JP4489257B2 - 組換えアデノウイルスベクターの作製方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、組換えアデノウイルスベクターの作製方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、哺乳動物細胞への遺伝子導入に有用な組換えアデノウイルスベクターの作製方法と、この方法に用いる遺伝子操作材料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、分子生物学や分子遺伝学等における知識の蓄積や様々な技術開発により生命科学は大きく発展し、生命現象に関して多くの情報が得られるようになってきている。種々の分野において活発な研究開発が行われているが、中でも、遺伝子機能の解析は大きな比重を占めており、単離した遺伝子を細胞や生物個体に導入するための様々な技術やそのためのベクターが開発されている。
【０００３】
哺乳類の細胞への遺伝子導入に用いられるベクターも数多く開発されているが、最近はウイルスを利用したベクター（ウイルスベクター）が注目されている。特に、アデノウイルスベクターは分裂する細胞だけでなく、非分列細胞にも感染し、高いウイルス価に調製することができ、しかも様々な組合せのエンハンサーおよびプロモーターの制御下で目的の遺伝子を発現させることができるため、遺伝子治療への応用も検討されている。
【０００４】
これまでに、組換えアデノウイルスベクターの作製法として、in vivo相同組換えを利用した方法やin vitroでライゲーションする方法など、多くの方法が開発されている。また、アデノウイルスゲノムのＥ１領域を欠損させたベクターを用いると、導入した遺伝子は発現するが感染性ウイルス粒子は産生されないため、特に遺伝子治療等における有用な遺伝子導入手段として利用されている。
【０００５】
このように、他のウイルスベクターと比較して多くの利点を持つアデノウイルスベクターではあるが、ウイルスゲノムが36kbと長いため、実際の組換えベクターの構築においては、手順が複雑であったり作製効率が低いといった問題がある。例えば、Ｅ１領域を置き換えた組換えアデノウイルスベクターの作製方法としては、２つのプラスミド間での哺乳動物細胞（例えば２９３細胞）におけるin vivo相同組換えを利用した方法（例えば、Virology 163:614-617, 1988；Nucleic Acids Res. 26:3687-3693, 1998）が知られている。これらの方法の場合、第１のプラスミドはアデノウイルスゲノムの５’端ＩＴＲ（inverted terminal repeat）、パッケージングシグナル、目的の遺伝子およびウイルスゲノムの任意部分を含み、第２のプラスミドは、第１プラスミドと重なるウイルスゲノム部分と３’端ＩＴＲを含む残りのウイルスゲノムを保有している。しかしながら、哺乳動物細胞における相同組換えの起こる頻度はかなり低いため、これらの方法では哺乳動物細胞への両プラスミドのトランスフェクションを大量に行う必要がある。
【０００６】
また、別の方法として、ＣＯＳ−ＴＰＣ法が提案されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1320-1324, 1996）。これは、全長のアデノウイルスゲノムと目的遺伝子の発現ユニットとを含むコスミドベクターと、制限酵素で消化したウイルスＤＮＡ−ＴＰＣ（terminal protein complex）を同時に哺乳動物細胞にトランスフェクションする方法である。この方法は、ウイルスＤＮＡ−ＴＰＣを用いることによって、目的の組換えアデノウイルスベクターを効率よく回収することができる。しかしながら、この方法の場合には、アデノウイルスゲノムを制限酵素で消化することによってアデノウイルス親株の出現を防止してはいるものの、その除去は完全でなく、安全性の点で問題がある。
【０００７】
さらに別の方法としては、Ｃre−loxＰ組換えシステムを応用した組換えアデノウイルスベクターの作製法が報告されてもいる（J. Virol. 71:1842-1849, 1997）。この方法は、Ｃreレコンビナーゼが働くことによって、ドナーとなるアデノウイルスと、発現カセットを持つシャトルプラスミドとの間での分子間組換えを生じさせる方法であり、効率よく組換えアデノウイルスベクターを作製することができる。しかしながら、この発明の場合には、ドナーウイルスを用意する必要があり、またドナーウイルスが最終的なウイルス試料に残存する可能性がある。
【０００８】
その他にも、コスミドベクターを用いてin vitroで全アデノウイルスゲノムを再構築する試みがなされているが、哺乳動物細胞へのトランスフェクションの前に複雑なＤＮＡ作製過程が必要であり、実用的なものではない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおりの組換えアデノウイルスベクターの作製法に関する様々な報告や提案より以前に、Grahamは、アデノウイルス５型のＥ１領域に１カ所のみ存在する制限酵素ＸbaＩサイトに小さなプラスミドを挿入して構築した環状ＤＮＡを哺乳動物細胞（２９３細胞）にトランスフェクションすると、この環状ＤＮＡはウイルスＤＮＡと同様の効率で感染性ウイルスを産生することを報告している（EMBO J. 3:2917-2922, 1984）。
【００１０】
この報告は、環状アデノウイルスＤＮＡのＥ１領域あるいはＥ３領域を外来性遺伝子に置き換えることによって、組換えアデノウイルスベクターが簡単に作製できることを示しているが、実際にこの方法で組換えアデノウイルスベクターを構築するに当たっては２つの問題が存在した。一つは、アデノウイルスゲノムＤＮＡを含む非常に大きなプラスミドに発現カセットを組み込む効率の低さであり、もう一つの問題は、作製されたアデノウイルスベクターにプラスミドＤＮＡ部分が残ることである。
【００１１】
この出願の発明は、以上のとおりの従来技術の現状に鑑みてなされたものであって、組換えアデノウイルスベクターを簡便かつ高効率で作製することのできる新しい方法と、この発明を実施するための遺伝子操作材料を提供することを課題としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するため、以下の(1)から(12)の発明を提供する。
(1) Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失させたアデノウイルスゲノムＤＮＡのいずれかの欠失部位に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコスミド配列と発現カセットとを挿入結合して組換えコスミドアデノウイルスベクターを作製し、この組換えコスミドアデノウイルスベクターとレコンビナーゼ発現ベクターとをアデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にコトランスフェクションし、細胞中において組換えコスミドアデノウイルスベクターからコスミドベクター配列を除去することによって、アデノウイルスゲノムＤＮＡおよび発現カセットからなるＤＮＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターを作製することを特徴とする組換えアデノウイルスベクターの作製方法。
(2) レコンビナーゼがCreレコンビナーゼであり、その認識配列がloxＰ配列である前記(1)の作製方法。
(3) レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼであり、その認識配列がＦＲＴ配列である前記(1)の作製方法。
(4) アデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞が、ヒト胎児腎細胞由来２９３細胞である前記(1)から(3)のいずれかの作製方法。
(5) Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失させたアデノウイルスゲノムＤＮＡのいずれかの欠失部位に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコスミド配列と発現カセットとを挿入結合して組換えコスミドアデノウイルスベクターを作製し、この組換えコスミドアデノウイルスベクターを、レコンビナーゼおよびアデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にトランスフェクションし、細胞中において組換えコスミドアデノウイルスベクターからコスミドベクター配列を除去することによって、アデノウイルスゲノムＤＮＡおよび発現カセットからなるＤＮＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターを作製することを特徴とする組換えアデノウイルスベクターの作製方法。
(6) レコンビナーゼがCreレコンビナーゼであり、その認識配列がloxＰ配列である前記(5)の作製方法。
(7) レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼであり、その認識配列がＦＲＴ配列である前記(5)の作製方法。
(8) レコンビナーゼおよびアデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞が、レコンビナーゼを産生するヒト胎児腎細胞由来２９３細胞である前記(5)から(7)のいずれかの作製方法。
(9) Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失させたアデノウイルスゲノムＤＮＡの欠失部位に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコスミド配列が挿入結合されていることを特徴とするコスミドアデノウイルスベクター。
(10) レコンビナーゼがCreレコンビナーゼであり、その認識配列がloxＰ配列である前記(9)のコスミドアデノウイルスベクター。
(11) レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼであり、その認識配列がＦＲＴ配列である前記(9)のコスミドアデノウイルスベクター。
(12) ＦＬＰレコンビナーゼを産生するヒト胎児腎細胞由来２９３細胞。
【００１３】
すなわち、この出願の前記発明においては、「コスミド配列」とは、両端に同方向のレコンビナーゼ認識配列を有する直鎖状のコスミドベクター配列を意味する。また、「コスミドアデノウイルスベクター」とは、Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失したアデノウイルスゲノムＤＮＡと前記コスミド配列とからなる環状ＤＮＡコンストラクトを意味する。さらに、「組換えコスミドアデノウイルスベクター」とは、前記コスミドアデノウイルスベクターに発現カセットを組み込んだ環状ＤＮＡコンストラクトを意味する。さらにまた、「組換えアデノウイルスベクター」とは、前記組換えコスミドアデノウイルスベクターからコスミド配列が除去された直鎖状ＤＮＡ配列を感染性粒子内に組み込んだアデノウイルスを意味する。
【００１４】
以下、この出願の発明について、その実施の形態を詳しく説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
この出願の前記(1)および(5)の組換えアデノウイルスベクターの作製方法においては、前記(9)のコスミドアデノウイルスベクターを使用する。このコスミドアデノウイルスベクターの調製において、アデノウイルスゲノムＤＮＡ（約36kb）は公知のクローン（例えば、実施例で使用したｐＦＧ１４０等）を利用することができる。そして、このゲノムＤＮＡを適当な制限酵素やヌクレアーゼ等で処理することによって、そのＥ１領域（約2.0kb）もしくはＥ１領域とＥ３領域（約3.0kb）の両方を欠失させたＤＮＡ断片（約31〜34kb）を得ることができる。このＤＮＡ断片を、開裂して直鎖状にしたコスミド配列とライゲーションし、環状ＤＮＡコンストラクトを形成する。コスミドベクターは大腸菌λファージのcos部位を有するプラスミドであり、30〜42kbの外来ＤＮＡを挿入することができるため、前記の約34kbのＤＮＡ断片を収納することができる。このコスミド配列はまた、両端にレコンビナーゼ認識配列を有している。この認識配列は、使用するレコンビナーゼの種類によって決定され、例えば、Ｃreレコンビナーゼの場合にはloxＰ配列を、また、ＦＬＰレコンビナーゼの場合にはＦＲＴ配列を用いることができる。例えば、loxＰ配列は34bpの配列であり、公知のクローン（例えば、実施例で使用したｐＢＳ246：GIBCO BRL社製等）から切り出して用いることができる。また、ＦＲＴ配列は公知のクローンｐＮＥＯβＧＡＬ（Stratagene社製等）から切り出して用いることができる。さらに、コスミド配列のレコンビナーゼ認識配列の外側には、アデノウイルスゲノムＤＮＡ接続部位以外に、少なくとも１カ所のクローニングサイト（制限酵素部位）を有するＤＮＡ配列を延長させるのが好ましい。
【００１６】
この出願の前記(1)および(5)の組換えアデノウイルスベクター作製方法においては、以上のとおりに調製した環状のコスミドアデノウイルスベクターに、外来遺伝子を含む発現カセットを挿入結合し、組換えコスミドアデノウイルスベクターを調製する。発現カセットは、プロモーター配列、外来遺伝子（ｃＤＮＡ）およびポリAシグナル等からなるＤＮＡ断片である。
【００１７】
なお、この出願の前記(1)および(5)の方法発明においては、予めコスミドベクター配列と発現カセットを連結し、これと前記アデノウイルスＤＮＡ断片とをライゲーションして組換えコスミドアデノウイルスベクターとすることもできる。あるいは、外来遺伝子（ｃＤＮＡ）を含まない発現カセットを挿入したコスミドアデノウイルスベクターを作製し、この発現カセット内に外来遺伝子（ｃＤＮＡ）を組み込んで組換えコスミドアデノウイルスベクターとすることもできる。
【００１８】
この出願の前記(1)の発明方法は、次いで、これらの組換えコスミドアデノウイルスベクターを、レコンビナーゼ発現ベクターとともに、アデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にコトランスフェクトする。レコンビナーゼ発現ベクターとしては、例えば、ＣreレコンビナーゼまたはＦＬＰレコンビナーゼ発現ベクターを使用することができる。ＣreレコンビナーゼはloxＰ配列を認識し、２つのloxＰ配列に挟まれたDNA配列を切り出す（Nucleic Acids Res. 17:147-161, 1989）。また、ＦＬＰレコンビナーゼはＦＲＴ配列を認識し、２つのＦＲＴ配列に挟まれたＤＮＡ配列を切り出す（Trends Genet. 9:413-421, 1993）。従って、これらのレコンビナーゼ発現ベクターと前記の組換えコスミドアデノウイルスベクターとを共にホスト細胞に導入すると、レコンビナーゼの作用によって環状ＤＮＡのloxＰ配列またはＦＲＴ配列に挟まれたコスミドベクター配列が切り出され、アデノウイルスゲノムＤＮＡと発現カセットとからなる直鎖状ＤＮＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターが作製される。
【００１９】
Creレコンビナーゼ発現ベクターとしては、公知のクローン（例えば、実施例で使用したMC1-creプラスミド等）を使用することができる。また、ＦＬＰレコンビナーゼ発現ベクターとしては、ｐＯＧ４４（Stratagene社製）等を用いることができる。
【００２０】
アデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞としてはヒト胎児腎細胞由来２９３細胞が好ましいが、これに限定されるものではなく、例えば、予めＥ１タンパク質遺伝子を導入したHeLa細胞や正常細胞等を用いることができる。あるいはまた、Ｅ１タンパク質遺伝子を導入したトランスジェニック動物から単離した細胞を用いることもできる。
【００２１】
一方、この出願の前記(5)の発明方法においては、前記のとおりに作製した組換えコスミドアデノウイルスベクターを、レコンビナーゼおよびアデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にトランスフェクトする。すなわち、この方法では、ホスト細胞がレコンビナーゼを恒常的に産生しているために、組換えコスミドアデノウイルスベクターのみをトランスフェクションすることによって、ホスト細胞が産生するレコンビナーゼの作用により環状ＤＮＡのレコンビナーゼ認識配列に挟まれたコスミドベクター配列が切り出され、アデノウイルスゲノムＤＮＡと発現カセットとからなる直鎖状ＤＮＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターが作製される。なお、レコンビナーゼおよびＥ１タンパク質産生細胞としては、例えば、文献公知のCreレコンビナーゼ産生２９３細胞（J. Virol. 71:1842-1849, 1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:13565-13570, 1996）や、後記する実施例に示した方法によって作製されるＣreレコンビナーゼ産生２９３細胞を用いることができる。また、この出願によって新たに提供される前記(12)のＦＬＰレコンビナーゼ産生２９３細胞を用いることができる。さらには、予めE1タンパク質遺伝子とレコンビナーゼ遺伝子とを導入したHeLa細胞や正常細胞、あるいはE1タンパク質遺伝子とレコンビナーゼ遺伝子とを導入したトランスジェニック動物から単離した細胞等を用いることもできる。
【００２２】
このようにして作製した組換えアデノウイルスベクターの全長は、野生型アデノウイルスと同様の36kb前後であり、様々な動物細胞に対して高い感染力を有している。
【００２３】
なお、この前記発明(12)のＦＬＰ コンビナーゼ産生293細胞は、公知の方法によって作製することができる。例えば、ＦＬＰレコンビナーゼをコードするＤＮＡ断片を動物細胞用発現ベクターに組込み、このベクターを293細胞に導入することによって、ＦＬＰレコンビナーゼ産生293細胞を作製することができる。ＦＬＰレコンビナーゼをコードするＤＮＡ断片は、公知の発現ベクターpOG44（Stratagene社製）等から切り出して使用することができる。また、動物細胞用発現ベクターには、前記のベクターpOG44を直接使用することができる他、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する公知のベクターを使用することができる。発現ベクターを293細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。さらに、ＦＬＰレコンビナーゼ発現ベクターには、ピューロマイシン等の薬剤耐性遺伝子を併せて組み込み、ベクターが導入された細胞の選択マーカーとすることもできる。
