており、ＦＬＰレコンビナーゼの作用によ
ってネオマイシン耐性遺伝子が切り出されるとlacＺが
発現されるため、293細胞のＦＬＰレコンビナーゼ産生
をテストすることができる。このテストによって、ＦＬ
Ｐレコンビナーゼ産生能を有する細胞株293ＦＬＰを得
た。
【００４０】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、哺乳動物細胞に感染力を有する組換えア
デノウイルスベクターを簡便かつ効率よく作製すること
が可能となる。例えば、従来の相同組換えを用いた組換
えアデノウイルスベクターの作製方法では、予想外の組
換えベクターが製造される危険性があり、また、製造過
程が複雑で長時間の工程を必要とするが、この発明の方
法は複雑な作業工程を必要とせず、しかも所望の構造と
機能とを有する組換えベクターを確実に製造することが
可能である。また、従来の相同組換えを用いた方法で
は、使用する２９３細胞の継代数が50以下である必要が
あるが、この出願の発明方法では、少なくとも70代以上
継代した２９３細胞を用いても組換えアデノウイルスベ
クターの製造が可能である。
発明によって、哺乳動物細胞に感染力を有する組換えア
デノウイルスベクターを簡便かつ効率よく作製すること
が可能となる。例えば、従来の相同組換えを用いた組換
えアデノウイルスベクターの作製方法では、予想外の組
換えベクターが製造される危険性があり、また、製造過
程が複雑で長時間の工程を必要とするが、この発明の方
法は複雑な作業工程を必要とせず、しかも所望の構造と
機能とを有する組換えベクターを確実に製造することが
可能である。また、従来の相同組換えを用いた方法で
は、使用する２９３細胞の継代数が50以下である必要が
あるが、この出願の発明方法では、少なくとも70代以上
継代した２９３細胞を用いても組換えアデノウイルスベ
クターの製造が可能である。
【００４１】従って、この出願の発明により提供される
方法および材料によって、哺乳動物細胞を用いた遺伝子
機能解析が促進される。また、遺伝子治療のためのベク
ター開発も促進される。
方法および材料によって、哺乳動物細胞を用いた遺伝子
機能解析が促進される。また、遺伝子治療のためのベク
ター開発も促進される。
【図１】実施例１で構築したコスミドアデノウイルスベ
クターｐＡＬＣ（上）と発現カセット（下）の構造を示
す模式図である。34kbのアデノウイルスゲノムＤＮＡは
白い環で、ゲノムの方向は矢印で示す。７kbのコスミド
ベクターは黒三角で示すloxＰ配列で挟まれており、そ
の中にcos部位、カナマイシン耐性遺伝子（Km）、大腸
菌ori、アンピシリン耐性遺伝子（Ap）を含む。発現カ
セットはＣＡＧプロモーター、マウスＩＬ−５ｃＤＮ
Ａ、ＩＲＥＳ、ＥＧＦＰｃＤＮＡ、ポリＡ添加シグナル
（pA）から成る。発現カセットはｐＡＬＣベクターのSw
a Ｉサイトに挿入され、実施例２の組換えコスミドアデ
ノウイルスベクターｐＡＬＣ−ＩＬ−５が構築される。
クターｐＡＬＣ（上）と発現カセット（下）の構造を示
す模式図である。34kbのアデノウイルスゲノムＤＮＡは
白い環で、ゲノムの方向は矢印で示す。７kbのコスミド
ベクターは黒三角で示すloxＰ配列で挟まれており、そ
の中にcos部位、カナマイシン耐性遺伝子（Km）、大腸
菌ori、アンピシリン耐性遺伝子（Ap）を含む。発現カ
セットはＣＡＧプロモーター、マウスＩＬ−５ｃＤＮ
Ａ、ＩＲＥＳ、ＥＧＦＰｃＤＮＡ、ポリＡ添加シグナル
（pA）から成る。発現カセットはｐＡＬＣベクターのSw
a Ｉサイトに挿入され、実施例２の組換えコスミドアデ
ノウイルスベクターｐＡＬＣ−ＩＬ−５が構築される。
【図２】実施例３で構築した組換えアデノウイルスベク
ターの作業工程の概要を示す模式図である。実施例２の
ｐＡＬＣ−ＩＬ−５を大腸菌ＤＨ10Ｂを用いて増殖・精
製し、ｐＭＣｌ−creプラスミドと共に２９３細胞にト
ランスフェクションした。一過性に発現するＣreレコン
ビナンーゼは、効率よく７kbのコスミド配列を切り出
し、最終的に、ＩＬ−５とＥＧＦＰの発現カセットを含
む感染性の組換えアデノウイルス粒子が産生された。
ターの作業工程の概要を示す模式図である。実施例２の
ｐＡＬＣ−ＩＬ−５を大腸菌ＤＨ10Ｂを用いて増殖・精
製し、ｐＭＣｌ−creプラスミドと共に２９３細胞にト
ランスフェクションした。一過性に発現するＣreレコン
ビナンーゼは、効率よく７kbのコスミド配列を切り出
し、最終的に、ＩＬ−５とＥＧＦＰの発現カセットを含
む感染性の組換えアデノウイルス粒子が産生された。
【図３】Ａは実施例３で構築した組換えアデノウイルス
