JP2007527722A - 多タンパク質適用のための新規発現ツール - Google Patents
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Abstract
Description
O'Reilly et al. Baculovirus expression vectors. A laboratory manual. Oxford Press, New York (1994) Luckow et al. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site−specific transposon−mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in E. coli. J. Virol. 67, 4566−4579 (1993)
第一の側面として、上述の目的は、下記式(I):
(a)頭部−頭部、頭部−尾部、又は尾部−尾部の配置での少なくとも2つの発現カセット、T1−MCS1−P1及びP2−MCS2−T2;それぞれ、マルチクローニングサイトであるMCS1又はMCS2を含み、MCS1はプロモーターP1及び終了配列T1に隣接しており、MCS2はプロモーターP2及び終了配列T2に隣接している、
(b)プロモーターP1とP2との間にある少なくとも1つの増殖モジュールM(少なくとも2つの制限部位A及びBを含む)、
(c)少なくとも2つの制限部位X及びY(それぞれ発現カセットの1つに隣接している)、
{式中:
(i)制限部位A及びX並びにB及びYは適合する、しかし、
(ii)AY及びBXのライゲーション産物は、制限部位A、B、X及びYに特異的な制限酵素であるa、b、x、又はyによって酵素的に切断されず、かつ
(iii)制限部位A及びB並びにX及びYは適合しない}]
の機能的配置を含む、複数遺伝子適用のための新規なポリヌクレオチドを提供することにより解決される。
(a)polh及びp10から選択されるプロモーターP1及びP2、
(b)SV40及びHSVtkから選択される終了配列、
(c)BstZ17I、SpeI、ClaI及びNruIからなる群から選択される、増殖モジュールM中の制限部位A及びB、
(d)PmeI及びAvrIIからなる群から選択される制限部位X及びY、
(e)cre−lox及びTn7組み換え系から選択されるウイルス組み込みのための部位。
(a)本発明の第一のベクターのMCS1及び/又はMCS2へと1つ以上の遺伝子をクローニングする工程、
(b)本発明の第二のベクターのMCS1及び/又はMCS2へと1つ以上の遺伝子をクローニングする工程
(c)第一のトランスファーベクター中の制限部位X及びYで、機能的配置全体を切り出す工程、
(d)増殖モジュールMで第二のトランスファーベクターを切断する工程、
(e)工程(c)で切り出された機能的配置を、工程(d)で切断された第二のベクターの増殖部位へとライゲーションし、それにより第一のトランスファーベクターの増殖モジュールと、第一及び第二のベクターの両方の発現カセットとを有する第三のトランスファーベクターを作製する工程、及び
(f)複数の発現カセットを有するトランスファーベクターを集合させるために、工程(a)から工程(e)を任意選択で反復する工程、
を含む、複数遺伝子発現カセットの作製方法を対象とする。
(a)先に定義されたとおりの本発明の複数遺伝子発現カセットを作製する工程、及び
(b)前記遺伝子を同時に発現することができる宿主細胞へと前記複数遺伝子発現カセットを導入する工程、
を含む、in vitroでの多タンパク質複合体の製造方法を対象としている。
(a)請求項39乃至42に係る複数遺伝子発現カセットを作製する工程、及び
(b)前記遺伝子を同時に発現する動物へと前記複数遺伝子発現カセットを導入する工程、
を含む、in vivoでの多タンパク質複合体の製造方法に関する。
(a)本発明の少なくとも1つのポリヌクレオチド及び/又はベクターを哺乳動物に投与する工程(それにより、前記ポリヌクレオチドの少なくとも1つの発現カセットによりコードされる少なくとも1つのタンパク質が、前記動物内で発現される)、
(b)任意選択でアジュバントを前記動物に投与する工程、及び