【００２４】
以下、実施例を示してこの出願の発明を詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００２５】
【実施例】
実施例１：コスミドアデノウイルスベクターの構築
コスミドベクターSuperCos１はStragene社(La Jolla,ＣＡ）より、loxＰ配列を含むプラスミドｐＢＳ246はGIBCO BRL社（Rockville, MD）より購入した。ｐＢS246のloxＰで挾まれる領域中のHind IIIサイトをXba Iへ、BamHＩサイトをSwa Iへ変更した。これをNot Iで切断し、２個のloxＰを持つ260bpの断片を分離した。SuperCos Iに１か所あるXba Iサイトは予め破壊しておき、Not lで切断したところに２個のloxＰを持つ260bpの断片を挿入し、コスミドベクター配列（ｐＬＣコスミド）を調製した。
【００２６】
アデノウイルスゲノムＤＮＡはｐＦＧ140から調製した。ｐＦＧ140はアデノウイルス５dl309の全ゲノムが環状に連結しており、そのＥ１領域のXba Ｉサイトに2.2kbのベクター部分を持つプラスミドであるが、このＥ１領域の681〜2559bp（ゲノム５‘端より）をBal31ヌクレアーゼによって欠失させ、そこにXba Ｉサイトを再構築した。
【００２７】
Ｅ１領域を欠失したアデノウイルスＤＮＡと前記ｐＬＣコスミドをそれぞれXba Ｉ切断し、ライゲーションした後、in vitroパッケージングによりバクテリオファージラムダの頭部に収容し、41kbのコスミドアデノウイルスベクター（ｐＡＬＣコスミド）を作製した（図１参照）。
実施例２：組換えコスミドアデノウイルスベクターの構築
様々なタイプの細胞で強く働くことが知られているＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルス初期エンハンサー・ニワトリβアクチンプロモーターのハイブリッド）の下流にマウスインターロイキン５（mlL-5）、ＥＭＣウイルス由来ｌＲＥＳ（lnternal ribosome entry site）、ｐＥＧＦＰ−ＮＩプラスミド由来ＥＧＦＰ（enhanced green fluorescent protein）ｃＤＮＡを結合し、その両端にSwa Ｉサイトを付加してＤＮＡ断片を調製し、このＤＮＡ断片をカナマイシン耐性のｐＨＳＧ２９８由来のベクターに組み込んだのち、この組換えベクターからSwa Ｉ断片を切り出して発現カセット（4.2kb）を調製した。
【００２８】
この発現カセットを、実施例１で構築したｐＡＬＣコスミドのSwa Ｉサイトに挿入した後、in vitroパッケージングによりバクテリオファージラムダの頭部に組み込み、組換えコスミドアデノウイルスベクター（ｐＡＬＣ−ＩＬ−５）を構築した。このベクターを大腸菌ＤＨ１０Ｂを用いて大量調整・精製し、回収した。
実施例３：組換えアデノウイルスベクターの構築
実施例２で構築した組換えコスミドアデノウイルスベクター（ｐＡＬＣ−ＩＬ−５）とＣreレコンビナーゼ発現ベクター（ＭＣ１−creプラスミド）とを、恒常的にアデノウイルスＥ１タンパク質を産生しているヒト胎児腎細胞由来の２９３細胞にコトランスフェクションした。２９３細胞の培養液は非働化10％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ（Minimum Essential Medium）を用い、ゼラチンで表面をコートしたシャーレ、あるいはマルチプレートを使用した。
【００２９】
１μgのｐＡＬＣ−ＩＬ−５と、0.1μgのＭＣ１−creプラスミドを１２穴マルチプレートにまいた２９３細胞にLIPOFECTAMINE（GIBCO BRL社製）を用いてコトランスフェクションした（図２参照）。
【００３０】
細胞変性効果（ＣＰＥ）はプラーク形成により10日以内で観察された。ＣＰＥの観察されたプレートの培養上清を2,000rpm、５分間、４℃で遠心し、その上清を75cm2のフラスコにまいた２９３細胞に加え感染させた。数日後、全面にＣＰＥが確認できたフラスコについて、細胞を集め凍結・融解を６回繰り返したものを3,500rpm、10分間、４℃で遠心し、その上清中に含まれる組換えアデノウイルスベクターの力価を測定した。測定は、ゼラチンコートした９６穴マルチプレートに播いた２９３細胞に段階希釈したウイルス懸濁液を加え培養し、ＣＰＥの有無を観察した結果から算定した。
【００３１】
また、コントロールとして、ｐＡＬＣ−ＩＬ−５のみを２９３細胞にトランスフェクションし、同様にプラーク形成を観察した。
【００３２】
その結果、Ｃreレコンビナーゼが存在しないコントロール条件の場合、別々にトランスフェクションした８穴の２９３細胞のいずれにもプラークは認められなかった。これはｐＡＬＣ−ＩＬ−５ＤＮＡはその長さが45kbであり、感染性アデノウイルス粒子が収容できる長さを超えているため、ウイルスが産生されなかったことを示している。一方、Ｃreレコンビナーゼ発現ベクターと共にトランスフェクションした場合には、８日以内に８穴の２９３細胞のすべてにおいてＣＰＥが認められた。それぞれについて繰り返し検討した結果、Ｃｒｅが共存する場合、合計２２穴の細胞のすべてでプラークを確認した。
【００３３】
以上の結果により、一過性に発現するＣreレコンビナーゼによってｐＡＬＣ−ＩＬ−５のコスミド配列が効率よく除去され、その結果形成される発現カセットを含む38kbの環状アデノウイルスベクターゲノムから、感染性の組換えアデノウイルスベクターが産生されたことが確認された。
実施例４：ウイルスＤＮＡの解析
実施例３で構築した組換えアデノウイルスベクターからコスミド配列が除かれているかどうかを確かめるため、そのＤＮＡの構造を解析した。
【００３４】
ウイルス懸濁液を１％ＳＤＳ、0.2mg/mlプロテアーゼＫ、10mM ＥＤＴＡで37℃、３時間消化し、フェノール、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿したものをアガロースゲルで電気泳動し、ゲルからウイルスＤＮＡを抽出・精製した。ウイルスＤＮＡをXba Ｉで消化し、0.4％および0.9％のアガロースゲルを用いて電気泳動した。
【００３５】
図３Ａは組換えアデノウイルスベクターゲノムの構造とその中のXba Ｉサイトを示す。組換えアデノウイルスベクターの懸濁液から精製したウイルスＤＮＡをXba Ｉで消化し、0.4％アガロースゲル（図３Ｂ、レーン１、２）、あるいは0.9％ゲル（図３Ｃ、レーン１、２）で電気泳動した。レーン１、２のウイルスＤＮＡは別々にトランスフェクションした細胞から調製した。次にｐＡＬＣ−ＩＬ−５ＤＮＡをXba Ｉで消化し同様に電気泳動した。loxP配列で挟まれたコスミド配列を含むXba Ｉ断片は9.1kbとして認められるが（図３Ｂ、Ｃ、レーン４）、組換えアデノウイルスベクターのＤＮＡにおいては2.1kbの断片として認められ（図３Ｃ、レーン１、２）、その差はｐＡＬＣ中のloxＰで挟まれたコスミド配列（約７kb）に相当する。この結果により、ｐＡＬＣ−ＩＬ−５中のコスミド配列はＣreレコンビナーゼの一過性発現によって効率よく除去され、その結果形成された発現カセットを含む３８ｋｂの環状アデノウイルスゲノムが増幅してウイルス粒子に収容され、感染性の組換えアデノウイルスベクターが産生されたことが確認された。予想される大きさ以外のＤＮＡ断片は認められず、この方法による組換えアデノウイルスベクター構築過程においては、異常な組換えはほとんど起こらないことも確認された。コントロールとして、アデノウイルスゲノムのクローンｐＦＧ140をトランスフェクションした２９３細胞のＤＮＡをXba Ｉで消化した場合は、予想された34.6kb、2.2kbおよび1.3kbの各断片が認められた（図３Ｂ、Ｃ、レーン３）。
実施例５：発現カセットに含まれる遺伝子の発現
ＩＬ−５の発現を確認するため、感染細胞の培養液を回収、遠心し、その上清中のＩＬ−５活性をＥＬＩＳＡ法で検討した。また、ＥＧＦＰの発現は蛍光顕微鏡で観察することにより検討した。
【００３６】
２９３細胞に組換えコスミドアデノウイルスベクターｐＡＬＣ−ＩＬ−５とｐＭＣｌ−creをコトランスフェクションすると、多くの細胞がＥＧＦＰ陽性となり、ウイルスのプラークが発達するに従い、すべてのプラークの周辺に強いＥＧＦＰ蛍光が認められた（図４Ａ、Ｃ）。
【００３７】
次に実施例３で構築した組換えアデノウイルスベクターの懸濁液を希釈し、２９３細胞に感染させプラークを形成させた。30個以上のプラークを調べ、そのすべてがＥＧＦＰ陽性細胞で囲まれていることを観察した（図４Ｂ、Ｄ）。ＩＬ−５とＥＧＦＰはＣＡＧプロモーターによってbicistronicに転写されることを考えると、ＥＧＦＰを発現するアデノウイルスベクターはＩＬ−５もまた発現することが予想される。そこでＩＬ−５の発現を確かめるために、９６穴マルチプレートにまいた２９３細胞に限界希釈したウイルス懸濁液を加え、別々のウイルスクローンを増殖させた。10個のウイルスクローンについて調べたところ、すべてＥＧＦＰは陽性であった。その培養上清のＩＬ−５活性をＥＬＩＳＡ法を用いて検討した結果、それぞれ高い価を示した（＞10μg/ml）。
