KR102389967B1 - 돼지 유행성 설사병 예방을 위한 백신용 바이러스 유사입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 유행성 설사병 예방을 위한 백신용 바이러스 유사입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 HIV(human immunodeficiency virus)의 pr55(Gag) 단백질 및 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV)의 스파이크 구조단백질(spike protein)을 포함하는 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자, 상기 바이러스- 유사입자를 포함하는 백신 조성물, 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자 제조용 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 돼지 유행성 설사병 예방 또는 치료를 위한 백신용 바이러스 유사입자의 제조방법에 관한 것이다.

Description

돼지 유행성 설사병 예방을 위한 백신용 바이러스 유사입자 및 이의 제조방법{Virus like particle for vaccines for the prevention of porcine epidemic diarrhea and method for preparing the same}

본 발명은 돼지 유행성 설사병 예방을 위한 백신용 바이러스 유사입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

돼지에 심각한 설사와 탈수를 유발하는 돼지 유행성 설사병(Porcine epidemic diarrhea; PED)은 현재 우리나라를 비롯한 아시아 국가의 양돈산업에 막대한 금전적 피해를 끼치는 중요한 바이러스성 질병중 하나이며, 주로 겨울철과 이른 봄에 전 연령의 돼지에게 감염되어 급성 설사증을 야기하고, 특히 신생자돈과 포유자돈에서 폐사율이 100%에 달 할 만큼 치명적인 질병이다. 최근에는 대부분의 계절에서 다양한 발병 양상을 나타내는 등, 위험성은 더욱 높아지고 있다.

이러한 PED는 1977년 영국에서 처음 보고되었으며, 국내에서는 1992년 처음 확인되었다. PED를 유발하는 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV)는 Coronaviridae에 속하는 28Kb 정도의 외막형, 단일 외가닥 RNA 바이러스로서 변이가 매우 빠르게 발생하고 있기에 농장에서 발생하는 PED와 백신주 간의 Strain이 일치하지 않아 정기적인 백신 접종을 실시하고 있음에도 백신에 의한 효과적인 예방이 이루어지지 않고 있다.

PEDV는 직경이 95-100nm인 구형의 입자이며, 표면에는 방사상으로 배열된 18-23nm의 곤봉 형태의 표면돌기가 있다. PEDV는 7가지 ORF로 구성되어 있으며, 3가지 비구조단백질 ORF1a, ORF1b, ORF3과 구조단백질인 Membrane(M), Nucleocapsid(N), Envelope(E), Spike(S) 단백질로 이루어진다. 이 중 Spike 단백질은 signal peptide, S1 domain, CO-26K equivalent(COE), S2 domain, transmembrane region, intra cellular domain으로 구성되는 150-220kDa 크기의 Type I transmembrane 단백질이며, 숙주 세포와의 접합 및 바이러스 침투에 관여하고, 세포로부터 중화항체의 형성 유도 기능 및 주요 면역원으로서의 역할을 수행한다. 또한 바이러스 외피에 가장 많이 존재하며, 27-32kDa 크기의 Membrane 단백질은 코로나 바이러스 속의 바이러스 입자의 형성에 필수적인 요소로 알려져 있으며, Membrane 단백질과 Envelope 단백질(~10kDa)의 동시 발현을 통해 코로나 바이러스의 바이러스 유사 입자의 생산이 가능하다는 연구가 보고된 바 있다. Nucleocapsid 단백질은 55-58kDa 크기이며, Membrane 단백질과의 상호작용을 통해 막에 박혀있는 단백질들이 구조를 형성하여 세포 밖으로 나갈 수 있도록 하는 신호 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

한편, PEDV는 국내뿐만 아니라 전 세계 돼지 농가에 금전적으로 큰 피해를 주고 있음에도 불구하고 뚜렷한 치료 방법 및 백신 개발에 대한 연구가 미미한 실정이다. 개발된 백신으로는 다른 종의 바이러스에 비해 낮은 병원성을 보이는 CV777 종이 약독화된 바이러스 백신으로 처음 사용되었으며, PEDV의 피해가 심각한 아시아 국가들에서는 배양세포에서 93회 이상 계대하여 병원성을 약화시킨 바이러스가 백신으로 사용되었고, 현재 국내에서는 KPED-9, PED-SM98, DR-13가 PEDV의 백신주로 사용되고 있으나, 이 또한 RNA 바이러스가 가지는 성질 중 하나인 변이(mutation)에 의해 실제 발병한 야생주 바이러스와 백신주 간의 염기서열 차이로 인해 PEDV의 예방효과가 낮은 수준이고, 접종 이후 백신 바이러스가 배출되는 문제점을 가지고 있다.

따라서 빠르게 변이하는 PED 바이러스에 신속하게 대응이 가능하고, 실제 바이러스와 형태가 매우 유사하여 높은 항원성을 나타낼 뿐만 아니라 바이러스의 핵산을 가지고 있지 않기에 안전성이 있고, 접종 이후에도 백신 바이러스가 검출되는 문제점을 가지지 않는 백신용 바이러스 유사입자(Virus Like Particle: VLP)에 대한 연구가 전 세계적으로 활발히 진행되고 있으나, 아직까지 돼지유행성설사병 바이러스에 효과적으로 대응 가능한 성공적인 백신용 PED VLP가 개발되지 못하고 있는 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-1765394호

따라서 본 발명의 목적은 돼지 유행성 설사병 예방용 백신의 제조를 위한 신규한 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자를 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자 제조용 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 목적은 돼지 유행성 설사병 예방 또는 치료를 위한 백신용 바이러스 유사입자의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 HIV(human immunodeficiency virus)의 pr55(Gag) 단백질; 및 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV)의 스파이크 단백질(spike protein; S);을 포함하는, 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 스파이크 단백질(spike protein)은 서열번호 1 또는 서열번호 11로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HIV(human immunodeficiency virus)의 pr55(Gag) 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은, HIV(human immunodeficiency virus)의 pr55(Gag) 단백질을 코딩하는 염기서열; 및 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV)의 스파이크 단백질(spike protein)을 코딩하는 염기서열;을 포함하는, 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자 제조용 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HIV(human immunodeficiency virus)의 pr55(Gag) 단백질을 코딩하는 염기서열은 서열번호 4로 이루어진 염기서열이고, 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV)의 스파이크 단백질(spike protein)을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2 또는 서열번호 12로 이루어진 염기서열일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 5로 표시되는 배큘로바이러스의 hr3(homologous region 3), 서열번호 6으로 표시되는 p6.9 프로모터, 서열번호 7로 표시되는 배큘로바이러스의 다각체 단백질(polyhedrin) 코딩 유전자의 프로모터, 서열번호 8로 표시되는 Burst 서열을 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 도 19의 개열지도를 갖는 pBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(-19aa) 벡터 또는 pBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(H1384R) 벡터일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 숙주 세포는 BT1-Tn-5B1-4 세포, Hi5 세포, LD652Y 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, Kc1 세포, SL2 세포, Bm5 세포, BmN 세포 및 모기(mosquito) 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 곤충 세포일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 곤충은 누에나방(Bombyx mori), 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni) 및 벌집다방(Galleria mellonella)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한 본 발명은, (1) 본 발명의 재조합 발현 벡터를 이용하여 재조합 배큘로바이러스를 제조하는 단계; (2) 상기 재조합 배큘로바이러스를 숙주 세포에 감염시키는 단계; (3) 상기 숙주 세포를 배양하고 그 배양물을 수득하는 단계; 및 (4) 상기 배양물로부터 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자를 수득하는 단계를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 예방 또는 치료를 위한 백신용 바이러스 유사입자의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 숙주 세포는 BT1-Tn-5B1-4 세포, Hi5 세포, LD652Y 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, Kc1 세포, SL2 세포, Bm5 세포, BmN 세포 및 모기(mosquito) 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 곤충 세포일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (4) 단계에서 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자는 상기 숙주세포의 원형질막에서 버딩(budding)을 통해 배양배지로 방출되는 것일 수 있다.

