JP5152962B2 - 目的タンパク質の製造方法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、目的タンパク質の製造方法に関する。
バキュロウイルス遺伝子発現系は、真核生物である昆虫由来の細胞中で組換えタンパク質を生産するため、糖鎖付加、リン酸化などの翻訳後修飾が行われるため、活性を有する組換えタンパク質の大量生産に適している。
さらに効率よく組換え遺伝子の発現を行うために、カイコ発現系に利用されるカイコガ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）をＢＡＣ（Bacterial Artificial Choromosome）クローン化できるＢｍＮＰＶシャトルベクター（バクミド）が開発され、大腸菌体内でのクローニングや組換えウイルスの構築を迅速に行うことができるようになった（例えば、特許文献１参照）。
さらに効率よく組換え遺伝子の発現を行うために、カイコ発現系に利用されるカイコガ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）をＢＡＣ（Bacterial Artificial Choromosome）クローン化できるＢｍＮＰＶシャトルベクター（バクミド）が開発され、大腸菌体内でのクローニングや組換えウイルスの構築を迅速に行うことができるようになった（例えば、特許文献１参照）。
真核生物の細胞におけるタンパク質発現では、細胞内器官である小胞体においてタンパク質の翻訳後修飾が行われる。翻訳後修飾は各種の分子シャペロンによってなされており、例えば、糖鎖付加、ジスルフィド結合の形成、フォールディング等が挙げられる。
また、熱ショックに対する応答として、タンパク質の構造を正常に維持する作用を有する１種の分子シャペロンであるヒートショックプロテインが細胞質に発現することが知られている。
また、熱ショックに対する応答として、タンパク質の構造を正常に維持する作用を有する１種の分子シャペロンであるヒートショックプロテインが細胞質に発現することが知られている。
また、昆虫細胞を用いた目的タンパク質発現系において、目的タンパク質の回収率の向上を目指し、目的タンパク質を発現するプラスミドと分子シャペロンを発現するプラスミドとを用いて形質転換した細胞株が知られている。前記形質転換細胞株においては、目的タンパク質と分子シャペロンとが同時に安定的に発現していることで目的タンパク質の回収率が向上するとされている（例えば、非特許文献１参照）。
しかしながら、非特許文献１に記載の方法では、目的タンパク質と分子シャペロンとを同時に安定的に発現可能な細胞株を目的タンパク質に応じてそれぞれ確立する必要があり、また、目的タンパク質の回収率の点においても十分であるとは言い難かった。
本発明は、目的タンパク質の回収率が良好な目的タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
本発明は、目的タンパク質の回収率が良好な目的タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
本発明は、ｍｉｎｉＦレプリコンとバキュロウイルスＤＮＡと目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドと目的タンパク質発現用プロモーターとを含む目的タンパク質発現バクミドと、ｍｉｎｉＦレプリコンとバキュロウイルスＤＮＡと分子シャペロンをコードするポリヌクレオチドと前記目的タンパク質発現用プロモーターと比べて転写活性化がより早期であり且つ転写量がより少ない分子シャペロン発現用プロモーターとを含む分子シャペロン発現バクミドと、を昆虫由来の細胞に導入する工程を含む目的タンパク質の製造方法である。
前記目的タンパク質発現用プロモーターは、ポリヘドリンプロモーターであることが好ましい。また、前記分子シャペロン発現用プロモーターは、ＯｐＩＥ１又はＯｐＩＥ２であることが好ましい。また、前記バキュロウイルスＤＮＡは、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ又はＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡであることが好ましい。更に前記目的タンパク質発現バクミド及び前記分子シャペロン発現バクミドの少なくとも一方は、ウイルス由来のプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子の少なくとも１種を欠損しているバクミド変異体であることが好ましい。
特に、好ましい目的タンパク質の製造方法は、ｍｉｎｉＦレプリコン、バキュロウイルスＤＮＡ、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び目的タンパク質発現用プロモーターを含む目的タンパク質発現バクミドと、ｍｉｎｉＦレプリコン、バキュロウイルスＤＮＡ、分子シャペロンをコードするポリヌクレオチド、及び前記目的タンパク質発現用プロモーターと比べて転写活性化がより早期であり且つ転写量がより少ない分子シャペロン発現用プロモーターを含む分子シャペロン発現バクミドと、を昆虫由来の細胞に導入する工程を含み、前記分子シャペロン発現用プロモーターは、ＯｐＩＥ２プロモーターであり、前記分子シャペロンがＥＲｐ５７、Ｂｉｐ、又はＨＳＰ７０である当該目的タンパク質の製造方法である。