(c)前記の少なくとも1つのタンパク質に特異的な抗体及び/又は前記抗体を産生する脾臓細胞を任意選択で単離する工程、
を含む、ワクチン製造方法にも関する。
(a)本発明の少なくとも1つのポリヌクレオチド及び/又はベクターを含む宿主細胞を準備する工程(前記宿主細胞は、関心のある少なくとも2つのタンパク質に対する遺伝子を有する少なくとも1つの発現カセットを含んでおり、かつ前記タンパク質を同時に発現できる)、及び
(b)1つ以上の発現しているタンパク質における相互作用又は修飾を検出する工程、
を含む、タンパク質複合体相互作用又はタンパク質の修飾をin vitroでスクリーニングするための方法に関する。
(a)本発明の少なくとも1つのポリヌクレオチド及び/又は本発明のベクターを含む宿主細胞を準備する工程(前記宿主細胞は、関心のある少なくとも2つのタンパク質に対する遺伝子を有する少なくとも1つの発現カセットを含んでおり、かつ前記タンパク質を同時に発現できる)、
(b)工程(a)の宿主細胞に、候補となる化合物を投与する工程、及び
(c)1つ以上の発現しているタンパク質におけるタンパク質複合体相互作用若しくは修飾を検出する工程、又はタンパク質複合体相互作用の阻害若しくはタンパク質の修飾の阻害を検出する工程、
を含む方法を包含する。
(a)本発明の少なくとも1つのポリヌクレオチド及び/又は本発明のベクターを含む動物を準備する工程(前記動物は、関心のある少なくとも2つのタンパク質に対する遺伝子を有する少なくとも1つの発現カセットを含んでおり、かつ前記タンパク質を同時に発現できる)、
(b)工程(a)の動物に、候補となる化合物を投与する工程、及び
(c)1つ以上の発現しているタンパク質におけるタンパク質複合体相互作用若しくは修飾を検出する工程、又はタンパク質複合体相互作用の阻害若しくはタンパク質の修飾の阻害を検出する工程、
を含む方法を教示する。
(i)治療用の1つ以上の遺伝子産物、好ましくはタンパク質、及び
(ii)1つ以上のバキュロウイルスタンパク質、
をコードする、少なくとも1つの複数遺伝子発現カセットを含むバキュロウイルスであって、前記バキュロウイルスは、治療される動物の哺乳類プロモーター(1つ以上)活性の制御下で、治療用遺伝子産物、好ましくはタンパク質に対する遺伝子を発現でき、かつバキュロウイルスプロモーターの制御下で、バキュロウイルスタンパク質に対する遺伝子を発現できる。
1.複数遺伝子適用のための新規なバキュロウイルスツール
以下に、特に複数遺伝子適用のために構築された、本発明の新規なバキュロウイルストランスファーベクターを詳細に記載する。これらのトランスファーベクターは、タンパク質の製造を高めるために改変された改変レシピエントバキュロウイルスDNAを提示し、かつこの目的のために調製されたE. coli細胞でこのバキュロウイルスDNAへと、2つのアクセス部位(attTn7及びLoxP)を介して遺伝子を組み込むための単純かつ迅速な方法を提示している。前記ベクター(pFBDM及びpUCDM)は、増殖モジュールを含んでおり、必要とされるユニークな制限部位を最小限に抑えながら、異種遺伝子のモジュラー結合を非常に容易にする。これらのベクターのウイルスプロモーター(現在のところ、p10及びpolh最後期プロモーター)は、所望する場合には、他のプロモーター配列に交換され得る。同様にして、終了配列(現在のところ、SV40、HSVtk)も置換され得る。
トランスファーベクターpFBDM(配列番号1、図11)は、polh又はp10プロモーター、及びSV40又はHSVtkポリAシグナル配列にそれぞれ隣接しているマルチクローニングサイトMCS1及びMCS2を有する2つの発現カセットを頭部−頭部の配置で含んでいる。増殖モジュールMは、プロモーター配列の間に位置している。Tn7転移のために用いられる配列(Tn7L及びTn7R)は、発現カセット及びゲンタマイシン耐性マーカーを包含する。より詳細には図2参照のこと。