본 발명의 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자는 HIV(human immunodeficiency virus)의 pr55(Gag) 단백질 및 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV)의 스파이크 구조단백질(spike protein)을 포함하도록 제조된 것으로, 실제 PED 바이러스와 형태가 매우 유사하여 높은 항원성을 가지며 바이러스의 핵산을 가지고 있지 않아 안전성이 있을 뿐만 아니라, 스파이크 구조단백질이 발현 후 원형질막으로 용이하게 이동할 수 있도록 스파이크 구조단백질(spike protein)의 돌연변이체를 사용하였고, HIV pr55(Gag) 단백질을 포함하도록 하여 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자가 세포막으로부터 버딩과정을 통해 숙주세포의 세포막 외부로 용이하게 방출되는 특징이 있어, 돼지 유행성 설사병 예방을 위한 백신용 바이러스 유사입자를 편리하고 효율적으로 생산할 수 있는 효과가 있다. 따라서 본 발명에서 제조한 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자는 돼지유행성 설사병 바이러스 감염에 의한 질환의 예방 또는 치료를 위한 백신 제조에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 PED 바이러스의 구조단백질인 M, E, N 및 S 단백질의 확보를 위한 클로닝 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 PED 바이러스의 구조단백질인 MENS를 모두 동시 발현시킬 수 있는 재조합 벡터 및 MES를 모두 동시 발현시킬 수 있는 재조합 벡터의 제조를 위한 클로닝 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 3은 PED 바이러스의 M, E, N 및 S 구조단백질을 각각 단독발현하거나, MENS 또는 MES의 구조단백질을 동시 발현 할 수 있는 재조합 BmNPV의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 4개의 구조단백질(MENS)로 구성된 PED 바이러스의 바이러스 유사 입자(A) 및 3개의 구조단백질(MES)로 구성된 PED 바이러스의 바이러스 유사 입자의 구조 모식도를 나타낸 것으로, 오렌지는 S 단백질, 녹색은 N 단백질, 파란색은 M 단백질, 연한 파란색은 E 단백질을 나타낸 것이다.
도 5는 PED 바이러스의 각 구조단백질에 대한 유전자를 포함하는 재조합 BmNPV를 Bm5 세포에 각각 감염시킨 후, 세포를 수거하여 각 구조단백질의 발현여부를 SDS-PAGE 전기영동(5a 및 5b)과 웨스턴 블럿(5c)으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 이때 Bm5 레인은 아무것도 처리하지 않은 군이고, BmNPV-K1은 PED 바이러스의 구조단백질에 대한 유전자를 포함하지 않은 재조합 BmNPV를 나타낸 것이다.
도 6은 MENS 구조단백질 및 MES 구조단백질의 유전자를 포함하는 재조합 BmNPV를 Bm5 세포에 각각 감염시킨 후, 세포를 수거하여 구조단백질들의 공동 발현여부를 SDS-PAGE 전기영동(6a)과 웨스턴 블럿(6b)으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 누에나방 유충에서 PEDV의 구조단백질들을 공동 발현시킨 후, 웨스턴블럿으로 확인하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 8은 항-spike 혈청을 이용하여 누에나방 유충에서 MENS 구조단백질 또는 MES 구조단백질의 발현을 웨스턴블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이며, 주황색은 S 단백질을 나타낸 것이다.
도 9는 누에나방 유충에서 PEDV의 구조단백질들을 공동 발현시킨 후, TEM(Transmision Electron Microscope) 분석 과정을 나타낸 모식도이다.
도 10은 MENS 또는 MES의 구조단백질을 동시 발현 할 수 있는 재조합 BmNPV(rBp-MENS 및 rBp-MES)를 누에나방 유충에 감염시킨 후, 생산된 바이러스 유사입자(VLP) 여부를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것으로, 주황색은 S 단백질을 나타낸 것이다.
도 11은 재조합 BmNPV(rBp-MENS 및 rBp-MES)를 누에나방 유충에 감염시킨 후, 생산된 바이러스 유사입자(VLP)를 전자현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것으로, 11a는 BmNPV-K1, 11b는 rBp-MENS 및 11c는 rBp-MES의 각 재조합 BmNPV로 감염시킨 결과이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에서 인간면역결핍바이러스(HIV)의 pr55(Gag)를 이용하여 키메릭 PEDV VLP를 생산하는 과정에 대한 모식도롤 나타낸 것이다.
도 13은 PEDV의 S 구조단백질에 대한 모식도를 나타낸 것으로, PEDV-S는 야생형의 S 구조단백질 도메인을 나타낸 것이고, PEDV-S H1384R은 PEDV S 도메인의 cytoplasmic 영역의 KxHxx 모티브를 구성하는 1384번째 아미노산인 H가 R로 돌연변이된 돌연변이체의 모식도를 나타낸 것이며, PEDV-S-19aa는 PEDV S 도메인의 cytoplasmic 영역에서 19개 아미노산을 삭제한 돌연변이체의 모식도를 나타낸 것이다.
도 14는 PEDV의 야생형 S, 돌연변이체인 S(-19aa) 및 S(H1384R)을 단독발현 할 수 있는 재조합 BmNPV를 제작하기 위한, 재조합 바이러스 벡터인 pBm-p6.9v-PEDV-S, pBm-p6.9v-PEDV-S(-19aa) 및 pBm-p6.9v-PEDV-S(H1384R) 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 15는 pBm-p6.9v-PEDV-S, pBm-p6.9v-PEDV-S(-19aa) 및 pBm-p6.9v-PEDV-S(H1384R) 재조합 바이러스 벡터를 이용하여 제조된 재조합 배큘로바이러스에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 16은 PEDV의 야생형 S, 돌연변이체인 S(-19aa) 및 S(H1384R)를 단독발현 할 수 있는 재조합 BmNPV를 각각 Bm5 세포에 감염시킨 후, S 단백질에 특이적인 항혈청인 anti-spike 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이며, 주황색은 S 단백질을 나타낸 것이다.
도 17은 PEDV의 야생형 S, 돌연변이체인 S(-19aa) 및 S(H1384R)를 단독발현 할 수 있는 재조합 BmNPV로 Bm5 세포에 각각 감염시킨 후, S 단백질의 위치를 확인하기 위한 면역형광 및 공초점 현미경 분석과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 18은 PEDV의 야생형 S, 돌연변이체인 S(-19aa) 및 S(H1384R)를 단독발현 할 수 있는 재조합 BmNPV로 Bm5 세포에 각각 감염시킨 후, S 단백질의 위치를 면역형광법으로 염색 후, 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 19는 HIV-pr55(Gag), EGFP 및 PEDV S(-19aa) 돌연변이 유전자를 모두 포함하는 고발현 재조합 바이러스 벡터인 pBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(-19aa) 벡터와 HIV-pr55(Gag), EGFP 및 PEDV S(H1384R) 돌연변이 유전자를 모두 포함하는 고발현 재조합 바이러스 벡터인 pBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(H1384R) 벡터를 제작하는 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 20은 HIV-pr55(Gag)-EGFP 유전자(a) 및 HIV-pr55(Gag)-EGFP- PESV-S(-19aa) 유전자(b)가 도입된 재조합 배큘로바이러스를 모식도로 나타낸 것이다.
도 21은 HIV-pr55(Gag)-EGFP 유전자 및 HIV-pr55(Gag)-EGFP- PESV-S(-19aa) 유전자가 도입된 재조합 배큘로바이러스인 rBm-p6.9v-Gag-EGFP 또는 rBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(-19aa)을 Bm5 세포에 각각 감염시킨 후, 배양배지를 수득하여 GFP 단일클론 항체(a) 및 anti-p24 단일클론 항체(b)로 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 재조합 바이러스인 rBm-p6.9v-Gag-EGFP 및 rBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(-19aa)을 각각 Bm5 세포에 감염시킨 후, 감염된 세포의 배양배지를 수득하여 원심분리 후 수득한 키메릭 바이러스 유사입자를 웨스턴 블럿으로 확인한 것으로서, (a)는 anti-GFP 항체를, (b)는 anti-p24 항체를, (c)는 anti-spike 혈청을 이용하여 수행한 결과이다.
도 23은 본 발명의 방법으로 생산한 PEDV 키메릭 바이러스 유사입자를 전자현미경으로 확인한 결과를 나타낸 것으로, (a)는 Gag-EGFP VLP, (b)는 PED-Gag-EGFP VLP를 나타낸 것이다.

본 발명은 돼지 유행성 설사병의 효과적인 예방 또는 치료를 위한 새로운 백신용 키메릭 바이러스 유사입자를 제공한다는 점에 특징이 있다.

본 발명에서 제공하는 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자는 HIV(human immunodeficiency virus)의 pr55(Gag) 단백질 및 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV)의 스파이크 구조단백질(spike protein; S protein)을 포함하는 것으로, 실제 PED 바이러스와 형태가 매우 유사하여 높은 항원성을 가지며 바이러스의 핵산을 가지고 있지 않아 안전성이 있고 신속하게 대량생산이 가능한 특징이 있다. 또한 본 발명의 키메릭 바이러스 유사입자는 종래 바이러스 백신이 갖는 백신 접종 이후의 바이러스 배출문제, 배출된 바이러스의 병원력 회복과 같은 문제가 발생하지 않아 더욱 안전성이 높은 백신으로 사용할 수 있다.

본 발명자들은 안정성이 높고 PED에 대한 예방 또는 치료효과가 우수한 새로운 PED 바이러스-유사입자를 개발하기 위해, HIV(human immunodeficiency virus) pr55(Gag) 단백질을 사용하였는데, HIV pr55(Gag) 단백질은 단일 단백질만으로 세포막을 둘러싸고 버딩(budding)할 수 있기에 본 발명의 키메릭 바이러스 유사입자를 숙주세포로부터 세포막 외부로 용이하게 방출할 수 있도록 한다.

또한 본 발명에 따른 키메릭 바이러스 유사입자는 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV)의 스파이크 단백질(spike protein)을 포함하는데, 상기 스파이크 단백질(S)은 signal peptide, S1 domain, CO-26K equivalent(COE), S2 domain, transmembrane region, intra cellular domain으로 구성되는 단백질이며, 숙주 세포와의 접합 및 바이러스 침투에 관여하고, 세포로부터 중화항체의 형성 유도 기능 및 주요 면역원으로서의 역할을 수행한다.

한편, PEDV는 스파이크 단백질(spike protein) 이외에도 구조단백질로 Membrane(M), Nucleocapsid(N) 및 Envelope(E) 단백질을 포함하고 있는데, 바이러스를 이용한 백신 제조를 위해서는 여러 개의 구조단백질을 동시에 성공적으로 발현시켜야 하는 문제가 있다. 그러나 본 발명자들이 일실시예를 통해, PEDV의 여러 구조단백질들을 동시에 성공적으로 과발현시키는 것이 매우 어렵다는 것을 확인하였다.

이에 본 발명에서 제공하는 키메릭 바이러스 유사입자는 PEDV의 구조단백질 중에서 특히 스파이크 단백질, 구체적으로는 스파이크 돌연변이 단백질을 포함하는 바이러스 유사입자를 제조하였다.

PEDV의 스파이크 단백질은 S1 도메인, S2 도메인, Trans membrane 도메인 및 cytoplasmic 도메인의 총 4개의 도메인으로 구성되어 있다. 이 중, cytoplasmic 도메인은 바이러스로부터 유래된 다른 단백질과 상호작용을 하는 역할을 수행한다.

또한, PEDV의 cytoplasmic 도메인에는 KxHxx의 서열을 갖는 특이적 모티브가 존재하며, 이는 ER 정체 신호(retention signal)로 작용한다고 알려져 있다. 따라서 cytoplasmic 도메인의 KxHxx motif에 의해 스파이크 단백질은 원형질막으로 이동하지 못하고 소포골지체중간구획 (ER-Golgi intermediate compartment; ERGIC)에 지속적으로 상주하게 된다.

이러한 점에 착안하여 본 발명자들은 백신으로 활성을 갖기 위해 중요한 PEDV의 스파이크 구조단백질이 세포 내에서 발현 후, 원형질막으로 용이하게 이동할 수 있도록 스파이크 단백질의 돌연변이체를 제조하였다.

스파이크 단백질의 돌연변이체로서, KxHxx 모티브의 1384번째 아미노산 H를 R로 치환시킨 돌연변이체(H1384R) 및 cytoplasmic 도메인의 19개 아미노산을 결실시킨 돌연변이체(-19aa)를 각각 제조하였고, 이들 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스를 제작한 후, 곤충세포에서의 발현 정도를 분석하였다.

그 결과, 상기 제조한 돌연변이체들이 곤충세포에서 발현됨을 확인하였고, 특히 cytoplasmic 도메인의 19개 아미노산을 결실시킨 스파이크 단백질 돌연변이체가 가장 높은 발현수준을 보이는 것으로 나타났다.

이에 본 발명자들은 PED 바이러스의 유사 입자의 제조를 위해, 스파이크 단백질, 바람직하게는 H1384R 또는 -19aa의 스파이크 돌연변이 단백질을 사용할 수 있음을 알 수 있었고, 더욱 바람직하게는 높은 항원성을 유지하면서 숙주 세포 내에서 과발현을 보이는 cytoplasmic 도메인의 19개 아미노산을 결실시킨 스파이크 돌연변이 단백질(-19aa)을 사용하는 것이 좋음을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명에서 제공하는 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자에 함유된 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV)의 스파이크 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 이와 기능적 동등물을 포함할 수 있다.

여기서 상기 서열번호 1로 이루어진 아미노산 서열은 cytoplasmic 도메인의 19개 아미노산을 결실시킨 스파이크 돌연변이체(-19aa) 단백질의 아미노산 서열을 나타낸 것이고, 상기 서열번호 11로 이루어진 아미노산 서열은 KxHxx 모티브의 1384번째 아미노산 H를 R로 치환시킨 스파이크 돌연변이체(H1384R) 단백질의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

또한, 상기 HIV(human immunodeficiency virus)의 pr55(Gag) 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 이와 기능적 동등물을 포함할 수 있다.

상기 “기능적 동등물"은 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1, 11 또는 3의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 서열번호 1, 11 또는 3의 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 가지는 단백질을 의미한다.

본 발명에서 상기 “바이러스-유사입자(Virus-Like Particle, VLP)”는 바이러스성 단백질을 수반하거나 수반하지 않는 비감염성 바이러스성 소단위체를 의미한다. 예컨대, 상기 바이러스 유사 입자는 DNA 또는 RNA 게놈이 완전히 결여되어 있거나, 바이러스성 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자는 자발적 자가 어셈블리를 진행할 수도 있다.

또한 상기 바이러스 유사입자는 유전 공학적인 방법에 의해서도 제조될 수 있으며, 구조 단백질로서 PEDV 유래의 스파이크 단백질, 바람직하게는 상기 기술된 돌연변이 스파이크 단백질을 포함할 수 있다. 상기 바이러스 유사입자는 별도의 원인 감염체, 즉 PEDV 없이도 유전 공학적인 방법에 의해 제조될 수 있으므로 높은 생산성 및 경제성이 구현될 수 있다.

