KR102275815B1 - 목적 단백질의 과발현 유도용 재조합 벡터 및 이를 이용한 곤충세포에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법 - Google Patents
목적 단백질의 과발현 유도용 재조합 벡터 및 이를 이용한 곤충세포에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 목적 단백질의 과발현 유도용 재조합 벡터 및 이를 이용한 곤충세포에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)인 배큘로바이러스의 hr3(homologous region 3) 염기서열 또는 hr5(homologous region 5) 염기서열; 및 상기 hr3 또는 hr5의 하류에 위치하고 p6.9 프로모터, vp39(viral protein39) 프로모터, 39K 프로모터 및 gp64(glycoprotein64) 프로모터로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 프로모터;를 포함하는 곤충 또는 곤충세포에서 목적 단백질의 과발현을 유도하는 재조합 배큘로바이러스 전이벡터, 상기 재조합 배큘로바이러스 전이벡터가 도입된 재조합 배큘로바이러스, 상기 재조합 배큘로바이러스가 도입된 곤충 또는 곤충세포 및 상기 재조합 배큘로바이러스 전이벡터를 이용하여 곤충 또는 곤충세포에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 목적 단백질의 과발현 유도용 재조합 벡터 및 이를 이용한 곤충세포에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
배큘로바이러스 발현 벡터 시스템(Baculovirus Expression System; BES)은 핵다각체병 바이러스(Nucleopolyhedrovirus; NPV) 유전자의 강력한 p10 유전자 프로모터 또는 다각체 단백질 유전자 프로모터(polyhedrin promoter)를 이용하는 발현 벡터 시스템으로 외래 단백질의 발현 효율이 매우 높을 뿐만 아니라, 고등 진핵세포인 곤충세포를 이용하므로 외래 단백질의 생물학적 및 면역학적 활성이 뛰어나기 때문에, 대장균(E. coli), 효모(Yeast), 포유 동물세포(Mammalian Cell) 등을 이용하는 다른 발현벡터 시스템에 비해 여러 가지 면에서 장점을 가지고 있어 크게 주목받고 있다.
곤충세포에서 외래 단백질을 발현시키는 경우, 대장균에서의 발현시스템과 유사한 정도로 단백질을 대량 생산할 수 있고, 당부가(glycosylation), 아실화(acylation), 이황화결합(disulfide bond formation)과 같은 번역 후 수식(post-translational modification)이 효과적으로 이루어져 대장균과 효모를 숙주세포로 이용한 경우와는 달리 천연형 단백질과 유사한 정도의 생물학적 활성을 갖는 외래 단백질을 대량으로 얻을 수 있어 산업적으로 매우 유용하다.
한편, 포유동물세포를 사용하는 재조합 단백질의 생산방법은 치료적 가치가 높은 단백질을 얻을 수 있지만, 포유동물 세포의 배양 및 유지를 위해 포유동물 유래의 각종 호르몬과 생장조절물질이 다량으로 필요하므로 상당한 비용이 요구된다는 문제점이 있다. 그러나 곤충 세포를 이용하는 경우 포유동물 세포와 유사한 번역 후 수식이 이루어진 목적 단백질을 저비용으로 생산할 수 있어 더욱 경제적인 방법으로 알려져 있다. 또한, 다른 발현계에 비해 가장 효율적으로 다중유전자의 발현(multi gene expression)이 가능하여 다양한 단백질의 동시발현이 요구되는 바이러스 유사입자(virus-like particle)의 제작 및 생산에 널리 이용되고 있다.
하지만 배큘로바이러스 발현 시스템에서 주로 이용하는 다각체 단백질 유전자 프로모터는 유용 단백질에 따라 발현수준이 다르게 나타나며 대부분 본래 다각체 단백질 유전자 프로모터에 의해 발현되는 다각체 단백질(polyhedral protein) 보다 낮은 수준으로 발현된다는 문제점이 있어, 기술적 한계점으로 지적되고 있다.
또한 현재까지 수많은 연구자들에 의해 프로모터 염기서열의 변경, 프로모터의 중첩, 발현증대를 위한 융합파트너(fusion partner)와의 융합발현, 조절 단백질과의 동시발현 등 다양한 시도가 이루어졌으나, 원래 다각체 단백질의 발현 수준에는 도달하지 못하는 실정이다.
이에 이러한 문제점을 해결하기 위한 방안으로 최근에는 다각체 단백질 코딩 유전자를 이용한 외래 단백질 발현 증대 기술이 개발되었으며, 이 기술은 다각체 단백질을 다양한 부분으로 조각내어 외래 단백질과 융합시킴으로써 발현량을 증대시키는 기술로서 외래 단백질이 반드시 부분 다각체 단백질과 융합 상태로 발현된다. 그러나 이러한 기술은 외래 단백질이 발현되는 경우, 외래 단백질 사용을 위해 반드시 융합된 부분 다각체 영역의 절단이라는 추가적 절단 및 정제공정이 수반되어야 하며, 외래 목적 단백질이 함께 절단되거나 그 활성을 잃게 되는 단점이 있고, 고가의 단백질 분해 효소를 이용해야 한다는 점에서 경제적으로 효율성이 낮다는 문제점이 있다.
또한, 배큘로바이러스 발현계에서 목적 단백질의 과발현에 주로 이용되는 다각체 단백질 유전자 프로모터 및 p10 유전자 프로모터는 감염말기 프로모터(very late promoter)로써 바이러스의 생활사 마지막 단계에서 폭발적으로 전사활성을 나타내는 프로모터들이다. 따라서 이들 프로모터의 전사활성이 최대치에 도달할 때에는 이미 숙주세포의 생리활성이 바이러스의 감염으로 매우 낮아지기 때문에 목적단백질의 발현량은 물론 폴딩(folding), 당쇄화, 이황화결합 등 번역 후 수식과정이 진행되는 시간이 매우 제한적일 수밖에 없다. 또한 숙주에 대한 병원성 바이러스를 이용하는 배큘로바이러스 발현계의 특성으로 다각체 단백질 유전자 프로모터 및 p10 유전자 프로모터와 같은 감염 말기에 높은 활성을 나타내는 감염 말기 프로모터를 이용할 경우, 숙주세포의 유용 단백질 발현능력을 충분히 활용하지 못하고 숙주 또는 숙주세포가 사멸되므로 실제적으로 목적 단백질의 생산량에는 한계가 있는 문제점이 있다.
따라서 여전히 외래 유용 목적 단백질의 활성을 높게 유지하면서 목적 단백질을 저비용으로 대량 생산할 수 있는 새로운 기술의 개발이 필요한 실정이다.