ベクターpFBDM及びpUCDMは、2つのプロモーター間に挿入されている増殖モジュールに起因して、複数遺伝子発現カセットを作製するのに特に適している。増殖のロジックを図4で図解する。複数遺伝子発現カセットを集合させるための唯一の必須条件は、増殖のために用いられる制限酵素(例えば、PmeI、AvrII、SpeI、及びBstZ17I又はNruIのいずれか)がユニークであることであって、これは、例えば、複数遺伝子カセットを集合する前に部位特異的突然変異誘発を行うことにより、又は挿入されたDNAコード配列の切断されるべきでない追加の部位を遮蔽可能な化合物(例えば、ペプチド核酸)を提供することにより、容易に達成され得る。遺伝子は、pFBDMのMCS1及びMCS2へとクローニングされる。ついで、発現カセット全体をPmeI及びAvrII消化により切り出す。得られたフラグメントを、SpeI/BstZ17I又はSpeI/NruI部位のいずれかを介した遺伝子のさらなるセットを含むpFBDMの増殖モジュールに入れる。SpeIはAvrIIと適合する粘着末端を産生し、他方、BstZ17I、NruI及びPmeIは平滑カッターである。その過程で、関与した制限部位は除去され、挿入されたカセット内に存在するモジュールを反復して用いることにより、増殖を繰り返すことができる。同様のロジックはまた、複数遺伝子発現カセットを有するpUCDM誘導体の作製にも適用される。さらに、プロモーター及び終了配列は、所望する場合には、本発明ベクター中の適切な制限部位を用いて容易に変更され得る。
改良されたタンパク質製造特性を得るために、バキュロウイルスゲノムを改変した。2つのバキュロウイルス遺伝子、v−cath及びchiAを破壊することにより、結果として、感染及びタンパク質製造の間の細胞内コンパートメントの保持を高めた。v−cath遺伝子は、ウイルスプロテアーゼV−CATHをコードしており、これは、ウイルスDNA上の近接遺伝子であるchiA(キチナーゼをコードする)依存性のプロセスにより、細胞死を活性化する。V−CATH活性を排除し、かつchiA遺伝子産物に干渉されない精製のためのキチン−親和性クロマトグラフィーを選択的に用いることができるように、両方の遺伝子を破壊した。このいわゆるMultiBacバキュロウイルスによって製造されるタンパク質の特性は、ウイルス依存性タンパク質分解活性の減少及び細胞溶解の減少を通じて、顕著に改善されている。破壊されたウイルスDNA配列の代わりに、cre−lox部位特異的組み換えのためのLoxP配列を入れた。より詳細には図5を参照のこと。
選択した遺伝子を、標準的なクローニング手順を用いて、pFBDM及びpUCDMのマルチクローニングサイトMCS1又はMCS2(図2、3参照のこと)へとクローニングする。pFBDM誘導体についてのライゲーション反応物を、クローニング用の標準的なE. coli細胞(例えば、TOP10、DH5α、HB101)へとトランスフォームし、アンピシリン(100μg/ml)を含む寒天上にまく。pUCDM誘導体についてのライゲーション反応物を、pir遺伝子を発現しているE. coli細胞(例えば、BW23473、BW23474)へとトランスフォームし、クロラムフェニコール(25μg/ml)を含む寒天上にまく。特異的制限消化及び挿入物のDNA配列決定に基づき、正しいクローンを選択する。
およそ5〜10ngのpUCDM誘導体を、50〜100μlのエレクトロコンピテントDH10MultiBacCre細胞とともに、氷上でインキュベート(15分間)する。エレクトロポレーション(200Ω、25μF、1.8kVパルス)に続いて、細胞を37℃で8時間インキュベートし、カナマイシン(50μg/ml)、クロラムフェニコール(25μg/ml)及びアンピシリン(100μg/ml)を含む寒天上にまく。37℃でのインキュベート後(12〜15時間)、コロニーが現れる。ついで、バクミドは昆虫細胞トランスフェクションのために調製され得(III.6.参照のこと)、又はコロニーはTn7転移によるpFBDM誘導体の組み込みのために調製され得る(以下を参照のこと)。
およそ5〜10ngのpFBDM誘導体を、50〜100μlのエレクトロコンピテントDH10MultiBacCre細胞とともに、氷上でインキュベート(15分間)する。エレクトロポレーション(200Ω、25μF、1.8kVパルス)に続いて、細胞を37℃で8時間インキュベートし、カナマイシン(50μg/ml)、ゲンタマイシン(7μg/ml)、アンピシリン(100μg/ml)、テトラサイクリン(10μg/ml)、BluoGal(100μg/ml)及びIPTG(40μg/ml)を含む寒天上にまく。37℃でのインキュベート後(18〜24時間)、白色コロニーを選択する。ついで、バクミドは昆虫細胞感染のために調製され得る(以下を参照のこと)。