본 발명의 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자는 표면에 PED 바이러스에서 유리한 항원 결정 부위를 포함하고 있어, 특정 개체에 투여되면 PED 바이러스에 대한 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있으며 투여된 개체에 면역력을 부여함으로써 돼지 유행성 설사병 바이러스 감염에 따른 질병에 대한 예방 또는 치료 효과를 도출할 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자를 포함하는 백신 조성물을 제공할 수 있다.

상기 백신 조성물은 상기 바이러스-유사입자 또는 이의 농축액을 포함하는 형태이거나, 형질전환 숙주 세포 자체 또는 형질전환 세포의 건조 분말 형태로 사용할 수 있다.

상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.

또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calciumcarbonate), 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 목적을 위한 백신 조성물의 투여량은 체중 1kg 당 0.001 ㎖ 내지 1 ㎖, 바람직하게는 체중 1kg당 0.2㎖ 내지 0.4 ㎖이다.

본 발명의 백신 조성물은 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 안구 및 뇌 내로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 투여경로를 통해 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

나아가 본 발명은 본 발명의 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자를 제조하기 위한 재조합 발현 벡터를 제공한다.

상기 본 발명의 재조합 발현 벡터는 HIV(human immunodeficiency virus)의 pr55(Gag) 단백질을 코딩하는 염기서열 및 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV)의 스파이크 구조단백질(spike protein)을 코딩하는 염기서열을 포함한다.

여기서 상기 HIV(human immunodeficiency virus)의 pr55(Gag) 단백질을 코딩하는 염기서열은 서열번호 4로 이루어진 염기서열 일 수 있고, 상기 스파이크 구조단백질(spike protein)을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2 또는 서열번호 12로 이루어진 염기서열일 수 있다. 이때 상기 서열번호 2의 염기서열은 cytoplasmic 도메인의 19개 아미노산을 결실시킨 스파이크 돌연변이체(-19aa)를 코딩하는 염기서열이고, 상기 서열번호 12의 염기서열은 KxHxx 모티브의 1384번째 아미노산 H를 R로 치환시킨 스파이크 돌연변이체(H1384R)를 코딩하는 염기서열이다.

또한 본 발명의 재조합 발현 벡터는 서열번호 5로 표시되는 배큘로바이러스의 hr3(homologous region 3), 서열번호 6으로 표시되는 p6.9 프로모터, 서열번호 7로 표시되는 배큘로바이러스의 다각체 단백질(polyhedrin) 코딩 유전자의 프로모터, 서열번호 8로 표시되는 Burst 서열을 더 포함한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에 포함되는, 상기 HIV pr55(Gag) 단백질 코딩 유전자는 본 발명에서 제조된 키메릭 바이러스 유사입자를 숙주세포로부터 세포막 외부로 버딩을 통해 방출될 수 있는 역할을 수행하기 위한 것이며, 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV)의 돌연변이 스파이크 구조단백질(spike protein)을 코딩하는 유전자는 발현된 스파이크 단백질이 원형질막으로 이동하도록 하기 위한 것이다.

상기 hr(homologous region) 서열은 배큘로바이러스의 게놈에 존재하는 반복된 염기서열 영역을 의미하며, hr1, hr2L, hr2R, hr3, hr4L, hr4R, hr5가 존재한다. 이들 hr 서열의 대부분이 바이러스 DNA 복제와 증식에서 중요한 역할을 수행하며 바이러스 또는 비바이러스 유전자의 전사 촉진자로 작용한다고 알려져 있다.

본 발명에서는 목적 단백질을 가장 우수한 효율로 과발현시킬 수 있는 hr(homologous region) 서열로서, hr3를 사용하는 것이 가장 좋다는 것을 확인함에 따라, 상기 hr3를 재조합 발현벡터의 일 구성으로 포함시켰고, 바람직하게 상기 hr3은 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것을 사용하였다.

또한 본 발명의 재조합 발현벡터는 p6.9 프로모터와 배큘로바이러스의 다각체 단백질(polyhedrin) 코딩 유전자의 프로모터의 유전자를 포함할 수 있다.

이는 다각체 단백질 코딩 유전자 프로모터에 의한 외래 목적 단백질의 발현을 더욱 촉진하기 위하여 p6.9 프로모터를 포함하도록 하였으며, 바람직하게 상기 p6.9 프로모터는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 배큘로바이러스의 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어진 것이다.

나아가 본 발명의 재조합 발현벡터는 Burst 서열을 더 포함할 수 있는데, 상기 Burst 서열은 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터 내 존재하는 일부분으로써 번역개시 부위와 TAAG 사이에 위치하는 서열이며, 배큘로바이러스의 감염말기에 V1f-1이 Burst 서열에 특이적으로 결합하여 전사를 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 Burst 서열은 서열번호 8로 이루어진 염기서열을 갖는다.

또한, 본 발명의 재조합 발현벡터는 발현된 HIV pr55(Gag) 및 스파이크 구조단백질의 위치 및 발현정도의 분석을 위한 표지자로 EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein) 유전자를 더 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 EGFP 유전자 서열은 서열번호 10에 나타내었고, EGFP 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 9에 나타내었다.

본 발명의 재조합 발현벡터에 있어서, 서열번호 5로 표시되는 배큘로바이러스의 hr3(homologous region 3) 서열, 서열번호 6으로 표시되는 p6.9 프로모터 서열, 서열번호 7로 표시되는 배큘로바이러스의 다각체 단백질(polyhedrin) 코딩 유전자의 프로모터 서열 또는 서열번호 8로 표시되는 Burst 서열은 목적 단백질의 발현 증대를 달성할 수 있는 한, 그 순서 및 개수, 방향성을 당 분야의 통상의 기술자의 상식에 따라 적절히 조절하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자 제조용 재조합 발현 벡터로서 도 19의 개열지도를 갖는 pBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(-19aa) 벡터 및 pBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(H1384R)를 각각 제조하였다.

본 발명에 있어서 상기 "재조합 발현벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다.

본 발명에 있어서 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

또한 본 발명은 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포를 제공할 수 있다.

상기 숙주 세포로는 이에 제한되지는 않으나, BT1-Tn-5B1-4 세포, Hi5 세포, LD652Y 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, Kc1 세포, SL2 세포, Bm5 세포, BmN 세포 및 모기(mosquito) 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 곤충세포 일 수 있다.

또한 상기 곤충은 이에 제한되지는 않으나, 누에나방(Bombyx mori), 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni) 또는 벌집다방(Galleria mellonella)일 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 방법은 본 발명의 재조합 벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 인산칼슘공침법,　DEAE-텍스트란처리법,　전기천공법, 재분포법 등의 공지 방법으로 수행될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터의 숙주 세포로의 도입은 숙주 세포에는 백미드(bacmid)를 동시에 도입할 수 있다.

상기 "백미드"란, 배큘로바이러스와 플라스미드의 합성어로 baculovirus shuttle vector 를 의미한다. 본 발명에 있어서 백미드는 AcNPV 계열의 bacmid 인 ApGOZA, AcGOZA, BmNPV (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus) 계열로 BpGOZA (int J.indust Entomol Vol. 2. No. 2001, pp155~160 참조), BmGOZA (Biotechnology Letters 23:1809-1817, 2001 참조) 게놈을 모두 제한없이 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 "형질전환"은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포의 주었을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상으로 형질변환, 형전환 또는 형변환 등이라고도 한다.

본 발명에서, 본 발명의 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입할 경우, 숙주 세포, 바람직하게는 곤충 세포 내에서 HIV Gag 및 돌연변이 스파이크 단백질이 동시에 과발현된다는 것을 확인할 수 있었고, 이로서 목적 산물인 HIV Gag 및 돌연변이 스파이크 단백질을 동시에 대량 생산할 수 있음을 확인하였다.

나아가 본 발명은, 돼지 유행성 설사병 예방 또는 치료를 위한 백신용 바이러스 유사입자의 제조방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 바람직하게 (1) 본 발명의 재조합 발현 벡터를 이용하여 재조합 배큘로바이러스를 제조하는 단계; (2) 상기 재조합 배큘로바이러스를 숙주 세포에 감염시키는 단계;(3) 상기 숙주 세포를 배양하고 그 배양물을 수득하는 단계; 및 (4) 상기 배양물로부터 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자를 수득하는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서, "배큘로 바이러스"는 사람이나 척추 동물에는 병원성이 없으며, 곤충에 대해서만 병원성을 나타내는 곤충 병원성 바이러스를 모두 포함한다. 바람직하게는 핵다각체병 바이러스(Nucleopolyhedrovirus: NPV) 및 과립병 바이러스(Granulovirus: GV)를 포함할 수 있다.

구체적으로, 먼저 (1) 본 발명의 재조합 발현 벡터를 이용하여 재조합 배큘로바이러스를 제조한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터를 배큘로바이러스 전체 게놈(genome) DNA와 함께 숙주세포 내로 동시전이(cotransfection) 시킨다. 발현 벡터의 발현 목적 단백질을 코딩하는 염기서열 양 옆에 존재하는 원래의 배큘로바이러스 DNA 단편 부위와 전체 배큘로바이러스 지놈 DNA 내에서 상기 단편 부위에 대응하는 부위가 같은 염기서열로 이루어져 있기 때문에, 이들 간의 상동재조합(homologous recombination)이 일어나게 되어, 최종적으로 재조합 배큘로바이러스가 만들어진다.

이후, (2) 상기 재조합 배큘로바이러스를 숙주 세포에 감염시키고, (3) 상기 숙주 세포를 배양하고 그 배양물을 수득한다.

재조합 배큘로바이러스는 발현 목적 단백질의 생성 여부와 발현 목적 단백질을 코딩하는 염기서열이 바이러스 게놈 상에 존재하고 있는지 등을 소규모의 배양을 통해 확인한 후, 재조합 바이러스의 대량 배양 및 증식을 통해 목적 단백질을 대량으로 발현시켜 생성시킨다.

목적단백질의 대량 생산은 상기 재조합 배큘로바이러스를 숙주세포인 곤충세포에 감염시킨 후 감염된 곤충세포를 대량으로 배양하여 배양물을 수득한다.

이후, (4) 상기 배양물로부터 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자를 수득한다.

본 발명의 방법에 따르면 본 발명의 PED 바이러스-유사입자는 숙주세포에서 발현 후, 돌연변이 스파이크 단백질이 원형질막으로 이동하는 특성과 Gag 단백질에 의한 원형질막에서의 버딩과정에 따른 세포 밖으로의 방출 특성에 의해, 배양 배지 내에 본 발명의 키메릭 PED 바이러스-유사입자를 대량 함유할 수 있다.

또한 상기 배양물로부터 키메릭 PED 바이러스 유사입자를 수득하는 단계에서, 바이러스 유사입자가 포함된 상기 배양물의 상층액을 일련의 과정을 거치지 않고 바이러스 유사입자가 포함된 원액 자체로서 백신항원으로 이용할 수 있고, 숙주세포는 일련의 과정을 거쳐서 백신항원으로 제조할 수 있다. 예컨대, 숙주세포에서 발현된 바이러스 유사입자를 별도의 정제과정을 거치지 않거나 또는 정제하여 배양된 숙주세포를 파쇄하여 제조한 세포 용해물을 그대로 사용할 수 있다.