特に、好ましい目的タンパク質の製造方法は、ｍｉｎｉＦレプリコン、バキュロウイルスＤＮＡ、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び目的タンパク質発現用プロモーターを含む目的タンパク質発現バクミドと、ｍｉｎｉＦレプリコン、バキュロウイルスＤＮＡ、分子シャペロンをコードするポリヌクレオチド、及び前記目的タンパク質発現用プロモーターと比べて転写活性化がより早期であり且つ転写量がより少ない分子シャペロン発現用プロモーターを含む分子シャペロン発現バクミドと、を昆虫由来の細胞に導入する工程を含み、前記分子シャペロン発現用プロモーターは、ＯｐＩＥ２プロモーターであり、前記分子シャペロンがＥＲｐ５７、Ｂｉｐ、又はＨＳＰ７０である当該目的タンパク質の製造方法である。
本発明によれば、目的タンパク質の回収率が良好な目的タンパク質の製造方法を提供することができる。
本発明の目的タンパク質の製造方法は、ｍｉｎｉＦレプリコンとバキュロウイルスＤＮＡと目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドと目的タンパク質発現用プロモーターとを含む目的タンパク質発現バクミドと、ｍｉｎｉＦレプリコンとバキュロウイルスＤＮＡと分子シャペロンをコードするポリヌクレオチドと前記目的タンパク質発現用プロモーターと比べて転写活性化がより早期であり且つ転写量がより少ない分子シャペロン発現用プロモーターとを含む分子シャペロン発現バクミドと、を昆虫由来の細胞に導入する工程を含むものである。
目的タンパク質発現用プロモーターに比べて、分子シャペロン発現用プロモーターの転写活性化に要する時間が短く、且つ、プロモーター活性が低く転写量が少ないことにより、目的タンパク質を良好な回収率で製造することができる。
目的タンパク質発現用プロモーターに比べて、分子シャペロン発現用プロモーターの転写活性化に要する時間が短く、且つ、プロモーター活性が低く転写量が少ないことにより、目的タンパク質を良好な回収率で製造することができる。
本発明においてｍｉｎｉＦレプリコンは、大腸菌ＤＨ５αＦ’ＩＱより分離したプラスミド由来の配列であって複製に必要な領域を意味する。このｍｉｎｉＦレプリコンは、例えばＦ’レプリコンから得ることができる。このｍｉｎｉＦレプリコンの構造は、例えば特開２００４−１７３５０７号公報に開示されている。
バキュロウイルスＤＮＡとしては、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ又はＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡであることが好ましい。ＢｍＮＰＶ ＤＮＡとＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡは本発明におけるバクミドの使用目的によって適宜選択可能である。
ここでＢｍＮＰＶは、蚕の幼虫、蚕の蛹および蚕の培養細胞に感染して、感染細胞の核内に多角体をつくるカイコガ核多角体病ウイルス（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus）を意味し、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡは、ＢｍＮＰＶのＤＮＡ配列を意味する。
またＡｃＭＮＰＶは、オートグラファ・カルフォルニカ多角体病ウイルス（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus）を意味し、ＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡは、ＡｃＭＮＰＶのＤＮＡ配列を意味する。
ここでＢｍＮＰＶは、蚕の幼虫、蚕の蛹および蚕の培養細胞に感染して、感染細胞の核内に多角体をつくるカイコガ核多角体病ウイルス（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus）を意味し、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡは、ＢｍＮＰＶのＤＮＡ配列を意味する。
またＡｃＭＮＰＶは、オートグラファ・カルフォルニカ多角体病ウイルス（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus）を意味し、ＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡは、ＡｃＭＮＰＶのＤＮＡ配列を意味する。
本発明における分子シャペロン発現バクミドは分子シャペロンをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１種を含む。分子シャペロンをコードするポリヌクレオチドは、複数の分子シャペロンをコードするものであってもよい。
前記分子シャペロンは、真核生物の細胞に由来する分子シャペロンであれば、特に制限なく用いることができ、特定のタンパク質に特異的な分子シャペロンであっても、タンパク質全般を対象とする普遍的な分子シャペロンであってもよい。更に、普遍的な分子シャペロンは、構成的に存在するものであっても、ヒートショック等の特定の条件下に発現する誘導性のものであってもよい。
前記分子シャペロンは、真核生物の細胞に由来する分子シャペロンであれば、特に制限なく用いることができ、特定のタンパク質に特異的な分子シャペロンであっても、タンパク質全般を対象とする普遍的な分子シャペロンであってもよい。更に、普遍的な分子シャペロンは、構成的に存在するものであっても、ヒートショック等の特定の条件下に発現する誘導性のものであってもよい。