【００３８】
以上の結果は、この出願の発明方法が、きわめて均一な組換えアデノウイルスベクターを産生することが可能であり、このベクターにより動物細胞中で導入遺伝子を確実に発現させることが可能であることを示している。
実施例６：Ｃreレコンビナーゼ産生２９３細胞の作製
Ｃreレコンビナーゼ遺伝子とＥＭＣウイルス由来のＩＲＥＳ（Internal ribosome entry site）配列およびピューロマイシン耐性遺伝子をｐＣＡＧＧＳ（Gene 108(2):193-199, 1991）のＥcoＲＩサイトに挿入してＣreレコンビナーゼ発現プラスミドｐCAGGS−cre−puroを構築し、２９３細胞にトランスフェクトし、２μgのピューロマイシン／ml含有培地で培養した。ピューロマイシン耐性コロニーを単離し、２９３細胞にレポータープラスミドｐＣＡＧ−ＣＡＴ−ＺをトランスフェクションすることによってＣreレコンビナーゼ活性をテストした。すなわちこのレポータープラスミドは、ＣＡＧプロモーターとlacＺ遺伝子の間に、loxＰ配列で挟まれたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子が挿入されており、Ｃreレコンビナーゼの作用によってＣＡＴ遺伝子が切り出されるとlacＺが発現されるため、２９３細胞のＣreレコンビナーゼ産生をテストすることができる（Biochem. Biophys. Res. Commun. 17(2):393-401, 1995）。このテストによって、Ｃreレコンビナーゼ産生能を有する細胞株２９３cre15を得た。
実施例７：２９３cre15における組換えアデノウイルスベクターの作製
実施例２で構築した組換えコスミドアデノウイルスベクター（ｐＡＬＣ−ＩＬ−５）１μg/wellを、実施例６で作製した２９３cre15にトランスフェクションした。９穴のトランスフェクション細胞の全てにおいてＣＰＥが観察され、ＣＰＥの全スポットには強いＥＧＦＰが観られた。
【００３９】
これらの結果から、レコンビナーゼ産生２９３細胞を用いることにより、レコンビナーゼ発現ベクターを使用せずとも、組換えコスミドアデノウイルスベクターから効率よく組換えアデノウイルスベクターが作製可能であることが確認された。
実施例８：ＦＬＰ コンビナーゼ産生293細胞の作製
ＦＬＰレコンビナーゼ遺伝子とＥＭＣウイルス由来のＩＲＥＳ（Internal ribosome entry site）配列およびピューロマイシン耐性遺伝子をpgk（phosphoglycerate kinase）プロモーターの下流に挿入してＦＬＰレコンビナーゼ発現プラスミドpgk-FLP-puroを構築し、293細胞にトランスフェクトし、２μgのピューロマイシン／ml含有培地で培養した。ピューロマイシン耐性コロニーを単離し、293細胞にレポータープラスミドpＮＥＯβＧＡＬをトランスフェクションすることによってＦＬＰレコンビナーゼ活性をテストした。すなわちこのレポータープラスミドは、ＳＶ40プロモーターの下流のlacＺ遺伝子の途中に、ＦＲＴ配列で挟まれたネオマイシン耐性遺伝子が挿入されており、ＦＬＰレコンビナーゼの作用によってネオマイシン耐性遺伝子が切り出されるとlacＺが発現されるため、293細胞のＦＬＰレコンビナーゼ産生をテストすることができる。このテストによって、ＦＬＰレコンビナーゼ産生能を有する細胞株293ＦＬＰを得た。
【００４０】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、哺乳動物細胞に感染力を有する組換えアデノウイルスベクターを簡便かつ効率よく作製することが可能となる。例えば、従来の相同組換えを用いた組換えアデノウイルスベクターの作製方法では、予想外の組換えベクターが製造される危険性があり、また、製造過程が複雑で長時間の工程を必要とするが、この発明の方法は複雑な作業工程を必要とせず、しかも所望の構造と機能とを有する組換えベクターを確実に製造することが可能である。また、従来の相同組換えを用いた方法では、使用する２９３細胞の継代数が50以下である必要があるが、この出願の発明方法では、少なくとも70代以上継代した２９３細胞を用いても組換えアデノウイルスベクターの製造が可能である。
【００４１】
従って、この出願の発明により提供される方法および材料によって、哺乳動物細胞を用いた遺伝子機能解析が促進される。また、遺伝子治療のためのベクター開発も促進される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で構築したコスミドアデノウイルスベクターｐＡＬＣ（上）と発現カセット（下）の構造を示す模式図である。34kbのアデノウイルスゲノムＤＮＡは白い環で、ゲノムの方向は矢印で示す。７kbのコスミドベクターは黒三角で示すloxＰ配列で挟まれており、その中にcos部位、カナマイシン耐性遺伝子（Km）、大腸菌ori、アンピシリン耐性遺伝子（Ap）を含む。発現カセットはＣＡＧプロモーター、マウスＩＬ−５ｃＤＮＡ、ＩＲＥＳ、ＥＧＦＰｃＤＮＡ、ポリＡ添加シグナル（pA）から成る。発現カセットはｐＡＬＣベクターのSwa Ｉサイトに挿入され、実施例２の組換えコスミドアデノウイルスベクターｐＡＬＣ−ＩＬ−５が構築される。
【図２】 実施例３で構築した組換えアデノウイルスベクターの作業工程の概要を示す模式図である。実施例２のｐＡＬＣ−ＩＬ−５を大腸菌ＤＨ10Ｂを用いて増殖・精製し、ｐＭＣｌ−creプラスミドと共に２９３細胞にトランスフェクションした。一過性に発現するＣreレコンビナーゼは、効率よく７kbのコスミド配列を切り出し、最終的に、ＩＬ−５とＥＧＦＰの発現カセットを含む感染性の組換えアデノウイルス粒子が産生された。
【図３】Ａは実施例３で構築した組換えアデノウイルスベクターＤＮＡの構造を示す模式図である。アデノウイルスゲノム（白いバー）とＩＬ−５とＥＧＦＰの発現カセット（黒いバー）の結合したものの中に、Ｃreレコンビナーゼによって除去されたコスミド配列のloxＰ（黒三角）１個が残る。下方の数字はアデノウイルスゲノムのマップユニット（m.u.）を、上方の数字は組換えアデノウイルスベクターＤＮＡをXba Ｉで消化した場合の断片の長さ（kb）をそれぞれ示す。ＢおよびＣは、様々なＤＮＡをXba Ｉで消化し、0.4％（Ｂ）および0.9％（Ｃ）アガロースゲルで電気泳動したパターンを示す図面に代わる写真である：レーン１と２はｐＡＬＣ−ＩＬ−５とｐＭＣｌ−creを２９３細胞にコトランスフェクションして産生されたウイルスＤＮＡ；レーン３はｐＦＧ140を２９３細胞にトランスフェクションして産生されたウイルスＤＮＡ；レーン４はｐＡＬＣ−ＩＬ−５ＤＮＡ。レーン１と２のＤＮＡはそれぞれ独立したトランスフェクションから得られたウイルスから調製した。loxＰで挟まれたコスミド配列は9.1kbのＤＮＡ断片に含まれている（レーン４、黒三角）。組換えアデノウイルスＤＮＡには9.1kbの断片は見られず、2.1kb断片が生じている（レーン１、２、白三角）。レーンＭはサイズマーカーを泳動しており、そのサイズを左側に示す（kb）。
【図４】実施例３で構築した組換えアデノウイルスベクターのプラーク形成と、プラーク周辺のＥＧＦＰの発現を示す図面に代わる写真である。ｐＡＬＣ−ＩＬ−５とｐＭＣｌ−creをコトランスフェクションした２９３細胞にはウイルスによるプラークが認められる（写真Ａ、Ｃ）。また、組換えアデノウイルスベクターを感染した２９３細胞にもプラークが認められる（写真Ｂ、Ｄ）。写真Ａ、Ｂの視野を蛍光顕微鏡で観察すると、ＥＧＦＰの蛍光が認められる（Ｃ、Ｄ）。
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、組換えアデノウイルスベクターの作製方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、哺乳動物細胞への遺伝子導入に有用な組換えアデノウイルスベクターの作製方法と、この方法に用いる遺伝子操作材料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、分子生物学や分子遺伝学等における知識の蓄積や様々な技術開発により生命科学は大きく発展し、生命現象に関して多くの情報が得られるようになってきている。種々の分野において活発な研究開発が行われているが、中でも、遺伝子機能の解析は大きな比重を占めており、単離した遺伝子を細胞や生物個体に導入するための様々な技術やそのためのベクターが開発されている。
【０００３】
哺乳類の細胞への遺伝子導入に用いられるベクターも数多く開発されているが、最近はウイルスを利用したベクター（ウイルスベクター）が注目されている。特に、アデノウイルスベクターは分裂する細胞だけでなく、非分列細胞にも感染し、高いウイルス価に調製することができ、しかも様々な組合せのエンハンサーおよびプロモーターの制御下で目的の遺伝子を発現させることができるため、遺伝子治療への応用も検討されている。
【０００４】
これまでに、組換えアデノウイルスベクターの作製法として、in vivo相同組換えを利用した方法やin vitroでライゲーションする方法など、多くの方法が開発されている。また、アデノウイルスゲノムのＥ１領域を欠損させたベクターを用いると、導入した遺伝子は発現するが感染性ウイルス粒子は産生されないため、特に遺伝子治療等における有用な遺伝子導入手段として利用されている。
【０００５】