따라서 본 발명의 목적은 곤충 또는 곤충세포에서 목적 단백질의 과발현을 유도하는 재조합 배큘로바이러스 전이벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 전이벡터가 도입된 재조합 배큘로바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 재조합 배큘로바이러스에 감염된 곤충 또는 곤충세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 전이벡터를 이용하여 곤충 또는 곤충세포에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV) 배큘로바이러스의 hr3(homologous region 3) 염기서열 또는 hr5(homologous region 5) 염기서열; 및 상기 hr3 또는 hr5의 하류에 위치하고 p6.9 프로모터, vp39(viral protein 39) 프로모터, 39K 프로모터 및 gp64(glycoprotein 64) 프로모터로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 프로모터;를 포함하는, 곤충 또는 곤충세포에서 목적 단백질의 과발현을 유도하는 재조합 배큘로바이러스 전이벡터를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 hr3(homologous region 3) 염기서열은 서열번호 1로 이루어진 것이고, 상기 hr5(homologous region 5) 염기서열은 서열번호 8로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 p6.9 프로모터는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 vp39(viral protein 39) 프로모터는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 39K 프로모터는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 gp64(glycoprotein 64) 프로모터는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스 전이벡터는 서열번호 6으로 표시되는 배큘로바이러스의 다각체 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터를 더 포함하되, 상기 프로모터는 p6.9 프로모터, vp39(viral protein 39) 프로모터, 39K 프로모터 또는 gp64(glycoprotein 64) 프로모터의 하류에 위치하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스 전이벡터는 서열번호 7로 표시되는 Burst 서열을 더 포함하되, 상기 Burst 서열은 서열번호 6으로 표시되는 배큘로바이러스의 다각체 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터 하류에 위치하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 곤충세포는 BT1-Tn-5B1-4 세포, Hi5 세포, LD652Y 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, Se 세포, Kc1 세포, SL2 세포, Bm5 세포, BmN 세포 및 모기(mosquito) 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 곤충은 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 파밤나방(Spodoptera exigua), 배추좀나방(Plutella xylostella), 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni), 누에나방(Bombyx mori) 및 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 목적 단백질은 녹색형광단백질(EGFP) 또는 인유두종바이러스 16형 (human papilloma virus 16; HPV16)의 구조단백질인 L1 단백질일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 전이벡터가 도입된 재조합 배큘로바이러스를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 재조합 배큘로바이러스에 감염된 곤충 또는 곤충세포를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 곤충세포는 BT1-Tn-5B1-4 세포, Hi5 세포, LD652Y 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, Se 세포, Kc1 세포, SL2 세포, Bm5 세포, BmN 세포 및 모기(mosquito) 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 곤충은 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 파밤나방(Spodoptera exigua), 배추좀나방(Plutella xylostella), 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni), 누에나방(Bombyx mori) 및 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은, (1) 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 전이벡터에 목적 단백질을 코딩하는 염기서열을 클로닝하는 단계; (2) 상기 클로닝된 배큘로바이러스 전이벡터를 이용하여 재조합 배큘로바이러스를 제조하는 단계; 및 (3) 상기 재조합 배큘로바이러스를 곤충 또는 곤충세포에 도입시키는 단계를 포함하는, 곤충 또는 곤충세포에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 목적 단백질은 녹색형광단백질(EGFP) 또는 인유두종바이러스 16형 (human papilloma virus 16; HPV16)의 구조단백질인 L1 단백질일 수 있다.
본 발명에 따른 과발현 벡터는 예방 또는 치료적 가치가 높은 외래 유용 단백질을 곤충 발현계에서 대량 발현이 가능한 효과가 있고, 기존 발현 벡터에 비해 이른 시기에 외래 유용 단백질의 과발현을 유도할 수 있어 숙주세포인 곤충세포의 세포사멸 유도 없이 유용 단백질을 고유한 형태로 생물학적 활성을 유지하면서 다량 발현시킬 수 있어 예방 또는 치료 목적의 항원과 같은 유용 목적 단백질들을 곤충세포를 이용하여 저비용 및 고효율로 생산할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에서 본 발명에서 제조한 재조합 발현벡터를 모식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 본 발명의 재조합 발현벡터에 의한 목적 유전자 EGFP의 과발현 정도를 형광현미경을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 유용단백질로서 인유두종바이러스 16형 (human papilloma virus 16; HPV16)의 구조단백질인 L1 항원을 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 발현벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서 제조한 재조합 발현벡터에 따른 HPV16 L1 단백질의 과발현 정도를 SDS-PAGE 전기영동 및 웨스턴 블랏(Western blot)을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 본 발명의 재조합 발현벡터에 의한 목적 유전자 EGFP의 과발현 정도를 형광현미경을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 유용단백질로서 인유두종바이러스 16형 (human papilloma virus 16; HPV16)의 구조단백질인 L1 항원을 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 발현벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서 제조한 재조합 발현벡터에 따른 HPV16 L1 단백질의 과발현 정도를 SDS-PAGE 전기영동 및 웨스턴 블랏(Western blot)을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 목적 단백질의 과발현 유도용 재조합 벡터 및 이를 이용한 곤충세포에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다는 점에 특징이 있다.
특히 본 발명은 종래 배큘로바이러스 발현 시스템에서 사용되던 다각체 단백질 유전자 프로모터에 비해 목적 단백질을 더 높은 수준으로 발현시켜 대량생산할 수 있는 새로운 목적 단백질의 과발현 유도용 재조합 벡터를 고안하였고, 이를 이용할 경우 곤충세포에서 목적 단백질을 빠른 시간 안에 대량 생산할 수 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명은 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV) 배큘로바이러스의 hr3(homologous region 3) 염기서열 또는 hr5(homologous region 5) 염기서열; 및 상기 hr3 또는 hr5의 하류에 위치하고 p6.9 프로모터, vp39(viral protein 39) 프로모터, 39K 프로모터 및 gp64(glycoprotein 64) 프로모터로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 프로모터;를 포함하는, 곤충 또는 곤충세포에서 목적 단백질의 과발현을 유도하는 재조합 배큘로바이러스 전이벡터를 제공한다.
앞서 기술한 바와 같이 본 발명자들은 종래 배큘로바이러스 발현 시스템에 의한 목적 단백질의 발현수준보다 더 우수한 과발현 효과를 얻을 수 있는 새로운 발현벡터를 개발하기 위해 연구하던 중, 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV) 배큘로바이러스의 hr3(homologous region 3) 또는 hr5(homologous region 5) 및 p6.9 유전자 프로모터, VP39 유전자 프로모터, 39k 유전자 프로모터 또는 gp64 유전자 프로모터를 함께 조합하여 이용할 경우, 유용 목적 단백질의 발현을 매우 효과적으로 증가시킬 수 있으며, 상기 목적 단백질을 융합 형태의 단백질이 아닌 목적 단백질의 고유한 형태로 대량 생산할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 상기 hr(homologous region) 서열은 배큘로바이러스의 게놈에 존재하는 반복된 염기서열 영역을 의미하며, hr1, hr2L, hr2R, hr3, hr4L, hr4R, hr5가 존재한다. 이들 hr 서열의 대부분이 바이러스 DNA 복제와 증식에서 중요한 역할을 수행하며 바이러스 또는 비바이러스 유전자의 전사 촉진자로 작용한다고 알려져 있다.
한편, 본 발명에서는 이들 hr(homologous region) 서열들 중에서, 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)의 hr3(homologous region 3) 또는 hr5(homologous region 5) 염기서열을 사용할 경우, 목적 단백질의 과발현 효과가 우수하다는 것을 확인하였고, 특히 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)의 hr3(homologous region 3) 염기서열을 사용할 경우, 가장 높은 과발현 효과를 확인하였으며, AcMNPV의 hr3 서열을 사용한 목적 단백질의 우수한 과발현 효과는 본 발명이 처음으로 규명한 것이다.
바람직하게, 본 발명에 따른 상기 hr3(homologous region 3)은 서열번호 1로 이루어진 염기서열이고, 상기 hr5(homologous region 5)은 서열번호 8로 이루어진 염기서열일 수 있으며, 상기 hr3 또는 hr5는 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있다.
본 발명에 따른 목적 단백질의 과발현 유도용 재조합 벡터는 AcMNPV의 hr3 또는 hr5 염기서열 하류에 프로모터가 위치되어 있으며, 상기 프로모터는 p6.9 프로모터, vp39(viral protein 39) 프로모터, 39K 프로모터 및 gp64(glycoprotein 64) 프로모터로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 프로모터를 포함하도록 조합하였다.