また本発明における分子シャペロンは、目的タンパク質に応じて適宜選択することができる。例えば、目的タンパク質が糖タンパク質の場合には、糖修飾及び／又は糖タンパク質のフォールディングに関与する分子シャペロンを好ましく用いることができ、具体的には、カルネキシン、カルレティキュリン等を挙げることができる。また、例えば、目的タンパク質がジスルフィド結合を有するタンパク質の場合には、ジスルフィド結合形成に関与する分子シャペロンを好ましく用いることができ、具体的には、ＥＲｐ５７、ＥＲｐ７２等のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーのタンパク質を挙げることができる。また、例えば、目的タンパク質の糖鎖付加部位がＮ末端側からおよそ５０アミノ酸残基より下流に位置する場合には、糖タンパク質のフォールディングに関与する特定の分子シャペロンを好ましく用いることができ、具体的には、ＢｉＰ等を挙げることができる。
前記分子シャペロンをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ヒト由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として適切なプライマーを用いたＰＣＲを適用することで調製することができる。
本発明における目的タンパク質発現用プロモーターとしては、目的タンパク質遺伝子の転写活性化が可能であれば、公知のプロモーターを特に制限なく用いることができる。また、公知のプロモーター改変方法により、プロモーター活性を向上させた改変プロモーターであってもよい。
中でも目的タンパク質の発現効率の観点から、高いプロモーター活性を有するプロモーターであることが好ましい。具体的には、例えば、ポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等を挙げることができ、中でもポリヘドリンプロモーターを好ましく挙げることができる。
中でも目的タンパク質の発現効率の観点から、高いプロモーター活性を有するプロモーターであることが好ましい。具体的には、例えば、ポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等を挙げることができ、中でもポリヘドリンプロモーターを好ましく挙げることができる。
本発明における分子シャペロン発現用プロモーターは、前記目的タンパク質発現用プロモーターと比べて転写活性化がより早期であり且つ転写量がより少ないプロモーターであることを特徴としている。
ここで転写量が少ないプロモーターであるとは、プロモーターの下流に位置する分子シャペロン遺伝子のｍＲＮＡへの転写活性が低く、分子シャペロンの発現量が少ないことを意味する。
また、転写活性化がより早期であるとは、本発明における目的タンパク質発現バクミドと分子シャペロン発現バクミドとを昆虫由来の細胞に導入した後、目的タンパク質の発現までに要する遅延時間よりも、分子シャペロンの発現までに要する遅延時間の方が短いことを意味する。これにより分子シャペロンが充分量発現された後に、目的タンパク質を発現させることができ、分子シャペロンによる目的タンパク質のフォールディングがより効率的に行われる。
一般的に、プロモーターには常に発現しているものと限られた時期に発現するものとがあることが知られている。常に発現しているプロモーターとしては、例えば、アクチンプロモーター等を挙げることができる。
また、限られた時期に発現するプロモーターとしては、例えば、感染後３６時間程度から発現を開始するポリヘドリンプロモーター、感染後１２時間程度から発現を開始するＧＰ６４プロモーター、感染直後から発現し、その後４２時間程度で発現が終了するＯｐＩＥ２プロモーター、等を挙げることができる。
また、限られた時期に発現するプロモーターとしては、例えば、感染後３６時間程度から発現を開始するポリヘドリンプロモーター、感染後１２時間程度から発現を開始するＧＰ６４プロモーター、感染直後から発現し、その後４２時間程度で発現が終了するＯｐＩＥ２プロモーター、等を挙げることができる。
本発明においては、目的タンパク質の回収率の点から、分子シャペロン発現用プロモーターの活性化に要する時間は、ウイルスの増幅を阻害しない限り、短い方が好ましい。
本発明において目的タンパク質発現用プロモーターと分子シャペロン発現用プロモーターの組合せは、目的タンパク質や発現させる昆虫由来の細胞の種類等に応じて適宜選択することができるが、目的タンパク質の回収率の観点から、例えば、目的タンパク質発現用プロモーターとしてポリヘドリンプロモーターを用いる場合、分子シャペロン発現用プロモーターとしてＯｐＩＥ１、ＯｐＩＥ２等を用いることが好ましく、ＯｐＩＥ２を用いることがより好ましい。
ここでＯｐＩＥ１及びＯｐＩＥ２は、オルギアシュードツガタ多角体病ウイルス（Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus）に由来するプロモーターを意味する。
ここでＯｐＩＥ１及びＯｐＩＥ２は、オルギアシュードツガタ多角体病ウイルス（Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus）に由来するプロモーターを意味する。