ベクターＤＮＡの構造を示す模式図である。アデノウイ
ルスゲノム（白いバー）とＩＬ−５とＥＧＦＰの発現カ
セット（黒いバー）の結合したものの中に、Ｃreレコン
ビナーゼによって除去されたコスミド配列のloxＰ（黒
三角）１個が残る。下方の数字はアデノウイルスゲノム
のマップユニット（m.u.）を、上方の数字は組換えアデ
ノウイルスベクターＤＮＡをXba Ｉで消化した場合の断
片の長さ（kb）をそれぞれ示す。ＢおよびＣは、様々な
ＤＮＡをXba Ｉで消化し、0.4％（Ｂ）および0.9％
（Ｃ）アガロースゲルで電気泳動したパターンを示す図
面に代わる写真である：レーン１と２はｐＡＬＣ−ＩＬ
−５とｐＭＣｌ−creを２９３細胞にコトランスフェク
ションして産生されたウイルスＤＮＡ；レーン３はｐＦ
Ｇ140を２９３細胞にトランスフェクションして産生さ
れたウイルスＤＮＡ；レーン４はｐＡＬＣ−ＩＬ−５Ｄ
ＮＡ。レーン１と２のＤＮＡはそれぞれ独立したトラン
スフェクションから得られたウイルスから調製した。lo
xＰで挟まれたコスミド配列は9.1kbのＤＮＡ断片に含ま
れている（レーン４、黒三角）。組換えアデノウイルス
ＤＮＡには9.1kbの断片は見られず、2.1kb断片が生じて
いる（レーン１、２、白三角）。レーンＭはサイズマー
カーを泳動しており、そのサイズを左側に示す（kb）。
ベクターＤＮＡの構造を示す模式図である。アデノウイ
ルスゲノム（白いバー）とＩＬ−５とＥＧＦＰの発現カ
セット（黒いバー）の結合したものの中に、Ｃreレコン
ビナーゼによって除去されたコスミド配列のloxＰ（黒
三角）１個が残る。下方の数字はアデノウイルスゲノム
のマップユニット（m.u.）を、上方の数字は組換えアデ
ノウイルスベクターＤＮＡをXba Ｉで消化した場合の断
片の長さ（kb）をそれぞれ示す。ＢおよびＣは、様々な
ＤＮＡをXba Ｉで消化し、0.4％（Ｂ）および0.9％
（Ｃ）アガロースゲルで電気泳動したパターンを示す図
面に代わる写真である：レーン１と２はｐＡＬＣ−ＩＬ
−５とｐＭＣｌ−creを２９３細胞にコトランスフェク
ションして産生されたウイルスＤＮＡ；レーン３はｐＦ
Ｇ140を２９３細胞にトランスフェクションして産生さ
れたウイルスＤＮＡ；レーン４はｐＡＬＣ−ＩＬ−５Ｄ
ＮＡ。レーン１と２のＤＮＡはそれぞれ独立したトラン
スフェクションから得られたウイルスから調製した。lo
xＰで挟まれたコスミド配列は9.1kbのＤＮＡ断片に含ま
れている（レーン４、黒三角）。組換えアデノウイルス
ＤＮＡには9.1kbの断片は見られず、2.1kb断片が生じて
いる（レーン１、２、白三角）。レーンＭはサイズマー
カーを泳動しており、そのサイズを左側に示す（kb）。
【図４】実施例３で構築した組換えアデノウイルスベク
ターのプラーク形成と、プラーク周辺のＥＧＦＰの発現
を示す図面に代わる写真である。ｐＡＬＣ−ＩＬ−５と
ｐＭＣｌ−creをコトランスフェクションした２９３細
胞にはウイルスによるプラークが認められる（写真Ａ、
Ｃ）。また、組換えアデノウイルスベクターを感染した
２９３細胞にもプラークが認められる（写真Ｂ、Ｄ）。
写真Ａ、Ｂの視野を蛍光顕微鏡で観察すると、ＥＧＦＰ
の蛍光が認められる（Ｃ、Ｄ）。
ターのプラーク形成と、プラーク周辺のＥＧＦＰの発現
を示す図面に代わる写真である。ｐＡＬＣ−ＩＬ−５と
ｐＭＣｌ−creをコトランスフェクションした２９３細
胞にはウイルスによるプラークが認められる（写真Ａ、
Ｃ）。また、組換えアデノウイルスベクターを感染した
２９３細胞にもプラークが認められる（写真Ｂ、Ｄ）。
写真Ａ、Ｂの視野を蛍光顕微鏡で観察すると、ＥＧＦＰ
の蛍光が認められる（Ｃ、Ｄ）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (12)
- 【請求項１】 Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を
欠失させたアデノウイルスゲノムＤＮＡのいずれかの欠
失部位に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコス
ミド配列と発現カセットとを挿入結合して組換えコスミ
ドアデノウイルスベクターを作製し、この組換えコスミ
ドアデノウイルスベクターとレコンビナーゼ発現ベクタ
ーとをアデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にコトラ
ンスフェクションし、細胞中において組換えコスミドア
デノウイルスベクターからコスミドベクター配列を除去
することによって、アデノウイルスゲノムＤＮＡおよび