このように、他のウイルスベクターと比較して多くの利点を持つアデノウイルスベクターではあるが、ウイルスゲノムが36kbと長いため、実際の組換えベクターの構築においては、手順が複雑であったり作製効率が低いといった問題がある。例えば、Ｅ１領域を置き換えた組換えアデノウイルスベクターの作製方法としては、２つのプラスミド間での哺乳動物細胞（例えば２９３細胞）におけるin vivo相同組換えを利用した方法（例えば、Virology 163:614-617, 1988；Nucleic Acids Res. 26:3687-3693, 1998）が知られている。これらの方法の場合、第１のプラスミドはアデノウイルスゲノムの５’端ＩＴＲ（inverted terminal repeat）、パッケージングシグナル、目的の遺伝子およびウイルスゲノムの任意部分を含み、第２のプラスミドは、第１プラスミドと重なるウイルスゲノム部分と３’端ＩＴＲを含む残りのウイルスゲノムを保有している。しかしながら、哺乳動物細胞における相同組換えの起こる頻度はかなり低いため、これらの方法では哺乳動物細胞への両プラスミドのトランスフェクションを大量に行う必要がある。
【０００６】
また、別の方法として、ＣＯＳ−ＴＰＣ法が提案されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1320-1324, 1996）。これは、全長のアデノウイルスゲノムと目的遺伝子の発現ユニットとを含むコスミドベクターと、制限酵素で消化したウイルスＤＮＡ−ＴＰＣ（terminal protein complex）を同時に哺乳動物細胞にトランスフェクションする方法である。この方法は、ウイルスＤＮＡ−ＴＰＣを用いることによって、目的の組換えアデノウイルスベクターを効率よく回収することができる。しかしながら、この方法の場合には、アデノウイルスゲノムを制限酵素で消化することによってアデノウイルス親株の出現を防止してはいるものの、その除去は完全でなく、安全性の点で問題がある。
【０００７】
さらに別の方法としては、Ｃre−loxＰ組換えシステムを応用した組換えアデノウイルスベクターの作製法が報告されてもいる（J. Virol. 71:1842-1849, 1997）。この方法は、Ｃreレコンビナーゼが働くことによって、ドナーとなるアデノウイルスと、発現カセットを持つシャトルプラスミドとの間での分子間組換えを生じさせる方法であり、効率よく組換えアデノウイルスベクターを作製することができる。しかしながら、この発明の場合には、ドナーウイルスを用意する必要があり、またドナーウイルスが最終的なウイルス試料に残存する可能性がある。
【０００８】
その他にも、コスミドベクターを用いてin vitroで全アデノウイルスゲノムを再構築する試みがなされているが、哺乳動物細胞へのトランスフェクションの前に複雑なＤＮＡ作製過程が必要であり、実用的なものではない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおりの組換えアデノウイルスベクターの作製法に関する様々な報告や提案より以前に、Grahamは、アデノウイルス５型のＥ１領域に１カ所のみ存在する制限酵素ＸbaＩサイトに小さなプラスミドを挿入して構築した環状ＤＮＡを哺乳動物細胞（２９３細胞）にトランスフェクションすると、この環状ＤＮＡはウイルスＤＮＡと同様の効率で感染性ウイルスを産生することを報告している（EMBO J. 3:2917-2922, 1984）。
【００１０】
この報告は、環状アデノウイルスＤＮＡのＥ１領域あるいはＥ３領域を外来性遺伝子に置き換えることによって、組換えアデノウイルスベクターが簡単に作製できることを示しているが、実際にこの方法で組換えアデノウイルスベクターを構築するに当たっては２つの問題が存在した。一つは、アデノウイルスゲノムＤＮＡを含む非常に大きなプラスミドに発現カセットを組み込む効率の低さであり、もう一つの問題は、作製されたアデノウイルスベクターにプラスミドＤＮＡ部分が残ることである。
【００１１】
この出願の発明は、以上のとおりの従来技術の現状に鑑みてなされたものであって、組換えアデノウイルスベクターを簡便かつ高効率で作製することのできる新しい方法と、この発明を実施するための遺伝子操作材料を提供することを課題としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するため、以下の(1)から(12)の発明を提供する。
(1) Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失させたアデノウイルスゲノムＤＮＡのいずれかの欠失部位に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコスミド配列と発現カセットとを挿入結合して組換えコスミドアデノウイルスベクターを作製し、この組換えコスミドアデノウイルスベクターとレコンビナーゼ発現ベクターとをアデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にコトランスフェクションし、細胞中において組換えコスミドアデノウイルスベクターからコスミドベクター配列を除去することによって、アデノウイルスゲノムＤＮＡおよび発現カセットからなるＤＮＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターを作製することを特徴とする組換えアデノウイルスベクターの作製方法。
(2) レコンビナーゼがCreレコンビナーゼであり、その認識配列がloxＰ配列である前記(1)の作製方法。
(3) レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼであり、その認識配列がＦＲＴ配列である前記(1)の作製方法。
(4) アデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞が、ヒト胎児腎細胞由来２９３細胞である前記(1)から(3)のいずれかの作製方法。
(5) Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失させたアデノウイルスゲノムＤＮＡのいずれかの欠失部位に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコスミド配列と発現カセットとを挿入結合して組換えコスミドアデノウイルスベクターを作製し、この組換えコスミドアデノウイルスベクターを、レコンビナーゼおよびアデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にトランスフェクションし、細胞中において組換えコスミドアデノウイルスベクターからコスミドベクター配列を除去することによって、アデノウイルスゲノムＤＮＡおよび発現カセットからなるＤＮＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターを作製することを特徴とする組換えアデノウイルスベクターの作製方法。
(6) レコンビナーゼがCreレコンビナーゼであり、その認識配列がloxＰ配列である前記(5)の作製方法。
(7) レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼであり、その認識配列がＦＲＴ配列である前記(5)の作製方法。
(8) レコンビナーゼおよびアデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞が、レコンビナーゼを産生するヒト胎児腎細胞由来２９３細胞である前記(5)から(7)のいずれかの作製方法。
(9) Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失させたアデノウイルスゲノムＤＮＡの欠失部位に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコスミド配列が挿入結合されていることを特徴とするコスミドアデノウイルスベクター。
(10) レコンビナーゼがCreレコンビナーゼであり、その認識配列がloxＰ配列である前記(9)のコスミドアデノウイルスベクター。
(11) レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼであり、その認識配列がＦＲＴ配列である前記(9)のコスミドアデノウイルスベクター。
(12) ＦＬＰレコンビナーゼを産生するヒト胎児腎細胞由来２９３細胞。
【００１３】
すなわち、この出願の前記発明においては、「コスミド配列」とは、両端に同方向のレコンビナーゼ認識配列を有する直鎖状のコスミドベクター配列を意味する。また、「コスミドアデノウイルスベクター」とは、Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失したアデノウイルスゲノムＤＮＡと前記コスミド配列とからなる環状ＤＮＡコンストラクトを意味する。さらに、「組換えコスミドアデノウイルスベクター」とは、前記コスミドアデノウイルスベクターに発現カセットを組み込んだ環状ＤＮＡコンストラクトを意味する。さらにまた、「組換えアデノウイルスベクター」とは、前記組換えコスミドアデノウイルスベクターからコスミド配列が除去された直鎖状ＤＮＡ配列を感染性粒子内に組み込んだアデノウイルスを意味する。
【００１４】