상기 프로모터 중 p6.9 프로모터는 DNA와 결합 후 배큘로바이러스의 budded virus (BV)에 내재시키는 역할을 하는 p6.9 단백질을 발현하는 프로모터로서 감염 말기인 late 시기에 전사 활성을 갖는다고 알려져 있고, vp39 프로모터는 배큘로바이러스의 major capsid protein인 VP39 단백질을 발현하기 위한 프로모터로서 감염 말기인 late 시기에 전사 활성을 갖는다.
또한, 39K 프로모터는 DNA 결합과 배큘로바이러스의 late gene의 발현을 촉진하는 역할을 하는 39K 단백질을 발현하기 위한 프로모터로서 late 시기 이전에 전사 활성을 갖는다고 알려져 있고, gp64 프로모터는 본래 배큘로바이러스의 budded virus(BV)가 숙주세포에 침투하는 과정에 필수적으로 요구되는 envelope fusion protein인 GP64 단백질을 발현하기 위한 프로모터로서 주로 감염 초기인 early 시기와 late 시기에 전사 활성을 갖는다.
이들 프로모터는 배큘로바이러스 발현계에서 외래 목적 단백질의 과발현을 위해 이용되며 감염 가장 마지막 단계인 very late 시기에 전사활성을 나타내는 다각체단백질 프로모터 또는 p10 프로모터에 비해 빠른 시기에 전사활성을 나타낼 수 있다.
따라서 본 발명에서는 목적 단백질의 과발현을 위한 재조합 벡터에 다각체단백질 프로모터 또는 p10 프로모터에 비해 빠른 시기에 전사활성을 갖는 상기와 같은 프로모터를 포함하도록 하였고, 상기 프로모터를 AcMNPV hr3(homologous region 3) 또는 AcMNPV hr5(homologous region 5)와 함께 사용할 경우, 목적 단백질을 짧은 시간 안에 매우 효과적으로 과발현시킬 수 있음을 처음으로 규명하였으며, 나아가 여기에 다각체 단백질 프로모터와 프로모터 활성 증진 효과가 있는 것으로 알려진 그 프로모터 일부 서열인 Burst 서열을 추가할 경우, 목적 단백질의 발현량을 더욱 증가시킬 수 있다는 것도 처음으로 규명하였다.
본 발명의 일실시예에 따르면, AcMNPV의 hr3 또는 hr5; p6.9 프로모터, vp39 프로모터, 39K 프로모터 또는 gp64 프로모터; 다각체 단백질 프로모터; 및 Burst 서열;을 포함하는 다양한 조합의 재조합 벡터를 제조하였고, 이때 목적단백질로 녹색형광단백질인 EGFP를 Burst 서열 하류에 위치하도록 한 후, 각 재조합 벡터를 배큘로바이러스에 도입하여 재조합 배큘로바이러스를 제조한 후, 재조합 배큘로바이러스를 곤충세포에 감염시켜 곤충세포에서 본 발명의 재조합 벡터에 따른 EGFP의 과발현 수준을 측정하였다.
그 결과, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 AcMNPV의 hr3 또는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 hr5 서열이 제거된 벡터의 경우, 다른 재조합 벡터들을 사용한 군들에 비해 EGFP의 발현 수준이 미비한 것으로 나타났고, p6.9 프로모터, vp39 프로모터, 39K 프로모터 또는 gp64 프로모터 중에서 p6.9 프로모터를 사용한 군이 높은 발현수준을 보이는 것으로 나타났으며, 특히 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 AcMNPV의 hr3를 사용한 군이 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 BmNPV의 hr3를 사용한 경우에 비해 더 높은 단백질의 발현수준을 보이는 것으로 나타났다.
따라서 본 발명자들은 목적 단백질의 과발현을 위한 최적의 재조합 벡터는 AcMNPV의 hr3; p6.9 프로모터; 다각체 단백질 프로모터; 및 Burst 서열을 순차적으로 포함하는 재조합 벡터임을 알 수 있었다.
본 발명에서 사용할 수 있는 프로모터로서, 상기 p6.9 프로모터는 바람직하게 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 사용할 수 있고, 상기 vp39(viral protein 39) 프로모터는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 사용할 수 있으며,상기 39K 프로모터는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것을 사용할 수 있고, 상기 gp64(glycoprotein 64) 프로모터는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것을 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 과발현 벡터는 배큘로바이러스의 다각체 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터를 더 포함할 수 있는데, 상기 배큘로바이러스의 다각체 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열일 수 있고, 상기 p6.9 프로모터, vp39(viral protein 39) 프로모터, 39K 프로모터 또는 gp64(glycoprotein 64) 프로모터의 하류에 위치한다.
또한, 본 발명의 과발현 벡터는 Burst 서열을 더 포함할 수 있는데, 상기 Burst 서열은 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터 내 존재하는 일부분으로써 번역개시 부위와 TAAG 사이에 위치하는 서열이며, 배큘로바이러스의 감염말기에 V1f-1이 Burst 서열에 특이적으로 결합하여 전사를 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 Burst 서열은 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어지 있으며, 상기 Burst 서열은 배큘로바이러스의 다각체 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터 하류에 위치하고, 서열번호 7의 염기서열은 CTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAAT인 BS(burst sequence) 서열이 4번 반복된 염기서열이다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 곤충 또는 곤충세포에서 목적 단백질의 과발현을 유도하는 재조합 배큘로바이러스 전이벡터를 이용하여 제조한 재조합 배큘로바이러스를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 배큘로바이러스에 감염된 곤충 또는 곤충세포를 제공할 수 있다.
상기 곤충은 이에 제한되지는 않으나, 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 파밤나방(Spodoptera exigua), 배추좀나방(Plutella xylostella), 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni), 누에나방(Bombyx mori) 및 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 곤충세포는 이에 제한되지는 않으나, BT1-Tn-5B1-4 세포, Hi5 세포, LD652Y 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, Se 세포, Kc1 세포, SL2 세포, Bm5 세포, BmN 세포 및 모기(mosquito) 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 Sf9 세포를 사용하였다.
본 발명에서 상기 "배큘로바이러스(baculovirus)"는 사람이나 척추동물에는 병원성이 없으며, 곤충에 대해서만 병원성을 가지고 있는 곤충 병원성 바이러스를 총칭하는 의미이다. 배큘로바이러스는 크게 핵다각체병 바이러스(Nucleopolyhedrovirus: NPV)와 과립병바이러스(Granulovirus: GV)로 나누어지며, 본 발명에서의 배큘로바이러스는 상기 핵다각체병 바이러스를 의미한다.
또한 상기 "배큘로바이러스의 다각체 단백질"은 감염 말기에 곤충 세포의 핵으로부터 대량 합성되어지는 배큘로 바이러스 다각체의 구조단백질로서(Smith et al., 1993, J. Virol., 46, 584-593), 예를 들어, 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)의 다각체 단백질, 파밤나방(Spodoptera exigua) 핵다각체병 바이러스의 다각체 단백질(Elisabeth et al., 1992, J. gen. Viral., 13, 2813-2821), 누에(Bombix mori) 핵다각체병 바이러스의 다각체 단백질(Iatrou et al., 1985, J. Virol., 54, 436-445) 등을 들 수 있으며, 본 발명에서는 바람직하게는 상기 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(AcMNPV)의 다각체 단백질을 이용한다.
또한 본 발명의 상기 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 프로모터 부위는 당업자라면 용이하게 인식할 수 있다. 즉, ATG 모티프를 포함하는 추정의 개시코돈이 확인되어 있고, 이 개시코돈으로부터 상류 부위가 추정 프로모터 부위이다.