発現カセットからなるＤＮＡ配列を有する組換えアデノ
ウイルスベクターを作製することを特徴とする組換えア
デノウイルスベクターの作製方法。 - 【請求項２】 レコンビナーゼがCreレコンビナーゼで
あり、その認識配列がloxＰ配列である請求項１の作製
方法。 - 【請求項３】 レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼ
であり、その認識配列がＦＲＴ配列である請求項１の作
製方法。 - 【請求項４】 アデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞
が、ヒト胎児腎細胞由来２９３細胞である請求項１から
請求項３のいずれかの作製方法。 - 【請求項５】 Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を
欠失させたアデノウイルスゲノムＤＮＡのいずれかの欠
失部位に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコス
ミド配列と発現カセットとを挿入結合して組換えコスミ
ドアデノウイルスベクターを作製し、この組換えコスミ
ドアデノウイルスベクターを、レコンビナーゼおよびア
デノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にトランスフェク
ションし、細胞中において組換えコスミドアデノウイル
スベクターからコスミドベクター配列を除去することに
よって、アデノウイルスゲノムＤＮＡおよび発現カセッ
トからなるＤＮＡ配列を有する組換えアデノウイルスベ
クターを作製することを特徴とする組換えアデノウイル
スベクターの作製方法。 - 【請求項６】 レコンビナーゼがCreレコンビナーゼで
あり、その認識配列がloxＰ配列である請求項５の作製
方法。 - 【請求項７】 レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼ
であり、その認識配列がＦＲＴ配列である請求項５の作
製方法。 - 【請求項８】 レコンビナーゼおよびアデノウイルスＥ
１タンパク質産生細胞が、レコンビナーゼを産生するヒ
ト胎児腎細胞由来２９３細胞である請求項５から７のい
ずれかの作製方法。 - 【請求項９】 Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を
欠失させたアデノウイルスゲノムＤＮＡの欠失部位に、
レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコスミド配列が
挿入結合されていることを特徴とするコスミドアデノウ
イルスベクター。 - 【請求項１０】 レコンビナーゼがCreレコンビナーゼ
であり、その認識配列がloxＰ配列である請求項９のコ
スミドアデノウイルスベクター。 - 【請求項１１】 レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナー
ゼであり、その認識配列がＦＲＴ配列である請求項９の
コスミドアデノウイルスベクター。 - 【請求項１２】 ＦＬＰレコンビナーゼを産生するヒト
胎児腎細胞由来２９３細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000215011A JP4489257B2 (ja) | 1999-07-19 | 2000-07-14 | 組換えアデノウイルスベクターの作製方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11-205355 | 1999-07-19 | ||
| JP20535599 | 1999-07-19 | ||
| JP2000215011A JP4489257B2 (ja) | 1999-07-19 | 2000-07-14 | 組換えアデノウイルスベクターの作製方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001086986A true JP2001086986A (ja) | 2001-04-03 |
| JP2001086986A5 JP2001086986A5 (ja) | 2006-10-26 |
| JP4489257B2 JP4489257B2 (ja) | 2010-06-23 |
Family
ID=16505505
Family Applications (1)
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