Cre−lox部位特異的組み換え及びTn7転移は、所望する場合には、DH10MultiBacCre細胞において同時に実施され得る。2つのトランスフォーメーションの効率は、1つのプラスミドのみでのトランスフォーメーションと比較して減少しているので、非常に大量のDNAをこの反応に用いなければならない。選択するおよそ2〜4μgのpFBDM誘導体及び2〜4μgのpUCDM誘導体を、50〜100μlのエレクトロコンピテントDH10MultiBacCre細胞とともに、氷上でインキュベート(15分間)する。エレクトロポレーション(200Ω、25μF、1.8kVパルス)に続いて、細胞を37℃で8時間インキュベートし、クロラムフェニコール(25μg/ml)、カナマイシン(50μg/ml)、ゲンタマイシン(7μg/ml)、テトラサイクリン(10μg/ml)、BluoGal(100μg/ml)及びIPTG(40μg/ml)を含む寒天上にまく。37℃でのインキュベート後(18〜24時間)、白色コロニーを選択する。ついで、バクミドは昆虫細胞感染のために調製され得る(以下を参照のこと)。
特定の適用のために、発現のためのタンパク質遺伝子を、Cre触媒によって組み込まれている外来遺伝子のセットをすでに運んでいるMultiBacバキュロウイルスのDNAに添加することが有利であり得る。ついで、組み込まれているpUCDM誘導体を有する組み換えMultiBacを提供するDH10MultiBacCre細胞(III.2.参照のこと)を、クロラムフェニコール(25μg/ml)、カナマイシン(50μg/ml)、アンピシリン(100μg/ml)、テトラサイクリン(10μg/ml)、BluoGal(100μg/ml)及びIPTG(40μg/ml)を含む寒天上に再度面線接種する。ついで、転移−コンピテントMultiBac誘導体を有する青色のコロニーを、OD600が0.5に達するまで、クロラムフェニコール(25μg/ml)、カナマイシン(50μg/ml)、アンピシリン(50μg/ml)及びテトラサイクリン(10μg/ml)を含む500mlの2×TYメディウム中で、37℃でインキュベートする。ついで、培養物を氷上で冷却し(15分間)、遠心分離(4000rpm、8分間)する。細胞ペレットを250mlの冷却10%グリセロール溶液(無菌)中に再懸濁し、遠心分離(4000rpm、8分間)する。ついで、細胞ペレットを200mlの冷却10%グリセロール溶液(無菌)に再懸濁し、再び遠心分離(4000rpm、8分間)する。ついで、細胞ペレットを50mlの冷却10%グリセロール溶液(無菌)に再懸濁し、遠心分離した後、最終的に1mlの10%グリセロール溶液(無菌)に再懸濁する。液体窒素中で、細胞を50〜100μlの一定分量で凍結し、−80℃で保存する。pFBDM誘導体の転移は、以下のとおりに実施され得る。
バクミドDNAの調製、昆虫細胞の感染、及びタンパク質発現を、慣例に従って実施する(例えば、O'Reilly, D.R., Miller, L.K. & Luckow, V.A. "Baculovirus expression vectors. A laboratory manual." Oxford University Press, New York−Oxford (1994); "Bac−to−BacTM Baculoviorus Expression Systems Manual." Invitrogen, Life Technologies Incorporated, (2000))。
DH10MultiBacCre細胞におけるMultiBacの増殖は、バクミド上のF−レプリコンの存在によって決まる。F−レプリコンの機能は、コピー数(1つ又は2つ)の厳格な管理であり、所望しない組み換えの可能性を減少させる。pFBDM誘導体のMultiBacへの導入により、lacZα遺伝子が破壊され、従って、複合バクミドのみを含む細胞の明確な同定が可能となる。しかし、pUCDM誘導体のCre触媒による組み込みの場合には、1つの複合バクミドと1つの親MultiBac分子との共存を、クロラムフェニコール耐性に基づいて除外できない。従って、Cre触媒により挿入された黄色の蛍光タンパク質EYFPに対する遺伝子を含むMultiBacを用いた初めのトランスフェクションからのウイルスを、プラーク精製によりコロニー的に分離した。32個のプラーク精製試料のうち29個(91%)がEYFPを発現していたので、ほぼ飽和した効率でcre−lox部位特異的組み換え反応が起こっていると言える(さらに詳細には図6参照のこと)。