本発明における目的タンパク質発現バクミドは、ｍｉｎｉＦレプリコン、バキュロウイルスＤＮＡ及びトランスポゾンの付着部位から構成されたバクミドの基本骨格に対して、両末端に配置されたトランスポゼースの認識配列と目的タンパク質発現用プロモーターと目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む挿入フラグメントを相同組換えして得ることができる。
また、分子シャペロン発現バクミドも同様に、バクミドの基本骨格に対して、分子シャペロン発現用プロモーターと分子シャペロンをコードするポリヌクレオチドを含む挿入フラグメントを相同組換えして得ることができる。
また、分子シャペロン発現バクミドも同様に、バクミドの基本骨格に対して、分子シャペロン発現用プロモーターと分子シャペロンをコードするポリヌクレオチドを含む挿入フラグメントを相同組換えして得ることができる。
ｍｉｎｉＦレプリコン、バキュロウイルスＤＮＡ及びトランスポゾンの付着部位から構成されたバクミドの基本骨格は、公知の方法で作製することができ、例えば特開２００４−１７３５０７号公報や、Biochemical and Biophysica Research Communications 326 (2005) p564-569などに記載されている。
また、バクミドの基本骨格に対する挿入フラグメントの相同組換えは公知の方法で行うことができる。例えば、国際公開２００７／０２９３６０号明細書に記載のλリコンビネーション系を好適に適用することができる。
また、バクミドの基本骨格に対する挿入フラグメントの相同組換えは公知の方法で行うことができる。例えば、国際公開２００７／０２９３６０号明細書に記載のλリコンビネーション系を好適に適用することができる。
本発明において、分子シャペロン発現用バクミド及び目的タンパク質発現バクミドの少なくとも一方は、ウイルス由来のプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子の少なくとも１種を欠損していることが好ましい。これにより、目的タンパク質の回収率をより向上させることができる。
ウイルス由来のプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子の少なくとも１つを欠損させる方法としては、例えば、国際公開第２００７/０２９３６０号明細書に記載の方法及びそれを適宜変更した方法を用いることができる。
ウイルス由来のプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子の少なくとも１つを欠損させる方法としては、例えば、国際公開第２００７/０２９３６０号明細書に記載の方法及びそれを適宜変更した方法を用いることができる。
上記目的タンパク質発現バクミドと分子シャペロン発現バクミドとを導入（感染）する昆虫由来の細胞としては、昆虫個体の細胞であっても、確立した細胞株であってもよく、目的等に応じて適宜選択することができる。
昆虫の種類としては、バクミドが感染しうる昆虫であれば特に制限はない。具体的には、例えば、バクミドがＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡを含む場合、スポドプテラ・フルギペルタ（Spodoptera frugiperda）及びイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）を挙げることができる。また、バクミドがＢｍＮＰＶ ＤＮＡを含む場合、カイコガ（Bombyx mori）を挙げることができる。
また、確立された細胞株としては、例えば、カイコガに由来するＢｍ５細胞及びＢｍＮ４細胞、スポドプテラ・フルギペルタに由来するＳｆ細胞、並びに、イラクサギンウワバに由来するＴｎ細胞等を挙げることができる。
目的タンパク質発現バクミドを昆虫由来の細胞に導入する方法としては、公知の方法を適用することができる。
例えば、確立された細胞株に導入する場合には、細胞を培養している培地に直接添加することで、目的タンパク質発現バクミドを昆虫由来の細胞に導入することができる。また、カイコガ個体の細胞に導入する場合には、カイコガの幼虫個体又はカイコガの蛹に目的タンパク質発現バクミドを含む溶液を直接接種することで導入することができる。
例えば、確立された細胞株に導入する場合には、細胞を培養している培地に直接添加することで、目的タンパク質発現バクミドを昆虫由来の細胞に導入することができる。また、カイコガ個体の細胞に導入する場合には、カイコガの幼虫個体又はカイコガの蛹に目的タンパク質発現バクミドを含む溶液を直接接種することで導入することができる。
本発明においては、昆虫由来の細胞によって生成された目的タンパク質を回収する回収工程を更に設けることが好ましい。
目的タンパク質の回収としては、特に制限なく公知の方法を適用することができる。このような回収工程には、例えば、Ｈｉｓタグ及びＦｌａｇタグのようなタグや、発現した目的タンパク質に対する抗体などを用いる方法や、イオン交換カラム及びアフィニティカラムなどによる精製方法など、公知の手段を用いることができる。
目的タンパク質の回収としては、特に制限なく公知の方法を適用することができる。このような回収工程には、例えば、Ｈｉｓタグ及びＦｌａｇタグのようなタグや、発現した目的タンパク質に対する抗体などを用いる方法や、イオン交換カラム及びアフィニティカラムなどによる精製方法など、公知の手段を用いることができる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、実施例中の％は特記しない限り、質量基準である。尚、市販のキットを使用した場合には、特記しない限り添付の取り扱い説明書にしたがって操作を行った。