상기 "배큘로바이러스 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터"는 상기 다각체 단백질의 전사 및 기능적 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미하며, 바람직하게는 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(AcMNPV) 다각체 단백질의 구조 유전자 상류 약 100 bp 서열 부위, 보다 바람직하게는 상류(upstream) -1 bp 내지 -52 bp 부위를 포함한다.
또한 본 발명의 상기 "배큘로바이러스 전이 벡터(baculovirus transfer vector)"는 다각체 단백질의 일부와 융합된 발현 목적 단백질 또는 발현 목적 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 배큘로바이러스의 DNA 게놈으로 옮겨주는 역할을 수행하는 벡터를 의미하며, 또한 배큘로바이러스의 발현 벡터와 동일한 의미로 사용된다.
본 발명의 배큘로바이러스 전이 벡터에서 배큘로바이러스 다각체 단백질 코딩 유전자 서열은 상기 배큘로바이러스 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터와 작동 가능하게 연결된다.
상기 “작동 가능하게 연결된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역(translation)을 조절하게 된다.
본 발명의 전이 벡터는 발현 목적 단백질을 코딩하는 염기서열(뉴클레오타이드 서열)이 클로닝될 수 있는 하나 이상의 제한효소 인식 뉴클레오타이드 서열, 즉 다중클로닝자리(multiple cloning site, MCS) 서열이 포함된다. 상기 제한효소로는 예를 들어, Eag I, EcoR I, EcoR Ⅱ, BamH Ⅰ, Bgl Ⅱ, BstB Ⅰ, Hind Ⅲ, Taq Ⅰ, Not Ⅰ, HinfⅠ, Sau3A, Pac I, Pov Ⅱ, Sma I, Hae Ⅲ, Hga I, Alu I, EcoR V, EcoP15 I, Kpn I, Pst I, Sac I, Sal I, Sca I, Spe I, Sph I, Stu I, Xba I, Xho I 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 발현하고자 하는 목적 단백질은 예를 들어, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절인자, 혈액 응고 인자 또는 백신 단백질을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일실시예에서는 녹색형광단백질(EGFP) 또는 인유두종바이러스 16형 (human papilloma virus 16; HPV16)의 VLP 형성에 요구되는 L1 단백질을 목적 단백질로 하여, 이들 각 단백질의 과발현을 유도한다.
또한, 본 발명의 배큘로바이러스 전이 벡터는 선별을 위한 선택표지를 포함할 수 있으며, 이러한 선택표지로서는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자가 포함할 수 있다. 예를 들어 암피실린(ampicillin), 겐타마이신(gentamicin), 카베니실린(carbenicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 스트렙토마이신(streptomycin), 카나마이신(kanamycin), 제네티신(G418), 네오마이신(neomycin) 또는 테트라사이클린(tetracycline)에 대한 내성 유전자를 들 수 있다.
본 발명의 배큘로바이러스 전이 벡터는 이로부터 발현되는 재조합 목적 단백질의 용이한 정제를 위해 다른 서열과 추가적으로 융합될 수 있으며, 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(glutathione-Stransferase,GST), 말토스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP), FLAG, 6x His (hexahistidine), NusA (Nutilization substance A)및 Trx (thioredoxin)을 인코딩하는 서열 등이 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 통하여 신속하고, 용이하게 정제할 수 있다.
나아가 본 발명은 상기 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 전이벡터를 이용하여 곤충 또는 곤충세포에서 목적 단백질을 대량 생산할 수 있는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 (1) 본 발명의 상기 재조합 배큘로바이러스 전이벡터에 목적 단백질을 코딩하는 염기서열을 클로닝하는 단계; (2) 상기 클로닝된 배큘로바이러스 전이벡터를 이용하여 재조합 배큘로바이러스를 제조하는 단계; 및 (3) 상기 재조합 배큘로바이러스를 곤충 또는 곤충세포에 도입하는 단계를 포함할 수 있다.
먼저, 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 전이벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 제조될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명에 따른 상기 재조합 배큘로바이러스 전이벡터에 대한 구체적인 설명은 앞서 기술된 바와 같이, 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)의 hr3(homologous region 3) 염기서열 또는 hr5(homologous region 5) 염기서열; 및 상기 hr3 또는 hr5의 하류에 위치하고 p6.9 프로모터, vp39(viral protein 39) 프로모터, 39K 프로모터 및 gp64(glycoprotein 64) 프로모터로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 프로모터를 포함할 수 있다.
또한 상기 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 전이벡터는 배큘로바이러스의 다각체 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터를 더 포함할 수 있으며, 상기 프로모터는 p6.9 프로모터, vp39(viral protein 39) 프로모터, 39K 프로모터 또는 gp64(glycoprotein 64) 프로모터의 하류에 위치시킬 수 있다.
또한 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 전이벡터는 Burst 서열을 더 포함할 수 있으며, 상기 Burst 서열은 배큘로바이러스의 다각체 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터 하류에 위치시킬 수 있다.
바람직하게 상기 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 전이벡터는 AcMNPV 배큘로바이러스의 hr3 염기서열 또는 hr5 염기서열; p6.9 프로모터; 배큘로바이러스의 다각체 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터; Burst 서열; 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자 서열이 순차적으로 연결된 DNA 단편을 제조한 후, 이를 통상의 플라스미드 벡터 안으로 클로닝하여 제조할 수 있다.
다음으로, 클로닝된 배큘로바이러스 전이벡터를 이용하여 재조합 배큘로바이러스를 제조한다. 재조합 배큘로바이러스의 제작은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 제조될 수 있으며, 크게 전이벡터의 형태에 따라 대장균 내에서 Transposition(전위) 방법을 통해 제조되거나 곤충세포 내에서 상동재조합을 통해 제조될 수 있으며 본 발명의 효과는 재조합 배큘로바이러스의 제작 방법에 제한되지 않는다.
대장균 내에서의 재조합 배큘로바이러스의 제작은 실시예 2에서 표현된 바와 같이 제작될 수 있으며, 재조합 배큘로바이러스의 Budded virus(BV)를 생성시키기 위하여 재조합 배큘로바이러스 전체 게놈(genome) DNA를 숙주세포 내로 형질주입(transfection) 시킨다. 본 발명에서 형질주입 방법은 당업계에서 공지된 진핵세포내로 유전자를 전달하는 방법을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들어, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등을 사용할 수 있다. 형질주입에 사용되는 숙주세포는 바람직하게는 곤충세포주를 사용하며, 예컨대, Sf21 (Spodoptera frugiperda 21; Invitrogen), Sf9 (Spodoptera frugiperda 9;Invitrogen), High Five™ (BTI-Tn-5B1-4; Invitrogen) 등을 사용할 수 있으며, Sf9 세포주가 가장 바람직하다.
그런 뒤, 발현 목적 단백질을 코딩하는 DNA 분자를 갖는 재조합 배큘로바이러스를 선별 및 분리하는데, 이 과정은 당업계에 공지된 방법을 통해 수행할 수 있다.
이후, 재조합 배큘로바이러스를 곤충 또는 곤충세포에 접종(Infection) 하여 목적 단백질을 과발현시키고 대량 생산한다.
재조합 배큘로바이러스는 발현 목적 단백질의 생성 여부와 발현 목적 단백질을 코딩하는 염기서열이 바이러스 게놈 상에 존재하고 있는지 등을 소규모의 배양을 통해 확인한 후, 재조합 바이러스의 대량 배양 및 증식을 통해 목적 단백질을 대량으로 발현시켜 생성시킨다.