市販のバキュロウイルス発現系を用いた異種タンパク質製造の間に、システインプロテアーゼの作用と一致するウイルス依存性タンパク質分解ブレイクダウンが観察された。バキュロウイルスのv−cath遺伝子は、昆虫細胞の宿主の液化に直接関与するシステインプロテアーゼをコードする。V−CATHは、ウイルスDNA上の近接遺伝子であるchiA(キチナーゼをコードする)依存性のプロセスにより、細胞死を活性化する。両方の遺伝子を破壊することにより、V−CATH活性が排除され、さらにchiA遺伝子産物に干渉されない精製のためのキチン親和性クロマトグラフィーを選択的に用いることが可能となる。MultiBacウイルスで感染させた細胞由来のサンプルと、v−cath及びchiAを運ぶ市販のバキュロウイルスで感染させた細胞由来のサンプルとを比較することにより、破壊の効果を分析した。MultiBacで感染させた細胞の溶解物では、細胞の元の状態の保持(maintenance of cell integrity)が非常に高められていると同時に、タンパク質分解活性の顕著な減少が観察された(より詳細には図7参照のこと)。
試験実験において、130kDaのIsw2pタンパク質及び145kDaのItc1pタンパク質からなる酵母菌Isw2クロマチン再構築複合体を発現させた。1つ目のMultiBacは、両方のタンパク質をattTn7部位に組み込んで作製し、2つ目のMultiBacは、Isw2pをattTn7部位に組み込み、Itc1pをLoxP部位に挿入して作製した。ウイルス上の2つの遺伝子の空間的な分断は、昆虫細胞におけるIsw2複合体の、サブユニットの相対的産生レベルにも、機能的集合にも悪影響を及ぼさず、同時組み込み及びタンパク質発現のためのCre−lox及びTn7部位の両方の有用性を裏付ける。より詳細には図8参照のこと。
酵母菌Isw2再構築複合体に加えて、さらに3つのメンバーからなる酵母菌Isw1b複合体(360kDa)及びヒト転写因子複合体(700kDa)を、MultiBacを用いて発現させた。さらに、全ての場合において、EYFP蛍光タンパク質も共発現させた。共発現実験において、EYFPの収率とそれぞれの複合体の収率に変化がなかったことから、この系において発現が飽和していないことが明らかとなり、より多くのサブユニットを含むさらに大きな複合体がMultibacを用いて発現可能なことが示唆される。より詳細には図9参照のこと。
バキュロウイルスプロモーター制御下の蛍光タンパク質EYFP及びECFP、並びにCMV後期プロモーター制御下のdsREDを含むMultiBac誘導体ウイルスを作製した。このハイブリッドウイルスで感染させた昆虫細胞は、EYFP及びECFPの発現を示した。昆虫細胞において増幅させたウイルスで感染させた哺乳動物COS細胞は、dsREDタンパク質の強い蛍光を示し、哺乳動物細胞への複数遺伝子導入のためのMultiBac(「BacMam」)の利用可能性を実証した。より詳細には図10参照のこと。
本発明のMultiBac系キットは、以下を1つ以上含んでいてもよい:
DH10MultiBacCre細胞、BW23474、BW23474細胞+、pFBDMベクター、pUCDMベクター、Tn7転移のためのコントロールプラスミド*、cre−lox部位特異的組み換えのためのコントロールプラスミド*、一般的なトランスフェクション試薬#
+;pUCDM誘導体の増殖のためのpir遺伝子を発現しているE. coli株(pir+バックグラウンドを有する任意の他の株を用いることもできる)。