（参考例）
＜システインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子欠損バクミド変異体の構築＞
［１］ｐＢｍＣＰＫＩ−ＣＡＴプラスミドの作製
野生型ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ（フナコシ社）を鋳型として、プライマーセットＡｃ０５１２３２（配列番号１５）−Ａｃ０５１２２９（配列番号１６）を用いてＰＣＲを行い、システインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子を含むＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲは１０×ＫＯＤバッファー、１００μＭ ｄＮＴＰ、１．２ｍＭ Ｍｇ２＋、１ｕｎｉｔ ＫＯＤｐｏｌ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、９４℃ ３０ｓｅｃ、６０℃ ３０ｓｅｃ、７４℃ ４５ｓｅｃを２５サイクルの条件で行った。増幅させた５７２ｂｐのＰＣＲフラグメントを１．５％アガロースゲル電気泳動した後、ゲルから切り出して精製した。次いで常法によりpT7Blue Vector（Novagen社製）に導入してシステインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子を含むｐＢｍＣＰＫＩプラスミドを得た。
＜システインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子欠損バクミド変異体の構築＞
［１］ｐＢｍＣＰＫＩ−ＣＡＴプラスミドの作製
野生型ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ（フナコシ社）を鋳型として、プライマーセットＡｃ０５１２３２（配列番号１５）−Ａｃ０５１２２９（配列番号１６）を用いてＰＣＲを行い、システインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子を含むＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲは１０×ＫＯＤバッファー、１００μＭ ｄＮＴＰ、１．２ｍＭ Ｍｇ２＋、１ｕｎｉｔ ＫＯＤｐｏｌ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、９４℃ ３０ｓｅｃ、６０℃ ３０ｓｅｃ、７４℃ ４５ｓｅｃを２５サイクルの条件で行った。増幅させた５７２ｂｐのＰＣＲフラグメントを１．５％アガロースゲル電気泳動した後、ゲルから切り出して精製した。次いで常法によりpT7Blue Vector（Novagen社製）に導入してシステインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子を含むｐＢｍＣＰＫＩプラスミドを得た。
次に、ｐＫＤ３（エール大学（米）のMary K. B. Berlyn博士から供与）とプライマーセットＣａｔ０５１２３０（配列番号１７）−Ｃａｔ０５１２３１（配列番号１８）を用いて上記と同様にＰＣＲを行い、クロラムフェニコール耐性遺伝子カセット（ＣＡＴ）を得た。
上記ｐＢｍＣＰＫＩプラスミドをＳｇｒＡＩ−ＰｓｈＡＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（例えば宝酒造のBlunting kit）で平滑末端化した後、この平滑化したｐＢｍＣＰＫＩプラスミドに、クロラムフェニコール耐性遺伝子カセットを挿入して連結し、プラスミドｐＢｍＣＰＫＩ−ＣＡＴを得た。
上記ｐＢｍＣＰＫＩプラスミドをＳｇｒＡＩ−ＰｓｈＡＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（例えば宝酒造のBlunting kit）で平滑末端化した後、この平滑化したｐＢｍＣＰＫＩプラスミドに、クロラムフェニコール耐性遺伝子カセットを挿入して連結し、プラスミドｐＢｍＣＰＫＩ−ＣＡＴを得た。
［２］ＣＰＫＩ−ＣＡＴフラグメントの作製
プラスミドｐＢｍＣＰＫＩ−ＣＡＴを鋳型として、プライマーセットＡｃ０５１２３２（配列番号１５）−Ａｃ０５１２２９（配列番号１６）を用いてＰＣＲを行い、システインプロテアーゼ遺伝子の一部と、キチナーゼ遺伝子の一部とがクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換わったシステインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子欠損用カセット（ＣＰＫＩ−ＣＡＴフラグメント）を得た。
プラスミドｐＢｍＣＰＫＩ−ＣＡＴを鋳型として、プライマーセットＡｃ０５１２３２（配列番号１５）−Ａｃ０５１２２９（配列番号１６）を用いてＰＣＲを行い、システインプロテアーゼ遺伝子の一部と、キチナーゼ遺伝子の一部とがクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換わったシステインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子欠損用カセット（ＣＰＫＩ−ＣＡＴフラグメント）を得た。
［３］ＢｍＮＰＶ Ｂａｃｍｉｄ Ｐ−Ｃ−の構築