이상 본 발명의 방법으로 제조된 키메릭 PED 바이러스-유사입자는 PED 바이러스의 많은 구조단백질을 모두 사용하지 않아도 되며 높은 항원성을 가지고 있고 바이러스의 핵산을 가지고 있지 않아 안정성과 효능이 우수한 PED 예방용 백신으로 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

PEDV 바이러스 유사입자의 제조 및 구조단백질의 발현 분석

<1-1> 재조합 도너 벡터의 구축

<1-1-1> PEDV의 4종의 구조단백질인 M, E, N, S를 각각 단독으로 포함하는 도너 벡터의 제조

돼지유행성 설사병바이러스 (PEDV)를 구성하는 4종의 구조단백질인 M(membrane protein), (E)envelope protein, (N)nucleocapsid protein, (S)spike protein의 유전자를 확보하기 위하여 각각의 cDNA가 클로닝된 플라스미드를 주형으로 하기 표 1의 프라이머((PED-M-F / PED-M-R), (PED-E-F / PED-E-R), (PED-N-F / PED-N-R), (PED-S-F / PED-S-R))들을 이용한 PCR을 통해 각각의 증폭된 DNA를 얻었고, 증폭 DNA를 pMD20-T 벡터에 클로닝 하여 pT-PEDV-M, pT-PEDV-E, pT-PEDV-N, pT-PEDV-S 벡터를 각각 제조하였다(도 1 참조).

이후, 제조된 pT-PEDV-M 및 pT-PEDV-E 벡터는 제한효소 EcoR I 및 Hind III를 이용하여 PEDV-M 및 PEDV-E 유전자를 확보하였고, pT-PEDV-N 벡터는 제한효소 Sal I 및 Pst I을 이용하여 PEDV-N 유전자를 확보하였으며, pT-PEDV-S 벡터는 제한효소 Sal I 및 Not I을 이용하여 PEDV-S 유전자를 확보한 뒤, 이들 확보한 각각의 유전자를 재조합 BmNPV 제작에 이용되는 기본벡터인 pAceBac1에 클로닝함으로써 pBm-PEDV-M, pBm-PEDV-E, pBm-PEDV-N 및 pBm-PEDV-S 벡터를 각각 제조하였다(도. 1 참조).

<1-1-2> PEDV의 4종의 구조단백질 중에서 M, E, N, S를 동시 발현하는 도너벡터 또는 M, E, N를 동시 발현하는 도너 벡터의 제조

PEDV의 구조단백질 M, E, N, S 4가지를 동시 발현하는 벡터 또는 M, E, S를 동시 발현 가능한 co-expression 벡터를 제작하기 위하여, 상기 <1-1-1>에서 제조한 pBm-PEDV-E 벡터를 제한효소 I-Ceu I 및 BstX I로 처리하여 PEDV-E 유전자를 포함한 발현 카세트를 확보한 뒤, 제한효소 I-Ceu I로 처리된 pBm-PEDV-N 벡터에 클로닝 하여 pBm-PEDV-N-E를 제작하였다. 또한, pBm-PEDV-M 벡터를 제한효소 I-Ceu I 및 BstX I로 처리하여 PEDV-M 유전자를 포함한 발현 카세트를 확보한 뒤, 제한효소 I-Ceu I로 처리된 pBm-PEDV-S 벡터에 클로닝 하여 pBm-PEDV-S-M를 제작하였다. 그 후 pBm-PEDV-E로부터 제한효소 I-Ceu I 및 BstX I 처리를 통해 PEDV-E 유전자를 포함한 발현 카세트를 확보한 뒤, 제한효소 I-Ceu I로 처리된 pBm-PEDV-S-M 벡터에 클로닝 하여 M, E 및 S 유전자가 공동 발현될 수 있는 pBm-PEDV-MES 벡터를 제조하였다(도 2 참조).

또한, pBm-PEDV-N-E 벡터를 제한효소인 I-Ceu I 및 BstX I를 처리하여 PEDV-E 및 PEDV-N 유전자발현 카세트를 확보한 뒤, 제한효소 I-Ceu I가 처리된 pBm-PEDV-S-M 벡터에 클로닝 하여 M, E, N 및 S가 모두 공동 발현될 수 있는 pBm-PEDV-MENS 벡터를 제작하였다(도 2 참조). 제작된 모든 재조합 플라스미드는 PCR 및 염기서열 분석을 통하여 그 구조와 최종적인 클로닝 여부를 확인하였다.

<1-2> 재조합 BmNPV 제작

PEDV의 구조단백질인 M, E, N, S를 각각 단독발현하거나, MENS 4종의 구조단백질을 동시발현 또는 MES 3종의 구조단백질을 동시발현 할 수 있는 재조합 BmNPV(Recombinant Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus)를 제작하기 위하여, <1-1>에서 제조한 pBm-PEDV-M, pBm-PEDV-E, pBm-PEDV-N, pBm-PEDV-S, pBm-PEDV-MES 또는 pBm-PEDV-MENS 벡터를 BpBacmid 시스템(Lee, 2018)을 이용하여 재조합 BmNPV를 각각 제작하였다(도 3 참조). 그 후 각각의 재조합 BmNPV를 rBp-PEDV-M, rBp-PEDV-E, rBp-PEDV-N, rBp-PEDV-S, rBp-PEDV-MES, rBp-PEDV-MENS로 명명 하였으며, 재조합 단백질 발현 여부를 검정하기 위하여 각각의 재조합 BmNPV DNA 3μg를 Bm5 세포내로 형질주입하고, 3일 뒤 현미경을 통해 바이러스의 증식을 확인한 후 BV의 대량 증식 및 역가 측정 후 실험에 이용하였다.

<1-3> Bm5 세포에서 PEDV 바이러스 구조단백질의 발현 분석

세포의 소포골지체중간구획 (ER-Golgi intermediate compartment; ERGIC)막을 둘러싸고 버딩(budding)하는 생활사를 가지는 PEDV의 구조단백질 중, N 단백질(nucleocapsid protein)은 PEDV의 RNA와 결합함으로써 추후 바이러스 입자 내부에 핵산을 진입시키는 역할을 수행하며, 나머지 3종의 구조단백질(M,E,S)은 모두 trans membrane domain-type 1을 가짐으로써 번역 후 ER 막에 존재하게 된다. 그 중 M 단백질(membrane protein)과 E 단백질(envelope protein)은 서로간의 단백질-단백질 결합에 의해 ER 막을 둘러싸고 방출하는 역할을 수행하며 이때 함께 존재하던 S 단백질(spike protein)도 방출되어 바이러스 입자의 표면에 존재하게 된다. PEDV와 함께 코로나바이러스속에 속하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 (SARS)의 VLP 제작에서 버딩을 유발하는 M 및 E 단백질은 필수적인 요소로 여겨지고 있으나 N 단백질의 경우 그 필요성이 아직 불분명하다. 따라서 아직 VLP제작에 대한 보고가 없는 PEDV의 VLP를 제작하기 위하여 4가지 구조단백질을 동시발현 가능한 재조합 BmNPV와 MES 3가지 구조단백질을 동시발현 가능한 재조합 BmNPV를 각각 제작하여 바이러스 유사입자의 형성 여부와 효율을 다음과 같은 방법으로 분석하였다.

구조단백질의 동시발현에 앞서 각 구조단백질의 발현 여부를 검정하기 위하여 Bm5 세포에 각각 5 M.O.I.가 되도록 각 재조합 바이러스를 접종하고 감염 72시간 후 세포를 수거하여 세포 내 구조단백질의 발현여부를 확인하였다. SDS-PAGE 겔을 이용한 단백질 전기영동결과, 대조군으로 이용된 바이러스 비접종군 Bm5 세포와 야생주 배큘로바이러스를 접종한 경우에서는 특이적 밴드가 관찰되지 않았다.

한편, 이와 대조적으로 rBp-PEDV-M 바이러스를 접종한 군에서는 고유의 분자량인 25.3 kDa 보다 낮은 위치인 약 18 kDa 부근에 특이적 밴드가 관찰되었다. rBp-PEDV-N의 경우 정상적인 분자량을 갖는 48.9 kDa의 N 단백질이 확인되었다. 반면, rBp-PEDV-E의 경우, 예상된 크기인 8.8 kDa 부근에서 특이적인 밴드를 확인할 수 없었으나, rBp-PEDV-S의 경우 예상된 정상적인 크기의 151 kDa 부근에서 특이적인 밴드를 확인할 수 있었다(도 5a 참조). 또한, 이들에 대한 특이적인 항혈청인 anti-PED 혈청을 이용하여 웨스턴블럿을 수행한 결과, 대조군으로 이용된 비접종군 Bm5 세포와 야생주 배큘로바이러스를 접종한 실험군에서는 특이적 밴드가 관찰되지 않았으나(도 5c 참조), rBp-PEDV-M의 경우 SDS-PAGE에서 관찰되었던 약 18 kDa 부근에서 특이적이고 강한 밴드가 관찰되었으며 정상적인 분자량 크기의 25.3 kDa 부근에서 약한 밴드가 관찰되었다(도 5c 참조). 또한, rBp-PEDV-E의 경우 표식자 기준 15 kDa 보다 아래에 특이적인 밴드를 약하게 확인할 수 있었으며, rBp-PEDV-S의 경우 정상적인 분자량의 특이적이고 강한 밴드를 확인할 수 있었다(도 5c 참조).

나아가 본 발명자들은 PEDV 구조단백질의 동시발현 여부를 검정하기 위하여 1×10⁶개의 Bm5 세포에 각각 5 M.O.I.가 되도록 바이러스를 접종하고 감염 72, 84, 96시간 후 세포를 수거하여 세포 내 구조단백질의 발현여부를 확인하였다. 12% SDS-PAGE 겔을 이용한 단백질 전기영동결과 M, E, N, S를 모두 동시 발현한 경우, 감염 72시간째에 모든 구조단백질의 밴드가 확인되었지만, 발현량이 저조하였고 감염 84, 96시간째에는 S 단백질(spike protein)이 확인되지 않았다(도 6a 및 6b 참조). 또한, M, E, S를 동시 발현한 경우에는 감염 72시간째에 모든 구조단백질의 발현이 확인되었으나, 구조단백질의 단독발현에 비해 매우 낮은 수준의 발현량을 보였고, 구조단백질에 따라 최고 발현을 보이는 시기가 서로 다르게 나타났기에 바이러스 유사입자를 형성하는데 그 효율이 낮음을 알 수 있었다(도 6a 및 6b 참조).

<1-4> 누에나방 유충에서 PEDV 바이러스 구조단백질의 발현 및 VLP 생산

실시예 <1-3>의 결과를 통해, PEDV 구조 단백질의 발현을 확인하였을 때 N 또는 S 단백질의 경우, SDS-PAGE 결과에서 확인 가능한 수준이었지만 M 단백질과 E 단백질의 경우, 그 분자량이 불분명하게 발현되거나 매우 약한 수준의 발현을 보이는 것을 확인하였다. 따라서 Bm5 세포주에서의 VLP 생산은 불가능하거나 매우 낮은 수준이라는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명자들은 세포주에 비해 더 높은 수준의 단백질 생산이 가능하고, 번역 후 변형과정의 효율이 더욱 우수함으로써 단백질-단백질 상호작용이 활발한 것으로 알려진 누에 유충에서 구조 단백질의 발현을 유도하고 VLP 생산이 가능한지 다음과 같은 실험을 수행하였다.

즉, rBp-PEDV-MES 및 rBp-PEDV-MENS 재조합 바이러스를 5령 누에 유충에 주사 접종하고 충분한 감염이 발생한 96시간 째에 혈림프를 수거하여 20% PEG 용액을 이용하여 10배 농축한 뒤, 10% SDS-PAGE 겔에서 anti-spike 항 혈청을 이용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군으로 이용한 야생주 배큘로바이러스(BmNPV-K1)를 접종한 실험군에서는 특이적인 밴드가 확인되지 않았으나 rBp-PEDV-MES 및 rBp-PEDV-MENS을 각각 접종한 실험군에서는 S 단백질에 해당하는 특이적인 밴드가 확인되었다. 또한, 구조단백질의 동시발현 개수에 따라 확인되는 S 단백질의 양이 상이하게 나타났다. 나아가 S 단백질의 발현 확인만으로는 VLP 형성 여부의 확인이 어렵다고 판단하여 전자현미경으로 VLP 생성여부를 관찰하였다.