*;実験において、蛍光タンパク質ECFP及びEYFPに対する遺伝子を運ぶベクターをコントロールとして使用した。これらの遺伝子は、Molecular Probeにより、許可を得て販売されている。蛍光顕微鏡によるか、蛍光分光光度計を用いるかのいずれかによる蛍光観察がもっぱら容易であるので、これらはコントロールとして特に有用である。しかし、容易に同定可能なタンパク質(グルクロニダーゼ(glucuronidase)、カテコールジオキシゲナーゼ、XylE、ルシフェラーゼなど)をコードする遺伝子を運ぶ任意のタイプのコントロールプラスミドを用いることもできる。
#;例えば、CellFECTIN(Invitrogen)、LipoTAXI(登録商標)トランスフェクション試薬(Stratagene)など。
Claims (25)
- 下記式(I):
(a)頭部−頭部、頭部−尾部、又は尾部−尾部の配置での少なくとも2つの発現カセット、T1−MCS1−P1及びP2−MCS2−T2;それぞれ、マルチクローニングサイトであるMCS1又はMCS2を含み、MCS1はプロモーターP1及び終了配列T1に隣接しており、MCS2はプロモーターP2及び終了配列T2に隣接している、
(b)プロモーターP1とP2との間にある少なくとも1つの増殖モジュールM(少なくとも2つの制限部位A及びBを含む)、
(c)少なくとも2つの制限部位X及びY(それぞれ発現カセットの1つに隣接している)、
{式中:
(i)制限部位A及びX並びにB及びYは適合する、しかし、
(ii)AY及びBXのライゲーション産物は、制限部位A、B、X及びYに特異的な制限酵素であるa、b、x、又はyによって酵素的に切断されず、かつ
(iii)制限部位A及びB並びにX及びYは適合しない}]
の機能的配置を含む、複数遺伝子適用のためのポリヌクレオチド。 - 前記増殖モジュールMの制限部位A及びBが、BstZ17I、SpeI、ClaI及びNruIからなる群、又は前記酵素と同一の切断部位を有する制限酵素(「イソシゾマー」)から選択される、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 前記制限部位X及びYが、PmeI及びAvrIIからなる群、又は前記酵素と同一の制限部位を有する制限酵素(「イソシゾマー」)から選択される、請求項1又は2記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターP1及びP2が、polh、p10及びpXIV最後期バキュロウイルスプロモーター、vp39バキュロウイルス後期プロモーター、vp39polhバキュロウイルス後期/最後期ハイブリッドプロモーター Pcap/polh、pcna、etl、p35、egt、da26バキュロウイルス初期プロモーター;CMV、SV40、UbC、EF−1α、RSVLTR、MT、PDS47、Ac5、PGAL及びPADHからなる群から選択される、請求項1乃至3のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- 前記終了配列T1及びT2が、SV40、HSVtk、又はBGH(ウシ成長ホルモン)から選択される、請求項1乃至4のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- ベクター又は宿主細胞へと組み込まれるための少なくとも1つの部位をさらに含む、請求項1乃至5のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- 前記組み込み部位が、Tn7のトランスポゾンエレメント、λ−インテグラーゼ特異的接着部位及びSSR(部位特異的リコンビナーゼ)、好ましくはcre−lox特異的組み換え(LoxP)部位又はFLPリコンビナーゼ特異的組み換え(FRT)部位、からなる群から選択される、請求項6記載のポリヌクレオチド。
- (a)polh及びp10から選択されるプロモーターP1及びP2、
(b)SV40及びHSVtkから選択される終了配列、
(c)BstZ17I、SpeI、ClaI及びNruIからなる群から選択される、増殖モジュールM中の制限部位A及びB、
(d)PmeI及びAvrIIからなる群から選択される制限部位X及びY、
(e)cre−lox及びTn7組み換え系から選択されるウイルス組み込みのための部位、
を含む、請求項1乃至7のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。 - 請求項1乃至8のいずれか一項記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