以下、この出願の発明について、その実施の形態を詳しく説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
この出願の前記(1)および(5)の組換えアデノウイルスベクターの作製方法においては、前記(9)のコスミドアデノウイルスベクターを使用する。このコスミドアデノウイルスベクターの調製において、アデノウイルスゲノムＤＮＡ（約36kb）は公知のクローン（例えば、実施例で使用したｐＦＧ１４０等）を利用することができる。そして、このゲノムＤＮＡを適当な制限酵素やヌクレアーゼ等で処理することによって、そのＥ１領域（約2.0kb）もしくはＥ１領域とＥ３領域（約3.0kb）の両方を欠失させたＤＮＡ断片（約31〜34kb）を得ることができる。このＤＮＡ断片を、開裂して直鎖状にしたコスミド配列とライゲーションし、環状ＤＮＡコンストラクトを形成する。コスミドベクターは大腸菌λファージのcos部位を有するプラスミドであり、30〜42kbの外来ＤＮＡを挿入することができるため、前記の約34kbのＤＮＡ断片を収納することができる。このコスミド配列はまた、両端にレコンビナーゼ認識配列を有している。この認識配列は、使用するレコンビナーゼの種類によって決定され、例えば、Ｃreレコンビナーゼの場合にはloxＰ配列を、また、ＦＬＰレコンビナーゼの場合にはＦＲＴ配列を用いることができる。例えば、loxＰ配列は34bpの配列であり、公知のクローン（例えば、実施例で使用したｐＢＳ246：GIBCO BRL社製等）から切り出して用いることができる。また、ＦＲＴ配列は公知のクローンｐＮＥＯβＧＡＬ（Stratagene社製等）から切り出して用いることができる。さらに、コスミド配列のレコンビナーゼ認識配列の外側には、アデノウイルスゲノムＤＮＡ接続部位以外に、少なくとも１カ所のクローニングサイト（制限酵素部位）を有するＤＮＡ配列を延長させるのが好ましい。
【００１６】
この出願の前記(1)および(5)の組換えアデノウイルスベクター作製方法においては、以上のとおりに調製した環状のコスミドアデノウイルスベクターに、外来遺伝子を含む発現カセットを挿入結合し、組換えコスミドアデノウイルスベクターを調製する。発現カセットは、プロモーター配列、外来遺伝子（ｃＤＮＡ）およびポリAシグナル等からなるＤＮＡ断片である。
【００１７】
なお、この出願の前記(1)および(5)の方法発明においては、予めコスミドベクター配列と発現カセットを連結し、これと前記アデノウイルスＤＮＡ断片とをライゲーションして組換えコスミドアデノウイルスベクターとすることもできる。あるいは、外来遺伝子（ｃＤＮＡ）を含まない発現カセットを挿入したコスミドアデノウイルスベクターを作製し、この発現カセット内に外来遺伝子（ｃＤＮＡ）を組み込んで組換えコスミドアデノウイルスベクターとすることもできる。
【００１８】
この出願の前記(1)の発明方法は、次いで、これらの組換えコスミドアデノウイルスベクターを、レコンビナーゼ発現ベクターとともに、アデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にコトランスフェクトする。レコンビナーゼ発現ベクターとしては、例えば、ＣreレコンビナーゼまたはＦＬＰレコンビナーゼ発現ベクターを使用することができる。ＣreレコンビナーゼはloxＰ配列を認識し、２つのloxＰ配列に挟まれたDNA配列を切り出す（Nucleic Acids Res. 17:147-161, 1989）。また、ＦＬＰレコンビナーゼはＦＲＴ配列を認識し、２つのＦＲＴ配列に挟まれたＤＮＡ配列を切り出す（Trends Genet. 9:413-421, 1993）。従って、これらのレコンビナーゼ発現ベクターと前記の組換えコスミドアデノウイルスベクターとを共にホスト細胞に導入すると、レコンビナーゼの作用によって環状ＤＮＡのloxＰ配列またはＦＲＴ配列に挟まれたコスミドベクター配列が切り出され、アデノウイルスゲノムＤＮＡと発現カセットとからなる直鎖状ＤＮＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターが作製される。
【００１９】
Creレコンビナーゼ発現ベクターとしては、公知のクローン（例えば、実施例で使用したMC1-creプラスミド等）を使用することができる。また、ＦＬＰレコンビナーゼ発現ベクターとしては、ｐＯＧ４４（Stratagene社製）等を用いることができる。
【００２０】
アデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞としてはヒト胎児腎細胞由来２９３細胞が好ましいが、これに限定されるものではなく、例えば、予めＥ１タンパク質遺伝子を導入したHeLa細胞や正常細胞等を用いることができる。あるいはまた、Ｅ１タンパク質遺伝子を導入したトランスジェニック動物から単離した細胞を用いることもできる。
【００２１】
一方、この出願の前記(5)の発明方法においては、前記のとおりに作製した組換えコスミドアデノウイルスベクターを、レコンビナーゼおよびアデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にトランスフェクトする。すなわち、この方法では、ホスト細胞がレコンビナーゼを恒常的に産生しているために、組換えコスミドアデノウイルスベクターのみをトランスフェクションすることによって、ホスト細胞が産生するレコンビナーゼの作用により環状ＤＮＡのレコンビナーゼ認識配列に挟まれたコスミドベクター配列が切り出され、アデノウイルスゲノムＤＮＡと発現カセットとからなる直鎖状ＤＮＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターが作製される。なお、レコンビナーゼおよびＥ１タンパク質産生細胞としては、例えば、文献公知のCreレコンビナーゼ産生２９３細胞（J. Virol. 71:1842-1849, 1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:13565-13570, 1996）や、後記する実施例に示した方法によって作製されるＣreレコンビナーゼ産生２９３細胞を用いることができる。また、この出願によって新たに提供される前記(12)のＦＬＰレコンビナーゼ産生２９３細胞を用いることができる。さらには、予めE1タンパク質遺伝子とレコンビナーゼ遺伝子とを導入したHeLa細胞や正常細胞、あるいはE1タンパク質遺伝子とレコンビナーゼ遺伝子とを導入したトランスジェニック動物から単離した細胞等を用いることもできる。
【００２２】
このようにして作製した組換えアデノウイルスベクターの全長は、野生型アデノウイルスと同様の36kb前後であり、様々な動物細胞に対して高い感染力を有している。
【００２３】
なお、この前記発明(12)のＦＬＰ コンビナーゼ産生293細胞は、公知の方法によって作製することができる。例えば、ＦＬＰレコンビナーゼをコードするＤＮＡ断片を動物細胞用発現ベクターに組込み、このベクターを293細胞に導入することによって、ＦＬＰレコンビナーゼ産生293細胞を作製することができる。ＦＬＰレコンビナーゼをコードするＤＮＡ断片は、公知の発現ベクターpOG44（Stratagene社製）等から切り出して使用することができる。また、動物細胞用発現ベクターには、前記のベクターpOG44を直接使用することができる他、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する公知のベクターを使用することができる。発現ベクターを293細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。さらに、ＦＬＰレコンビナーゼ発現ベクターには、ピューロマイシン等の薬剤耐性遺伝子を併せて組み込み、ベクターが導入された細胞の選択マーカーとすることもできる。
【００２４】
以下、実施例を示してこの出願の発明を詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００２５】
【実施例】
実施例１：コスミドアデノウイルスベクターの構築
コスミドベクターSuperCos１はStragene社(La Jolla,ＣＡ）より、loxＰ配列を含むプラスミドｐＢＳ246はGIBCO BRL社（Rockville, MD）より購入した。ｐＢS246のloxＰで挾まれる領域中のHind IIIサイトをXba Iへ、BamHＩサイトをSwa Iへ変更した。これをNot Iで切断し、２個のloxＰを持つ260bpの断片を分離した。SuperCos Iに１か所あるXba Iサイトは予め破壊しておき、Not lで切断したところに２個のloxＰを持つ260bpの断片を挿入し、コスミドベクター配列（ｐＬＣコスミド）を調製した。
【００２６】
アデノウイルスゲノムＤＮＡはｐＦＧ140から調製した。ｐＦＧ140はアデノウイルス５dl309の全ゲノムが環状に連結しており、そのＥ１領域のXba Ｉサイトに2.2kbのベクター部分を持つプラスミドであるが、このＥ１領域の681〜2559bp（ゲノム５‘端より）をBal31ヌクレアーゼによって欠失させ、そこにXba Ｉサイトを再構築した。
【００２７】
Ｅ１領域を欠失したアデノウイルスＤＮＡと前記ｐＬＣコスミドをそれぞれXba Ｉ切断し、ライゲーションした後、in vitroパッケージングによりバクテリオファージラムダの頭部に収容し、41kbのコスミドアデノウイルスベクター（ｐＡＬＣコスミド）を作製した（図１参照）。