이를 위해, 바이러스를 감염시킨 후, 수득한 혈림프를 25 % sucrose cushion위에서 초원심분리를 통해 간단한 정제 및 농축을 수행하고(도 9 참조), 농축액에서의 S 단백질의 존재 유무를 재 검정하기 위해 10 % SDS-PAGE 겔에서 anti-spike 항혈청을 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과, rBp-PEDV-MES 감염 농축액 에서만 S 단백질에 대한 특이적 밴드를 재확인할 수 있었다(도 10 참조). S 단백질의 존재가 확인된 rBp-PEDV-MES 시료와 확인되지 않은 rBp-PEDV-MENS 시료 모두를 음성 염색(negative staining)을 수행한 다음, 에너지 여과형 투과전자현미경을 통해 VLP의 생성 여부를 관찰하였다.

그 결과, 대조군으로 이용된 BmNPV-K1 접종 시료에서는 특이적인 VLP의 형태가 관찰되지 않았고(도 11a 참조), rBp-MES를 접종 시료에서는 PEDV의 실제 크기인 약 150 nm의 크기를 가지는 VLP를 확인할 수 있었다(도 11c 참조).한편, S 단백질이 확인되지 않았던 rBp-PEDV-MENS 시료에서도 약 150 nm의 크기의 VLP가 관찰되었으나 rBp-PEDV-MES에 비해 매우 낮은 수준인 것으로 관찰되었다(도 11b 참조).

이러한 결과를 통해, 본 발명자들은 PEDV 구조단백질의 동시발현을 통해 VLP 형성이 가능하다는 것을 확인할 수 있었으나, 구조단백질 및 VLP 생산량이 비교적 적은 것으로 확인되어 유용하게 사용할 수 있는 PEDV의 VLP의 생산량 확보에는 많은 어려움이 있음을 알 수 있었다.

<실시예 2>

키메릭 PEDV 유사입자(VLP)의 제작

외막형 바이러스의 경우 일반적으로 바이러스의 구조 형성을 위해서는 비외막형바이러스와는 다르게 여러 개의 구조단백질을 동시에 성공적으로 발현해야만 한다. PEDV 또한 구조형성에 필수적이라고 알려져 있는 E 단백질과 M 단백질을 반드시 포함하고, 숙주세포와의 막융합 및 침투역할을 수행하기 때문에 백신개발에 있어서 중요한 타겟이 되는 스파이크(S) 단백질을 동시발현 해야 하므로 VLP 형성을 위해서는 적어도 3개 이상의 구조단백질에 대한 안정적인 과발현이 요구된다. 그러나 상기 실시예 1의 결과에서 나타났듯이, rBp-MENS 및 rBp-MES 접종에 따른 MENS 및 MES 구조단백질들의 발현분석 결과, 이들 단백질들의 발현효율이 매우 낮아 VLP 생산이 어렵다는 것을 알 수 있었다. 실제로도 현재까지 외막형 바이러스에 대해서는 성공적인 VLP 생산이 보고되지 않고 있다.

따라서 본 발명자들은 백신용 PEDV-VLP의 성공적인 생산을 위하여 구조단백질 중 주요한 면역 타겟이 되는 스파이크(S) 단백질만을 포함하는 키메릭(chimeric) VLP를 제작하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다.

키메릭 VLP의 제조를 위해, 먼저 단일 구조단백질로 바이러스의 구조형성이 용이한 것으로 보고된 외막형바이러스의 구조단백질을 이용하여 VLP 형태를 만들고, 제작하고자 하는 목적 바이러스에서 면역에 중요한 단백질이 VLP에 포함되도록 하였다. 이를 위해, 단일 단백질만으로 세포막을 둘러싸고 버딩할 수 있도록 인간면역결핍바이러스 (Human Immunodeficiency Virus; HIV)의 pr55 (Gag) 단백질을 이용하여 생산이 어려운 외막형 VLP의 용이한 제작을 위한 플랫폼을 구축하였고(도 12 참조), PEDV의 M, E, N 단백질과 같은 다양한 구조단백질들의 발현 없이 병원성 바이러스의 주요 항원 단백질만으로 높은 수율을 나타내는 백신용 키메릭 PEDV-VLP를 제작하기 위한 실험을 수행하였다.

<2-1> PEDV-S 구조단백질의 분석 및 S 구조단백질의 돌연변이체 제조

키메릭 PEDV-VLP의 제작을 위해 먼저 세포 소포골지체중간구획 (ER-Golgi intermediate compartment; ERGIC)막에 위치하여 버딩하는 특성을 갖는 PEDV의 S 단백질(spike protein)을 세포의 원형질막에서 버딩하는 특징을 갖는 HIV의 pr55 (Gag) VLP의 표면에 성공적으로 위치시키기 위하여, PEDV S 단백질에 대한 분석을 먼저 수행하였다. S 구조단백질은 총 4,161 bp의 염기로 구성되어 있으며 번역되었을 때 약 151 kDa 의 분자량을 갖는 것으로 알려져 있으며, S1 domain, S2 domain, Trans membrane domain, cytoplasmic domain 총 4개의 domain으로 구성되어 있다. 각 도메인에 따라 숙주에 감염 시, 그 역할이 다른데 S1 domain과 S2 domain은 숙주세포의 수용체와의 결합 및 침투에 관여하고, trans membrane domain 및 cytoplasmic domain은 바이러스 입자 형성 단계에서 membrane protein, envelope protein, nucleocapsid protein에 의한 바이러스 입자 표면에 존재하기 위한 역할을 수행한다. Transmembrane domain의 경우, type 1으로서 세포막을 기준으로 단백질의 N-term 부위가 밖으로 돌출되고 C-term 부위가 내부에 존재하게 되어 세포막을 관통하여 위치하도록 하고, 이에 따라 세포막 영역 내부에 존재하게 되는 cytoplasmic domain은 바이러스로 부터 유래된 다른 단백질과 상호작용 하는 역할을 수행한다. 또한, PEDV의 cytoplasmic domain에는 KxHxx의 서열을 갖는 특이적 모티브가 존재하며, 이는 ER 정체 신호(retention signal)로 작용한다.

따라서 cytoplasmic domain의 KxHxx motif에 의해 spike protein이 원형질막으로 이동하지 못하고 ERGIC에 지속적으로 상주하게 된다. 한편, S 단백질의 발현 후, 상기 단백질을 원형질막으로 변경하고자 원숭이 유래 Vero 세포에서 KxHxx 모티브를 구성하는 1384번째 아미노산 H를 R로 돌연변이시킨 돌연변이체를 제조하고, 또한 cytoplasmic domain의 19개 아미노산을 삭제한 돌연변이체를 제조한 후, 곤충세포에서 이들 단백질의 발현 후 위치를 확인하고 키메릭 VLP 제작에 이용하였다.

Spike protein의 1384번째 아미노산 H를 R로 점 돌연변이시킨 PEDV-S(H1384R)과 cytoplasmic domain의 19개 아미노산을 삭제한 PEDV-S(-19aa) 단편을 제작하기 위하여, PEDV-S-EcoRI-F (5'- CCCGGGATGAAGTCTTTAACCTACTTC -3') 과 PEDV S-H1384R-SalI (5'- GTCGACTCACTGCACGCGGACCTTTTC -3')을 이용한 PCR을 통해 점돌연변이체인 PEDV-S(H1384R) 산물을 얻었고, PEDV-S-EcoRI-F (5'- GGATCCATGAAGTCTTTAACCTACTTC -3') 과 PEDV S-19aaR-SalI (5'- GTCGACTCAACCTGAGAAACAAGCACAGCA -3')을 이용한 PCR을 통해 PEDV-S(-19aa) 산물을 수득하였다. 그 후 pMD20-T 벡터에 클로닝 후 염기서열 분석을 통해 목적한 점돌연변이 여부 및 목적 부위의 결손 여부를 재확인 하였다.

<2-2> 재조합 도너 백터 구축 및 재조합 BmNPV 제작

상기 <2-1>에서 제조한 S 구조단백질의 돌연변이체(S(-19aa), S(H1384R))를 단독 발현할 수 있는 재조합 BmNPV를 제작하기 위하여, pBm-p6.9v-PEDV-S, pBm-p6.9v-PEDV-S(-19aa), pBm-p6.9v-PEDV-S(H1384R) 벡터와 BmBacmid-Δpcc system을 이용하여 재조합 BmNPV를 각각 제작하였다(도 14 참조). 여기서 상기 p6.9v는 배큘로바이러스의 p6.9 유전자 프로모터를 의미한다. 제조된 각각의 재조합 BmNPV를 rBm-p6.9v-PEDV-S, rBm-p6.9v-PEDV-S(-19aa), rBm-p6.9v-PEDV-S(H1384R)로 명명 하였으며(도 15 참조), 각각의 재조합 BmNPV에 의한 단백질 발현 여부를 검정하기 위하여 재조합 BmNPV DNA 3 μg를 Bm5 세포내로 형질주입 하고 3일 뒤 현미경을 통해 바이러스의 증식을 확인하였으며 이후 BV의 대량 증식 및 역가 측정 후 다음 실험에 이용하였다.

<2-3> 돌연변이 스파이크(Spike) 구조단백질의 발현 분석

실시예 <2-2>에서 제조된 재조합 BmNPV에 의한 스파이크(S) 구조단백질의 발현 정도를 분석하기 위해, Bm5 세포에 각각 5 M.O.I.가 되도록 rBm-p6.9v-PEDV-S, rBm-p6.9v-PEDV-S(-19aa) 및 rBm-p6.9v-PEDV-S(H1384R)바이러스를 각각 접종하고 감염 4일차에 수거하여 S 단백질에 특이적인 항혈청인 anti-spike 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.

그 결과, 대조군으로 이용된 바이러스-비접종 Bm5 세포와 BmBacmid 접종군 에서는 특이적인 밴드가 관찰되지 않았으나 PEDV-S, PEDV-S(-19aa) 및 S(H1384R)에서는 약 150 kDa 부근 영역에 S 단백질에 해당하는 특이적인 밴드가 확인되었으며 발현수준은 다른 차이가 있는 것으로 나타났다. 구체적으로, PEDV-S의 경우 가장 저조한 발현량을 보이는 것으로 나타났다. 따라서 S(-19aa) 및 S(H1384R) 돌연변이체를 키메릭 VLP 제작에 이용할 수 있음을 알 수 있었고, 특히 S(-19aa) 돌연변이체가 가장 높은 발현량을 보이는 것으로 확인되어, S(-19aa) 돌연변이체를 키메릭 VLP 제작에 이용하는 것이 가장 효과적이라는 것을 알 수 있었다(도 16 참조).

또한, 높은 발현량과 함께 S 단백질이 발현 후 성공적으로 원형질막에 이동하였는지를 확인하기 위하여 면역형광염색을 수행하였다. 이를 위해 Bm5 세포에 각각 5 M.O.I.가 되도록 rBm-p6.9v-PEDV-S, rBm-p6.9v-PEDV-S(-19aa) 및 rBm-p6.9v-PEDV-S(H1384R) 바이러스를 각각 접종하고 감염 4일차에 수거하여 PBS로 2회 세척한 뒤 슬라이드 글라스에 점적하고 세포가 가라앉을 때 까지 10분간 정치한 후 99% 차가운 메탄올을 이용하여 세포를 고정화시켰다. 그 후 spike protein의 특이적 형광염색을 위하여 spike protein의 S1 domain에 특이적으로 반응하는 S1-항체를 처리하고 488 nm의 파장을 510 nm로 변형 방출시킴으로써 녹색형광으로 보일 수 있도록 제작된 Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 488)을 처리하여 spike protein에 특이적으로 반응한 S1-antibody에 다시 특이적으로 반응시켰다. 그 후 핵과 세포질의 구분을 위하여 DAPI 용액을 염색을 수행하고 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다(도 17 참조).