- 前記ウイルスが、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)、オートノマスパルボウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、レトロウイルス、ラジノウイルス、エプステインバーウイルス、レンチウイルス、セムリキフォレストウイルス及びバキュロウイルスからなる群から選択される、請求項9記載のベクター。
- 前記ベクターがバキュロウイルス発現ベクターである、請求項10記載のベクター。
- 2つのバキュロウイルス遺伝子v−cath及びchiAが機能破壊されている、請求項11記載のベクター。
- SSR(部位特異的リコンビナーゼ)に対する部位、好ましくはcre−lox部位特異的組み換えのためのLoxP部位をさらに含む、請求項9乃至12のいずれか一項記載のベクター。
- 前記cre−lox部位が、2つのバキュロウイルス遺伝子v−cath及びchiAの1つ又は両方に位置している、請求項12又は13記載のベクター。
- トランスポゾンエレメント、好ましくはTn7接着部位を含む、請求項9乃至14のいずれか一項記載のベクター。
- 前記ベクターが、配列番号1(pFBDM)の配列を有する、請求項9記載のベクター。
- 前記ベクターが、配列番号2(pUCDM)の配列を有する、請求項9記載のベクター。
- 請求項1乃至8のいずれか一項記載のポリヌクレオチド配列及び/又は請求項9乃至17のいずれか一項記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト細胞、げっ歯類細胞、ブタ細胞、ウシ細胞及びヒツジ細胞;C. elegans細胞;酵母菌細胞、好ましくは、S. cervisiae、S. pombe、C. albicans及びP. pastoris;昆虫細胞;及びE. coli細胞からなる群から選択される、請求項18記載の宿主細胞。
- 請求項1乃至8のいずれか一項記載のポリヌクレオチド配列及び/又は請求項9乃至17のいずれか一項記載のベクターを含む、組み換え動物。
- 哺乳動物、好ましくは、ヒト、げっ歯類、ブタ及びウシ、並びにC. elegansから選択される、請求項20記載の動物。
- (a)請求項9乃至17のいずれか一項記載の第一のベクターのMCS1及び/又はMCS2へと1つ以上の遺伝子をクローニングする工程、
(b)請求項9乃至17のいずれか一項記載の第二のベクターのMCS1及び/又はMCS2へと1つ以上の遺伝子をクローニングする工程
(c)前記第一のトランスファーベクター中の制限部位X及びYで、機能的配置全体を切り出す工程、
(d)増殖モジュールMで前記第二のトランスファーベクターを切断する工程、
(e)工程(c)で切り出された機能的配置を、工程(d)で切断された前記第二のベクターの増殖部位へとライゲーションし、それにより前記第一のトランスファーベクターの増殖モジュールと、前記第一及び第二のベクターの両方の発現カセットとを有する第三のトランスファーベクターを作製する工程、及び
(f)複数の発現カセットを有するトランスファーベクターを集合させるために、工程(a)から工程(e)を任意選択で反復する工程、
を含む、複数遺伝子発現カセットの作製方法。 - (a)請求項22記載の複数遺伝子発現カセットを作製する工程、及び
(b)前記遺伝子を同時に発現することができる宿主細胞へと前記複数遺伝子発現カセットを導入する工程、
を含む、in vitroでの多タンパク質複合体の製造方法。 - (a)請求項22記載の複数遺伝子発現カセットを作製する工程、及び
(b)前記遺伝子を同時に発現する動物へと前記複数遺伝子発現カセットを導入する工程、
を含む、in vivoでの多タンパク質複合体の製造方法。 - 遺伝子治療用の複数遺伝子導入ビヒクルを含む薬剤を調製するための、請求項1乃至8のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、及び/又は請求項9乃至17のいずれか一項記載のベクターの使用。
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