목적단백질의 대량 생산은 상기 재조합 배큘로바이러스를 숙주세포인 곤충세포에 접종시킨 후 감염된 곤충세포를 대량으로 배양함으로써 수행할 수 있다.
또한 목적 단백질의 발현 및 정제는 당업계에서 공지된 곤충세포의 배양 및 단백질의 정제방법을 사용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어, 본 발명에서 발현된 목적 단백질은 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)의 방법을 통해 신속하고 용이하게 정제할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
외래 단백질의 발현 증대를 위한 배큘로바이러스 유래 서열을 이용한 재조합 발현벡터의 제조
곤충 세포에서 목적하는 유용한 외래 단백질의 발현을 증대할 수 있는 배큘로바이러스 전이용 재조합 발현벡터를 제조하기 위해, 배큘로바이러스의 p6.9 유전자 프로모터, VP39 유전자 프로모터, 39k 유전자 프로모터, gp64 유전자 프로모터, 전사 촉진자인 hr3(homologous region 3) 서열, hr5(homologous region 5), Burst 서열 및 다각체 단백질 유전자의 프로모터 서열을 각각 달리 조합하여 하기 표 1 및 도 1에 기재한 바와 같은 다양한 조합의 재조합 발현벡터를 각각 제조하였다. 또한, 본 발명의 재조합 발현벡터에 의한 단백질 과발현 여부를 확인하기 위한 표지 단백질로서 녹색형광단백질(EGFP: enhanced green fluorescent protein)을 이용하였고, 대조군으로는 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터(polyhedrin 프로모터) 하류에 EGFP 유전자만을 발현시키는 pAc-EGFP 재조합 벡터를 제조하여 이용하였다.
또한 상기 표 1의 재조합 벡터 제조에 사용한 벡터 구성을 위한 각 염기서열은 하기 표 2에 나타내었다.
상기 표 1의 재조합 서열구성에 해당하는 각각의 조합된 염기서열은 pAceBac1 벡터(Geneva Biotech, Geneve, Switzerland)에 클로닝하여 표 1에 기재된 각각의 재조합 벡터들을 제조하였다.
<
실시예
2>
본 발명의 재조합 발현벡터가 도입된 재조합 바이러스의 제조
실시예 1에서 제조된 재조합 벡터가 도입된 재조합 바이러스를 제작하기 위하여, 실시예 1의 재조합 벡터 DNA와 AcMNPV의 bacmid 인 Multibac system (Multibac system, Geneva Biotech, Geneve, Switzerland)을 이용하여 재조합 배큘로바이러스를 제작하고 이를 곤충 세포주인 Sf9(Spodoptera frugiperda 9) (Gibco BRL, USA)세포에 형질주입하여 재조합 바이러스들을 제작하였다.
구체적으로 재조합 바이러스(recombinant virus)의 제작을 위해 상기 실시예 1에서 제조된 재조합 벡터를 Multibac system competent 세포 내로 형질전환 시키고, 겐타마이신(10 μg/mL), 카나마이신(40 μg/mL), 테트라사이클린(10 μg/mL), X-gal 및 IPTG가 처리된 LB 플레이트를 이용하여 24시간 이상 37 ℃에서 암배양 후 하얀색 콜로니를 선별하여 배양하고 PureLink® HiPure Plasmid Miniprep Kit (ThermoFisher, USA)를 이용하여 추출하였다. LacZ 유전자 내 att-Tn7으로 목적 유전자의 전이를 확인하기 위하여 AccuPower® ProFi Taq PCR Premix (Bioneer Co., Daejeon, Korea)를 이용하여 M13F(-40) primer (5’-GTT TTC CCA GTC ACG AC-3’)와 M13R(-40) primer (5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 후 재조합 바이러스의 생성을 위하여 1.0 × 106cells/ml로 분주된 Sf9 세포에 형질주입(transfection)하였다. 형질도입 3일 후부터 위상차 현미경을 이용하여 재조합 바이러스의 생성을 확인하였다.
<실시예 3>
본 발명의 재조합 발현벡터에 의한 단백질 과발현의 확인
본 발명의 실시예 1에서 제조된 재조합 발현 벡터들 간의 재조합 단백질 발현 효율을 비교 분석하기 위해, 표지 단백질인 EGFP의 발현수준을 측정하였다. 이를 위해 상기 실시예 2에서 제조한 각 재조합 배큘로바이러스를 5 M.O.I. (multiplicity of infection)로 Sf9 세포에 접종한 후, 접종 1일부터 6일까지 1일 간격으로 형광광도 측정을 수행하였다. 녹색형광단백질인 EGFP는 488 ㎚에서 최고의 여기파장과 510 ㎚에서 최고의 방출파장을 나타내며 형광현미경 상에서 방출되는 청색광(Max 470 ㎚)이 녹색광(510 ㎚)으로 변환되어 형광을 관찰할 수 있다.
분석 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 모든 과발현 재조합 배큘로바이러스를 이용하여 발현된 EGFP의 활성은 대조군으로 이용된 rAc-EGFP에 비해 높게 나타났으며, 대부분 감염 3일차에 가장 높은 단백질 발현양을 보였으며 기본 벡터 형태를 가지는 rAc-EGFP 감염군에 비해서도 월등히 높은 단백질 발현양을 보이는 것으로 나타났다. 배큘로바이러스의 감염시기 중 Late 시기에 높은 전사량을 나타내는 것으로 알려진 vp39 promoter와 p6.9 promoter, early 시기에 활성을 보이는 39K promoter, early mRNA initiation site와 late mRNA initiation site를 모두 가지기에 비교적 이른 시기부터 늦은 시기까지 활성을 보이는 gp64 promoter 모두 접종 1일차부터 very late promoter로 구성된 대조군 rAc-EGFP에 비해 EGFP의 발현이 빠르게 확인되었다.
특히, 배큘로바이러스 유래 프로모터들 중에서도 p6.9 프로모터를 사용하고 인핸서로서 AcMNPV의 hr3(homologous region 3) 및 hr5(homologous region 5)가 도입된 재조합 발현벡터인 pAc-Ac-Hr3-p6.9v-EGFP 및 pAc-Ac-Hr5-p6.9v-EGFP의 벡터를 사용한 군이 다른 실험군들에 비해 월등히 우수한 단백질 발현 증대 효과가 있는 것으로 나타났고, p6.9 프로모터 및 AcMNPV의 hr3(homologous region 3) 서열이 도입된 pAc-Ac-Hr3-p6.9v-EGFP 재조합 발현벡터를 사용한 군이 상기 벡터로 제조된 재조합 바이러스가 도입된 Sf9 세포주에서 접종 2일 만에 다른 형태의 과발현 벡터의 최대발현량을 상회하는 수준으로 가장 많은 양의 과발현된 단백질을 확인할 수 있었다.
뿐만 아니라, 도 2의 결과에 나타낸 바와 같이, 인핸서로서 hr3 서열을 사용한 경우, 동일한 p6.9 프로모터를 사용하였을 지라도 BmNPV의 hr3 서열이 도입된 재조합 벡터를 사용한 군에 비해 AcMNPV의 hr3 서열이 도입된 재조합 벡터를 사용한 군이 단백질 과발현 효과가 더 우수한 것으로 나타났다.