ｂａｃｍｉｄ−ＢｍＮＰＶ ＤＮＡを含むＤＨ１０Ｂコンピテントセル（インビトロジェン社）にRed recombinase plasmid ｐＫＤ４６（エール大学（米）のMary K.B. Berlyn 博士から供与）をトランスフォーメーションし、Ｋａｎ／Ａｍｐ ＬＢプレート（カナマイシン、アンピシリン：各５０μg/ml）上で、３０℃一晩培養した。生育したコロニーのうちｂａｃｍｉｄ−ＢｍＮＰＶとｐＫＤ４６が含まれているものを選択し、０．２％アラビノース存在下のＳＯＢ培地（カナマイシン、アンピシリン：各５０μg/ml）で、再度３０℃一晩培養した培養液（Ｄ６１０の値が０．５〜０．６）に氷冷１０％グリセロールを加えて、エレクトロポレーション用のコンピテントセルを作製した。
作製したコンピテントセル５０μｌに、５００ｎｇの精製ＣＰＫＩ−ＣＡＴフラグメントを常法に従ってヒートショック法によってトランスフォーメーションし、５００μｌのＳＯＣを添加後、３７℃１時間培養した。培養液をＣｍ／Ｋａｎ ＬＢプレート一枚に付き２５０μｌでプレーティング後、３７℃で一晩培養した。形成されたコロニーを拾い、システインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子欠損バクミド変異体（ＢｍＮＰＶ Ｂａｃｍｉｄ Ｐ−Ｃ−）を単離した。
ｂａｃｍｉｄ−ＢｍＮＰＶ ＤＮＡを含むＤＨ１０Ｂコンピテントセル（インビトロジェン社）にRed recombinase plasmid ｐＫＤ４６（エール大学（米）のMary K.B. Berlyn 博士から供与）をトランスフォーメーションし、Ｋａｎ／Ａｍｐ ＬＢプレート（カナマイシン、アンピシリン：各５０μg/ml）上で、３０℃一晩培養した。生育したコロニーのうちｂａｃｍｉｄ−ＢｍＮＰＶとｐＫＤ４６が含まれているものを選択し、０．２％アラビノース存在下のＳＯＢ培地（カナマイシン、アンピシリン：各５０μg/ml）で、再度３０℃一晩培養した培養液（Ｄ６１０の値が０．５〜０．６）に氷冷１０％グリセロールを加えて、エレクトロポレーション用のコンピテントセルを作製した。
作製したコンピテントセル５０μｌに、５００ｎｇの精製ＣＰＫＩ−ＣＡＴフラグメントを常法に従ってヒートショック法によってトランスフォーメーションし、５００μｌのＳＯＣを添加後、３７℃１時間培養した。培養液をＣｍ／Ｋａｎ ＬＢプレート一枚に付き２５０μｌでプレーティング後、３７℃で一晩培養した。形成されたコロニーを拾い、システインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子欠損バクミド変異体（ＢｍＮＰＶ Ｂａｃｍｉｄ Ｐ−Ｃ−）を単離した。
（実施例１）
＜分子シャペロン発現バクミドの調製＞
−ＥＲｐ５７発現バクミドの調製−
分子シャペロンＥＲｐ５７をコードするポリヌクレオチドを、ヒト胃由来ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、下記表１に示したプライマーセット（配列番号１及び配列番号２）と、ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、９５℃で３分間保持した後、９５℃ ３０秒、５６℃ ４０秒、７２℃ ２分３０秒を３２サイクルの条件でＰＣＲを行うことによって調製した。この断片を常法によりｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）に挿入した。
＜分子シャペロン発現バクミドの調製＞
−ＥＲｐ５７発現バクミドの調製−
分子シャペロンＥＲｐ５７をコードするポリヌクレオチドを、ヒト胃由来ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、下記表１に示したプライマーセット（配列番号１及び配列番号２）と、ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、９５℃で３分間保持した後、９５℃ ３０秒、５６℃ ４０秒、７２℃ ２分３０秒を３２サイクルの条件でＰＣＲを行うことによって調製した。この断片を常法によりｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）に挿入した。
・ＯｐＩＥ２プロモーターを有するデスティネーションベクターの調製
ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）を鋳型とし、下記表２に示したＰＣＲプライマーセット（配列番号３及び配列番号４）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製）を用いて、９５℃ ２分の後、９５℃ ３０秒、５５℃ ４０秒、６８℃ １分３０秒を３０サイクルの条件でＰＣＲを行い、ＯｐＩＥ２プロモーターを含むポリヌクレオチドを得た。
また、ｐＤＥＳＴ８（インビトロジェン社製）を鋳型とし、下記表２に示したＰＣＲプライマーセット（配列番号５及び６）と、ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、９５℃ ２分の後、９５℃ ３０秒、５５℃ ４０秒、７２℃ ８分を３２サイクルの条件でＰＣＲを行い、ｐＤＥＳＴ８のデスティネーションベクター部分を増幅した。
上記で得られたＯｐＩＥ２プロモーターを含むポリヌクレオチドとｐＤＥＳＴ８のデスティネーションベクター部分とを、制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIIIでそれぞれ処理し、DNA Ligation Kit（タカラバイオ社製）を用いてライゲーション処理を行い、ＯｐＩＥ２プロモーターを含むデスティネーションベクターｐＤＩＥを得た。
ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）を鋳型とし、下記表２に示したＰＣＲプライマーセット（配列番号３及び配列番号４）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製）を用いて、９５℃ ２分の後、９５℃ ３０秒、５５℃ ４０秒、６８℃ １分３０秒を３０サイクルの条件でＰＣＲを行い、ＯｐＩＥ２プロモーターを含むポリヌクレオチドを得た。
また、ｐＤＥＳＴ８（インビトロジェン社製）を鋳型とし、下記表２に示したＰＣＲプライマーセット（配列番号５及び６）と、ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、９５℃ ２分の後、９５℃ ３０秒、５５℃ ４０秒、７２℃ ８分を３２サイクルの条件でＰＣＲを行い、ｐＤＥＳＴ８のデスティネーションベクター部分を増幅した。
上記で得られたＯｐＩＥ２プロモーターを含むポリヌクレオチドとｐＤＥＳＴ８のデスティネーションベクター部分とを、制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIIIでそれぞれ処理し、DNA Ligation Kit（タカラバイオ社製）を用いてライゲーション処理を行い、ＯｐＩＥ２プロモーターを含むデスティネーションベクターｐＤＩＥを得た。
常法に従い、ゲートウェイ（登録商標）・クローニングによりｐＤＩＥに、上記で作製したＥＲｐ５７遺伝子を含むプラスミドからＥＲｐ５７遺伝子を挿入し、続いてＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）システムにより遺伝子発現カセットを、上記で得られたシステインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子欠損バクミド変異体（ＢｍＮＰＶ Ｂａｃｍｉｄ Ｐ−Ｃ−）に挿入することにより、分子シャペロン発現用プロモーターとしてＯｐＩＥ２を含み、分子シャペロンとしてＥＲｐ５７を発現する分子シャペロン発現バクミドを得た。
−Ｂｉｐ発現バクミドの調製−
ＥＲｐ５７発現バクミドの調製において、上記表１に示したプライマーセットの代わりに下記表３に示すプライマーセット（配列番号7及び配列番号８）を用いて調製した分子シャペロンＢｉｐをコードするポリヌクレオチドを用いた以外は同様にして、分子シャペロンとしてＢｉｐを発現する分子シャペロン発現バクミドを得た。
ＥＲｐ５７発現バクミドの調製において、上記表１に示したプライマーセットの代わりに下記表３に示すプライマーセット（配列番号7及び配列番号８）を用いて調製した分子シャペロンＢｉｐをコードするポリヌクレオチドを用いた以外は同様にして、分子シャペロンとしてＢｉｐを発現する分子シャペロン発現バクミドを得た。
−ＨＳＰ７０発現バクミドの調製−
ＥＲｐ５７発現バクミドの調製において、上記表１に示したプライマーセットの代わりに下記表４に示すプライマーセット（配列番号９及び配列番号１０）を用いて調製した分子シャペロンＨＳＰ７０を用いた以外は同様にして、分子シャペロンとしてＨＳＰ７０を発現する分子シャペロン発現バクミドを得た。
ＥＲｐ５７発現バクミドの調製において、上記表１に示したプライマーセットの代わりに下記表４に示すプライマーセット（配列番号９及び配列番号１０）を用いて調製した分子シャペロンＨＳＰ７０を用いた以外は同様にして、分子シャペロンとしてＨＳＰ７０を発現する分子シャペロン発現バクミドを得た。
−ＣＮＸ発現バクミドの調製−
ＥＲｐ５７発現バクミドの調製において、上記表１に示したプライマーセットの代わりに下記表５に示すプライマーセット（配列番号１１及び配列番号１２）を用いて調製した分子シャペロンＣＮＸを用いた以外は同様にして、分子シャペロンとしてＣＮＸを発現する分子シャペロン発現バクミドを得た。
ＥＲｐ５７発現バクミドの調製において、上記表１に示したプライマーセットの代わりに下記表５に示すプライマーセット（配列番号１１及び配列番号１２）を用いて調製した分子シャペロンＣＮＸを用いた以外は同様にして、分子シャペロンとしてＣＮＸを発現する分子シャペロン発現バクミドを得た。
−ＣＲＴ発現バクミドの調製−
ＥＲｐ５７発現バクミドの調製において、上記表１に示したプライマーセットの代わりに下記表６に示すプライマーセット（配列番号１３及び配列番号１４）を用いて調製した分子シャペロンＣＲＴを用いた以外は同様にして、分子シャペロンとしてＣＲＴを発現する分子シャペロン発現バクミドを得た。
ＥＲｐ５７発現バクミドの調製において、上記表１に示したプライマーセットの代わりに下記表６に示すプライマーセット（配列番号１３及び配列番号１４）を用いて調製した分子シャペロンＣＲＴを用いた以外は同様にして、分子シャペロンとしてＣＲＴを発現する分子シャペロン発現バクミドを得た。
＜ＧＦＰｕｖ-β３ＧｎＴ２融合タンパク質発現バクミドの調製＞
J.Biotechnol. 129, p681−688, 2007に記載の方法に従ってＧＦＰｕｖ-β３ＧｎＴ２融合タンパク質を発現するバクミドを調製した。このバクミドにおいてモデルタンパク質（目的タンパク質）であるＧＦＰｕｖ-β３ＧｎＴ２融合タンパク質はポリヘドリンプロモーターによって発現調節を受けている。
J.Biotechnol. 129, p681−688, 2007に記載の方法に従ってＧＦＰｕｖ-β３ＧｎＴ２融合タンパク質を発現するバクミドを調製した。このバクミドにおいてモデルタンパク質（目的タンパク質）であるＧＦＰｕｖ-β３ＧｎＴ２融合タンパク質はポリヘドリンプロモーターによって発現調節を受けている。