그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 대조군인 BmBacmid만을 감염시킨 세포에서는 아무런 형광을 관찰 할 수 없었으므로 배큘로바이러스 감염에 의한 비특이적 결합은 발생하지 않음을 알 수 있었고, 야생형 S 단백질의 유전자를 포함하는 rBm-p6.9v-PEDV-S에 의해 감염된 세포의 경우, 원형질막 주변에서 약한 형광이 관찰되었다. 또한 rBm-p6.9v-PEDV-S(-19aa) 및 rBm-p6.9v-PEDV-S(H1384R)에 감염된 세포 역시 원형질막 주변에서 뚜렷한 형광을 관찰할 수 있었으며, 특히 rBm-p6.9v-PEDV-S(-19aa)에 의한 형광이 원형질 막에서 가장 강한 것으로 확인됨에 따라 많은 수의 스파이크 단백질이 번역 후 원형질막으로 이동한 것을 알 수 있었다. 한편, rBm-p6.9v-PEDV-S에 의한 스파이크 단백질이 원형질막에서 소량 관찰된 것은 본래 스파이크 단백질의 ER 정체 신호에 의해 대부분의 단백질이 ERGIC에 존재하고 소량이 원형질막으로 이동한 것으로 판단된다.

따라서 HIV-pr55(Gag) VLP의 표면에 가장 많은 양의 S 단백질을 포함할 수 있는 형태는 S 단백질의 cytoplasmic domain에서 19개 아미노산 서열이 제거된 PEDV-S(-19aa) 돌연변이체를 사용하는 것이 가장 적합하다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 3>

PEDV의 스파이크(S) 구조단백질을 갖는 키메릭 바이러스 유사입자의 제작

<3-1> 재조합 도너 백터의 구축

HIV-pr55(Gag) 유전자와 EGFP 유전자를 융합하기 위하여 상기 표 1에 기재된 HIV-1-Gag-F 및 HIV-1-Gag-R 프라이머와 누에에 대하여 코돈최적화 후 합성된 HIV-pr55(Gag) 유전자를 이용하여 PCR을 수행한 뒤, PCR 산물을 pMD20-T 벡터에 클로닝하여 HIV-pr55(Gag) 유전자가 도입된 pT-Gag 플라스미드를 제조하였다. 그 후 제한효소 EcoR I 및 BamH I을 이용하여 pBluescriptII 벡터에 pr55(Gag)를 도입하여 재조합 pBlue-Gag-EGFP 플라스미드를 제작하였다. 이후, 제한효소 BamH I 및 Sac II를 처리하여 EGFP 유전자를 클로닝하여 Gag-EGFP 융합 유전자를 가지는 pBlue-Gag-EGFP 플라스미드를 제작하였다. 그런 뒤, 제한효소인 EcoR I 및 Pst I를 처리하여 Gag-EGFP 유전자를 과발현 벡터인 pBm-p6.9v에 클로닝하여 pBm-6.9v-Gag-EGFP 벡터를 제작하였다(도 19a 참조).

이후 Gag-EGFP와 S 단백질의 돌연변이체인 spike(-19aa)를 동시 발현하기 위하여 상기 실시예 2에서 제작한 pBm-p6.9v-PEDV-S(-19aa)를 제한효소 I-Ceu I로 처리하였다. 또한 pBm-6.9v-Gag-EGFP는 제한효소 I-Ceu I 및 BstX I 처리하여 Gag-EGFP 발현 카세트를 얻었고 이를 상기 제한효소가 처리된 pBm-p6.9v-PEDV-S(-19aa)에 클로닝하여 pBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(-19aa)의 재조합 바이러스 벡터를 제작하였다(도 19b 참조).

<3-2> 재조합 BmNPV 제작

상기 <3-1>을 통해 제조한 pBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(-19aa) 바이러스 재조합 벡터 및 상기 <3-1>에서 S 단백질에 대한 유전자를 포함하지 않는 대조군 pBm-p6.9v-Gag-EGFP 바이러스 재조합 벡터를 BmBacmid-Δpcc system을 이용하여 각각의 재조합 BmNPV를 제작하였고, 이를 각각 rBm-p6.9v-Gag-EGFP(대조군) 및 rBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(-19aa)로 명명하였다(도 20 참조). 이후, 각각의 재조합 BmNPV에 의한 단백질 발현 여부를 확인하기 위하여 재조합 BmNPV DNA 3 μg를 Bm5 세포 내로 형질주입 하고 3일 뒤 현미경을 통해 바이러스의 증식을 확인하였다.

<3-3> 본 발명의 키메릭 바이러스 유사입자의 생산확인

본 발명자들은 PEDV의 S 구조단백질을 갖는 키메릭 바이러스 유사입자의 생산을 위해, 상기 <3-2>에서 제조한 재조합 BmNPV인 rBm-p6.9v-Gag-EGFP(대조군) 및 rBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(-19aa)를 Bm5 세포에 5 M.O.I.가 되도록 감염시키고, 72시간 후 Gag-EGFP의 정상적 발현 및 위치를 확인하기 위해 형광현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 2가지 바이러스에 각각 감염된 Bm5 세포 모두 원형질막에서 EGFP이 발현됨을 확인할 수 있었고, 이로써 Gag-EGFP가 정상적으로 발현 되었을 뿐만 아니라 발현 후 원형질막으로 이동이 되었음을 알 수 있었다.

이후, 각 바이러스에 감염된 곤충세포로부터 정상적인 VLP의 생산 및 버딩(budding) 여부를 확인하기 위하여 바이러스 감염 세포의 배양배지를 수거하고 SDS-PAGE 겔을 이용한 웨스턴 블럿을 수행하였다.

그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, Anti-GFP를 이용한 결과에서 BmBacmid만을 접종한 경우 특이적 밴드가 관찰되지 않았으나, rBm-p6.9v-Gag-EGFP 및 rBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(-19aa) 재조합 바이러스 감염세포의 배지에서는 EGFP 밴드가 확인되었다. 또한 VLP가 버딩 후 성숙과정을 통해 전구체 형태의 Gag 단백질은 자가절단이 발생하는데, 본 분석 결과, EGFP의 고유한 분자량인 27 kDa 부근에서 밴드를 확인할 수 있었고, 비절단 형태의 분자량인 82 kDa 에서도 특이적인 밴드를 확인할 수 있었다(도 21a 참조).

또한, pr55(Gag) 단백질에 대하여 특이적인 항체 anti-p24를 이용한 분석 결과도 동일하게 약 82 kDa 부근의 밴드가 확인됨에 따라 곤충 세포내에서 Gag-EGFP 융합 단백질이 발현되고 있음을 확인할 수 있었고, 약 55 kDa 부근에 EGFP가 절단되고 남은 pr55(Gag) 단백질이 확인되었으며 그 아래 추가적인 분열이 발생중인 단백질도 확인되었다(도 21b 참조). 따라서 2가지 재조합 배큘로바이러스에 접종된 세포의 배양배지에서 Gag-EGFP에 대한 특이적인 밴드가 관찰됨으로써, Gag-EGFP가 정상적인 발현 후 버딩을 통해 배양배지로 VLP 형태로 방출된 것임을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 Gag-EGFP 및 Gag-EGFP-spike 키메릭 VLP의 형성 확인을 위해, 5×10⁶개의 Bm5 세포에 재조합 BmNPV인 rBm-p6.9v-Gag-EGFP 및 rBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(-19aa)를 5 M.O.I.가 되도록 각각 접종하고 감염 96시간 후 배양배지를 수거한 다음, 원심분리를 통해 세포 및 부유물을 제거하고 0.2 um 시린지 필터를 이용하여 추가적인 불순물을 제거한 뒤, 20 % sucrose cushion위에서 144,000 × g, 3시간 동안 초원심분리 하였다. 이후, 침전물을 PBS를 이용해 재현탁시킨 후, 12% SDS-PAGE 전기영동 및 웨스턴 블럿을 수행하였다. Anti-GFP를 이용한 분석에서, 2가지 바이러스에 각각 접종된 실험군 모두 비절단 형태의 Gag-EGFP가 관찰되었으며, 27 kDa 부근에 절단된 EGFP도 확인되었다(도 22a 참조). Anti-p24를 이용한 결과에서도 Gag-EGFP가 확인되었으며, VLP의 성숙과정을 통해 24 kDa 의 분자량을 갖는 p24 또한 관찰되었다(도 22b 참조).

또한 S 단백질에 특이적인 항혈청을 이용한 웨스턴 분석에서는 rBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(-19aa) 바이러스 접종군에서 약 151 kDa에 해당하는 S 단백질이 검출됨에 따라 초원심 분리로 얻어진 Gag VLP에 PEDV의 S 구조단백질이 함께 존재한다는 것을 확인할 수 있었다(도 22c 참조).