実施例２：組換えコスミドアデノウイルスベクターの構築
様々なタイプの細胞で強く働くことが知られているＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルス初期エンハンサー・ニワトリβアクチンプロモーターのハイブリッド）の下流にマウスインターロイキン５（mlL-5）、ＥＭＣウイルス由来ｌＲＥＳ（lnternal ribosome entry site）、ｐＥＧＦＰ−ＮＩプラスミド由来ＥＧＦＰ（enhanced green fluorescent protein）ｃＤＮＡを結合し、その両端にSwa Ｉサイトを付加してＤＮＡ断片を調製し、このＤＮＡ断片をカナマイシン耐性のｐＨＳＧ２９８由来のベクターに組み込んだのち、この組換えベクターからSwa Ｉ断片を切り出して発現カセット（4.2kb）を調製した。
【００２８】
この発現カセットを、実施例１で構築したｐＡＬＣコスミドのSwa Ｉサイトに挿入した後、in vitroパッケージングによりバクテリオファージラムダの頭部に組み込み、組換えコスミドアデノウイルスベクター（ｐＡＬＣ−ＩＬ−５）を構築した。このベクターを大腸菌ＤＨ１０Ｂを用いて大量調整・精製し、回収した。
実施例３：組換えアデノウイルスベクターの構築
実施例２で構築した組換えコスミドアデノウイルスベクター（ｐＡＬＣ−ＩＬ−５）とＣreレコンビナーゼ発現ベクター（ＭＣ１−creプラスミド）とを、恒常的にアデノウイルスＥ１タンパク質を産生しているヒト胎児腎細胞由来の２９３細胞にコトランスフェクションした。２９３細胞の培養液は非働化10％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ（Minimum Essential Medium）を用い、ゼラチンで表面をコートしたシャーレ、あるいはマルチプレートを使用した。
【００２９】
１μgのｐＡＬＣ−ＩＬ−５と、0.1μgのＭＣ１−creプラスミドを１２穴マルチプレートにまいた２９３細胞にLIPOFECTAMINE（GIBCO BRL社製）を用いてコトランスフェクションした（図２参照）。
【００３０】
細胞変性効果（ＣＰＥ）はプラーク形成により10日以内で観察された。ＣＰＥの観察されたプレートの培養上清を2,000rpm、５分間、４℃で遠心し、その上清を75cm2のフラスコにまいた２９３細胞に加え感染させた。数日後、全面にＣＰＥが確認できたフラスコについて、細胞を集め凍結・融解を６回繰り返したものを3,500rpm、10分間、４℃で遠心し、その上清中に含まれる組換えアデノウイルスベクターの力価を測定した。測定は、ゼラチンコートした９６穴マルチプレートに播いた２９３細胞に段階希釈したウイルス懸濁液を加え培養し、ＣＰＥの有無を観察した結果から算定した。
【００３１】
また、コントロールとして、ｐＡＬＣ−ＩＬ−５のみを２９３細胞にトランスフェクションし、同様にプラーク形成を観察した。
【００３２】
その結果、Ｃreレコンビナーゼが存在しないコントロール条件の場合、別々にトランスフェクションした８穴の２９３細胞のいずれにもプラークは認められなかった。これはｐＡＬＣ−ＩＬ−５ＤＮＡはその長さが45kbであり、感染性アデノウイルス粒子が収容できる長さを超えているため、ウイルスが産生されなかったことを示している。一方、Ｃreレコンビナーゼ発現ベクターと共にトランスフェクションした場合には、８日以内に８穴の２９３細胞のすべてにおいてＣＰＥが認められた。それぞれについて繰り返し検討した結果、Ｃｒｅが共存する場合、合計２２穴の細胞のすべてでプラークを確認した。
【００３３】
以上の結果により、一過性に発現するＣreレコンビナーゼによってｐＡＬＣ−ＩＬ−５のコスミド配列が効率よく除去され、その結果形成される発現カセットを含む38kbの環状アデノウイルスベクターゲノムから、感染性の組換えアデノウイルスベクターが産生されたことが確認された。
実施例４：ウイルスＤＮＡの解析
実施例３で構築した組換えアデノウイルスベクターからコスミド配列が除かれているかどうかを確かめるため、そのＤＮＡの構造を解析した。
【００３４】
ウイルス懸濁液を１％ＳＤＳ、0.2mg/mlプロテアーゼＫ、10mM ＥＤＴＡで37℃、３時間消化し、フェノール、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿したものをアガロースゲルで電気泳動し、ゲルからウイルスＤＮＡを抽出・精製した。ウイルスＤＮＡをXba Ｉで消化し、0.4％および0.9％のアガロースゲルを用いて電気泳動した。
【００３５】
図３Ａは組換えアデノウイルスベクターゲノムの構造とその中のXba Ｉサイトを示す。組換えアデノウイルスベクターの懸濁液から精製したウイルスＤＮＡをXba Ｉで消化し、0.4％アガロースゲル（図３Ｂ、レーン１、２）、あるいは0.9％ゲル（図３Ｃ、レーン１、２）で電気泳動した。レーン１、２のウイルスＤＮＡは別々にトランスフェクションした細胞から調製した。次にｐＡＬＣ−ＩＬ−５ＤＮＡをXba Ｉで消化し同様に電気泳動した。loxP配列で挟まれたコスミド配列を含むXba Ｉ断片は9.1kbとして認められるが（図３Ｂ、Ｃ、レーン４）、組換えアデノウイルスベクターのＤＮＡにおいては2.1kbの断片として認められ（図３Ｃ、レーン１、２）、その差はｐＡＬＣ中のloxＰで挟まれたコスミド配列（約７kb）に相当する。この結果により、ｐＡＬＣ−ＩＬ−５中のコスミド配列はＣreレコンビナーゼの一過性発現によって効率よく除去され、その結果形成された発現カセットを含む３８ｋｂの環状アデノウイルスゲノムが増幅してウイルス粒子に収容され、感染性の組換えアデノウイルスベクターが産生されたことが確認された。予想される大きさ以外のＤＮＡ断片は認められず、この方法による組換えアデノウイルスベクター構築過程においては、異常な組換えはほとんど起こらないことも確認された。コントロールとして、アデノウイルスゲノムのクローンｐＦＧ140をトランスフェクションした２９３細胞のＤＮＡをXba Ｉで消化した場合は、予想された34.6kb、2.2kbおよび1.3kbの各断片が認められた（図３Ｂ、Ｃ、レーン３）。
実施例５：発現カセットに含まれる遺伝子の発現
ＩＬ−５の発現を確認するため、感染細胞の培養液を回収、遠心し、その上清中のＩＬ−５活性をＥＬＩＳＡ法で検討した。また、ＥＧＦＰの発現は蛍光顕微鏡で観察することにより検討した。
【００３６】
２９３細胞に組換えコスミドアデノウイルスベクターｐＡＬＣ−ＩＬ−５とｐＭＣｌ−creをコトランスフェクションすると、多くの細胞がＥＧＦＰ陽性となり、ウイルスのプラークが発達するに従い、すべてのプラークの周辺に強いＥＧＦＰ蛍光が認められた（図４Ａ、Ｃ）。
【００３７】
次に実施例３で構築した組換えアデノウイルスベクターの懸濁液を希釈し、２９３細胞に感染させプラークを形成させた。30個以上のプラークを調べ、そのすべてがＥＧＦＰ陽性細胞で囲まれていることを観察した（図４Ｂ、Ｄ）。ＩＬ−５とＥＧＦＰはＣＡＧプロモーターによってbicistronicに転写されることを考えると、ＥＧＦＰを発現するアデノウイルスベクターはＩＬ−５もまた発現することが予想される。そこでＩＬ−５の発現を確かめるために、９６穴マルチプレートにまいた２９３細胞に限界希釈したウイルス懸濁液を加え、別々のウイルスクローンを増殖させた。10個のウイルスクローンについて調べたところ、すべてＥＧＦＰは陽性であった。その培養上清のＩＬ−５活性をＥＬＩＳＡ法を用いて検討した結果、それぞれ高い価を示した（＞10μg/ml）。
【００３８】
以上の結果は、この出願の発明方法が、きわめて均一な組換えアデノウイルスベクターを産生することが可能であり、このベクターにより動物細胞中で導入遺伝子を確実に発現させることが可能であることを示している。
実施例６：Ｃreレコンビナーゼ産生２９３細胞の作製
Ｃreレコンビナーゼ遺伝子とＥＭＣウイルス由来のＩＲＥＳ（Internal ribosome entry site）配列およびピューロマイシン耐性遺伝子をｐＣＡＧＧＳ（Gene 108(2):193-199, 1991）のＥcoＲＩサイトに挿入してＣreレコンビナーゼ発現プラスミドｐCAGGS−cre−puroを構築し、２９３細胞にトランスフェクトし、２μgのピューロマイシン／ml含有培地で培養した。ピューロマイシン耐性コロニーを単離し、２９３細胞にレポータープラスミドｐＣＡＧ−ＣＡＴ−ＺをトランスフェクションすることによってＣreレコンビナーゼ活性をテストした。すなわちこのレポータープラスミドは、ＣＡＧプロモーターとlacＺ遺伝子の間に、loxＰ配列で挟まれたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子が挿入されており、Ｃreレコンビナーゼの作用によってＣＡＴ遺伝子が切り出されるとlacＺが発現されるため、２９３細胞のＣreレコンビナーゼ産生をテストすることができる（Biochem. Biophys. Res. Commun. 17(2):393-401, 1995）。このテストによって、Ｃreレコンビナーゼ産生能を有する細胞株２９３cre15を得た。
実施例７：２９３cre15における組換えアデノウイルスベクターの作製
実施例２で構築した組換えコスミドアデノウイルスベクター（ｐＡＬＣ−ＩＬ−５）１μg/wellを、実施例６で作製した２９３cre15にトランスフェクションした。９穴のトランスフェクション細胞の全てにおいてＣＰＥが観察され、ＣＰＥの全スポットには強いＥＧＦＰが観られた。