＜ＧＦＰｕｖ-β３ＧｎＴ２融合タンパク質の発現＞
得られた分子シャペロン発現バクミド１μｇと、ＧＦＰｕｖ-β３ＧｎＴ２融合タンパク質を発現するバクミド１μｇとを、カイコガの幼虫（四齢）へ注射器で導入した。７日後、カイコガの幼虫の体液から発現したタンパク質を常法により回収し、遠心分離により精製した。
次いで発現したタンパク質について、Biosci. Biotechnol. Biochem. 67、ｐ2388−2395、2003に記載の方法により、β３ＧｎＴ２活性を測定した。結果を図１に示した。
得られた分子シャペロン発現バクミド１μｇと、ＧＦＰｕｖ-β３ＧｎＴ２融合タンパク質を発現するバクミド１μｇとを、カイコガの幼虫（四齢）へ注射器で導入した。７日後、カイコガの幼虫の体液から発現したタンパク質を常法により回収し、遠心分離により精製した。
次いで発現したタンパク質について、Biosci. Biotechnol. Biochem. 67、ｐ2388−2395、2003に記載の方法により、β３ＧｎＴ２活性を測定した。結果を図１に示した。
（比較例１）
実施例１のＧＦＰｕｖ-β３ＧｎＴ２融合タンパク質の発現において、分子シャペロン発現バクミドの代わりに、発現用遺伝子を含まないバクミドを用いた以外は実施例１と同様にして、ＧＦＰｕｖ-β３ＧｎＴ２融合タンパク質を発現させ、β３ＧｎＴ２活性を測定した。結果を図１に示した。
実施例１のＧＦＰｕｖ-β３ＧｎＴ２融合タンパク質の発現において、分子シャペロン発現バクミドの代わりに、発現用遺伝子を含まないバクミドを用いた以外は実施例１と同様にして、ＧＦＰｕｖ-β３ＧｎＴ２融合タンパク質を発現させ、β３ＧｎＴ２活性を測定した。結果を図１に示した。
図１において、ＧＦＰはＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合タンパク質発現用バクミド、Ｂａｃｍｉｄは発現用遺伝子を含まないバクミドを、また、ＥＲｐ５７等は分子シャペロン発現バクミドをそれぞれ接種したことを示す。
図１から、目的タンパク質発現バクミドとしてＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合タンパク質発現バクミドを用い、分子シャペロン発現バクミドとしてＥＲｐ５７、Ｂｉｐ及びＨＳＰ７０発現バクミドを用いることによって、目的タンパク質であるＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合タンパク質を良好な回収率で得られることが分かる。
図１から、目的タンパク質発現バクミドとしてＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合タンパク質発現バクミドを用い、分子シャペロン発現バクミドとしてＥＲｐ５７、Ｂｉｐ及びＨＳＰ７０発現バクミドを用いることによって、目的タンパク質であるＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合タンパク質を良好な回収率で得られることが分かる。
Claims (6)
- ｍｉｎｉＦレプリコンと、バキュロウイルスＤＮＡと、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、目的タンパク質発現用プロモーターとを含む目的タンパク質発現バクミドと、
ｍｉｎｉＦレプリコンと、バキュロウイルスＤＮＡと、分子シャペロンをコードするポリヌクレオチドと、前記目的タンパク質発現用プロモーターと比べて転写活性化がより早期であり且つ転写量がより少ない分子シャペロン発現用プロモーターとを含む分子シャペロン発現バクミドと、
を昆虫由来の細胞に導入する工程を含み、
前記分子シャペロン発現用プロモーターは、ＯｐＩＥ２プロモーターであり、
前記分子シャペロンがＥＲｐ５７、ＢｉＰ、又はＨＳＰ７０である、
目的タンパク質の製造方法。 - 前記目的タンパク質発現用プロモーターは、ポリヘドリンプロモーターである請求項１に記載の目的タンパク質の製造方法。
- 前記分子シャペロンが、ＥＲｐ５７又はＢｉＰである請求項１又は請求項２に記載の目的タンパク質の製造方法。
- 前記バキュロウイルスＤＮＡは、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ又はＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡである請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の目的タンパク質の製造方法。
- 前記昆虫細胞がカイコガの細胞である請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の目的タンパク質の製造方法。
- 前記目的タンパク質発現バクミド及び前記分子シャペロン発現バクミドの少なくとも一方は、ウイルス由来のプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子の少なくとも１種を欠損しているバクミド変異体である請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の目的タンパク質の製造方法。
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