<실시예 4>
본 발명의 재조합 발현벡터를 이용한 유용 단백질 L1의 과발현 확인
나아가 본 발명자들은 본 발명에서 제조한 상기 재조합 발현벡터를 이용하여 실제적으로 유용 단백질을 곤충 세포내에서 과발현 시킬 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 실시예 3에서 단백질 과발현 효율이 우수한 p6.9 프로모터 및 AcMNPV의 hr3 서열 또는 AcMNPV의 hr5 서열이 각각 조합된 재조합 벡터인 pAc-Ac-Hr3-p6.9v-EGFP 및 pAc-Ac-Hr5-p6.9v-EGFP에서 EGFP 대신 HPV16의 VLP 형성에 요구되는 L1 단백질의 유전자를 삽입시킨 배큘로바이러스 전이용 재조합 발현벡터인 pAc-Ac-Hr3-p6.9v-HPV16 L1 및 pAc-Ac-Hr5-p6.9v-HPV16 L1를 각각 제조하였고, 이때 비교군으로 AcMNPV의 hr3 서열 대신 BmNPV의 hr3 서열 및 HPV16 L1이 도입된 재조합 발현벡터와 인핸서 서열이 없으며 HPV16 L1 유전자가 도입된 재조합 발현벡터를 각각 제조하여 사용하였다. 상기 제조된 HPV16 L1 유전자가 도입된 각 재조합 발현벡터는 상기 실시예 2와 동일한 방법을 통해 각각의 재조합 배큘로바이러스(재조합 AcMNPV)를 제조하였다. 이후 재조합 바이러스를 6웰 플레이트에 분주하여 배양된 Sf9 곤충 세포주에 5 M.O.I로 접종 후 72시간 후 수거하여 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏을 통해 발현된 HPV16 L1의 단백질 수준을 측정하였다.
웨스턴블랏 분석을 위하여 SDS-PAGE 겔을 nitrocellulose membrane (Pall Corp, New York, USA)에 15 V의 전압으로 1시간 동안 transfer하였고, blocking을 위하여 TBS-T (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 % Tween 20, pH 7.4)에 녹인 5% skim milk를 1시간 처리하였다. 이후 HPV16 L1에 특이적인 anti-HPV16 L1 항체(abcam, Cambridge, UK)를 TBS-T에 희석하여 처리한 후, 15분씩 3번 세척하였다. 2차 항체(anti-mouse IgG) 또한 TBS-T에 희석하여 처리한 후, 15분씩 3번 세척하였다. 최종적으로 membrane에 Western HRP substrate (Merck Millipore, Burlington, USA)를 처리하고 Azure c300 Western Blot Chemiluminescent Blot Imaging System (Azure biosystem,Dublin, USA)으로 이미지를 촬영하여 특이적인 밴드를 관찰하였다.
또한 상기 본 발명의 실시예에서 HPV16 L1 유전자, 즉 HPV VLP 항원을 발현시키기 위해 제조한 재조합 발현벡터 및 재조합 배큘로바이러스에 대한 각 명칭과 모식도는 표 3 및 도 3에 나타내었으며, 상기 HPV16 L1 유전자의 염기서열을 서열번호 10에 나타내었고, HPV16 L1 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 11에 나타내었으며, EGFP 유전자의 염기서열을 서열번호 12에 나타내었고, EGFP 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 13에 나타내었다.
분석 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 약 50 kDa 분자량 마커 부근에서 본 발명의 유용 단백질인 HPV16T-L1의 밴드를 확인하였으며, 특히 AcMNPV hr3 서열을 포함하는 과발현 벡터인 pAc-Ac-Hr3-p6.9v-HPV16 벡터를 사용한 군, 즉 rAc-p6.9v-HPV16T-Achr3 바이러스 감염 군에서 HPV16T-L1 단백질의 발현이 가장 높은 것으로 확인되었으며, 이러한 결과는 HPV16의 L1단백질에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블랏 결과에서도 동일하게 나타났다.
이상의 결과를 통해 본 발명자들은 인핸서로서 AcMNPV 유래의 hr3 또는 hr5 서열을 포함하며, p6.9 프로모터, 다각체 단백질 유전자의 프로모터 서열 및 Burst 서열이 순차적으로 연결된 재조합 발현벡터를 이용할 경우, 외래 유용 단백질을 곤충 세포 내에서 신속하게 과발현을 유도할 수 있어, 유용 단백질을 용이하게 대량생산할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Recombinant vector for overexpressing target protein and
mass-production method of target protein using the same in insect
cell
<130> NPDC83551
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 666
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AcNPV homologous region 3 sequence
<400> 1
gatttacgcg tagaattcta cttgtaaagc aagttaaaat aagccgtgtg caaaaatgac 60
atcagacaaa tgacatcatc tacctatcat gatcatgtta ataatcatgt tttaaaatga 120
catcagctta tgactaataa ttgatcgtgc gttacaagta gaattctact cgtaaagcga 180
gtttagtttt gaaaaacaaa tgagtcatca ttaaacatgt taataatcgt gtataaagga 240
tgacatcatc cactaatcgt gcgttacaag tagaattcta ctcgtaaagc gagttcggtt 300
ttgaaaaaca aatgacatca tttcttgatt gtgttttaca cgtagaattc tactcgtaaa 360
gtatgttcag tttaaaaaac aaatgacatc attttacaga tgacatcatt tcttgattat 420
gttttacaag tagaattcta ctcgtaaagc aagtttagtt ttaaaaaaca aatgacatca 480
tctcttgatt atgttttaca agtagaattc tactcgtaaa gcgagtttag ttttgaaaaa 540
caaatgacat catctcttga ttatgtttta caagtagaat tctactcgta aagcgagttt 600
agttttcaaa aacaaatgac atcatccctt gatcatgcgt tacaagtaga attctactcg 660
taaagc 666
<210> 2
<211> 325
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AcNPV p6.9 promoter sequence
<400> 2
aaattccgtt ttgcgacgat gcagagtttt tgaacaggct gctcaaacac atagatccgt 60
acccgctcag tcggatgtat tacaatgcag ccaataccat gttttacacg actatggaaa 120
actatgccgt gtccaattgc aagttcaaca ttgaggatta caataacata tttaaggtga 180
tggaaaatat taggaaacac agcaacaaaa attcaaacga ccaagacgag ttaaacatat 240
atttgggagt tcagtcgtcg aatgcaaagc gtaaaaaata ttaataaggt aaaaattaca 300
gctacataaa ttacacaatt taaac 325
<210> 3
<211> 329
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AcNPV vp39 promoter sequence
<400> 3
gtcttgtaag gcagtttgat ttctttgctt tctctccaca ccaacggcac caacgcgttg 60
gtatctttag gccaataaac aaattttttg tgtttggaat tagtcttttt cacgcttgat 120
attatgttat tgcaagcgct ctgaataggt atacgagtgc gaaagccgtt ttcgtcgtac 180
aaatcgaaat attgttgtgc cagcgaataa ttaggaacaa tataagaatt taaaatttta 240
tacaacaaat cttggctaaa atttattgaa taagagattt ctttctcaat cacaaaatcg 300
ccgtagtcca tatttataac ggcaacaat 329
<210> 4
<211> 903
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AcNPV 39k promoter sequence
<400> 4
aaggctgtcc tgctgtgtgc ccgtcgcgcg taccggagcg cgaacgcgcc cgccgccgac 60
atgaacgaca cttttttaga aaaaatttcc ataccacgag gtcatcgcga ttgttgcgac 120
gcaaaagttt acgagacagc cgtgcgcgag tttgtggaag aaactggccg gttttttgac 180
agcgcgttca tctacaagtt gccatttacg ttacaatgga aagatgacgg cgtcacctac 240
aagtatttga tatacgtagg cgtcgtgcgc ggcaacttga ttaacgtgaa cgccaaaccc 300
aacacgtaca ccgtgaagtt gttgccgggc acgtttggca atgactaccg tataatgtta 360
aaaccgcgac gcttcaattg cgaaatagcg cgcagcctgg ccatcgtgcc gctcaacaaa 420
tactttaatt atatgaacga caaacaactg atcacgtacg attacagcaa ttacattgaa 480
ttttttgatt ttgtgcgcag cgtcaaggcg cgttttgata ataggcaatt gcaggacttt 540
ttctacgcca ctctgaaaaa gatagacaac gatgcccccc aaaaattgca cgcacttagg 600
cgggtgtgat tcggactgct tgactcgcag cgaaatacaa gcgctgttca gggaagccat 660
caacacgctc aagcacacga tgaacacaga aaacgtctgc gcgcacatgt tggacatcgt 720
gtcgtttgag cgtataaaag aatatataag agctaattta ggccatttca cagtaatcac 780
cgacaaatgt tcgaagcgta aggtgtgtct tcatcacaaa cgaattgcca ggttgttggg 840
cattaaaaaa atatatcatc aagaatacaa acgggttgtt tcaaaggttt acaagaagca 900
aac 903
<210> 5
<211> 206
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AcNPV gp64 promoter sequence
<400> 5
tgtcgactga gcgtccgtgt tcatgatccc gtttttataa cagccagata aaaataatct 60