나아가 초원심분리를 통해 침전된 본 발명에서 제조한 VLP의 형태적 검정을 위해 음성 염색(negative staining)을 수행한 뒤 에너지 여과형 투과전자현미경으로 관찰하였는데, 그 결과, Gag-EGFP에 의한 VLP의 생성을 선명하게 확인할 수 있었고(도 23a 참조), S 단백질을 갖는 것으로 확인된 키메릭 VLP 또한 정상적인 형태를 갖는다는 것을 확인함으로써, 본 발명자들은 상기와 같은 본 발명의 방법에 의해 종래 개발되지 못했던 PEDV에 대한 백신용 바이러스 유사입자(VLP)를 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 23b 참조).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Chungbuk National University <120> Virus like particle for vaccines for the prevention of porcine epidemic diarrhea and method for preparing the same <130> NPDC84135 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spike mutant protein sequence(-19aa) <400> 1 Met Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe 20 25 30 Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val 35 40 45 Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr 50 55 60 Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile 65 70 75 80 Phe Val Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser 85 90 95 Gln Glu Pro Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala 100 105 110 Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe 115 120 125 Pro Ser Ile Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn 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cttttgtcca atgattccac tttggtgcat ggtaaggtgg tttccaacca accattgttg 840 gtcaattgtc ttttggccat tcctaagatt tatggactag gccaattttt ctcctttaat 900 caaacgatcg atggcgtttg taatggagct gctgtgcagc gtgcaccaga ggctctgagg 960 tttaacatta atgacacctc tgtcattctt gctgaaggct caattgtact tcatactgct 1020 ttaggaacaa atttttcttt tgtttgcagt aattcctcaa atcctcactt agctaccttc 1080 gccatacctc tgggtgctac ccaagtacct tattattgtt ttcttaaagt ggatacttac 1140 aactccactg tttataaatt tttggctgtt ttacctccta ccgtcaggga aattgtcatc 1200 accaagtatg gtgatgttta tgtcaatggg tttggatact tgcatctcgg tttgttggat 1260 gctgtcacaa ttaatttcac tggtcatggc actgacgatg atgtttctgg tttttggacc 1320 atagcatcga ctaattttgt tgatgcactc atcgaagttc aaggaaccgc cattcagcgt 1380 attctttatt gtgatgatcc tgttagccaa ctcaagtgtt ctcaggttgc ttttgacctt 1440 gacgatggtt tttaccctat ttcttctaga aaccttctga gtcatgaaca gccaatttct 1500 tttgttactc tgccatcatt taatgatcat tcttttgtta acattactgt atctgcttcc 1560 tttggtggtc atagtggtgc caaccttatt gcatctgaca ctactatcaa tgggtttagt 1620 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360 gatacgggtc actcgaacca ggtgagtcaa aactacccta tagtacagaa tatacaaggt 420 cagatggttc accaagccat atcacctagg acattaaatg cttgggtaaa agtagtcgag 480 gagaaggcct tctcacctga agtaattccg atgttttctg ctctaagcga aggtgcgaca 540 ccgcaagact tgaacaccat gctaaatacg gtcggtggtc accaagctgc tatgcagatg 600 ttgaaggaaa caatcaacga agaggctgct gaatgggacc gtgtgcaccc tgtgcatgct 660 ggtccaattg cacctggcca gatgagagaa cctcgtggta gcgacatagc cggtacaaca 720 agtacacttc aggagcaaat aggctggatg acaaacaacc ctcctatacc tgttggtgaa 780 atctataaaa gatggataat cctcggattg aacaaaatag tccgaatgta ttctccaaca 840 agtatcttgg atataaggca aggtccgaaa gaacctttcc gtgattatgt agatagattt 900 tataaaactc tgcgagcaga acaggctagt caagaggtta aaaattggat gaccgaaaca 960 ctactagtac aaaatgcgaa cccagattgt aaaacaatcc tgaaagcact aggaccggct 1020 gccactctgg aggaaatgat gacggcttgt caaggtgttg gtggtcctgg tcacaaagct 1080 cgtgtgcttg ctgaagcgat gtcacaagta acaaactctg ctacgattat gatgcagcgt 1140 ggaaacttcc gaaatcaacg aaaaatcgta aaatgtttca attgtggaaa ggaaggtcac 1200 actgctcgaa actgtcgagc tcctcgcaag aaaggatgct ggaagtgtgg taaggaaggt 1260 caccagatga aagattgtac tgagagacaa gcaaatttcc ttggtaagat ttggccttcg 1320 tataagggta gacctggtaa cttcctacaa tcaagacctg aacctacagc tcctcctgaa 1380 gaatcattcc gaagtggagt ggaaactacc actcctcctc aaaagcaaga gccaattgat 1440 aaagagttat atcctctaac ttcattaagg tctcttttcg gtaacgaccc tagttcgcaa 1500 aacagaaacg gggatccact agttctaga 1529 <210> 5 <211> 1703 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Baculovirus homologous region 3 DNA sequence <400> 5 aatattagac aacaaagatt tattttattc atgccactac tcggttccgt ttttcaagct 60 gaccagttgt catgcggaaa atgacgtcat tattaatgct ttaaacgagt tacgcaacaa 120 cgttaaagtg gacgctgatt gcgaatcggc caaagaccta tcgcacgttt taaacgcgta 180 cgcttatgtg ggcaatggga tcggttgtag atccgcgtac gacggagatg cgatagtggt 240 aaaaaaagaa gccgtgccca gccacgtgta cgccaacctg aacacgcaat ccaacgacgg 300 cgtcaaatac aatcgttggt tgcacgttaa aaacgaccaa tacatggcgt gtcctgaaga 360 attgtacgat aacgacgaat ttaaatgtaa cgtagaatcg gataaattat attatttgga 420 taatttacaa gaagattcca ttgtataaac attttatgtc gaaaacaaat gacatcagct 480 tatgattcat acttaatcgt gcgttacaag tagaattcta cttgtaaagc gagtttaatt 540 tgaaaaacaa attagtcatt attaaacatg ttaacaatcg tgtataaaaa tgacatcagt 600 ttaatgatga catcatctct tgattatgtt ttacacgtag aattctactc gtaaagccgg 660 ttcagttttg aaaaacaaat gacatcatct ttcgattgtg ttttacacgt agaattctac 720 tcgtaaagcc agttcagttt tgaaaaacaa atgacatcat ttttttaaat tcagttttga 780 aaaacaaatg acatcatctc ttgatcatgt tttacacgta gaattctact cgtaaagcga 840 gttcagtttt gaaaaacaaa tgacatcatt cagttttgaa aaacaaatga catcatcttt 900 cgattgtgtt ttacacgtag aattctactc gtaaagccag ttcagttttg aaaaacaaat 960 gacatcatct tttgattgtg ttttacacgt agaattctac tcgtaaagcc agttcaattt 1020 tgaaaaacaa atgacatcat cttagaggta gacccgtcgc caagacgggt ctgctcatat 1080 gtcgttttgt atttgtcatt gcctcttttc acgacgctgt ctggagcatg ggtatatggc 1140 gtagaccctt ttcatacgtc gttttgtatt tgtcattgac gtgatcgtta attgcttttt 1200 tggtatattg gaaattgtgt taaataaaat gactatattt tttattgaaa attattttat 1260 ttaaaatttt aaataattcc tacaaacatt gaaaacactg taggtatctt ggcacatgca 1320 aacaacgcac ggcctatcgt cgaacaccgc cattacatta tattagcctc tcatacaatc 1380 gttgaacaat tttaataaat aatctttaca agtatcgttt gaaggcctca taaacaattt 1440 atatgattta atatcaatat actttttcaa tctagcctcg aatgggctgt tcacaaatta 1500 cgcttcttcc acaataattg cgtcgtagca aattgccaaa tacttgacgc aactaataac 1560 gtctgaatgg gtttcatctt gagcacacct ccatcatcaa aatcataaaa cgatctattt 1620 gtggggcaaa gctgctgtac cgtataaatc gtataatacg acgcggagaa attaatttct 1680 ggcagggacg taatattgga tcc 1703 <210> 6 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6.9 promoter DNA sequence <400> 6 aaattccgtt ttgcgacgat tcagagtttt tgaacaggct gctcaaacac atagatccgt 60 acccgctcag tcggatgtat tacaatgcgg ccaataccat gttttacacg accatggaaa 120 actatgccgt gtccaattgc aagttcaaca ttgaggatta caataacata tttaaggtga 180 tggaaaatat taggaaacac agcaacaaaa atttaaacga ccaagacgag ttaaacatat 240 atttgggagt tcaatcgtcg aatgcaaagc gtaaaaaata ttaataaggt aaaaactaca 300 gctacataaa ttacacaatt taaac 325 <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Baculovirus polyhedrin coding DNA promoter sequence <400> 7 caaataaata agtattttac tgttttcgta acagttttgt aataaaaaaa cctataaata 60 60 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Burst DNA sequence <400> 8 ctgttttcgt aacagttttg taataaaaaa acctataaat 40 <210> 9 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP amino acid sequence <400> 9 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 10 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP DNA sequence <400> 10 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720 720 <210> 11 <211> 1386 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spike mutant protein sequence(H1384R) <400> 11 Met Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe 20 25 30 Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val 35 40 45 Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr 50 55 60 Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile 65 70 75 80 Phe Val Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser 85 90 95 Gln Glu Pro Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala 100 105 110 Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe 115 120 125 Pro Ser Ile Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr 130 135 140 Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu 145 150 155 160 His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe 165 170 175 Ser Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val 180 185 190 Ala Thr Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr 195 200 205 Glu Pro Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly 210 215 220 Ile Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn 225 230 235 240 Val Phe Ala Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe 245 250 255 Asn Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys 260 265 270 Val Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro 275 280 285 Lys Ile Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp 290 295 300 Gly Val Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg 305 310 315 320 Phe Asn Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val 325 330 335 Leu His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser 340 345 350 Ser Asn Pro His Leu Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr Gln 355 360 365 Val Pro Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val 370 375 380 Tyr Lys Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile 385 390 395 400 Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu 405 410 415 Gly Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp 420 425 430 Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp 435 440 445 Ala Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys 450 455 460 Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu 465 470 475 480 Asp Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu 485 490 495 Gln Pro Ile Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe 500 505 510 Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn 515 520 525 Leu Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val 530 535 540 Asp Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser 545 550 555 560 Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu 565 570 575 Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr 580 585 590 Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu 595 600 605 Phe Gly Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys 610 615 620 Gly Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp 625 630 635 640 Val Ser Phe Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly 645 650 655 Phe Lys Gly Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala 660 665 670 Gly Val Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn 675 680 685 Val Thr Ser Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu 690 695 700 Gln Ala Ala Tyr Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu 705 710 715 720 Ser Ser Ser Thr Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr 725 730 735 His Ser Asn Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser 740 745 750 Asn Ile Gly Val Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln 755 760 765 Ser Gly Gln Val Lys Ile Ala Pro Thr Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile 770 775 780 Pro Thr Asn Phe Ser Met Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Tyr 785 790 795 800 Asn Thr Pro Val Ser Val Asp Cys Ala Thr Tyr Val Cys Asn Gly Asn 805 810 815 Ser Arg Cys Lys Gln Leu Leu Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Cys Lys Thr 820 825 830 Ile Glu Ser Ala Leu Gln Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Val Glu Val 835 840 845 Asn Ser Met Leu Thr Ile Ser Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr Ile 850 855 860 Ser Ser Phe Asn Gly Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Val 865 870 875 880 Ser Val Tyr Asp Pro Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser Phe 885 890 895 Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Thr 900 905 910 Val Asp Glu Asp Tyr Lys Arg Cys Ser Asn Gly Arg Ser Val Ala Asp 915 920 925 Leu Val Cys Ala Gln Tyr Tyr Ser Gly Val Met Val Leu Pro Gly Val 930 935 940 Val Asp Ala Glu Lys Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly 945 950 955 960 Met Val Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser Tyr 965 970 975 Ala Val Gln Ala Arg Leu Asn Tyr Leu Ala Leu Gln Thr Asp Val Leu 980 985 990 Gln Arg Asn Gln Gln Leu Leu Ala Glu Ser Phe Asn Ser Ala Ile Gly 995 1000 1005 Asn Ile Thr Ser Ala Phe Glu Ser Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln Thr 1010 1015 1020 Ser Lys Gly Leu Asn Thr Val Ala His Ala Leu Thr Lys Val Gln Glu 1025 1030 1035 1040 Val Val Asn Ser Gln Gly Ala Ala Leu Thr Gln Leu Thr Val Gln Leu 1045 1050 1055 Gln His Asn Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Asp Asp Ile Tyr Ser 1060 1065 1070 Arg Leu Asp Ile Leu Ser Ala Asp Val Gln Val Asp Arg Leu Ile Thr 1075 1080 1085 Gly Arg Leu Ser Ala Leu Asn Ala Phe Val Ala Gln Thr Leu Thr Lys 1090 1095 1100 Tyr Thr Glu Val Gln Ala Ser Arg Lys Leu Ala Gln Gln Lys Val Asn 1105 1110 1115 1120 Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser Gln Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Gly Asp 1125 1130 1135 Gly Glu His Ile Phe Ser Leu Val Gln Ala Ala Pro Gln Gly Leu Leu 1140 1145 1150 Phe Leu His Thr Val Leu Val Pro Ser Asp Phe Val Asp Val Ile Ala 1155 1160 1165 Ile Ala Gly Leu Cys Val Asn Asp Glu Ile Ala Leu Thr Leu Arg Glu 1170 1175 1180 Pro Gly Leu Val Leu Phe Thr His Glu Leu Gln Asn His Thr Ala Thr 1185 1190 1195 1200 Glu Tyr Phe Val Ser Ser Arg Arg Met Phe Glu Pro Arg Lys Pro Thr 1205 1210 1215 Val Ser Asp Phe Val Gln Ile Glu Ser Cys Val Val Thr Tyr Val Asn 1220 1225 1230 Leu Thr Arg Asp Gln Leu Pro Asp Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Val 1235 1240 1245 Asn Lys Thr Leu Asp Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Asn Arg Thr Gly 1250 1255 1260 Pro Ser Leu Pro Leu Asp Val Phe Asn Ala Thr Tyr Leu Asn Leu Thr 1265 1270 1275 1280 Gly Glu Ile Ala Asp Leu Glu Gln Arg Ser Glu Ser Leu Arg Asn Thr 1285 1290 1295 Thr Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ile Tyr Asn Ile Asn Asn Thr Leu Val 1300 1305 1310 Asp Leu Glu Trp Leu Asn Arg Val Glu Thr Tyr Ile Lys Trp Pro Trp 1315 1320 1325 Trp Val Trp Leu Ile Ile Phe Ile Val Leu Ile Phe Val Val Ser Leu 1330 1335 1340 Leu Val Phe Cys Cys Ile Ser Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys 1345 1350 1355 1360 Cys Cys Ala Cys Phe Ser Gly Cys Cys Arg Gly Pro Arg Leu Gln Pro 1365 1370 1375 Tyr Glu Val Phe Glu Lys Val Arg Val Gln 1380 1385 <210> 12 <211> 4161 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spike mutant DNA sequence(H1384R) <400> 12 atgaagtctt taacctactt ctggttgttc ttaccagtac tttcaacact tagcctacca 60 caagatgtca ccaggtgctc agctaacact aattttaggc ggttcttttc aaaatttaat 120 gttcaggcgc ctgcagttgt tgtactgggc ggttatctac ctattggtga aaaccagggt 180 gtcaattcaa cttggtactg tgctggccaa catccaactg ctagtggcgt tcatggtatc 240 tttgttagcc atattagagg tggtcatggc tttgagattg gcatttcgca agagcctttt 300 gactctagtg gttaccagct ttatttacat aaggctacta acggtaacac taatgctact 360 gcgcgactgc gcatttgcca gtttcctagc attaaaacat tgggccccac tgctaataat 420 gatgttacaa caggtcgtaa ttgcctattt aacaaagcca tcccagctca tatgagtgaa 480 catagtgttg tcggcataac atgggataat gatcgtgtca ctgtcttttc tgacaagatc 540 tattattttt attttaaaaa tgattggtcc cgtgttgcga caaagtgtta caacagtgga 600 ggttgtgcta tgcaatatgt ttacgaaccc acctattaca tgcttaatgt tactagtgct 660 ggtgaggatg gtatttctta tcaaccctgt acagctaatt gcattggtta tgctgccaat 720 gtatttgcta ctgagcccaa tggccacata ccagaaggtt ttagttttaa taattggttt 780 cttttgtcca atgattccac tttggtgcat ggtaaggtgg tttccaacca accattgttg 840 gtcaattgtc ttttggccat tcctaagatt tatggactag gccaattttt ctcctttaat 900 caaacgatcg atggcgtttg taatggagct gctgtgcagc gtgcaccaga ggctctgagg 960 tttaacatta atgacacctc tgtcattctt gctgaaggct caattgtact tcatactgct 1020 ttaggaacaa atttttcttt tgtttgcagt aattcctcaa atcctcactt agctaccttc 1080 gccatacctc tgggtgctac ccaagtacct tattattgtt ttcttaaagt ggatacttac 1140 aactccactg tttataaatt tttggctgtt ttacctccta ccgtcaggga aattgtcatc 1200 accaagtatg gtgatgttta tgtcaatggg tttggatact tgcatctcgg tttgttggat 1260 gctgtcacaa ttaatttcac tggtcatggc actgacgatg atgtttctgg tttttggacc 1320 atagcatcga ctaattttgt tgatgcactc atcgaagttc aaggaaccgc cattcagcgt 1380 attctttatt gtgatgatcc tgttagccaa ctcaagtgtt ctcaggttgc ttttgacctt 1440 gacgatggtt tttaccctat ttcttctaga aaccttctga gtcatgaaca gccaatttct 1500 tttgttactc tgccatcatt taatgatcat tcttttgtta acattactgt atctgcttcc 1560 tttggtggtc atagtggtgc caaccttatt gcatctgaca ctactatcaa tgggtttagt 1620 tctttctgtg ttgacactag acaatttacc atttcactgt tttataacgt tacaaacagt 1680 tatggttatg tgtctaaatc acaggacagt aattgccctt tcaccttgca atctgttaat 1740 gattacctgt cttttagcaa attttgtgtt tccaccagcc ttttggctag tgcctgtacc 1800 atagatcttt ttggttaccc tgagtttggt agtggtgtta agtttacgtc cctttacttt 1860 caattcacaa agggtgagtt gattactggc acgcctaaac cacttgaagg tgtcacggac 1920 gtttctttta tgactctgga tgtgtgtacc aagtatacta tctatggctt taaaggtgag 1980 ggtatcatta cccttacaaa ttctagcttt ttggcaggtg tttattacac atctgattct 2040 ggacagttgt tagcctttaa gaatgtcact agtggtgctg tttattctgt tacgccatgt 2100 tctttttcag agcaggctgc atatgttgat gatgatatag tgggtgttat ttctagtttg 2160 tctagctcca cttttaacag tactagggag ttgcctggtt tcttctacca ttctaatgat 2220 ggctctaatt gtacagagcc tgtgttggtg tatagtaaca taggtgtttg taaatctggc 2280 agtattggct acgtcccatc tcagtctggc caagtcaaga ttgcacccac ggttactggg 2340 aatattagta ttcccaccaa ctttagtatg agtattagga cagaatattt acagctttac 2400 aacacgcctg ttagtgttga ttgtgccaca tatgtttgta atggtaactc tcgttgtaaa 2460 caattactca cccagtacac tgcagcatgt aagaccatag agtcagcatt acaactcagc 2520 gctaggcttg agtctgttga agttaactct atgcttacta tttctgaaga ggctctacag 2580 ttagctacca ttagttcgtt taatggtgat ggatataatt ttactaatgt gctgggtgtt 2640 tctgtgtatg atcctgcaag tggcagggtg gtacaaaaaa ggtcttttat tgaagacctg 2700 ctttttaata aagtggttac taatggcctt ggtactgttg atgaagacta taagcgctgt 2760 tctaatggtc gttctgtggc agatctagtc tgtgcacagt attactctgg tgtcatggta 2820 ctacctggtg ttgttgacgc tgagaagctt cacatgtata gtgcgtctct catcggtggt 2880 atggtgctag gaggttttac ttctgcagcg gcattgcctt ttagctatgc tgttcaagct 2940 agactcaatt atcttgctct acagacggat gttctacagc ggaaccagca attgcttgct 3000 gagtctttta actctgctat tggtaatata acttcagcct ttgagagtgt taaagaggct 3060 attagtcaaa cttccaaggg tttgaacact gtggctcatg cgcttactaa ggttcaagag 3120 gttgttaact cgcagggtgc agctttgact caacttaccg tacagctgca acacaacttc 3180 caagccattt ctagttctat tgatgacatt tactctcgac tggacattct ttcagccgat 3240 gttcaggttg accgtctcat caccggcaga ttatcagcac ttaatgcttt tgttgctcaa 3300 accctcacta agtatactga ggttcaggct agcaggaagt tagcacagca aaaggttaat 3360 gagtgcgtta aatcgcaatc tcagcgttat ggtttttgtg gtggtgatgg cgagcacatt 3420 ttctctctgg tacaggcagc acctcagggc ctgctgtttt tacatacagt acttgtaccg 3480 agtgattttg tagatgttat tgccatcgct ggcttatgcg ttaacgatga aattgccttg 3540 actctacgtg agcctggctt agtcttgttt acgcatgaac ttcaaaatca tactgcgacg 3600 gaatattttg tttcatcgcg acgtatgttt gaacctagaa aacctaccgt tagtgatttt 3660 gttcaaattg agagttgtgt ggtcacctat gtcaatttga ctagagacca actaccagat 3720 gtaatcccag attacatcga tgttaacaaa acacttgatg agattttagc ttctctgccc 3780 aatagaactg gtccaagtct tcctttagat gtttttaatg ccacttatct taatctcact 3840 ggtgaaattg cagatttaga gcagcgttca gagtctctcc gtaatactac agaggagctc 3900 caaagtctta tatataatat caacaacaca ctagttgacc ttgagtggct caaccgagtt 3960 gagacatata tcaagtggcc gtggtgggtt tggttgatta ttttcattgt tctcatcttt 4020 gttgtgtcat tactagtgtt ctgctgcatt tccacgggtt gttgtggatg ctgcggctgc 4080 tgctgtgctt gtttctcagg ttgttgtagg ggtcctagac ttcaacctta cgaagttttt 4140 gaaaaggtcc gcgtgcagtg a 4161