【００３９】
これらの結果から、レコンビナーゼ産生２９３細胞を用いることにより、レコンビナーゼ発現ベクターを使用せずとも、組換えコスミドアデノウイルスベクターから効率よく組換えアデノウイルスベクターが作製可能であることが確認された。
実施例８：ＦＬＰ コンビナーゼ産生293細胞の作製
ＦＬＰレコンビナーゼ遺伝子とＥＭＣウイルス由来のＩＲＥＳ（Internal ribosome entry site）配列およびピューロマイシン耐性遺伝子をpgk（phosphoglycerate kinase）プロモーターの下流に挿入してＦＬＰレコンビナーゼ発現プラスミドpgk-FLP-puroを構築し、293細胞にトランスフェクトし、２μgのピューロマイシン／ml含有培地で培養した。ピューロマイシン耐性コロニーを単離し、293細胞にレポータープラスミドpＮＥＯβＧＡＬをトランスフェクションすることによってＦＬＰレコンビナーゼ活性をテストした。すなわちこのレポータープラスミドは、ＳＶ40プロモーターの下流のlacＺ遺伝子の途中に、ＦＲＴ配列で挟まれたネオマイシン耐性遺伝子が挿入されており、ＦＬＰレコンビナーゼの作用によってネオマイシン耐性遺伝子が切り出されるとlacＺが発現されるため、293細胞のＦＬＰレコンビナーゼ産生をテストすることができる。このテストによって、ＦＬＰレコンビナーゼ産生能を有する細胞株293ＦＬＰを得た。
【００４０】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、哺乳動物細胞に感染力を有する組換えアデノウイルスベクターを簡便かつ効率よく作製することが可能となる。例えば、従来の相同組換えを用いた組換えアデノウイルスベクターの作製方法では、予想外の組換えベクターが製造される危険性があり、また、製造過程が複雑で長時間の工程を必要とするが、この発明の方法は複雑な作業工程を必要とせず、しかも所望の構造と機能とを有する組換えベクターを確実に製造することが可能である。また、従来の相同組換えを用いた方法では、使用する２９３細胞の継代数が50以下である必要があるが、この出願の発明方法では、少なくとも70代以上継代した２９３細胞を用いても組換えアデノウイルスベクターの製造が可能である。
【００４１】
従って、この出願の発明により提供される方法および材料によって、哺乳動物細胞を用いた遺伝子機能解析が促進される。また、遺伝子治療のためのベクター開発も促進される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で構築したコスミドアデノウイルスベクターｐＡＬＣ（上）と発現カセット（下）の構造を示す模式図である。34kbのアデノウイルスゲノムＤＮＡは白い環で、ゲノムの方向は矢印で示す。７kbのコスミドベクターは黒三角で示すloxＰ配列で挟まれており、その中にcos部位、カナマイシン耐性遺伝子（Km）、大腸菌ori、アンピシリン耐性遺伝子（Ap）を含む。発現カセットはＣＡＧプロモーター、マウスＩＬ−５ｃＤＮＡ、ＩＲＥＳ、ＥＧＦＰｃＤＮＡ、ポリＡ添加シグナル（pA）から成る。発現カセットはｐＡＬＣベクターのSwa Ｉサイトに挿入され、実施例２の組換えコスミドアデノウイルスベクターｐＡＬＣ−ＩＬ−５が構築される。
【図２】 実施例３で構築した組換えアデノウイルスベクターの作業工程の概要を示す模式図である。実施例２のｐＡＬＣ−ＩＬ−５を大腸菌ＤＨ10Ｂを用いて増殖・精製し、ｐＭＣｌ−creプラスミドと共に２９３細胞にトランスフェクションした。一過性に発現するＣreレコンビナーゼは、効率よく７kbのコスミド配列を切り出し、最終的に、ＩＬ−５とＥＧＦＰの発現カセットを含む感染性の組換えアデノウイルス粒子が産生された。
【図３】Ａは実施例３で構築した組換えアデノウイルスベクターＤＮＡの構造を示す模式図である。アデノウイルスゲノム（白いバー）とＩＬ−５とＥＧＦＰの発現カセット（黒いバー）の結合したものの中に、Ｃreレコンビナーゼによって除去されたコスミド配列のloxＰ（黒三角）１個が残る。下方の数字はアデノウイルスゲノムのマップユニット（m.u.）を、上方の数字は組換えアデノウイルスベクターＤＮＡをXba Ｉで消化した場合の断片の長さ（kb）をそれぞれ示す。ＢおよびＣは、様々なＤＮＡをXba Ｉで消化し、0.4％（Ｂ）および0.9％（Ｃ）アガロースゲルで電気泳動したパターンを示す図面に代わる写真である：レーン１と２はｐＡＬＣ−ＩＬ−５とｐＭＣｌ−creを２９３細胞にコトランスフェクションして産生されたウイルスＤＮＡ；レーン３はｐＦＧ140を２９３細胞にトランスフェクションして産生されたウイルスＤＮＡ；レーン４はｐＡＬＣ−ＩＬ−５ＤＮＡ。レーン１と２のＤＮＡはそれぞれ独立したトランスフェクションから得られたウイルスから調製した。loxＰで挟まれたコスミド配列は9.1kbのＤＮＡ断片に含まれている（レーン４、黒三角）。組換えアデノウイルスＤＮＡには9.1kbの断片は見られず、2.1kb断片が生じている（レーン１、２、白三角）。レーンＭはサイズマーカーを泳動しており、そのサイズを左側に示す（kb）。
【図４】実施例３で構築した組換えアデノウイルスベクターのプラーク形成と、プラーク周辺のＥＧＦＰの発現を示す図面に代わる写真である。ｐＡＬＣ−ＩＬ−５とｐＭＣｌ−creをコトランスフェクションした２９３細胞にはウイルスによるプラークが認められる（写真Ａ、Ｃ）。また、組換えアデノウイルスベクターを感染した２９３細胞にもプラークが認められる（写真Ｂ、Ｄ）。写真Ａ、Ｂの視野を蛍光顕微鏡で観察すると、ＥＧＦＰの蛍光が認められる（Ｃ、Ｄ）。
Claims (11)
- Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失させたアデノウイルスゲノムＤＮＡのいずれかの欠失部位に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコスミド配列と発現カセットとを挿入結合して組換えコスミドアデノウイルスベクターを作製し、この組換えコスミドアデノウイルスベクターとレコンビナーゼ発現ベクターとをアデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にコトランスフェクションし、細胞中において組換えコスミドアデノウイルスベクターからコスミドベクター配列を除去することによって、アデノウイルスゲノムＤＮＡおよび発現カセットからなるＤＮＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターを作製することを特徴とする組換えアデノウイルスベクターの作製方法。
- レコンビナーゼがCreレコンビナーゼであり、その認識配列がloxＰ配列である請求項１の作製方法。
- レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼであり、その認識配列がＦＲＴ配列である請求項１の作製方法。
- アデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞が、ヒト胎児腎細胞由来２９３細胞である請求項１から請求項３のいずれかの作製方法。
- Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失させたアデノウイルスゲノムＤＮＡのいずれかの欠失部位に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコスミド配列と発現カセットとを挿入結合して組換えコスミドアデノウイルスベクターを作製し、この組換えコスミドアデノウイルスベクターを、レコンビナーゼおよびアデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞にトランスフェクションし、細胞中において組換えコスミドアデノウイルスベクターからコスミドベクター配列を除去することによって、アデノウイルスゲノムＤＮＡおよび発現カセットからなるＤＮＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターを作製することを特徴とする組換えアデノウイルスベクターの作製方法。
- レコンビナーゼがCreレコンビナーゼであり、その認識配列がloxＰ配列である請求項５の作製方法。
- レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼであり、その認識配列がＦＲＴ配列である請求項５の作製方法。
- レコンビナーゼおよびアデノウイルスＥ１タンパク質産生細胞が、レコンビナーゼを産生するヒト胎児腎細胞由来２９３細胞である請求項５から７のいずれかの作製方法。
- Ｅ１領域もしくはＥ１およびＥ３領域を欠失させたアデノウイルスゲノムＤＮＡの欠失部位に、レコンビナーゼ認識配列を両端に有するコスミド配列が挿入結合されていることを特徴とするコスミドアデノウイルスベクター。
- レコンビナーゼがCreレコンビナーゼであり、その認識配列がloxＰ配列である請求項９のコスミドアデノウイルスベクター。
- レコンビナーゼがＦＬＰレコンビナーゼであり、その認識配列がＦＲＴ配列である請求項９のコスミドアデノウイルスベクター。
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