tatcaattaa gataaaaaga taagattatt aatctaacaa cgtgccttgt gtcacgtagg 120
ccagataacg gtcgggtata taagatgcct caatgctact agtaaatcag tcacaccaag 180
gcttcaataa ggaacacaca agcaag 206
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polyhedrin promoter sequence
<400> 6
caaataaata agtattttac tgttttcgta acagttttgt aataaaaaaa cctataaat 59
<210> 7
<211> 160
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Burst sequence (x4)
<400> 7
ctgttttcgt aacagttttg taataaaaaa acctataaat ctgttttcgt aacagttttg 60
taataaaaaa acctataaat ctgttttcgt aacagttttg taataaaaaa acctataaat 120
ctgttttcgt aacagttttg taataaaaaa acctataaat 160
<210> 8
<211> 483
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AcNPV homologous region 5 sequence
<400> 8
cgcgtaaaac acaatcaagt atgagtcata atctgatgtc atgttttgta cacggctcat 60
aaccgaactg gctttacgag tagaattcta cttgtaatgc acgatcagtg gatgatgtca 120
tttgtttttc aaatcgagat gatgtcatgt tttgcacacg gctcataaac tcgctttacg 180
agtagaattc tacgtgtaac gcacgatcga ttgatgagtc atttgttttg caatatgata 240
tcatacaata tgactcattt gtttttcaaa accgaacttg atttacgggt agaattctac 300
ttgtaaagca caatcaaaaa gatgatgtca tttgtttttc aaaactgaac tcgctttacg 360
agtagaattc tacgtgtaaa acacaatcaa gaaatgatgt catttgttat aaaaataaaa 420
gctgatgtca tgttttgcac atggctcata actaaactcg ctttacgggt agaattctac 480
gcg 483
<210> 9
<211> 1697
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BmNPV homologous region 3 sequence
<400> 9
aatattagac aacaaagatt tattttattc atgccactac tcggttccgt ttttcaagct 60
gaccagttgt catgcggaaa atgacgtcat tattaatgct ttaaacgagt tacgcaacaa 120
cgttaaagtg gacgctgatt gcgaatcggc caaagaccta tcgcacgttt taaacgcgta 180
cgcttatgtg ggcaatggga tcggttgtag atccgcgtac gacggagatg cgatagtggt 240
aaaaaaagaa gccgtgccca gccacgtgta cgccaacctg aacacgcaat ccaacgacgg 300
cgtcaaatac aatcgttggt tgcacgttaa aaacgaccaa tacatggcgt gtcctgaaga 360
attgtacgat aacgacgaat ttaaatgtaa cgtagaatcg gataaattat attatttgga 420
taatttacaa gaagattcca ttgtataaac attttatgtc gaaaacaaat gacatcagct 480
tatgattcat acttaatcgt gcgttacaag tagaattcta cttgtaaagc gagtttaatt 540
tgaaaaacaa attagtcatt attaaacatg ttaacaatcg tgtataaaaa tgacatcagt 600
ttaatgatga catcatctct tgattatgtt ttacacgtag aattctactc gtaaagccgg 660
ttcagttttg aaaaacaaat gacatcatct ttcgattgtg ttttacacgt agaattctac 720
tcgtaaagcc agttcagttt tgaaaaacaa atgacatcat ttttttaaat tcagttttga 780
aaaacaaatg acatcatctc ttgatcatgt tttacacgta gaattctact cgtaaagcga 840
gttcagtttt gaaaaacaaa tgacatcatt cagttttgaa aaacaaatga catcatcttt 900
cgattgtgtt ttacacgtag aattctactc gtaaagccag ttcagttttg aaaaacaaat 960
gacatcatct tttgattgtg ttttacacgt agaattctac tcgtaaagcc agttcaattt 1020
tgaaaaacaa atgacatcat cttagaggta gacccgtcgc caagacgggt ctgctcatat 1080
gtcgttttgt atttgtcatt gcctcttttc acgacgctgt ctggagcatg ggtatatggc 1140
gtagaccctt ttcatacgtc gttttgtatt tgtcattgac gtgatcgtta attgcttttt 1200
tggtatattg gaaattgtgt taaataaaat gactatattt tttattgaaa attattttat 1260
ttaaaatttt aaataattcc tacaaacatt gaaaacactg taggtatctt ggcacatgca 1320
aacaacgcac ggcctatcgt cgaacaccgc cattacatta tattagcctc tcatacaatc 1380
gttgaacaat tttaataaat aatctttaca agtatcgttt gaaggcctca taaacaattt 1440
atatgattta atatcaatat actttttcaa tctagcctcg aatgggctgt tcacaaatta 1500
cgcttcttcc acaataattg cgtcgtagca aattgccaaa tacttgacgc aactaataac 1560
gtctgaatgg gtttcatctt gagcacacct ccatcatcaa aatcataaaa cgatctattt 1620
gtggggcaaa gctgctgtac cgtataaatc gtataatacg acgcggagaa attaatttct 1680
ggcagggacg taatatt 1697
<210> 10
<211> 1416
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV16 L1 DNA sequence
<400> 10
atgtctcttt ggctgccgag tgaggccacc gtgtacctgc ctcctgtccc agtatccaag 60
gtcgtaagca cggatgaata cgttgcgcgc accaacatct attatcacgc aggaacttcc 120
agactacttg cggtgggaca tccctatttc cccatcaaga agcctaacaa caacaaaata 180
ctcgtaccta aagttagcgg tctgcaatac agggtgtttc gtatctatct ccccgacccc 240
aataagtttg gattccctga tacgtcattc tacaatccag acacacagcg gctggtctgg 300
gcttgtgtcg gtgttgaagt tggtcgtgga cagccactcg gtgtgggcat tagtggccac 360
cctttactta ataagttgga tgacacagag aacgctagtg cctacgcagc aaatgctggc 420
gtggataacc gcgagtgtat ctctatggac tacaaacaaa cgcagttgtg tttaattggt 480
tgcaaacccc ctatagggga acactggggc aagggatccc cgtgtaacaa cgttgcagta 540
acaccaggtg actgcccccc attagaatta atcaacacgg ttattcaaga tggcgacatg 600
gttgataccg gcttcggtgc tatggacttt acgacattac aggcgaacaa aagtgaagtt 660
ccgctggata tttgcacatc tatctgcaag tatccggact atattaagat ggtgtcagag 720
ccgtacggcg acagcctgtt cttctactta cgtagggagc aaatgtttgt cagacatctg 780
tttaatcgcg ctggcgctgt tggagaaaat gtaccagacg acctgtacat taaaggctcc 840
gggtctactg cgaacttagc cagttcaaac tatttcccga cacctagtgg ttctatggtg 900
acctcggatg cccaaatatt taataagcct tactggcttc aaagagcaca gggccacaac 960
aatggcatct gctggggtaa ccagctattt gttactgtgg ttgacactac ccgctcaacg 1020
aacatgagct tatgtgcggc catctccact tcagaaccta cctacaagaa taccaacttc 1080
aaggagtacc ttaggcacgg tgaggaatat gacttacagt tcattttcca gctgtgcaag 1140
ataaccctca ctgccgacgt gatgagctac atccactcca tgaattccac tattttggag 1200
gactggaatt ttggtctcca accacctcca ggaggcacct tggaggatac ctaccgtttt 1260
gtcacaagcc aggcaatcgc ttgccagaag catacacctc cagcacccaa agaagatccc 1320
ttgaagaaat atactttctg ggaagttaat ttaaaggaaa agttctctgc cgacttggat 1380
caattcccct taggaagaaa atttttacta caataa 1416
<210> 11
<211> 471
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV16 L1 amino acid sequence
<400> 11
Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val
1 5 10 15
Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn
20 25 30
Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro
35 40 45
Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys
50 55 60
Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile Tyr Leu Pro Asp Pro
65 70 75 80
Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln
85 90 95
Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro
100 105 110
Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp
115 120 125
Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg
130 135 140
Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly
145 150 155 160
Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Asn
165 170 175
Asn Val Ala Val Thr Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn
180 185 190
Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met
195 200 205
Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile
210 215 220
Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu
225 230 235 240
Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe
245 250 255
Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Glu Asn Val Pro
260 265 270
Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser
275 280 285
Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala
290 295 300
Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn
305 310 315 320
Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr
325 330 335
Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu
340 345 350
Pro Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu
355 360 365
Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr
370 375 380
Ala Asp Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu
385 390 395 400
Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp
405 410 415
Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr
420 425 430
Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu
435 440 445
Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu
450 455 460
Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln
465 470
<210> 12
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFP DNA sequence
<400> 12
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
720
<210> 13
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFP amino acid sequence
<400> 13
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
Claims (14)
- 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV) 배큘로바이러스의 hr3(homologous region 3) 염기서열; p6.9 프로모터의 염기서열; 배큘로바이러스의 다각체 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터 염기서열; 및 Burst 염기서열이 순차적으로 연결되어 포함되며,
상기 hr3(homologous region 3) 염기서열은 서열번호 1로 이루어진 것이고,
상기 p6.9 프로모터의 염기서열은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이고,
상기 배큘로바이러스의 다각체 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터 염기서열은 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것이고,
상기 Burst 염기서열은 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는,
곤충 또는 곤충세포에서 신속하게 목적 단백질의 과발현을 유도하는 재조합 배큘로바이러스 전이벡터. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 곤충세포는 BT1-Tn-5B1-4 세포, Hi5 세포, LD652Y 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, Se 세포, Kc1 세포, SL2 세포, Bm5 세포, BmN 세포 및 모기(mosquito) 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 곤충 또는 곤충세포에서 신속하게 목적 단백질의 과발현을 유도하는 재조합 배큘로바이러스 전이벡터. - 제1항에 있어서,
상기 곤충은 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 파밤나방(Spodoptera exigua), 배추좀나방(Plutella xylostella), 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni), 누에나방(Bombyx mori) 및 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 곤충 또는 곤충세포에서 신속하게 목적 단백질의 과발현을 유도하는 재조합 배큘로바이러스 전이벡터. - 제1항에 있어서,
상기 목적 단백질은 녹색형광단백질(EGFP) 또는 HPV16 L1 단백질인 것을 특징으로 하는, 곤충 또는 곤충세포에서 신속하게 목적 단백질의 과발현을 유도하는 재조합 배큘로바이러스 전이벡터. - 제1항의 재조합 배큘로바이러스 전이벡터가 도입된 재조합 배큘로바이러스.
- 제9항의 재조합 배큘로바이러스에 감염된 곤충 또는 곤충세포.
- 제10항에 있어서,
상기 곤충세포는 BT1-Tn-5B1-4 세포, Hi5 세포, LD652Y 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, Se 세포, Kc1 세포, SL2 세포, Bm5 세포, BmN 세포 및 모기(mosquito) 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 곤충 또는 곤충세포. - 제10항에 있어서,
상기 곤충은 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 파밤나방(Spodoptera exigua), 배추좀나방(Plutella xylostella), 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni), 누에나방(Bombyx mori) 및 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 곤충 또는 곤충세포. - (1) 제1항의 재조합 배큘로바이러스 전이벡터에 목적 단백질을 코딩하는 염기서열을 클로닝하는 단계;
(2) 상기 클로닝된 배큘로바이러스 전이벡터를 이용하여 재조합 배큘로바이러스를 제조하는 단계; 및
(3) 상기 재조합 배큘로바이러스를 곤충 또는 곤충세포에 도입시키는 단계를 포함하는,
곤충 또는 곤충세포에서 신속하게 목적 단백질을 대량 생산하는 방법. - 제13항에 있어서,
상기 목적 단백질은 녹색형광단백질(EGFP) 또는 HPV16 L1 단백질인 것을 특징으로 하는, 곤충 또는 곤충세포에서 신속하게 목적 단백질을 대량 생산하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200008045A KR102275815B1 (ko) | 2020-01-21 | 2020-01-21 | 목적 단백질의 과발현 유도용 재조합 벡터 및 이를 이용한 곤충세포에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200008045A KR102275815B1 (ko) | 2020-01-21 | 2020-01-21 | 목적 단백질의 과발현 유도용 재조합 벡터 및 이를 이용한 곤충세포에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102275815B1 true KR102275815B1 (ko) | 2021-07-08 |
Family
ID=76894603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200008045A KR102275815B1 (ko) | 2020-01-21 | 2020-01-21 | 목적 단백질의 과발현 유도용 재조합 벡터 및 이를 이용한 곤충세포에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법 |
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|---|---|
| KR (1) | KR102275815B1 (ko) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998006855A1 (en) * | 1996-08-16 | 1998-02-19 | The Texas A & M University System | Compositions and methods for delivery of nucleic acids to hepatocytes |
| KR101563583B1 (ko) | 2011-05-17 | 2015-10-27 | 충북대학교 산학협력단 | 베큘로바이러스 다각체 단백질의 부분 융합을 이용한 외래 재조합 단백질의 발현량을 증가시키는 방법 |
| WO2019050111A1 (ko) * | 2017-09-07 | 2019-03-14 | 주식회사 옵티팜 | 외래 단백질 발현 증가를 위한 재조합 전이 벡터 |
-
2020
- 2020-01-21 KR KR1020200008045A patent/KR102275815B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998006855A1 (en) * | 1996-08-16 | 1998-02-19 | The Texas A & M University System | Compositions and methods for delivery of nucleic acids to hepatocytes |
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| KR20190027616A (ko) * | 2017-09-07 | 2019-03-15 | 주식회사 옵티팜 | 외래 단백질 발현 증가를 위한 재조합 전이 벡터 |
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