Claims (14)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 서열번호 4로 이루어진 HIV(human immunodeficiency virus)의 pr55(Gag) 단백질을 코딩하는 염기서열; 및 서열번호 2 또는 서열번호 12로 이루어진 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV)의 스파이크 돌연변이 단백질을 코딩하는 염기서열;을 포함하는 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자 제조용 재조합 발현 벡터로서,
   상기 발현 벡터에는 서열번호 5로 표시되는 배큘로바이러스의 hr3(homologous region 3) 염기서열, 서열번호 6으로 표시되는 p6.9 프로모터 염기서열, 서열번호 7로 표시되는 배큘로바이러스의 다각체 단백질(polyhedrin) 코딩 유전자의 프로모터 염기서열, 서열번호 8로 표시되는 Burst 염기서열 및 상기 HIV의 pr55(Gag) 단백질을 코딩하는 염기서열이 순차적으로 연결되어 위치하고 있고,
   서열번호 5로 표시되는 배큘로바이러스의 hr3(homologous region 3) 염기서열, 서열번호 6으로 표시되는 p6.9 프로모터 염기서열, 서열번호 7로 표시되는 배큘로바이러스의 다각체 단백질(polyhedrin) 코딩 유전자의 프로모터 염기서열, 서열번호 8로 표시되는 Burst 염기서열 및 서열번호 2 또는 서열번호 12로 이루어진 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV)의 스파이크 돌연변이 단백질을 코딩하는 염기서열이 순차적으로 연결되어 위치하고 있는 것을 특징으로 하는,
   키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자 제조용 재조합 발현 벡터.
6. 삭제
7. 삭제
8. 제5항에 있어서,
   상기 재조합 발현 벡터는 도 19의 개열지도를 갖는 pBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(-19aa) 벡터 또는 pBm-p6.9v-Gag-EGFP-S(H1384R) 벡터인 것을 특징으로 하는, 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자 제조용 재조합 발현 벡터.
9. 제5항의 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포.
10. 제9항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 BT1-Tn-5B1-4 세포, Hi5 세포, LD652Y 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, Kc1 세포, SL2 세포, Bm5 세포, BmN 세포 및 모기(mosquito) 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 곤충 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
11. 제10항에 있어서,
    상기 곤충은 누에나방(Bombyx mori), 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni) 및 벌집다방(Galleria mellonella)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
12. (1) 제5항의 재조합 발현 벡터를 이용하여 재조합 배큘로바이러스를 제조하는 단계;
    (2) 상기 재조합 배큘로바이러스를 숙주 세포에 감염시키는 단계;
    (3) 상기 숙주 세포를 배양하고 그 배양물을 수득하는 단계; 및
    (4) 상기 배양물로부터 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자를 수득하는 단계를 포함하는,
    키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자의 제조방법.
13. 제12항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 BT1-Tn-5B1-4 세포, Hi5 세포, LD652Y 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, Kc1 세포, SL2 세포, Bm5 세포, BmN 세포 및 모기(mosquito) 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 곤충 세포인 것을 특징으로 하는, 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자의 제조방법.
14. 제12항의 방법으로 제조된 키메릭 돼지 유행성 설사병 바이러스-유사입자.

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